Yoel Beovides INIVIT, Cuba · 2018. 9. 17. · Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales ,...

Yoel BeovidesINIVIT, Cuba

Grupo MUSACUBINSTITUTO DE INVESTIGACIONES DE VIANDAS

TROPICALES (INIVIT, Cuba)

RED BIOALI: BIOTECNOLOGÍA PARA FORTALECER PROGRAMAS DE MEJORA DE ESPECIES DE

INTERÉS SOCIOECONOMICO

Instituto de Investigaciones de Viandas

Tropicales, fundado en 1967 (Ministerio

de la Agricultura, Cuba).

1967

Desarrolla Proyectos de Investigación-Desarrollo propios, con Institutos,Universidades y Empresas Cubanas e Internacionales.

Experiencia en Asesorías Técnicas a productores en Cuba y decolaboración en varios países.

casi 50 años de experiencia en

la investigación científica y

como soporte al desarrollo de

una agricultura sostenible

a 250 Km –Habana

a 35 Km – Santa Clara

Misión-INIVITProveer la base científico - técnica

fundamental para contribuir a lasostenibilidad y competitividad de la cadenaproductiva de:

– Raíces, rizomas y tubérculos(Manihot, Ipomoea,Xanthosoma/Colocasia/Alocasia,Dioscorea, Solanum)

– Plátanos y bananos (Musa spp.)

– Papaya (Carica papaya L)

– Granos (Phaseolus, Zea mays L)Ornamentales, forestales, frutales…

Una agricultura de bajos insumos

y alta eficiencia, económicamente

viable, con paradigmas biológico

y orgánico, compatible y

protectora del medio ambiente.

¿Cuáles son nuestros propósitos?

por una agricultura productiva, eficiente, sostenible

Objetivos de trabajo

�Obtención de cultivares con características superiores.

�Conservación, evaluación, documentación y explotación de los recursos genéticos.

�Producción de semilla original y básica por métodos convencionales, convencionales acelerados y técnicas biotecnológicas.

�Definición de tecnologías para el Manejo Integrado de plagas y enfermedades.

�Diagnóstico y saneamiento de las principales enfermedades.

�Desarrollo de técnicas biotecnológicas para el

Objetivos de trabajo

�Ajustes a la fitotecnia de los cultivos.

�Nutrición de los cultivos mediante el empleo de

fertilizantes químicos, biofertilizantes y abonos

orgánicos.

�Desarrollo de software con novedosa información

sobre los cultivos y sus tecnologías.

�Capacitación, asesoría y adiestramiento.

�Generalización de los resultados científicos y

transferencia de paquetes tecnológicos.

Estructura Administrativa

Dirección General

Dirección Administrativa

Dirección de Capital Humano

Dirección Económico Contable

Dirección Desarrollo Institucional

Dirección de Manejo de Plagas

Dirección de Genética y RecursosFitogenéticos

Dirección de Biotecnología Vegetal

Además, dos Estaciones Experimentales(Camagüey y Santiago de Cuba) y

Capital Humano INIVIT272 trabajadores (incluidos obreros, personal de

servicios, profesionales, investigadores, directivos).

33 investigadores

Por categoría investigativa: Por

categoría científica:

Investigador Titular – 11 Doctores

en Ciencias – 13

Investigador Auxiliar – 12 Master

en Ciencias – 17

Investigador Agregado – 6

de

,

Nuclear,

Amplio espectro de especialidades:

Agronomía, Biología,

Economía, Física Nuclear,

Cibernética, Mecanización

agrícola, etc.

Proyectos Nacionales de Investigación con: - otros Institutos del Ministerio de la Agricultura,- varias Universidades cubanas - Institutos del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación

(CITMA)

Proyectos Internacionales con:

- Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) –Colombia

- Centro Internatcional de la Papa (CIP) – Perú - Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA) – Nigeria - Agencia Internacional de la Energía Atómica (AIEA)- Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences (CATAS)- Center for International Research on Environment and

Development (CIRAD) – Guadalupe

Nigeria, Ghana,

Venezuela, Colombia,

Belize, Surinam,

México, Brazil,

Barbados, etc.

* FAO, CLAYUCA y

otras.

10

Researchlines

10 líneas

Mejora genética

Recursos genéticos

Producción,

conservación y

manejo de

semillas Prácticas

Culturales

Cosecha y post-

cosecha

Agro-economía

Informática

Agrícola

Nutrición (mineral, biológica

y orgánica)

Manejo integrado de plagas

Biotecnología

• Propagación masiva de plantas

� Organogénesis y embriogénesis somática� Automatización de la micropropagación� Sistemas de Inmersión Temporal (SIT)� Inmersión total con aireación constante

• Mejoramiento genético

� Selección in vitro a enfermedades� Mutagénesis in vitro� Embriogénesis somática

• Obtención de plantas libres de virus (D. Manejo de Plagas)

� Diagnóstico� Saneamiento

• Transformación genética (en inicios)

• Conservación de germoplasma in vitro

• Biología molecular (en colaboración con otras Instituciones)

� Selección asistida por marcadores moleculares

Líneas de Investigación

Plátanos y bananos

(Musa spp.)

354

Ñame (Dioscoreaspp.)

125

Yuca(Manihot esculenta

Crantz)

554

Malanga(Xanthosoma

spp.)

94

Malanga(Colocasia esculenta

Schott)

104

Boniato(Ipomoea batatas (L)

Lam)

700

cultivares resistentes a SN y MP programa

IMTP de INIBAP.

Producción semilla

original y básica

Trabajar con intencionalidad la obtención y generalización de cultivares y variedades

Raíces y tubérculosPlátanos y bananos Papaya

Institutos de

InvestigaciónProducción de

“Semilla” en Fincasy productoresespecializados

Categoría Certificada y Controlada

CategoríaRegistrada

CategoríaOriginal y

Básica

Empresas estatales y Fincas de

productores privados

INIVIT

Esquema nacional de producción de ‘Semillas’

Garantizar mayores

producciones50% incremento en rendimientos –nuevos clones y variedades (genética) y calidad de la semilla

cultivo in vitro

'INIVIT Y–93–4'

'INIVIT Y- 80+1'

'CEMSA 74 – 6329'

'CMC-40''SEÑORITA'

(Medero, 2008)

34 SSR – diversidad genética

(43,84% DM; 26,4 t.ha-1)

(45,84% DM; 26,9 t.ha-1).

Selección Asistida (Materia seca, SNPs)

Alta diversidad

genética

varios alelos únicos

Seis MM asociados

a MS

(37,48 t.ha-1)

(34,49 t.ha-1)(B.A.S.E., Beovides et al., 2015)

(Cultivos Tropicales, B.A.S.E., Beovides et al.,

2015)

CEMSA 78-354Ocupa el 40% (22000 ha)

INIVIT B-2 2005Ocupa 20 000 ha.‘Potencial: 56 t.ha-1.En producción: 40t.ha-1 en primavera.

INIVIT B-240-2006Ciclo corto (cuatro meses)Potencial: 55 t.ha-1. 17 t.ha-1 en producción.

‘INIVIT BS-16’

Nuevo clon con alto contenido de carotenos (provitamina A)

‘Morado INIVIT’

13 °Bx30 t/ha en

135 díasAntociani

nas

Tolerancia a Cylas formicarius

(Fab.)

‘INIVIT B 98-3’

45 t/ha en cuatro meses INIVIT BS 65-2013

Tolerante a la sequía extrema con rendimientos >17 t/ha.

(Alocasia, Xanthosoma andColocasia)

'INIVIT MC-2001'

'CAMERUM 14'

'INIVIT MX-2008'

'MÉXICO 8'

‘VERDE'

'BELEP' (D. alata)

'IRAT - 72' (D. alata)

'BLANCO DE GUINEA' (D. rotundata)

‘Ñame Pa' (D. esculenta)

Aclimatización

Micropropagación

OTROS CULTIVOS IMPORTANTES

‘Maradol Roja’Hortalizas (varias)

‘INIVIT P-2007’Nueva variedadmás tolerante alos mildius, altorendimiento.

Prácticas agroecológicasesencia del desarrollo

sostenible

Micorrizas Comp

ost

intercalamiento

Controles biológicos

Instituto de

Investigaciones en

Viandas Tropicales

INIVIT - CUBA

Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales

IINNIIVVIITT

CD-ROMCD-ROM

BOLETIN

ES

BOLETIN

ES

PLEGAB

LES

PLEGAB

LES

http://www.inivit.cu

Producción de

plátanos y bananos en

CubaPosee gran significación dentrode la producción de ‘Viandas’(más del 30% anual).

Actualmente esta producción estábasada en varios cultivarespertenecientes a los subgrupos:Cavendish (AAA),Plantain (AAB),Burros (ABB)y tetraploides introducidos de laFundación Hondureña deInvestigaciones Agrícolas (FHIA).

‘FHIA-21’

‘FHIA-25’

Mejoramiento

Genético de Musaspp. en Cuba

Mejoramiento

Genético de Musaspp. en Cuba

BANCO DE GERMOPLASMA

36

133120

41

24

0

20

40

60

80

100

120

140

Nú

me

ro d

e a

cc

es

ion

es

Número de accesiones por grupo genómico

Diploides Triploides (AAA) Triploides (AAB)

354

Variabilidad genética

forma y color de la pampana

Variabilidad

genética

Raquis desnudo

Burro CEMSA

aspecto del raquis

MÉTODOS DE MEJORA PREVISTOS

Cultivo de anteras

Selección temprana de mutantes

Inducción de mutaciones por agentes físicos

Selección clonal de individuos genéticamente superiores

Hibridación

Embriogénesis somática

OBJETIVOS

DELPROGRAMA DE

MEJORA DE MUSASPPIntroducción de nuevos genotipos diploides y

triploides como progenitores masculinos o femeninosen el Programa de MG.

Desarrollar mejores diploides mediante cultivo deanteras con talla baja, características agronómicassobresalientes y resistencia a plagas yenfermedades.

Obtención de bananos y plátanos híbridos a través dela hibridación.

Inducción de mutaciones con el uso de mutágenosfísicos en banano y plátano en busca de resistencia otolerancia a las principales plagas y porte bajo.

1

2

3

4

OBJETIVOS DEL

PROGRAMA DE

MEJORA DE MUSASPPEmbriogénica somática para la propagación y el

mejoramiento

Evaluación de nuevos cultivares obtenidos a travésde ensayos de campo y los métodos de deteccióntemprana para los niveles de resistencia a las plagas(insectos, ácaros, enfermedades y nematodos).

Desarrollo de estudios sobre la interacción genotipo -ambiente.

5

6

7

�RETO FUNDAMENTAL

Lograr una base clonal relativamente amplia

para evitar o minimizar la uniformidad genética,

y con ello obtener cultivares menos vulnerables

a los efectos del cambio climático (plagas,

temperaturas, sequía), con mejor calidad

nutritiva y altos rendimientos.

1. Amplio banco de germoplasma (todos los gruposgenómicos representados)

2. Áreas experimentales y laboratorios para apoyode la investigación.

3. Equipo multidisciplinario con experiencia en elmanejo del cultivo y la mejora convencional, queincluye:

� Mejoradores

� Fitopatólogos

� Fitotecnistas

� Biotecnólogos

� Nutricionistas

PROGRAMA DE MEJORA DE

MUSA SPP

Limitado acceso a técnicas

que facilitan y mejoran el

conocimiento de la

variabilidad y elevan la

eficiencia de la mejora

genética (basadas en

marcadores moleculares,

proteómica, metabolómica,

Disponer de nuevos cultivares diploidessilvestres o mejorados para su uso comoparentales masculinos.

Obtención de cultivares triploides otetraploides con característicasagronómicas deseables (reducción delporte de la planta, disminución del ciclo delcultivo, calidad de la fruta), posibletolerancia a plagas y sequía.

Caracterización, evaluación y

1

2

3

Mejora Convencional por

Hibridación

Selección de progenitores masculinos y femeninosEstudios de fertilidad del polen, caracterización morfoagronómica, otros.

Avances en el programa de Mejora

de Musa spp.

Evaluación frente a las principales plagasSigatoka Negra, Sigatoka Amarilla, Fusarium

oxysporum, Nematodos

En mejora convencional (hibridación)

Principales resultadosSe identificaron progenitores masculinos con altafertilidad polínica, y femeninos productores de semillas.Se estudió la compatibilidad entre ellos. Se hapropuesto una métodología para obtener híbridos queincluye el rescate de embriones mediante cultivo in vitroy la evaluación en campo de las plantas resultantes.

RESULTADOS EN EL FITOMEJORAMIENTO

Selección

clonalCultivares comerciales:

‘CEMSA ¾’ (AAB)

‘Burro CEMSA’ (ABB)

‘Manzano INIVIT’ (AAB)

INIVIT PV-2011 (AAB) 4

CEMSA ¾ (AAB)1

Burro CEMSA (ABB)

2

Manzano INIVIT(AAB)

3

Selección clonal

altura entre 2,0 y 2,65 m, racimo en forma de cono truncado con 12-16

dedos por mano y 30–32 dedos por racimo, con un peso del racimo entre

20,10 y 26,60 kg por racimo.

INIVIT PV 06-30 (AAB)

Primer híbrido de banano obtenido por el programa

de mejora del INIVIT

Tolerante a Sigatoka negra y nematodos.

Potencial de rendimiento de 65 t/ha para sistemas

extradensos.

Peso del racimo: 20-22 Kg

Nuevos Híbridos

Nuevo clon de plátano obtenido mediante el método de variación somaclonal, con un

rendimiento potencial de 50 t/ha para sistemas de

alta densidad.


Nuevos Híbridos

Nuevo clon obtenido por método de selección, con

racimos de 25-30 kg de peso


Híbrido cubano de alto potencial productivo (48

t/ha).

Resistente a plagas.

Adaptabilidad a la sequía.


Resultados en la propagación y mejoramiento genético de Musa spp por

métodos biotecnológicos en INIVIT

López et al., 1999, INFOMUSA — Vol 8, No 2López et al. 2005. Biotec Veg, Vol. 5, No. 2: 115 - 119

Resultados en la propagación y mejoramiento genético de Musa spp por

métodos biotecnológicos en INIVIT

Reajuste del sistema de propagación tradicional in vitro

e implementación de la propagacion por Sistemas de Inmersión Temporal tipos RITA, BIT y Plant form

Desarrollo de un protocolo de regeneración de plantaspor embriogénesis somática en cultivares de plátanovianda Musa AAB con fines de propagacion y mejorapor inducción de mutaciones.

Uso de otras alternativas de la biotecnología para complementar la mejora genética clásica de Musa

mediante el rescate de embriones cigóticos, el doblajede cromosomas y el intercambio internacional de germoplasma

Fase preparativa

del explante

Establecimiento y propagación in vitro

Biotec Vegetal Vol. 6, No. 1, 2006, CubaRevista Colomb de Biotec XV (1): 98-107, 2013

Biotec Vegetal Vol. 6, No. 1, 2006, CubaRevista Colomb de Biotec XV (1): 98-107, 2013

Establecimiento (MS + 1 mg.L-1 BAP)

Multiplicación de material irradiado M1V1 – M1V3(MS + 3,5 mg.L-1 BAP +

1,5 mg.L-1 Kin)

Multiplicación en CRAS60 días

Aclimatización

Selección de plantas "plus"

Evaluación en campo II y III Ciclos. 24

meses

‘INIVIT PV 06 30’Selección en campo (I

ciclo) 12 meses

Propagación en CRAS

60 días

30 días

Extracción de ápices

meristemáticos(2,0-3,0 mm)

Enraizamiento M1V4

(MS) 30 días

30 días

30 días

45 días

Formación de yemas múltiples(MS + 3,5 mg.L-1 BAP + 1,5 mg.L-1

Kin)

Esquema empleo para la inducción de mutaciones a partir de brotes multiples utilizado en el cultivar ‘Zanzibar’ (AAB) para obtener mutantes de porte bajo.

Fig

ura 1. P

roto

colo

para el d

esarrollo

de la em

brio

gén

esis som

ática en

plátan

o vian

da M

us

aA

AB

Biotecnología Vegetal 5(1): 60-64. 2005

Biotechnologies at work for smallholders: Case studies fromdeveloping countries Publisher: FAO. ISBN 978-92-5-107877-8.Roma, pp 47-55. 2013

Germinación de embriones somáticos en Sistemas de Inmersión Temporal

Escalado de la propagación por embriogénesis somática a las biofábricas y su validación en condiciones de producción

1. Improvement of Bananas through Gamma Ray Irradiation.Philippine Journal of Crop Science (PJCS), 38 (2): 47-53. 2013.

2. Mutation Induction Using Gamma Irradiation and Embryogenic CellSuspensions in Plantain (Musa spp.) Protocols Springer 2017.

Rescate de embriones cigóticos

Híbridos en campo

Variantes somaclonales

Plantas de tipo hembras seleccionados de cultivar 'CEMSA ¾'

Philippine Journal of Crop Science (PJCS) August 2013, 38 (2):47-53 Copyright 2013

Gestión sostenible de enfermedades de plátanos y bananos

1.Evaluación de nuevos híbridos obtenidos en Programascubanos y foráneos de Mejoramiento de Musa aSigatoka y Fusariosis del banano.

2.Desarrollo de métodos de selección temprana aenfermedades del banano y stress a sequía.

3.Caracterización molecular de aislados de M. fijiensis y

Fusarium (Foc) (para esto necesitamos ayuda externa,tenemos la fortaleza de trabajar con el germoplasmacubano de Musa spp.)

4.Aislamiento de microorganismos de la rizofera delbanano. Potenciación biológica. Caracterizaciónmolecular de aislados de Trichoderma spp. y otrosmicroorganismos.

Gestión sostenible de enfermedades de plátanos y bananos

5. Desarrollo de sistemas integrales de gestión de lasenfermedades. Control biológico: (empleo debiofungicidas y plantas con propiedades biocidas),evaluación de compuestos orgánicos e inorgánicossobre lesiones de M. fijiensis, Control cultural,evaluación de nuevas moléculas.

6. Trabajo en planes de contingencia a la entrada deFusarium TR4. Manejo integrado del cultivo y de lasenfermedades para reducir el impacto del Fusarium

R1, R2, STR4, TR4.

7. Construcción de capacidades colectivas. Formaciónde facilitadores.

Tenemos experiencia con evaluación de híbridos procedentes del CIRAD, por tanto estaríamos en condiciones de plantar y evaluar nuevos híbridos y hacer investigaciones de campo en estos temas.

Tenemos experiencia con evaluación de híbridos procedentes del CIRAD, por tanto estaríamos en condiciones de plantar y evaluar nuevos híbridos y hacer investigaciones de campo en estos temas.

Resultadosrecientes

1-a

1-b

1-c

2-a 2-b

Fig. 1. Desarrollo del grano de polendesde tétrada (a) hasta el estadomaduro (c).Fig. 2. Formación de callo de laantera (a) y desdiferenciación de lamicrospora (b)

en la investigación agrícola y la asesoría a

productores

en la generalización de resultados científicos en la

agricultura

cultivares con alto potencial de rendimiento y

semilla de alta calidad

Amplias colecciones de germoplasma y áreas de

campo PERO… necesitamos acceder a fondos, capacitación y colaboración… complemento a la mejora clásica

4to. Simposio Internacional INIVIT’2007

Simposio Diversidad vegetal y adaptación al cambio climático:

enfoque de género

En el marco del XXI Congreso de la Sociedad Mesoamericana para la Biología y la Conservación (SMBC) “Conservación de la biodiversidad en manos de las

mujeres mesoamericanas”

Costa Rica (30 de Octubre al 03 de Noviembre, 2017), Hotel Crowne Plaza Corobicí, San José, Costa Rica.

Estrategias de mitigación y adaptación al cambio climático. Soberanía y seguridad alimentaria. Participación de la mujer.Desarrollo rural sostenible. Manejo y conservación de la diversidad vegetal autóctona. Agricultura familiar y equidad de género para el

Temáticas:

[email protected]

http://www.bioali.es/

www.inivit.cu

Paloma MoncaleánNeiker, España

Herramientas biotecnológicas para la producción de plantas en el

actual escenario de cambio climático

Inconvenientes:

Evaluar características deseables en fases maduras, mientras que

su multiplicación se limita a las fases juveniles

La mejor alternativa de producción de planta de alta calidad esla multiplicación vegetativa de individuos seleccionados quehayan expresado características fenotípicas de interés.

PROGRAMAS DE MEJORA

MEJORA CLÁSICA

Polinización controlada,

establecimiento de huertos semilleros, etc.

NUEVAS HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS:

CULTIVO IN VITRO

Organogénesis, embriogénesis, etc.

Multiplicación vegetativa

Neiker: Organogénesis de semilla

Neiker: Organogénesis de individuos adultos

Low rootingTransitory reinvigorationAnd more…..

¿Cual es el problema?

¿Hacia donde vamos?

Cortesía Pramod Gupta (Weyerhaeuser)

� PRODUCCIÓN DE PLANTASELECCIONADA TOLERANTE AESTRÉS BIÓTICO Y ABIÓTICO

�PRODUCCIÓN MASIVA A LA CARTA

� SILVICULTURA CLONAL DE ALTORENDIMIENTO.

� CLONACIÓN DE MATERIAL CONFINES DE INVESTIGACIÓN

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA


SOMATIC EMBRYOGENESIS

INICIATION AND PROLIFERATION PERCENTAGES

MATURATION SUCCESS

GERMINATION RATES

NARROW COMPETENCE WINDOW

¿Cómo combatir la estrecha ventana de competencia?

0

5

10

15

20

25

14 jun 21 jun 28 jun 5 jul 12 jul 19 jul 26 jul

Pro

lifer

ació

n (

%)

aab

abc

bc

cd

de

e ESTADÍOS 2 A 4 DE DESARROLLO DEL EMBRIÓN ZIGÓTICO

0

20

40

60

80

100

EDM CGM

Pro

lifer

ació

n (

%)

a

b

EDM CGM

L-glutamine (550 mg L-1)

asparagine (525 mg L-1)

arginine (175 mg L-1)

L-citrulline (19,75 mg L-1)

L-ornitine (19 mg L-1)

L-lisine (13,75 mg L-1)

L-alanin (10 mg L-1)

L-proline (8,75 mg L-1)

EDM CGM

Casein hidrolized (1 gL-1)

L-glutamine (500 mgL-1)

¿Cómo mejorar las tasas de iniciación y proliferación?

AA-SOLUTION ABA SUCROSE CODE

EDM 60 µM 30 g/l A6S3ED

EDM 90 µM 30 g/l A9S3ED

EDM60 µM 60 g/l A6S6ED

EDM90 µM 60 g/l A9S6ED

CG60 µM 30 g/l A6S3CG




L-glutamine (550 mgl-1) asparagine (525 mgl-1) arginine (175 mgl-1) L-citrulline (19.75 gl-1)L-ornithine (19 mgl-1) L-lysine (13.75 mgl-1) L-alanine (10 mgl-1) L-proline (8.75 mgl-1)

Casein Hidrolisate (1 gl-1)

L-glutamine (500 mgl-1)

• Fresh mass weight (150, 100 mg or less…..• With or without activated charcoal

¿Cómo mejorar la maduración de los embriones somáticos?

0

20

40

60

80

100

120

140

160

nº

em

bry

os

per

10

0 m

g

fresh

ma

ss

maturation media

¿Será una “super linea” celular?

¿Cómo mejorar la maduración de los embriones somáticos?

0 20 40 60 80

100

120

140

160

180

1(14-2)

19(14-5)

4(14-4)

10(14-5)

3(16-3)

1(16-2)

12(16-3)

13(16-3)

2(16-6)

11(16-6)

15(16-4)

11(16-4)

17(16-6)

25(16-6)

12(16-4)

4(18-3)

6(18-4)

8(18-4)

1(18-3)

1(19-4)

7(19-4)

6(19-3)

7(19-2)

13(19-4)

nº de embriones somáticos / 100 mg de peso fresco

Lín

eas celulares

¿C

óm

o m

ejorar la m

adu

ración

de lo

s emb

rion

es so

mático

s?

Containers: Petri dishes.

Culture media: EDM (Walter et al. 1998) with half strength macronutrients of LP

medium (Quoirin and Lepoivre 1977), 30 gL-1 sucrose, 2 gL-1 activated charcoal.

Gelling agent: Gelrite ® (5,5 gL-1)

Environmental conditions: 21 ± 1ºC under a 16-h photoperiod at 120 µmol m-2 s-1

¿Cómo mejorar la germinación de los embriones somáticos?

0%

20%

40%

60%

80%

100%

germination acclimatization

Su

rviv

al(%

)

Simplifications and contributions of this protocol:

• Low amount of ET required (100mg orless../plate).

• Eliminates subculturing during the maturationprocess.

• A great number of clones is obtained, due to thehigh productivity of the process.

• It is not necessary a pretreatment beforegermination, as the SE obtained present goodquality.

1500 embryos per 1g ET95% success in germination

1425 somatic plants per 1g of embryogenic tissue

150 embryos/100 mg ET

>19 shoots/embryo

60 % rooting

Combined somatic embryogenesis and organogenesis protocol

Pinus brutia

Cryptomerya

japonica

Sequoia

sempervirens

El gran reto: Es posible la embriogénesis somática utilizando

material adulto como explanto inicial?

Es posible la embriogénesis somática a partir de individuos adultos de Pinus radiata

En Pinus sylvestris se haobtenido tejidoembriogénico pero laconversión a planta no hasido posible (Aronen et al.

2009)

En Picea glauca se hanobtenido plantassomáticas a partir de unindividuo somáticoadulto (Klimaszewska et al.

2011)

Se ha conseguidoregenerar planta a partirde individuos adultos deespecies angiospermas(Rugini y Caricato 1995; Toribioet al. 2004)

Hipótesis de trabajo

Vegetative buds from 20 years old trees

6 collection dates from February to May 2008

5 genotypes

Culture conditions:

Material and Methods

DCR (Gupta y Durzan, 1985)

0.2 gL-1 PVP

1 gL-1 glutamine

1 gL-1 casein hydrolysate

1 gL-1 inositol

1,5 gL-1 gellam gum

20 μM 2,4-D

25 μM NAA

1 μM BA

(Walter et al. 1998)

L-glutamine (550 mgL-1)asparagine (525 mgL-1)

arginine (175 mgL-1)

L-citrulline (19.75 mgL-1)

L-ornithine (19 mgL-1)

L-lysine (13.75 mgL-1)

L-alanine (10 mgL-1)

L-proline (8.75 mgL-1)

3 gL-1 gellam gum

4.5 µM 2,4-D

2.7 µM BA

Slices of 1-1,5 mm, 22ºC in the dark

A

B(Malabadi and van Staden, 2005)

Korea, 2010

Embriogénesis de árboles adultos

AB

Proliferation could be observed

SLOW

FAST


The tissue became yellow-brown andproliferation failed.


Vegetative buds from 20 years old trees

3 collection dates from December 2009 to January 2010

5 genotypes


Supervivencia Productividad

Temperaturas Disponibilidad de agua

¿Podemos encontrar especies y/o genotipos de especies productivas

tolerantes al estrés hídrico?

Cambio climático: IPCC 2007- actualidad

O2: P. radiata var. radiata

(Basque Country)

O3: P. radiata var. radiata(Australia)

O1: P. radiata var. binata × var. radiataO4: P. attenuata x P. radiataO5: P. radiata var. cedrosensis × P. radiata var. radiata

Six Pinus radiata ecotypes

Species hybridVariety hybrid

Variety hybrid

O6: P. radiata var. radiata(New Zealand)

Material vegetal

Plants/Ecotype peat:perlite (7/3, v/v) (T=

23ºC RH=70ºC)

Two-year-old plants

W- Control

(two-daily to field capacity)

D- Water stressed(without irrigation)

Scheme of the experiment

Drought (C1) Drought (C2)Rewatering

T0 T4 R7

4 weeks 1 week 50% plants with external symptoms

Drought

Hormonal dynamic

Physiological processes Osmotic adjustment

Growth Anatomy

Hardening?

Physiological processes

Water status:

RWC (%)

Ψpd, Ψleaf, Ψt

Gas exchange:

gs, E, AN (%)

Needle hydraulic conductance:

Kleaf

Electrolyte leakage:

E.L. (%)

Fluorescence parameters:

Fv/Fm, ΦPSII , qCN

Photosynthetic pigments:

Chl a, Chl b, carotenoids

Physiological parameters

Statistical analysis:

MANOVA, PC analysis, ANCOVA

O4- Pinus attenuata X Pinus radiata O5- var. Cedrosensis x P. radiata var. radiata

Physiology

Tolerance≅Ψleaf, Ψt, RWC

↓Ψπ ↑Active OA

↑ε < 4MPa

↑Put, Spd, Spm

↓Heigh

=Diameter

↓Substomatal chamber

= JA and ACC

−SA

−ABA and IAA

Hardening ↑Active OA

↑Pro, GABA, Glu

Morphology Phytohormones

O1- P. Radiata var. Binata X P. Radiata

O5 ≅ O4 but ↑ Biomass

Resultados estudios fisiológicos

Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD)(2014):Development of productive contingency species for

forestation in Spain and New Zealand may be better adapted to predicted changes in climate due to global warning.

SCION (Nueva Zelanda) NEIKER

Desarrollo de protocolos de embriogénesis

somática de híbridos de Pino

Estudio de procesos organogénicos de embriones

somáticos

Híbridos Pinus spp.: P. radiata x P. attenuata

Supervivencia Productividad

Temperatura Disponibilidad agua

¿Podemos modular la tolerancia a estrés abiótico?

Cambio climático: IPCC 2007- actualidad

Es posible generar tolerancia a estrés abiótico en Pinus radiata

En Arabidopsis thaliana se hademostrado que las condicionesambientales en las que viven losparentales pueden inducircambios moleculares (pool demiRNA, metilación del DNA) enestas plantas que conducen aadaptacionestransgeneracionales a diversostipos de estrés (Sunkar y Zhu2004; Boyko et al. 2010).

Las semillas de Picea abies

“recuerdan” las temperaturas(Johnsen et al. 2005a) y elfotoperiodo (Johnsen et al.2005b) al que han sidosometidos durante laembriogénesis zigótica y lamaduración de las semillas.

Las condiciones ambientalespueden inducir cambiosepigenéticos en la planta quefavorecen su adaptación a undeterminado estrés, pudiendo seréstos permanentes e inclusohereditarios (Mirouze y Paszkowski,2011)

Hipótesis de trabajo


Lineas celularesLineas celularesGran número de embriones

somáticos

Gran número de embriones

somáticos

Plantas somáticas adaptadas a

condiciones Ex vitro

Plantas somáticas adaptadas a

condiciones Ex vitro

Analizar el efecto de las condiciones físicas y químicas del ambiente de cultivodurante las fases de la embriogénesis somática en Pinus radiata y determinar sicondicionan la tolerancia al estrés hídrico de las plantas somáticas generadas.

2 g/L

3 g/L

4 g/L

2 g/L

3 g/L

4 g/L

Initiation Proliferation Maturation Germination

18 ºC

EDM

23ºC

4.5 g/L 9 g/L 7 g/L

2 g/L

3 g/L

4 g/L

23 ºC

28 ºC

FASE DE INICIACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO

LP

INITIATION EXPERIMENT

INITIATION EXPERIMENT

a

P. radiataMaturation rate:

89%

P. halepensisMaturation rate:

100%

Influencia a largo plazo

INICIACIÓN

Líneas celulares

18ºC – 4 gL-1DIVERSIDAD GENÉTICA

Eficiencia proceso

28ºC – 4 gL-1EMBRIONES SOMÁTICOS

Modificación de las condiciones ambientales en la maduración

18ºC

23ºC

28ºC

Initiation

Proliferation, Maturation and Germination

Stressed plants

Control plants

Estrés hídrico Rehidratación

ESTUDIOS FISIOLÓGICOS PARA ANALIZAR RESPUESTA A ESTRÉS HÍDRICO

• Water status determination

• Gas exchange parameters

• Phytohormone concentration

• Protein profile

Somatic plantsPhysiological

characterizationAnalysis of

survival and quality

PARAMETROS FISIOLÓGICOS ANALIZADOS

FASE DE INICIACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

00 5 10 15 20 25

ψ

Leaf

(M

Pa)

TimeLeaf Potential (MPa)

D 28ºC

D 23ºC

D 18ºC

W CONTROL

TL

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25

WU

E

Time

WUE

D 28ºC

W CONTROL

D 23ºC

D 18ºC

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

Inta

ntan

eous

net

pho

tosy

nthe

sis

Time

Instantaneous net photosynthesis (AN)

D 28ºC

D 23ºC

W CONTROL

D 18ºC

ESTUDIOS FISIOLÓGICOS PARA ANALIZAR RESPUESTA A ESTRÉS HÍDRICO

3.5 g/L

4.5 g/L

5.5 g/L

3.5 g/L

4.5 g/L

5.5 g/L


18 ºC

EDM

23ºC

9 g/L 7 g/L

3.5 g/L

4.5 g/L

5.5 g/L

EDM

23ºC

3 g/L

23 ºC

28 ºC

FASE DE PROLIFERACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO

8 g/L

9 g/L

10 g/L

8 g/L

9 g/L

10 g/L


8 g/L

9 g/L

10 g/L

EDM

23ºC

7 g/L

18 ºC

23 ºC

28 ºC

EDM

23ºC

3 g/L 4.5 g/L

FASE DE MADURACIÓN DEL TEJIDO EMBRIOGÉNICO

Endogenous Isoprenoid CKs: tZ, tZR, tZOG, tZROG, tZRMP, tZ7G, tZ9G, cZ, cZR, cZOG, cZROG, cZRMP, cZ9G, DHZ, DHZR, DHZOG, DHZROG, DHZRMP, DHZ7G, DHZ9G, iP, iPR, iPRMP, iP7G, iP9G.

Endogenous Aromatic CKs: BAP, BAPR, BAP9G, BAPR5MP, oT, oTR, oT9G, mT, mTR, mT9G, pT, pTR.

Endogenous IAA and conjugates: IAA, oxIAA, IAAsp, IAGlu.

Results:cis Z > trans Z23ºC-3g/L Endogenous CK content

HORMONAL PROFILE

Respuesta

% iniciación

% iniciación

2 g L-1

3 g L-1

4 g L-1

2 g L-1

3 g L-1

4 g L-1

2 g L-1

3 g L-1

4 g L-1

18 ºC

Tratamiento

Iniciación

HI

LI

139 spots expresión

diferencial significativa

LI:25 spots

HI: 2 spots

23 ºC

28 ºC

PROTEIN PROFILE

0 15 30 45

uncharacterized proteins

response to ROS

gene expression

defense response

carbohydrate metabolic process

Functional category

% expressed proteins

0 15 30 45

uncharacterized proteins

response to ROS

gene expression

defense response

carbohydrate metabolic process

Functional category

% expressed proteins

Categorias funcionales (Swiss-Prot)

•Estudiar el efecto de condiciones más extresantes, aumentando la temperatura decultivo.

•Analizar si existen marcas epigenéticas en las masas embriogénicas y en las plantassomáticas resultantes.

•Obtener macadores de tolerancia al estrés hídrico: estudios hormonales, etc….

•Profundizar en los estudios de estrés inducido en invernadero para corroborarresultados en las diferentes fases del proceso embriogénico.

•Desarrollo de ensayos en campo con plantas somáticas con aparente diferente“tolerancia” a estrés, en diferentes ambientes climatológicos.

PERSPECTIVAS FUTURAS

Socios y colaboradores:

Mariano Toribio (IMIDRA, España)

Isabel Arrillaga (Universidad de Valencia, España)

Mari Carmen San José (CSIC-Galicia, España)

Dra. Hargreaves (SCION, Nueva Zelanda)

Dr. Strnad (Palacky University, Czech Republic)

Dr. Jorge Canhoto (University of Coimbra, Portugal)

Dra. Klymaszewska (Forest Research Institute, Canadá)

¡¡GRACIAS¡¡

Taller TécnicoSandra Correia, Universidad de Coimbra, Portugal

DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA

EN TORNO AL USO DE MICROALGAS

DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS

Proteomics

Functional genomics

Immunohysto-chemical analysis

Plant physiology

Plant tissue

culture

Genetic transformation

Molecular Biology toolsMolecular Biology tools

Auxins (2,4-D, picloram)High sucrose

No PGRsLow sucrose


TamarilloTomate de árbol

(Solanum betaceum) somatic embryogenesis

B

C

A

D E

nec

em

F G

H I J

1 cm

5 mm 5 mm

5 mm

1 cm

5 mm

5 mm

2 cm


Tamarillo somatic embryogenesisTamarillo somatic embryogenesis

EMBRYOGENIC CELLS

NON-EMBRYOGENIC CELLS

In vitro establishment

Seeds (mature zygotic

embryos)

Tamarillotree

Young leaves

SHOOT MULTIPLICATION SE INDUCTION SOMATIC EMBRYO DEVELOPMENT EMBLINGS ACLIMATIZATION

MS basal mediumHigh sucrose levels

Auxin (2,4-D or picloram)

MS basal mediumLow sucrose levels

No PGRs

Plant cloning CryopreservationCryopreservationGenetic

transformationGenetic

transformationCell suspension

culturesCell suspension

culturesProtoplastsProtoplasts


What We Can Learn from Proteomics?

Somatic embryogenesisSomatic embryogenesis


TCA/acetoneIEF solubilization buffer

13 cm-long IPG strips (pH 3–10)10% acrylamide gels

Colloidal Coomassie Blue G-250

PDQuestTM 8.0

MASCOT Protein Pilot software

Proteomic analysis of embryogenic competence acquisition

Embryogenic callus Non-embryogenic callus

EC

an

dN

EC

lin

es

main

ten

an

ce

MS

+ A

UX

IN

+ 9

% s

ucro

se


Pic

loram

ind

uced

2,4

-D i

nd

uced

2D-electrophoresis analysis


Zygotic

Embryo

Embryogenic

Callus

420 spots

Leaf

Embryogenic

Callus

374 spots

Zygotic

Embryo Non-

Embryogenic

Callus

322 spots

Leaf Non-

Embryogenic

Callus

313 spots

ZEEC

LEC

ZENEC

LNEC


Zygotic

Embryo

Embryogenic

Callus

420 spots

Leaf

Embryogenic

Callus

374 spots

Zygotic

Embryo Non-

Embryogenic

Callus

322 spots

Leaf Non-

Embryogenic

Callus

313 spots



• Up-regulated in EC

• Up-regulated in NEC


MIPS Functional Catalogue Database(Munich Information Center for Protein Sequences)

Zygotic

Embryo

Embryogenic

Callus

420 spots

Leaf

Embryogenic

Callus

374 spots

Zygotic

Embryo Non-

Embryogenic

Callus

322 spots

Leaf Non-

Embryogenic

Callus

313 spots




Non-embryogenic callus


Embryogenic callus

DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGASDESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS

Non-embryogenic callus Embryogenic callus

DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGASProteomic analysis of embryo development in Pinus radiata

Plant Biotechnology 33, 143–152 (2016)

DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGASProteomic analysis of embryo development in Pinus radiata

EnolasePhosphoglycerate kinase

Chaperone proteins

Vicilin

Plant Biotechnology 33, 143–152 (2016)

Mass Spectrometry Unit Anjo et al., Proteomics 2015, 15, 757-762Anjo et al., Proteomics 2017, 17, 1600278

SWATH-MS method

Protein patterns associated with tamarillo somatic embryogenesis

Protein patterns associated with Quercus suber somatic embryogenesis

SE1 SE2 SE3 SE4 EA COTEC

Plant cloningPlant cloning CryopreservationCryopreservationGenetic




� 3363 mg of increment per 100 mg of initial cell mass

Weight increment

W/V ratio

� 40 mg of cells cultured in 20 ml of TP liquid medium

Growth ability of different types of calli

Embryogenic calli proliferation in liquid medium

Alves et al. (in press)

DARKNESS 25 ºC

GI 13 weeks 3 weeks GI 2 GI 33 weeks

EC1

NEC

EC250 ml liquid

medium TP

80 rpm

Stops at GI 1

Cell suspension filtration

(0.22μm membrane)

Culture media protein precipitation(ammonium sulfate) andsolubilization (30 mM

sodium phosphate buffer, pH 7)

SDS-PAGE

NEC

EC2

EC1

NEC

EC2

EC1

DESARROLLO DE UNA BIOREFINARÍA EN TORNO AL USO DE MICROALGAS mRNA isolation

cDNAs library

Protein expression

Antibody hybridization

Sequencing

ComparativeSDS-PAGE analysis

cDNAs

E. coli infection

Embryogenic callus

Non-embryogenic callus

NEP-TCNon-Embryogenic Protein

from Tamarillo Callus (GenBank JQ766254)

Faro, M.R. et al. 2003. 7th Int.

Botanical Meeting – Plant Cell

Biology. Lisbon.

� Non Embryogenic Protein of

Tamarillo Callus

� 26.5 kDa protein expressed

consistently in NEC

� tRNA/rRNA methyltransferase

(76% homology)

� SpoU Methylase family: SAM-

dependent

methyltransferases (PF00588)

NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)PROTEIN and GENE EXPRESSION

D

NEP-TC 175 bp

EF1α 380 bp

t0 t10 t12 EC NEC Ct0 t4 t6 t8 t10 t12 EC NEC

NEP-TC ~25 kDa

B

t0 t4 t6 t8 t10 EC NEC

NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)IMMUNOLOCALIZATION

t4 t6 t8 t10 EC NEC

4w

6w

8w

10w

EC

NEC

NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)IMMUNOGOLD LABELLING

Cytosolic location

NEP-TC (Non-embryogenic protein from tamarillo callus)

Is NEP-TC a tRNA/rRNA methyltransferase?

Methyltransferase activity in protein extracts of calli

Methyltransferase Activity (Kit Enzo Life Sciences)

Time (min)

Flu

ore

scen

ce (

RFU

)

Recombinant NEP-TC expression



Transformation of E.coli cells (BL-21 strain)

Induction of expressionwith IPTG (1mg/mL) and culture growth(30ºC, overnight)

Culture lysis andprotein purification

(affinitycromatography) SDS-page / Western blot

Culture growth in LB media (4h, 37ºC, O.D. 0,7-0,8)

Recombinant NEP-TC purification



1 L of expression medium

4.1 mg of recombinant NEP-TC

Ion-Metal Affinity Chromatography(IMAC)

Molecular Exclusion Chromatography (Superdex

200-PG column)

Methyltransferase activity

Recombinant NEP-TC EXPRESSION and PURIFICATION

Calbiochem’s SAM Methyltransferase Assay kit (CBA096)

O.D. (510nm) - production of SAH in SAM-dependent methylation reactions

MTase

Expression of target protein in E.coli BL21.

Purification of the target protein.

Western Blot analysis of purified NEP-TC with anti-his tag antibody



Calbiochem’s SAM Methyltransferase Assay kit (CBA096)

O.D. (510nm) - production of SAH in SAM-dependent methylation reactions

MTase

Substrate Specific activity (nmol/min/ mg protein)

RNA 0.0323 ± 0.0245

DNA 0 - 0.0228

Ribosomes 0.0393 ± 0.0285

rRNA 0.3370 ± 0.1520

NEP-TC down regulationNEP-TC down regulation

• Final product of recombination

contains: one spliceable intron and

nptII as plant selectable marker gene.

• T-DNA constructs will produce double-stranded RNA

- hairpin RNA - from the NEP-TC gene sequence,

triggering post-transcriptional gene silencing.

GATEWAYTM vector(Invitrogen)

Construct sequence verification by PCR and

restriction analysis, before incorporation

into LBA4404 Agrobacterium strain.

• NEP-TC 264 bp PCR products generated with

attB1 and attB2 recombinant sites;

Liquid induction medium + AS 20µM+ Bacterial suspension

LB broth (pH 7.2) rif (50)+spec(50)Induction medium (+AS) plates

2-3 months

Cefo + Carb + Kan (250mg/l)

Cefo + Carb (125mg/l)Kan (100mg/l)

Kan (50mg/l)

2 weeks

Kan (50mg/l)

1 month

Kan (50mg/l)

CO

NT

RO

L(w

ith

ou

t an

tib

ioti

cs)

SE

LEC

TIO

N

PLA

TE

S





Agrobacterium mediated genetic transformation

NEP-TC down-regulated tamarillo lines

PCR analysis of

putative transgenic

plants

≈ 75% transformed

plants

0.5 µm0.5 µm

0.5 µm

NECEC

Development of a reliable method to targetand isolate uniform populations of embryogenic

cells at the very early stages of SE.

2 mg/l 2,4-D or5 mg/l picloram9% sucrose8-10 weeks

3% sucrose3-4 weeks

NEP-TCrRNA methyltransferase?

EndogenousAUXIN levels

Endogenous auxin levelsEndogenous auxin levels

IAA quantification by HPLC

Endogenous auxin (IAA)IMMUNOLOCALIZATION

Laser

++

++

+

+

+

--

--

-

-

-

Original embryogenic tissue sample (mixture of cells/protoplasts)

Empty drop

Embryogenic cell

Non-embryogenic cell

Non-discriminated event

New drop

+

-

SE-induced tissue sampling

Protoplast isolation

Protoplast purification

FACS

Next generation sequencing

Tissue cryofixation

Cryosectioning

Immunodetection

Confocal microscopy

Anti-IAA Anti-NEPTC

2nd antibody2nd antibody

Embryogenic tissue section

Immunolocalization

FLUO RESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING IMMUNOHISTOCHEMISTRY

Leaves Embryogeniccallus

Induced explants Non-embryogeniccallus

Enzymatic isolationCelulase/macerozyme/driselase/pectinase;27 ºC -30 ºC; 6h - overnight

Protoplast purificationPellet / interphasic band100 - 300 g; 5 – 10 min

Viability and yieldFDA / Evans blueHemocytometer

pellet pellet

Interphasic

band





culturesProtoplasts

Protoplasts isolation and purification

Fluorescence activated cell sortingFluorescence activated cell sorting

ORI

GIN

AL

SAM

PLE

bright field green blue

SORT

ED E

C

POPU

LATI

ON

Center for Bioinformatics and Computational Biology

Sorted populations of

cells

Sorted populations of

cells

Total RNATotal RNA

RNAseq librariesRNAseq libraries

SequencingSequencing

Bioinformaticsdata analysis


Laser capture microdissection

LCM cellsLCM cells

Total RNATotal RNA

RNAseq librariesRNAseq libraries

SequencingSequencing



Fluorescence activated cell sorting

Hystochemical analysisHystochemical analysis

Correia et al. (2012) Plant Cell Tiss Org Cult. 109:143–152

Increased tolerance to water stress of acclimatized tetraploid plants of Solanum betaceum

Plant physiologyPlant physiology

WATER STRESSAcclimatizationMicropropagation

Tetraploid vs Diploid plants2nWS

4nWS

Increased tolerance to water stress of acclimatized tetraploid plants of Solanum betaceum

Sugars |Proline |MDA

Plant growth

Photosynthetic performance

Water potential

Plant physiologyPlant physiology

2nWS

4nWS

Paula Veríssimo (Univ Coimbra, PT)

José Feijó (Univ Maryland, USA)

Jörg Becker (IGC, PT)

Célia Miguel (ITQB-IBET, PT)Margarida Oliveira (ITQB-IBET, PT)

Glória Pinto (Univ Aveiro, PT)

Paloma Moncálean (Neiker, ES)Itziar Montalbán (Neiker, ES)

Ana Alhinho

Ana Alves

Ana Braga

Ana Pedrosa

André Caeiro

Bruno Casimiro

Cátia Pereira

Diana Augusto

Diana Graça

João Martins

Pedro Antunes

Taller TécnicoPablo González Goicoechea, Neiker, España

Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑA

Aplicación de herramientas –ómicas en los programas de mejora

agroalimentaria

Pablo G [email protected]


Resumen

• Una historia del desarrollo de herramientas genómicas en los robles blancos europeos

• Descanso

• Bioinformática para mejoradores


Quercus sp en alimentación


Objetivos Mejora GenéticaEliminar intermediarios


Los Actores

…


Los Robles Blancos EuropeosQ. robur

Q. petraeaDos especies condistribución amplia

e importanciaeconómica y ecológica


Los Robles Blancos Europeos… Y UNA VEINTENA DE “ESPECIES MENORES”


“Ancient Knowledge” in IberiaThe syngameon


Barreras Reproductoras

Además, la diferenciación entre especies de los genes candidatos fue mayor que la de otros genes elegidos al azar !!


Análisis Genéticos ClásicosEnsayos de Procedencias

EnsayoRecolección

Ducousso et al., 1996Kremer et al., 2002Banach & Lienowiecki, 2011

Evaluación


Análisis Genéticos ClásicosMapa Genético 1ª Generación

Barreneche et al., 1999)


Análisis Genéticos ClásicosQTLs

x

Evaluación

CruzamientosProgenie

Saintagne et al., 2004; Parelle et al., 2007;Brendel et al., 2008; Deroy et al., 2010


Los Robles Blancos EuropeosPhylogeography

Petit et al., 2002

cpDNA haplotypes

Olalde et al., 2002


Diferencias Entre EspeciesEscaneado Genómico (AFLPs, gSSRs)

P-R1

P-R3

P-R10

P-R4

P-R7

P-R5

P-R12

P-R6

R9

P-Py4b

Scotti-Saintagne et al., 2005


EVOLTREEEVOLution of TREEs as drivers of terrestrial diversity – Es una Red de Excelencia nacida bajo UE FP6. En la actualidad se financia mediante las aportaciones de los socios. Integrada en EFIATLANTIC.

http://www.evoltree.org

Objetivo

Infraestructuras Comunes46 genotecas de robles (>106 clones)15.000 BAC clones> 100.000 EST-SSRs


Desarrollo y Mapeo EST-SSRsThe markers

4 cDNA librariesBudsLeavesRootsXylem

stackPACK

Cross_Matchd2_clusterPHRAPCRAW

103,000 Unigene ESTsmreps

5,218 EST-SSRsESTScanFrameDP

Coding vs non-coding regions

Durand et al., 2010BMC Genomics

748 primersPrimer3


Desarrollo y Mapeo EST-SSRsThe maps

278 F1s X 953 markersBudsLeavesRootsXylemMissing data > 0.5

LOD score > 3.0

66 F1s X 128 markers

Joinmap

Framework MapsMapPopGenoPlayer

Bin-maps (14 F1s)

Durand et al., 2010BMC Genomics

2nd Generation Genetic MapBodénès et al., 2012BMC Plant Biology


Los robles blancos de IberiaRanges - Blanco-Castro et al. 1997

Pictures – Galan-Cela et al., 2013

Quercus fruticosa

El Aljibe Bot. Garden


POR QUE IMPORTA LA DIVERSIDAD GENETICA?

La diversidad genética constituye el material de base con el que trabajala EVOLUCION

ESPECIACION

Rob

les

del P

N Iz

ki

ADAPTACION

Latitud: 59.3 Latitud: 42.7

mal drenado bien drenado


Re-sprouting oaks (Rebollos)Quejigos (Q. faginea) and Melojos (Q. pyrenaica)

Acid Soils

Calcareous soils mainlyOut-competed by Q. pyrenaica on acid soils

Complementary distribution in relation to: - soil types (mainly)- climate

root-suckers stem sprouts


Range-wide DifferentiationSpeciation Genes

LG1 LG2 LG3 LG4 LG5 LG6

66 markers8 populations x 12 trees x 2 species

STRUCTUREGENOME SCANS

6 outliers in 5 bins


Range-wide DifferentiationSpeciation Genes

Genotyping 29 additional EST-SSRs from the 5 bins

6 additional outliers

Outliers are grouped

Three-marker haplotypes• Highly Significant LD• Co-location QTLs

Goicoechea et al., 2014Heredity


The genetic mosaic of speciationPopulation-wise Speciation Genes

Quercus faginea

Quercus pyrenaica

Pn Izki

PN Cabañeros

Pn Collado deLos Jardines

Pn Font Roja

Pn Sierra Nevada

Goicoechea et al. unpublished

48 treesper pop


110 SSRs (103 EST-SSRs y 7 gSSRs)



Clasificacion GenéticaSTRUCTURE (locprior=localidad/especie)

RESULTADOS

K=2

K=4

K=7

HAY POBLACIONES QUE SE PARECEN MASA LA OTRA ESPECIE QUE A LA PROPIA


Jost’s D

IUFRO – Arcachon – 2016/05/30



BAYESCAN

MSA

Outliers identifythe knownregions of inter-specificdifferentiation in LGs# 2, 3 and 12.

New EST-SSRs that had not been genotyped earlier identified highly divergent markers in LGs# 1, 4 and 7



SpeciationPairwise (Inter-sp)

2bp 3-6bp

2bp 2bp3-6bp 3-6bp

GOT021 in 10 / 12

Cluster from LG#12 in 6/12

Cluster from LG#2 in 7/12

GOT021 non-significant


Intra-specific Genome ScansAdaptation Genes

Large % of theoutliers are thesame in the twooak species.

13-15 outliers per species


LOCAL ADAPTATIONEnvironmental Data

January Tmax

I. 2300 weather stations

II. Lengths of the records: from15 to 50 years

III. Spatial resolution of 200m

IV. Datasets: Tmin, Tmax, Rainfall, Solar Radiation

Nimyerola et al., 2005

Open GIS Map Serverhttp://opengis.uab.es/wms/iberia/index.htm

6 sampling locations


BIO1 = Annual Mean TemperatureBIO2 = Mean Diurnal Range (Mean of monthly

(max temp - min temp))BIO3 = Isothermality (BIO2/BIO7) (* 100)BIO4 = Temperature Seasonality (standard

deviation *100)BIO5 = Max Temperature of Warmest MonthBIO6 = Min Temperature of Coldest MonthBIO7 = Temperature Annual Range (BIO5-BIO6)BIO8 = Mean Temperature of Wettest QuarterBIO9 = Mean Temperature of Driest QuarterBIO10 = Mean Temperature of Warmest QuarterBIO11 = Mean Temperature of Coldest QuarterBIO12 = Annual Precipitation…BIO27 = Radiation of coldest quarter (W m-2)

TmaxTminRainfallSolar Radiation

BIOCLIM VARIABLESCLIMATE ATLAS

From 6 sampling sites (7 populations)


LOCAL ADAPTATIONEnvironmental Data


Local AdaptationGEAs – The modelBayeScEnv: de Villemereuil and Gaggiotti (2015)

Where gi = local adaptation effect on locus i, caused byEj = environmental differentiation of population j

BayeScan

Null model (βj. = pop differentiation)

Locus-specific effect αi


Allows to distinguish departures from the neutral model due to unknown factors, from departures due to local adaptation caused by an environmental factor

Other ModelFeatures

1) each environmental variable is tested individually

2) Significance -tests based on the FDR


BLAST2GO: Conesa et al., 2005

Lightred, far-red

Cytokinin

Light UV

Brassinoster…

RNAi

Heat, cold

Osmoticwater, salt

JA

Landscape GenomicsGenomic-Environmental Associations


..in the meantime...

Quercus robur es tolerante a periodos de encharcamiento y Q. petraea prefiere suelos bien drenados.

- Genes Candidatos- Genotecas SSH- qPCR

Sobre-expresado en Q. robur

Sobre-expresado en Q. petraea


The end?

Reunión BIOALI 4-7 Julio, Vitoria-Gasteiz, ESPAÑAEskerrik Asko


Genomics for Breeders

A rough guide to complexity reduction techniques

and Bioinformatic needs


Genomics for BreedersSugerencias

1. Olvidense de secuenciar genomascompletos (probablemente está hecho o alguien lo está haciendo)

2. Reducción de problemas Bioinformáticos3. Diferentes soluciones adaptadas a

muchos presupuestos y necesidades


Complexity ReductionFamiliarity with AFLPs

Complexity reduction by usingTwo Restriction Enzymes and Selective PCR primers

Next-Generation Sequencing

1. Genotyping By Sequencing

2. RAD-seq

3. Gene Capture


Comparación entre métodos

Chen et al. 2013PLOS One


Genotyping-By-Sequencing

Elshire et al.,2011PLoS ONEMyles et al., 2013 TGs


GBS in Agrogenomics

Aggenome.com


RAD-seqddRAD, 2bpRAD, ezRAD …

Floragenex.com

ddRAD PROTOCOL

Peterson BK, Weber JN, Kay EH, Fisher HS, Hoekstra HE (2012) Double Digest RADseq: An Inexpensive Method for De Novo SNP Discovery and Genotyping in Model and Non-Model Species. PLoS ONE 7(5): e37135. doi:10.1371/journal.pone.0037135


Sequence CaptureTargeted Gene Capture

Posibilidad de analizar 1 gen o miles de genes, rutas metabólicas, gruposde candidatos, etc.

Permite altas coberturas(variantes raras)

Pero …

Se necesitan recursosgenómicos de la especie o especie relacionada


Sequence Capture

Agilent

Puede combinarse con RAD libraries para reducir aún másla complejidad del genoma.

Posibilidad de secuencias muylargas (> 20 kb,Dapprich et al., 2016 BMC

Genomics)

Facilita la bioinformática

Método con mayor futuro??


Sequence CaptureBioinformatics

Transcriptoma secuenciado

970 baits (targets)

Blast, RepeatMasker

353 tolerancia sequia,aquaporinas y ABA

617 non-synonimousSNPs (subspecies)

Genomic DNA:Sonication + Illumina’s TruSeq Nano DNAHybrid Capture:MyBaits protocol v.212 ciclos PCR post-captura89 muestras:1 línea Illumina HiSeq 2000

Illumina CASAVA pipeline


Sequence CaptureBioinformatics

FastQC – Calidad de secuencias (alta, no necesidad de “trimming”)

BWA – Mapeo de secuencias al transcriptoma de referencia

Default settings – Ficheros indexados SAM de referencia

Picard tools – comprimir ficheros SAM, ordenar secuencias y marcar duplicados

SAMtools ‘mpileup’– variant calling, output genotype probabilities in VCF files

bcftools ‘call’ – merge VCF files and call genotypes

VCFTools – Filtrar SNPs por frecuencia y % datos perdidos

PLINK LD filtering tool – Filtrar SNPs por LD

GENODIVE – Filtrar SNPs con Fis negativa (parálogos?)

Genética de Poblaciones


Gracias!!

Yoel Beovides INIVIT, Cuba · 2018. 9. 17. · Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales ,...

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