Western blotting, inmunoblotting o SDS-PAGE
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Western blotting, Western blotting, inmunoblotting o SDS-PAGEinmunoblotting o SDS-PAGE
Tecnica para detectar proteinas especificas separadas por electroforesis utilizando anticuerpos marcados.
Secuencia del Western blotSecuencia del Western blotElectroforesis de la muestra con las proteinasElectroforesis de la muestra con las proteinas
Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosaTransferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa
Coloracion de las proteinas para confirmar transferenciaColoracion de las proteinas para confirmar transferencia
Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la membrana de nitrocelulosamembrana de nitrocelulosa
Incubacion con el anticuerpo especifico primarioIncubacion con el anticuerpo especifico primario
Lavados del anticuerpo no unido Lavados del anticuerpo no unido
Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP)a perroxidasa de rabano picante (HRP)
Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas radiograficas radiograficas
Secuencia del Western blot – Paso 1Secuencia del Western blot – Paso 1Paso 1Electroforesis de las muestras de proteínas:
-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S--El SDS aporta cargas negativas-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gel de acuerdo a su peso molecular
Proteínas ya corriendo en el gel
Fuente de poder
Muestra de proteínas para cargar en el gel
Secuencia del Western blot – Paso 2Secuencia del Western blot – Paso 2Paso 2 - Transferencia a la membrana de nitrocelulosa:-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas
Cassette listo para iniciar transferenciaArmado del cassette de transferencia
El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia
Se quitan las burbujas para asegurarla correcta transferencia
Se detiene la corrida electroforeticaSe desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar
el gel con las proteinas separadas por masa
Paso 3Incubación con anticuerpos específicos y revelado:
Proteína sobre la membrana
Bloqueo de los sitios no ocupados en la membrana con proteína inerte (ej. Albúmina)
Incubar con anticuerpo primario
Incubar con anticuerpo secundario marcado con HRP
Incubar con sustrato especifico
Proteína de interes se ve como una banda oscura
Revelado quimioluminiscente
Paso 4Revelado y análisis:
Fundamento de la tecnica de revelado quimioluminiscenteFundamento de la tecnica de revelado quimioluminiscente
-El anticuerpo secundario estamarcado con HRP (peroxidasa)que en presencia de agua oxigenada degrada el luminol con emisión de luz
-La emisión de luz (fotones)se revela en oscuridadsobre una placa radiográfica sensible a la luz
-Las bandas se obtienen en el filmen la misma posición dondese encontraba la proteína
-Alta sensibilidad
Existen otras tecnicas de revelado de WBExisten otras tecnicas de revelado de WB
sustratosustrato enzimaenzima H2O2H2O2 productoproducto
coloreadocoloreado
quimioLumquimioLum ObsObs
luminolluminol HRPHRP sisi nono sisi muy sensiblemuy sensible
3,3´diaminobencidina3,3´diaminobencidina HRPHRP sisi marrónmarrón nono toxicotoxico
DAB+niquelDAB+niquel HRPHRP sisi negronegro nono toxico, mas toxico, mas sensible que sensible que
DABDAB
3,3´,5, 5´ 3,3´,5, 5´ tetrametilbencidinatetrametilbencidina
HRPHRP sisi azulazul nono producto producto semisolublesemisoluble
4 cloro naftol4 cloro naftol HRPHRP sisi azul-negroazul-negro nono poco poco sensiblesensible
Bromocloroindolil Bromocloroindolil fostato +NBTfostato +NBT
FALFAL nono azulazul nono reaccion reaccion lenta y lenta y
progresivaprogresiva
Naftol-AS-MX fosfato Naftol-AS-MX fosfato + Fast red+ Fast red
FALFAL nono rojorojo nono poco poco sensiblesensible
AP/misty purpleAP/misty purple FALFAL nono purpurapurpura nono muy establemuy estable
HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina
Utilizacion de WB en la clinica: Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIVConfirmacion de diagnostico de HIV
Commercial Methods in Clinical Microbiology. 2000. ASM Press.
env gp160gp120gp 41
gag p55p18p24
pol p65p51p31
-Se corren proteínas de HIV
-Se transfieren a nitrocelulosa
-Se incuba la membrana con suerodel paciente
-Se revela con anticuerpos secundarios
Utilizacion de WB en la clinica: Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIVConfirmacion de diagnostico de HIV
env gp160gp120gp 41
gag p55p18p24
pol p65p51p31
Criterio de la OMS:
-Negativo: Ninguna banda presente-Positivo: Dos bandas ENV presentes-Indeterminado: Cualquier banda que no alcance criteriode positividad
Utilizacion de WB en la clinica: Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIVConfirmacion de diagnostico de HIV
Seroconversion de un pacienteSeroconversion de un paciente
gp160/120
p66p55/51gp41
p32
p24
p17