VIỆN HOÁ HỌC - Trang chủ - Viện Hóa Học gop moi TV-TA.pdf · Viện Hóa học đã...

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC ------------

LÊ THỊ HỒNG NHUNG

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI THÔNG LÁ DẸT (PINUS KREMPFII LECOMTE) VÀ NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS L. MERR.).

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng có ai công bố trong các công trình

nghiên cứu trước đây.

Tác giả luận án

Lê Thị Hồng Nhung

3

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi

đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng

như đồng nghiệp, bạn bè và người thân.

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến PGS. TS. Trịnh

Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận

lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận

án.

Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Trần Văn Sung đã tạo điều kiện tốt

nhất để tôi được học tập, nghiên cứu tại Phòng Tổng hợp hữu cơ và cũng là người

đã ủng hộ tôi thực hiện luận án này.

Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ –

Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành

bản luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã

giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương

trình đào tạo.

Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội

cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời

gian học tập.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng

nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày……. tháng…… năm 2014

Tác giả luận án

4

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ………….……………………………….………... v

DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………….……..........vi

DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………..…... iix

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………ix

MỞ ĐẦU………….……………………………….………………..…...……… 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3

1.1. Tổng quan về hai loài nghiên cứu .............................................................. 3

1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) .............................................. 3

1.1.1.1. Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt ................................................. 3

1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu loài Thông lá dẹt ............................................ 4

1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pinus ... 5

1.1.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) ....................... 8

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương ......................................... 8

1.1.2.2. Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương ............... 9

1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu của loài Ngũ gia bì hương .............................. 9

1.2. Các hợp chất flavonoid ............................................................................ 14

1.2.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 14

1.2.2. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 16

1.3. Các hợp chất triterpene khung lupane ................................................... 19

1.3.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 19

1.3.2. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 19

1.4. Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính sinh

học của chúng .................................................................................................. 22

1.4.1. Chuyển hóa nhóm OH ............................................................................. 22

1.4.1.1. Chuyển hóa thành ester .................................................................. 22

1.4.1.2. Chuyển hoá thành ketone, acid, oxime, amine ................................ 24

1.4.1.3. Chuyển hóa thành carbamate ......................................................... 26

1.4.2. Chuyển hoá nhóm isopropenyl ................................................................ 27

5

1.4.2.1. Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) ............................................................... 27

1.4.2.2. Oxy hoá nối đôi ∆ 20(29) .............................................................. 28

1.4.2.3. Chuyển hoá ở vị trí allyl của nối đôi .............................................. 28

1.4.3. Chuyển hóa nhóm 28-COOH .................................................................. 29

1.4.3.1. Chuyển hóa thành ester .................................................................. 29

1.4.3.2. Chuyển hóa thành amide ................................................................ 30

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU ................................................................................................................. 32

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị ............................................................. 32

2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 32

2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 32

2.1.3. Thiết bị .................................................................................................... 32

2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 33

2.2.1.Phương pháp chiết tách ........................................................................... 33

2.2.1.1. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Thông lá dẹt ..................... 33

2.2.1.2. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương ............. 34

2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc ................................................................ 34

2.2.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ................................................ 35

2.2.3.1. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis ........................................ 35

2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ................................................................ 35

2.2.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................. 37

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 39

3.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) ........................................... 38

3.1.1. Cặn chiết n-hexane .................................................................................. 40

3.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc) .............................................................. 40

3.1.2.1. Phân lập chất .................................................................................. 40

3.1.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 42

3.1.3. Cặn chiết n-buthanol (n-BuOH) .............................................................. 43

3.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) ................ 45

3.2.1. Phân lập các hợp chất từ loài Ngũ gia bì hương ..................................... 45

6

3.2.1.1. Quá trình phân lập.......................................................................... 45

3.2.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 48

3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của hai chất AT1, AT2 ....................................... 48

3.2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 ............................................. 48

3.2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 ............................................. 57

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 64

4.1. Kết quả từ loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte).......................... 64

4.1.1. Thành phần hóa học của cặn n-hexane ................................................... 64

4.1.2. Các chất phân lập được từ cặn EtOAc .................................................... 65

4.1.2.1. Tectochrysin (PK1) ....................................................................... 65

4.1.2.2. Pinostrobin (PK2) .......................................................................... 68

4.1.2.3. Pinobanksin (PK3) ........................................................................ 71

4.1.2.4. Galangin (PK4) ............................................................................. 75

4.1.2.5. Strobopinin (PK5) ......................................................................... 78

4.1.2.6. Crytostrobin (PK6) ........................................................................ 82

4.1.3. Chất phân lập được từ cặn chiết n-BuOH ............................................... 85

4.2. Kết quả từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L. Merr.) . 92

4.2.1. Các hợp chất được phân lập và xác định từ loài Ngũ gia bì hương. ........ 92

4.2.1.1. 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1) ...... 92

4.2.1.2. 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) ......... 95

4.2.1.3. 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) .......... 98

4.2.2. Các dẫn xuất chuyển hóa hóa học của hợp chất AT1, AT2 ................... 105

4.2.2.1. Các dẫn xuất của AT1 .................................................................. 106

4.2.2.2. Các dẫn xuất của AT2 ................................................................ 112

4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và chuyển hóa hóa học.117

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ....................................................................... 117

4.3.2. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis ................................................ 119

4.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa ........................................................................ 120

BẢNG TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN HÓA HOÁ

HỌC TỪ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU………….…....…..................... 122

7

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 128

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................. 130

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ........... 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 133

PHỤ LỤC

8

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3β-OH tạo các hợp chất

56.1–56.8

22

Sơ đồ 1.2 Ester hoá betulinic acid ở vị trí 3β-OH tạo hợp chất 57 23

Sơ đồ 1.3 Chuyển hóa nhóm 3β-OH, 28-OH của betulin 23

Sơ đồ 1.4 Chuyển hóa nhóm 28-OH của betulin tạo dẫn xuất 64, 65 24

Sơ đồ 1.5 Chuyển hoá nhóm 3β-OH của betulinic acid thành ketone,

oxime, amine.

25

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp acid betulinic từ betulin 25

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp các dẫn xuất carbamate của betulinic acid 26

Sơ đồ 1.8 Chuyển hóa các dẫn xuất carbamate của betulin 27

Sơ đồ 1.9 Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid 27

Sơ đồ 1.10 Oxi hóa nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid 28

Sơ đồ 1.11 Chuyển hóa vị trí allyl của nối đôi tạo hợp chất 85- 87 29

Sơ đồ 1.12 Tổng hợp một số dẫn xuất este của 23-hydroxy betulinic acid 30

Sơ đồ 1.13 Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid 31

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết rễ Thông lá dẹt 39

Sơ đồ 3.2 Phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt 41

Sơ đồ 3.3 Phân lập chất PK7 từ cặn chiết n-BuOH của rễ Thông lá dẹt 44

Sơ đồ 3.4 Quy trình chiết mẫu Ngũ gia bì hương 45

Sơ đồ 3.5 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichlorometan của loài

Ngũ gia bì hương

47

Sơ đồ 4.1 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 106

Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 112

9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt 4

Hình 1.2 Hình ảnh về loài Ngũ gia bì hương 8

Hình 1.3 Vòng benzopyrano của hợp chất flavonoid 14

Hình 4.1 Phổ khối ESI-MS (positive) của chất PK1 67

Hình 4.2. Phổ 1H-NMR của chất PK1 (500 MHz, DMSO-d6) 67

Hình 4.3 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK1 (125 MHz, DMSO-d6) 68

Hình 4.4 Phổ 1H-NMR của chất PK2 (500 MHz, CD3OD) 70

Hình 4.5 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK2 (500 MHz, CD3OD) 70

Hình 4.6 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK2 (125 MHz, CD3OD) 71

Hình 4.7 Phổ khối FT-IR của chất PK3 73

Hình 4.8 Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK3 73



Hình 4.11 Phổ 13C-NMR của chất PK3 (125 MHz, CD3OD) 75

Hình 4.12 Phổ ESI-MS (positive ion) của chất PK4 77

Hình 4.13 Phổ 1H-NMR của chất PK4(500 MHz, CD3OD) 77

Hình 4.14 Phổ 13C-NMR của chất PK4 (125 MHz, CD3OD) 78

Hình 4.15 Phổ FT-IR của chất PK5 80



Hình 4.18 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK5 (125 MHz, CD3OD) 82

Hình 4.19 Phổ 1H-NMR của chất PK6 (500MHz, CD3OD) 84

Hình 4.20 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK6 (500MHz, CD3OD) 84

Hình 4.21 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK6 (125MHz, CD3OD) 85

Hình 4.22 Một số tương tác chính trong phổ HMBC của chất PK7 86

Hình 4.23 Một số tương tác chính trong phổ NOESY của chất PK7 87

Hình 4.24 Chất burselignan (PK7a) 87

10

Hình 4.25 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất PK7 88

Hình 4.26 Phổ 1H NMR của chất PK7 (500 MHz, CD3OD) 89

Hình 4.27 Phổ 13C và DEPT của chất PK7 (125 MHz, CD3OD) 89

Hình 4.28 Phổ HSQC của chất PK7 90

Hình 4.29 Phổ HMBC của chất PK7 90

Hình 4.30 Phổ NOESY của chất PK7 91

Hình 4.31 Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất AT1 94

Hình 4.32 Phổ 1H-NMR của chất AT1 (500 MHz, CDCl3) 94

Hình 4.33 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT1 (125MHz, CDCl3) 95

Hình 4.34 Phổ ESI-MS (positive ion) của chất AT2 97

Hình 4.35 Phổ 1H-NMR của chất AT2 (500 MHz, CDCl3) 97

Hình 4.36 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT2 (125MHz, CDCl3) 98

Hình 4.37 Các tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3 100

Hình 4.38 Phổ FT- IR của chất AT3 101

Hình 4.39 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất AT3 101

Hình 4.40 Phổ 1H-NMR của chất AT3 (500 MHz, CD3OD) 102

Hình 4.41 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất AT3 (500 MHz, CD3OD) 102

Hình 4.42 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT3 (125 MHz, CD3OD) 103

Hình 4.43 Phổ HSQC của chất AT3 103

Hình 4.44 Phổ HMBC của chất AT3 104

Hình 4.45 Phổ COSY của chất AT3 104

11

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi

Pinus

6

Bảng 1.2 Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi

Pinus

7

Bảng 1.3 Một số khung flavonoid thường gặp 15

Bảng 3.1 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT6, AT7 50

Bảng 3.2 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT10 – AT12 52



Bảng 4.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của cặn chiết n-

hexane bằng phương pháp GC-MS

64

Bảng 4.2 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK1 và tectochrysin 66

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK2 và pinostrobin 69

Bảng 4.4 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK3 và số liệu của pinobanksin 72

Bảng 4.5 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK4 76

Bảng 4.6 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK5 và (2S)-Strobopinin 79

Bảng 4.7 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK6 và (2S)-Cryptostrobin 83

Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK7, (+)-Isolariciresinol và

Burselignan

87

Bảng 4.9 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của AT1 và 24-nor-11α-hydroxy-

3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid

93

Bảng 4.10 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của AT1 và 24-nor-3α,11α

dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid

96

Bảng 4.11 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của AT3 (CD3OD, 500/125MHz) 99

Bảng 4.12 Kết quả hoạt tính gây độc tế bào 117

12

Bảng 4.13 Kết quả hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 119

Bảng 4.14 Kết quả hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH 120

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-

NMR

Carbon -13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

Phổ DEPT

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Correlation

Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt

nhân

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt

nhân 1H-1H-

COSY

1H-1H- Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H

ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass

Spectroscopy

Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử

HR-ESI-

MS

High Resolution Electron Spray

Ionization Mass Spectroscopy

Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng

phun mù điện tử

FT-IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

s singlet

d doublet

t triplet

q quartet

dd doublet of doublet

dt doublet of triplet

br broad

m multiplet

J (Hz) Hằng số tương tác (Hz)

13

δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính

bằng ppm (phần triệu)

CC Column Chromatography Sắc ký cột

SKLM Sắc ký lớp mỏng

KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô

Hep-G2 Hepatocellular carcinoma human

Ung thư gan người

MCF-7 Adeno carcinoma Ung thư vú

Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi

RD Human rhabdomyosarcoma Ung thư màng tim

TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-

acetate

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm

EC50 Effective concentration 50% Liều có hiệu quả trên 50% tế bào thử

nghiệm

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

Ac CH3CO- Acetyl

Me -CH3 Methyl

Bu -C4H9 Butyl

Et -C2H5 Ethyl

DMSO Dimetylsunfoxit

TMS Tetrametyl Silan

4-DMAP 4-dimetylaminopyridin

THF Tetrahydrofuran

TEA Triethylamine

AZT Azidothymidine

TBDPSCl Tert-Butyldiphenylchlorosilane

DIBALH Diisobutylaluminium hydride

EDCI 1-Ethyl-3-(3-

14

dimethylaminopropyl)carbodiimide

PL Phụ lục

rt Room temperature Nhiệt độ phòng

H hiệu suất phản ứng

Rf Retention factor

[αD] Năng suất quay cực

LSP Lượng sản phẩm

CTPT Công thức phân tử

KLPT Khối lượng phân tử

16

MỞ ĐẦU

Y học cổ truyền phương Đông có một lịch sử lâu đời và là một kho tàng y

dược phong phú từ hàng nghìn năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học

kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền đang có những đóng góp to

lớn vào việc phòng và chữa bệnh, làm tăng tuổi thọ của con người và nâng cao chất

lượng cuộc sống. Nhiều hợp chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên được sử dụng

làm thuốc có hiệu quả như atermisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua

L.) làm thuốc chống sốt rét diệt thể phân liệt, taxol từ cây Thông đỏ (Taxus

Cuspidata) được sử dụng làm thuốc chống ung thư…Ngoài ra, người ta còn có thể

sử dụng dịch chiết của thảo dược làm thực phẩm chức năng trong việc hỗ trợ chữa

bệnh như dịch chiết từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) là thuốc điều

trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) ở nam giới và u xơ tử cung ở

nữ giới, hay gần đây là sản phẩm từ dịch chiết của 7 loại thảo dược quý (Khổ qua,

Dây thìa canh, Hoài sơn, Sinh địa, Thương truật, Linh chi và tảo Spirulina) có khả

năng điều trị đái tháo đường… Với những kết quả đạt được cho thấy việc nghiên

cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và

thực tiễn cao, đặc biệt ở Việt Nam, một nước có thảm thực vật phong phú, có nguồn

tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá.

Ngoài việc phân lập các hợp chất trong thiên nhiên, các nhà khoa học còn

tiến hành chuyển hóa hóa học từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu nhằm tạo ra các

hoạt chất mới có hoạt lực cao hơn, ưu việt hơn, độc tính thấp hơn. Đây cũng là một

phương pháp để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, định hướng cho ngành

hóa dược. Theo thống kê dựa vào đơn thuốc ở Mỹ công bố cho thấy trên 50% loại

thuốc được kê đơn chứa các hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp

dựa vào cấu trúc của các hợp chất tự nhiên.

Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thuộc chi Pinus, họ Pinaceae.

Loài này mới chỉ có một công bố duy nhất trên thế giới từ năm 1966 và là một thực

vật đặc hữu của Việt Nam, “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót lại cho đến ngày nay.

17

Việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt

ngoài ý nghĩa về khoa học còn có ý nghĩa rất lớn về mặt xã hội.

Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae. Ngay từ những năm 80 của thế kỷ trước, đã có nhiều công trình công bố về thành phần hóa học của cây này. Nhiều hợp chất triterpene acid có khung lupan với hàm lượng khá cao đã được phân lập và xác định. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công trình khoa học nào về nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất triterpene từ cây này được công bố.

Trên nền tảng đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hóa học và thăm

dò hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) và Ngũ

gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)”.

Mục tiêu của luận án:

1. Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii

Lecomte)

2. Nghiên cứu chiết tách các chất, đặc biệt là các triterpene khung lupane có

hàm lượng cao từ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) để làm

nguyên liệu cho quá trình chuyển hóa.

3. Tổng hợp các dẫn xuất từ các triterpene phân lập được

4. Khảo sát hoạt tính sinh học như khả năng kháng chủng Bacillus subtilis, khả

năng gây độc với một số dòng tế bào ung thư, khả năng chống oxi hóa của các dịch

chiết và các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu

ứng dụng các hợp chất này trong công nghệ hóa dược.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

18

1.1. Tổng quan về hai loài nghiên cứu

1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)

1.1.1.1. Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt

Thông lá dẹt hay còn được gọi là Thông hai lá dẹt hay Thông lá dẹp, Thông

Sré (Pinus krempfii, tên đồng nghĩa là Ducampopinus krempfii (Lecomte) A. Chev),

thuộc chi Pinus, họ Thông Pinaceae. Loài này được ví như “sứ giả thời tiền sử” -

sinh cùng thời với khủng long, là một thực vật cổ “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót

lại cho đến ngày nay. Hiện tại, Thông hai lá dẹt được xếp ở loài hiếm, mức độ đe

dọa có thể bị tuyệt chủng (bậc R) do nạn săn lùng của sơn tràng và do môi trường

sống của chúng (rừng) bị thu hẹp đáng kể. Loài thông cổ với đặc trưng là có hai lá

dẹt hình lưỡi kiếm, là loài đặc hữu của Việt Nam, nó phân bố hẹp ở tỉnh Lâm Đồng

và đây là loài thông được nhiều nhà thực vật học trên thế giới hết sức quan tâm [1],

[2], [3], [4].

Thông lá dẹt là những cây đại thụ cao trên dưới 30m, đường kính có thể đạt

1,5-1,6m, đôi khi tới 2m. Tán của cây thường khá rộng, dày, sẫm màu và có hình rẻ

quạt. Đoạn thân dưới cành lớn, hầu như không có cành nhánh, tròn đều và đâm

thẳng vào tán lá. Cây mầm thường có khoảng 10-13 lá mầm đầu tiên có hình xoắn

cong về một hướng như lưỡi liềm, lá dài khoảng 2-3cm, sau đến là các lá nhỏ mọc

quanh thân, dài 1,5-2,5cm. Khi cây ở độ tuổi non (5-20 tuổi), lá dài và rộng bản (dài

10-15cm) hơn lá cây trưởng thành, xếp như hai lưỡi kéo ở phần đầu cành. Khi cây

trưởng thành, lá nhỏ và ngắn lại (dài 4-5cm), màu sẫm, mọc thành búi dày ở đầu

cành, làm cho tán cây thông già trở nên dày và sẫm màu hơn [3].

Hạt màu nâu nhạt và có cánh trắng khi chín, hạt có thể phát tán trong một

phạm vi tương đối rộng và nón quả còn tồn tại một thời gian trên cây. Quả chín vào

mùa mưa.

19

Hình 1.1. Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt

(lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam)

Trong công trình Thực vật học đại cương của Đông Dương, Hickel cho biết

thông lá dẹt thường gặp ở độ cao 1200 - 1500m và cây mọc thành quần thụ lớn. Ở

Việt Nam, Thông lá dẹt phân bố chính ở Lâm Đồng, song nơi dễ tiếp cận nhất là

vùng Cổng Trời, trên dãy Hòn Nga thuộc xã Lát, huyện Lạc Dương, cách thành phố

Đà Lạt 20km hoặc vùng núi Bidoup nằm trong khu bảo tồn thiên nhiên Thượng Đa

Nhim, địa phận Long Lanh, cách thành phố Đà Lạt 50km.

1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

loài Thông lá dẹt

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, mới chỉ có duy nhất một công trình

nghiên cứu về thành phần hóa học loài này của Holger Erdtman, Thụy Sĩ được công

bố vào năm 1966. Từ thân gỗ Thông lá dẹt thu tại Nha Trang, Việt Nam, 10 chất là

chrysin (5,7-dihydroxyflavone) (1), strobopinin (2), cryptostrobin (3),

demethoxymatteucinol (6,8-dimethylpinocembrin) (4), pinosylvin (5), pinosylvin

monomethylether (6), tectochrysin (7), pinobanksin (8), pinocembrin (9),

pinostrobin (10) đã được nhóm nghiên cứu này phân lập và nhận dạng [4]. Điều thú

20

vị là tất cả các hợp chất này đều thuộc nhóm flavanoid. Trong đó, các hợp chất C-

methyl flavanoid như 2, 3, 4, 8, 9 là các hợp chất có cấu trúc thú vị [4],[5]:

RO

HO

5: R = H6: R = Me

O

O

HO

OH

H

R

H

8: R = OH9: R = H

OOH

O O

7

OOH

O O

10

O

O

HO

OH1

O

O

HO

OH

H

H

H

2

H3C

O

O

HO

OH

H

H

H

4

H3C

CH3

Bên cạnh đó, thành phần chính của nhựa gỗ được xác định là dehydroabietic

acid và của tinh dầu là các monoterpenoid, thành phần đặc trưng có mặt trong hầu

hết tình dầu của các loài thông, đặc biệt là α- và β-pinen.


của chi Pinus

Trong khi loài Thông lá dẹt mới chỉ được nghiên cứu rất ít thì có nhiều loài

thuộc chi Pinus lại có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh

học đã được công bố và cho thấy có nhiều điều thú vị ở chi này. Theo thống kê trên

thế giới đến năm 2012 có trên 450 hợp chất được phân lập từ hơn 80 loài thuộc chi

21

Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpene (diterpene

khung abietane, cembrane; lignan; steroid….), phenol, flavonoid và flavonoid

glycoside [5], [6].

Hầu hết các loài thông đều có chứa tinh dầu và nhựa. Thành phần chính là

các acid thuộc khung abietane, pimarane và monoterpenoid đặc trưng như α,β-

pinene, có thể còn có β- phellandrene (P. contorta, P. banksiuna). Tuy nhiên, ở một

số loài P. sylvestris, P. albicaulis lại thấy có sự xuất hiện của sesqui- và diterpene

như (+)-δ-cadinene, (-)-torreyol. Đặc biệt, loài P. jefieyi có thể sản sinh ra loại nhựa

mà thành phần chính của nó là n-heptane, một hợp chất không có sự liên quan nào

đến các hợp chất terpene.

torreynol

H

H

H

OH

Bảng 1.1. Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi Pinus

Một điều thú vị là thân gỗ của hầu hết các loài Pinus nghiên cứu đều có chứa

các hợp chất flavonoid như pinosylvin (5), pinobanksin (8), pinocembrin (9), và các

dẫn xuất monomethyl của chúng. Ngoài ra, phần lớn các hợp chất xác định được từ

chi này là các hợp chất terpene như thunbergene được phân lập từ hai loài P.

22

thunbergii, P. Albicaulis và lambertianic, communic acid – hai diterpene khung

labdane có mặt trong các loài P. lambertiana, P. Elliottii tương ứng. Từ hạt của P.

sylvestris, hai diterpene acid khung labdane là pinifolic và dehydropinifolic acid

cũng được phân lập. Một chất mới thuộc nhóm này, anticopalic acid đã được tìm

thấy trong dịch chiết từ vỏ cây và gỗ của loài thông trắng P. monticola.

Bảng 1.2. Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi Pinus

Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi này

cũng được công bố.

Hoạt tính sinh học của các loài này được các nhà khoa học đánh giá cao là

khả năng chống oxi hóa. Từ vỏ của loài P. radiata và P. pinaster đã phân lập được

procyanidin, catechin và gallic acid - các hợp chất được biết đến với khả năng

chống oxi hóa [7], [8], [9]. Trong một công trình công bố năm 2012 của Osman

Ustun cho thấy tinh dầu của năm loài P. brutia, P. halepensis, P. nigra, P. pinea và

P. sylvestris đều cho hoạt tính chống oxi hóa [10].

Năm 2012, Ipek Suntar và cộng sự còn phát hiện khả năng chống viêm của

23

tinh dầu một số loài thuộc chi này như P. brutia Ten., P. halepensis Mill., P. nigra

Arn., P. pinea L. và P. sylvestris L. [11].

Ngoài ra, tinh dầu của một số loài khác như P. halepensis Mill., P.

densiflora, P. thunbergii, P. rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt

[12], [13].

1.1.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương

Ngũ gia bì hương có tên khoa học là Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.,

thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae. Cây bụi trườn, vươn cao hay dài đến 2-7m,

có phân cành,vỏ lúc non màu xanh, khi già

màu nâu xám, có nhiều gai nhọn sắc; cuống dài

2,5-3,5 cm, có gai; 3-5 lá chét, từ hình trứng

thuôn có mép khía răng khô đến hình thuôn dài

ở mép có gai nhọn (var. setosus Li), lá chét

giữa thường lớn hơn các lá chét bên; kích

thước lá chét thường 4-8 x 1,5-3 cm. Cụm hoa

dạng chùm tán, mọc ở đầu cành; hoa màu vàng

ngà hay trắng ngà, có cuống mảnh, dài 0,7-1

cm. Đài 5, nhỏ; cánh hoa 5 hình tam giác tròn

đầu. Nhị 5, chỉ nhị dài hơn cánh hoa. Bầu 2 ô,

đầu nhụy chẻ đôi. Quả hình cầu, hơi dẹt, khi

chín màu tím đen. 1-2 hạt nhỏ. Vỏ thân, vỏ rễ

và lá vò nát có mùi thơm đặc biệt [14], [15],

[16].

Hình 1.2. Hình ảnh về loài Ngũ

gia bì hương [14]

Ngũ gia bì hương phân bố ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, các nước Đông

Dương cho tới Philippin. Ở Việt Nam có gặp ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Cao

Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Hòa Bình. Mọc ở rừng rậm nhiệt đới thường xanh mưa

mùa ẩm, ở độ cao 200 - 1500m. Cây thích nghi ở ven suối, vách đá ẩm, ven đường

24

mòn. Lúc nhỏ ưa bóng và ẩm, khi lớn ưa sáng và có thể sống trong điều kiện khắc

nghiệt về đất đai và khí hậu. Tái sinh bằng chồi, rễ và giâm cành. Mùa hoa tháng 7 -

9; mùa quả chín tháng 12.

1.1.2.2. Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương

Trong y học, loài này được dân gian sử dụng để chữa nhiều loại bệnh khác

nhau. Vỏ, rễ, thân, lá làm thuốc bổ, tăng lực, mạnh gân cốt, kích thích tiêu hóa, ăn

ngon miệng, ngủ tốt, chữa đau nhức xương, mỏi gối, đau lưng, thấp khớp, ho, cảm

mạo, viêm ruột, đi tả, sỏi thận.

Vỏ được coi như một vị thuốc bổ. Nước sắc và rượu chế từ vỏ cây được dùng

phổ biến làm thuốc bổ nâng cao sức của các cơ, tăng trí nhớ, ngoài ra còn dùng làm

thuốc chữa bệnh phụ khoa, chữa đàn ông liệt dương, chữa các bệnh dạ dày, nhất là

nó còn có hiệu lực để chữa bệnh chậm lớn của trẻ em. Vỏ ngâm rượu cũng dùng

chữa bệnh tê thấp.

Rễ và cành lá dùng chữa: 1. Cảm mạo sốt cao, ho, đau ngực; 2. Đau lưng,

phong thấp đau nhức khớp; 3. Đau dạ dày, viêm ruột, đau bụng tiêu chảy; 4. Vàng

da, viêm túi mật; 5. Sỏi niệu đạo, bạch đới; 6. Gãy xương, viêm tuyến vú. Dùng 30 -

60g, sắc uống; 7. Dùng ngoài chữa đòn ngã, eczema, mụn nhọt và viêm mủ da. Rễ

tươi và lá được giã đắp ngoài hoặc nấu nước rửa, tắm.

Cành nhỏ nấu lên rửa, tắm chữa ngứa, ghẻ. Rễ và lá của nó cùng với hoa cúc

trắng giã nhỏ đắp mụn nhọt và nứt kẽ chân cũng có công hiệu [14], [15], [16].


của loài Ngũ gia bì hương

Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

loài cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) đã được các nhà

khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam công bố.

a. Thành phần hóa học

Các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất thuộc nhóm chất triterpene

đã được tìm thấy từ loài cây này.

25

Năm 1971, các nhà khoa học của Đại học Quốc gia Đài Loan đã nghiên cứu

về thành phần của loài này thu hái ở Taipei - Đài Loan. Từ dịch chiết MeOH, các

hợp chất (1,2,3,4,5,6)-cyclohexanehexol (scyllitol, 11) và myo-inositol (12) đã được

phân lập. Cũng chính từ cặn chiết này khi hòa tan trong nước và chiết phân lớp với

benzene nhóm tác giả đã phân lập được taraxerol (13), β-sitosterol (14), các ankan

C29 – C33, hai rượu béo triacontanol (15) và dotriacontanol (16) [17].

Từ lá của loài này thu hái gần Hà Nội, Ph.D.Ty và cộng sự đã phân lập và

xác định được năm triterpene acid khung lupane mới 17-21 là 3α,11α-dihydroxy-

23-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (17); 3α, 11α-dihydroxylup-20(29)-en-28-oic

acid (18); 30α, 11α,23-trihydroxylup-20(29)-en-28-oic acid (19) và hai hợp chất

nor-triterpene: 24-nor-3α, 11α-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid (20); 24-nor-

11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (21). Và cũng từ các chất phân lập

được, nhóm nghiên cứu đã tạo được 17 các dẫn xuất khác nhau bằng các phản ứng

este hóa, ankyl hóa,… [18], [19], [20].

26

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu Ph.D.Ty cũng đã xác định một cách tương đối

hàm lượng của một số triterpene khung lupane có trong loài này:

Tiếp tục nghiên cứu về loài cây này của Việt Nam, trong một số công bố gần

đây, Phan Van Kiem và các cộng sự cho thấy ngoài những hợp chất trên, trong loài

cây Ngũ gia bì hương thu hái ở miền Bắc Việt Nam còn chứa nhiều các hợp chất

khác như quercitrin (22), eleutheroside E (23), 1-(3-D-glucopyranosyl-2,6-

dimethoxy-4-propenylphenol (acantrifoside E) (24), 1-[β-D-glucopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-2,6-dimethoxy-4-propenylphenol (acantrifoside F)

(25), syringin (26), (2R,3R)-2,3-di-(3,4-methylenedioxybenzyl)-butyrolactone (27),

3α-acetoxy-30-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (acantrifoic acid A) (28),

3α-acetoxy-30-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid 28-O-α-L-

rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

(acantrifoside C) (29), 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid 28-O-

α-L-rhamnopyranosyl-(l→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl ester

(acantrifoside B) (30), ent-kaur-16-ene-19-oic acid (31), ent-pimara-8(14),15-dien-

19-oic acid (32). Trong đó, các chất 24, 25, 28, 29 và 30 là những hợp chất lần đầu

tiên phân lập được từ tự nhiên và chất 27 lần đầu tiên phân lập từ chi này [21], [22],

27

[23], [24], [25].

30

Bên cạnh đó, hai triterpene năm vòng thuộc khung taraxerane cũng được

nhóm nghiên cứu phân lập được từ loài này [21]:

28

Như vậy, các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Ngũ gia bì

hương (A. trifoliatus, họ Araliaceae) đã chỉ ra cây này có chứa nhiều triterpene, đặc

biệt là triterpene khung lupane và trong đó nhiều chất có hàm lượng cao.

b. Hoạt tính sinh học

Bên cạnh nghiên cứu về thành phần hóa học, Phan Van Kiem và cộng sự

cũng đã tiến hành nghiên cứu về hoạt tính của một dãy các chất được tách ra từ cây

này. Kết quả cho thấy, các chất 22, 28 có hoạt tính kháng MAO khá cao ngay cả ở

nồng độ thấp với các IC50 tương ứng là 0,12 và 0,18 mM. Các chất 31, 32 có hoạt

tính kháng enzim COX-1 với giá trị IC50 = 0,15 và 0,19 μg/ml, do đó có hoạt tính

kháng viêm rất tốt. Kiểm tra khả năng kháng vi khuẩn kiểm định, các chất 24, 31 lại

có thể kháng vi khuẩn Gr (+) là B. subtilis và chủng S. aureus. Đặc biệt hợp chất

phenylpropenyl glycosid mới, acantrifoside E (24) có hoạt tính kháng mạnh cả ba

dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư biểu mô người (KB) IC50 = 1,22 μg/ml,

tế bào ung thư màng tim người (RD) IC50 = 2,06 μg/ml, và tế bào ung thư gan người

(Hep-2) IC50 = 0,75 μg/ml [26].

Năm 2004, Xing Fu Cai và các cộng sự cũng tiến hành khảo sát hoạt tính

một số các hợp chất triterpene khung lupane có trong rễ loài A. koreanum. Kết quả

cho thấy impressic acid (20), hợp chất có trong loài A. trifoliatus với hàm lượng

lớn, thể hiện hoạt tính ức chế yếu tố sao chép (transcription factor) ở giá trị IC50 =

12,65 µM [27].

Ở một công bố mới nhất, năm 2013, một nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử

khả năng kháng viêm, chống phù nề ở chuột với ba dịch chiết n-hexane,

dichloroform, methanol của lá A. trifoliatus. Kết quả cho thấy, dịch chiết methanol

có khả năng chống viêm đáng kể, ở nồng độ cao nhất 500mg/kg thì có thể kháng

đến 77,24% [28]. Bên cạnh đó, một nhóm nghiên cứu khác lại tiến hành thử khả

năng cải thiện trí nhớ, chống trầm cảm với dịch nước từ lá loài này và cũng cho kết

quả tốt [29].

Từ các kết quả đã được công bố về hai loài nghiên cứu cho thấy thành phần

chính của chúng chủ yếu là các hợp chất flavonoid và triterpene khung lupane. Vì

29

vậy dưới đây là vài nét tổng quan về hóa học và hoạt tính sinh học của hai lớp chất

chính này từ hai cây nghiên cứu.

1.2. Các hợp chất flavonoid

Flavonoid là lớp hợp chất có cấu trúc phenolic, tồn tại phổ biến trong thực

vật. Có thể nói flavonoid được độc quyền hình thành trong thực vật (exclusively

produced in plants), chỉ có thực vật mới có khả năng sinh tổng hợp flavonoid và

được tìm thấy trong hầu như tất cả các loài thực vật nghiên cứu. Theo tính toán của

các nhà khoa học, mỗi năm có khoảng 2% lượng cacbon được thực vật quang hợp

(khoảng 109 tấn) được chuyển hóa thành các flavonoid và các hợp chất liên quan

[30]. Các hợp chất flavonoid được các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu từ những

năm 1940, đến nay có hơn 9000 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc,

hoạt tính sinh học. Thuật ngữ “Flavonoid” xuất phát từ chữ Latin flavus nghĩa là

màu vàng – màu sắc của phần lớn các hợp chất flavonoid. Tuy nhiên, một số hợp

chất có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc lớp này [31].

1.2.1. Cấu trúc hóa học

Flavonoid là những hợp chất tự nhiên có cấu tạo khung cacbon theo kiểu C6–

C3–C6 hay nói cách khác khung cơ bản gồm hai vòng benzene A, B nối với nhau

qua một mạch 3C. Trừ một số trường hợp mạch 3C hở như chalcone, đa số trường

hợp mạch 3C đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C chứa O như [32]:

Hình 1.3: Vòng benzopyrano của hợp chất flavonoid [31]

Dựa trên mức độ oxi hóa của mạch 3C và vị trí của gốc aryl (vòng B) liên kết

với vòng benzopyrano, người ta chia flavonoid thành các loại khác nhau như:

• Euflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl gắn ở vị trí C2 như anthocyanidin,

flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanone, 3-hydroxy flavone,

flavone flavonol, dihydro chalcone, chalcone, aurone.

30

• Isoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl gắn ở vị trí C3 như isoflavan, iso

flav-3-ene, isoflavan-4-ol, isoflavanone, isoflavone, rotenoid, pterocarpan,

coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon,

dihydroisochalcon, homo-isoflavone.

• Neoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl gắn ở vị trí C4. Nhóm hợp chất này

chỉ mới thấy giới hạn trong một số loài thực vật như 4-arylchroman, 4-aryl

couramin, dalbergion, 3,4-dihydro-4-arylcouramin, neoflavene.

Ngoài ra, người ta còn phân loại thành flavonoid, biflavonoid (những

flavonoid dimer), triflavonoid (cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid), flavonlignan

(những flavonoid mà phân tử có phần cấu trúc lignan).

Trong thực vật flavonoid tồn tại ở nhiều dạng nhóm thế khác nhau như thêm

nhóm hydroxyl, methyl hóa và quan trọng nhất là glycosyl hóa. Đôi khi, các nhóm

thế khác như vòng thơm, aliphatic acid, sunfate, prenyl, methylendioxy hay

isoprenyl cũng đính vào nhân flavonoid và các glycoside của chúng.

O

O

2

34

56

78

9

10

1'

3'

5'6'

2' 4'

A C

B

Flavone

O

OH Flavanol

Flavanone

Anthocyanidin

Isoflavone

Chalcone

Bảng 1.3. Một số khung flavonoid thường gặp

31

1.2.2. Hoạt tính sinh học

Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “những người thợ sửa chữa

sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại

các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung. Nhờ vậy

chúng mang lại những hoạt tính quý báu.

Có thể nói hoạt tính chống oxi hóa là hoạt tính đặc trưng của các hợp chất

flavonoid. Theo Rice-Avans và các cộng sự [33], khả năng chống oxi hóa có thể

được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng như: Trong phân

tử có chứa các nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường

hydro giúp các flavonoid có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các

gốc tự do; chứa các vòng thơm (vòng benzene, vòng dị nguyên tố) và các liên kết

bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp bền hóa các gốc tự do được hình

thành khi chúng bắt giữ các phần tử oxi hoạt động; chứa nhóm có thể tạo phức

chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra

các phần tử oxi hoạt động. Ví dụ, từ rễ loài Scutellaria baicalensis đã phân lập được

ba flavonoid chính là wogonin (5,7-dihydroxy-8-methoxyflavonoid) (35), baicalein

(5,6,7-trihydroxy-flavone) (36) và dẫn xuất 7-glucuronid của nó (baicalin) (37).

Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các chất này cho thấy baicalin có hoạt tính

chống oxi hóa tốt nhất (72%). Như vậy, việc gắn thêm một nhóm glucuronid tại C-7

làm cho khả năng chống oxi hóa tăng lên đáng kể [34].

Trong một nghiên cứu, Das và Pereira chỉ ra rằng trong phân tử flavonoid có

chứa các nhóm cacbonyl ở C-4 và liên kết đôi giữa C-2, C-3 thì có khả năng chống

oxi hóa cao như butein (38) [35]:

32

Rất nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy sự kỳ diệu của các hợp chất

flavonoid trong việc điều trị các căn bệnh ung thư. Hai flavones 39, 40 đã được tìm

thấy từ lá của loài Baeckea frutescens (Myrtaceae) có khả năng gây độc tế bào rất

mạnh (IC50 = 0,25μg/ml) đối với dòng tế bào bạch cầu (L1210) [36]:

Hoạt tính chống ung thư bằng cách thay đổi hình thái tế bào dẫn đến khả

năng ức chế sự phân bào của các dòng tế bào ung thư đã được tìm thấy ở các hợp

chất naringenin (41) và kaempferol 3-O-(2’’,6’’-di-O-p-trans-coumaroyl) glucosid

(42), phân lập từ hoa của loài Melastoma malabathricum trên dòng tế bào ung thư

vú (MCF-7) với các giá trị tương ứng là 0,28 và 1,3μM [37].

Bên cạnh đó, các hợp chất flavonoid còn cho thấy khả năng kháng virus

HIV. Baicalin (5,6,7-trihydroxy-flavon 7-glucuronide) (37) được phân lập từ cây

Scutellaria baicalensis có khả năng ức chế trực tiếp lên virus HIV; hay hai

biflavone là hinokiflavone (43) và robustafavone (44) có thể ức chế enzym phiên

mã ngược HIV-1 với IC50 = 65µM [38], [39].

33

Ngoài ra, các hợp chất flavonoid còn thể hiện các hoạt tính như kháng viêm,

kháng khuẩn, tiểu đường…Do sự gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường và các

biến chứng nguy hiểm mà căn bệnh này gây ra nên các hoạt tính của chúng đối với

căn bệnh tiểu đường đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Các kết quả

nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid tự nó có vai trò như chất kích thích insulin

hay bắt chước chức năng của insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hưởng đến hoạt

động của các enzym trong quá trình chuyển hóa đường…[40],[41]. Từ rễ của cây

Dorstenia psilurus (họ Dâu tằm, Moraceae), Tabopda và cộng sự đã phân lập được

hợp chất dạng prenyl flavonol dorsilurin F (45) có hoạt tính ức chế enzym α-

glucosidaza tốt với giá trị IC50 = 4,13μM. Đặc biệt, cũng với enzym α-glucosidaza,

một dẫn xuất của luteolin là 6-hydroxyluteolin (46) có thể ức chế đến 92% ở nồng

độ 500μM [42].

Từ cây Eysenhardtia platycarpa (họ Đậu, Fabaceae), 5,4,1”-trihydroxyy-6,7-

(3”,3”-dimethylchromano) flavone (47) đã được phân lập. Chất này có khả năng

chống lại sự tăng đường huyết ở chuột với liều lượng 30 mg/kg trọng lượng cơ thể

[43].

O

O

HO

OHOH

45

OH

O

O

HO

OH46

OH

HO

OH

O

OH

OH

O47

O

HHO

34

1.3. Các hợp chất triterpene khung lupane

1.3.1. Cấu trúc hóa học

Hợp chất triterpene khung lupane thuộc lớp chất triterpene (C30Hn) - được

tạo bởi 6 đơn vị isopren hợp với nhau bởi 2 mảnh C15 nối với nhau ở giữa theo

cách đầu - đầu, đuôi - đuôi [44]. Về mặt cấu trúc hóa học các triterpene khung

lupane có hệ năm vòng (6-6-6-6-5) với các nhóm thế thường là các nhóm metyl

ở các vị trí C-4α và β, C-8β, C-10β, C-14α, C-17β và nhóm thế isopropyl ở vào

vị trí C-19α.

Các triterpene khung lupane tồn tại tương đối phổ biến trong những loài

thực vật bậc cao. Triterpene khung lupane đầu tiên được tìm thấy ở trong vỏ hạt

đậu Lupin (Lupinus luteus), thuộc họ Leguminosae có chứa nhóm OH ở vị trí C-3,

chính vì điều này mà các hợp chất thuộc nhóm này có tên gọi là lupeol [45].

1.3.2. Hoạt tính sinh học

Trong quá trình nghiên cứu hợp chất thiên nhiên nói chung, các hợp chất

triterpene khung lupane nói riêng, các nhà khoa học đã thấy được những hoạt tính

quý báu của hợp chất thuộc nhóm triterpene khung lupane.

Lupeol (48) là hợp chất thuộc nhóm triterpene khung lupane có chứa trong

nhiều loài thực vật, trong các loại rau như bắp cải trắng, hạt tiêu, dưa chuột, cà

chua, trong trái cây như ô liu, quả sung, xoài, dâu tây, nho đỏ và trong cây thuốc

như nhân sâm Mỹ. Mohammad Saleem đã chứng minh được chất này có khả năng

chống viêm và ung thu rất tốt [46]. Ở một nghiên cứu gần đây của M.A. Fernandez

cho thấy lupeol có thể gây độc đối với các dòng tế bào Hep-G2, A-431, H-4IIE với

giá trị IC50 lần lượt là 77; 101; 77,6µM và khả năng chống oxi hóa cao. Chính vì

35

vậy, lupeol còn được ứng dụng trong mỹ phẩm bảo vệ da [47].

Tia cực tím là nguyên nhân phổ biến nhất của ung thư da. Hợp chất 3β, 25-

epoxy-3α-hydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid (49) được tìm thấy ở loài

Liquidamber styraciflua (họ Hamamelidaceae) có thể hoạt động như một khởi sự

chống khối u mạnh do UVB gây ra [48].

Hai hợp chất (+)-20(29)-lupene-3β,11α-diol (50) phân lập từ loài Salvia

deserta và (+)-1,11-dihydroxy-20(29)-lupene-3-one (51) từ loài Nepeta hindostana

(Labiatae) đều có khả năng kháng khuẩn cao, giảm mức cholesterol [45].

Hợp chất (+)-12,20 (29)- lupadiene-3β,27,28-triol (52) được phân lập từ loài

cây trúc đào (Nerium oleander), thuộc họ Apocynaceae có khả năng chống HIV và

khối u ác tính [49].

36

Acid 3α-hydroxy-lup-20(29)-ene-23,28-dioic (53) là một triterpene diacid

khung lupane có hàm lượng cao tới 7% trọng lượng lá khô của loài cây chân chim

(Schefflera octophylla), loài cây được dân gian dùng làm thuốc chữa bệnh về gan

[50].

Betulin hay 20(29)-lupene-3β,28-diol (54) là một chất đặc trưng cho khung

lupan, được phân lập lần đầu tiên vào năm 1988 từ loài Betula alba (Betulaceae).

Qua nhiều công trình nghiên cứu cho thấy chất này có mặt trong nhiều loài thực vật

thuộc các họ khác nhau và có nhiều hoạt tính như: hoạt tính gây độc tế bào, hoạt

tính chống HIV, có tác dụng bảo vệ gan và làm giảm khả năng gây độc của CdCl2 ở

nồng độ thấp [51].

Ngoài betulin (54), betulinic acid (55) cũng là một triterpene khung lupane

được tìm thấy từ nhiều loài Betula (Betulaceae). Ở nồng độ 5µM betulinic acid đã

ức chế đáng kể sự phát triển của TPA (2,5µg) khi được kích thích bởi 50µg hợp

chất 7,12-dimethylbenzanthracen [52]. Ngoài ra, theo tài liệu công bố năm 2013 của

K. Julius và các cộng sự, betulinic acid có khả năng chống oxi hóa cao với IC50 =

0,141μg/ml, đặc biệt khi kết hợp với acid ascorbic thì khả năng chống oxi hóa càng

tăng (IC50 = 0,037μg/ml) [53]. Tuy nhiên, betulinic acid được nhắc đến nhiều với

khả năng chống HIV cao, khả năng ức chế sự phiên bản của virus HIV trong tế bào

Lympo-H9 [54]. Hoạt tính cao và hàm lượng trong thực vật lớn nên 55 và các dẫn

xuất của chúng hiện đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu về mặt hóa

học, dược lý và đặc biệt là mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học [55],

[56].

37

1.4. Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính

sinh học của chúng

Với mục tiêu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, các nhà khoa học

đã tiến hành chuyển hóa hóa hóa học ở một số triterpene khung lupane có hoạt tính

sinh học cao. Đặc biệt các chất có khả năng chuyển hóa phong phú nhờ sự có mặt

của các nhóm OH, COOH, nối đôi Δ 20(29) trong phân tử như betulin, betulinic acid,

23-hydroxy betulinic acid…được quan tâm.

1.4.1. Chuyển hóa nhóm OH

1.4.1.1. Chuyển hóa thành ester

Có rất nhiều công trình khoa học đã chỉ ra rằng các dẫn xuất tạo ester ở vị trí

3β-OH của betulinic acid cho hoạt tính cao hơn hẳn so với hợp chất acid ban đầu

[57], [58]. Tiến hành phản ứng ester hoá trong pyridine với tác nhân tham gia phản

ứng là các acid anhydride hoặc các acyl chloride (Sơ đồ 1.1) và thử hoạt tính sinh

học các dẫn xuất, Kashiwada đã chỉ ra được 3-O-(3',3'-dimethylsuccinyl) betulinic

acid (56.6) có hoạt tính kháng HIV rất mạnh với giá trị EC50< 3,5 ×10-4 µM và độ

chọn lọc TI > 20000 trong trường hợp tế bào lymphô H9 bị nhiễm cấp [54].

Sơ đồ 1.1: Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3β-OH tạo hợp chất 56.1–56.8[54]

Theo một công bố gần đây, dẫn xuất 3-O-3’-Methylsuccinyl-betulinic acid

(57) được tổng hợp theo Sơ đồ 1.2 có khả năng chống HIV mạnh với giá trị EC50 =

0,0087 μM, thấp hơn rất nhiều so với betulinic acid (EC50 = 1,4 μM), thậm chí còn

thấp hơn cả AZT (EC50 = 0,034 μM). Ngoài ra, 57 có giá trị TI = 6,3 × 103, thấp

hơn so với bevirimat (TI= 20000), một loại thuốc đã được thử nghiệm lâm sàng

[54], [59].

38

Sơ đồ 1.2: Ester hoá betulinic acid ở vị trí 3β-OH tạo hợp chất 57 [54], [59]

Bên cạnh đó, nhóm các nhà khoa học người Nga, Oxana B. Kazakova cũng

chứng minh các dẫn xuất ester hóa ở vị trí C-3, C-28 của betulin (54) (Sơ đồ 1.3)

cũng cho hoạt tính sinh học đáng chú ý [60]. Cả hai hợp chất 58 và 59 đều có khả

năng kháng lại chủng virus ung thư cổ tử cung HPV-11. Ngoài ra, 58 còn có hoạt

tính bảo vệ gan, chống loét, chống viêm, hoạt tính điều hòa miễn dịch và hoạt tính

kháng HIV.

Sơ đồ 1.3. Chuyển hóa nhóm 3β-OH, 28-OH của betulin [60]

39

Theo Nguyễn Văn Tuyến và cộng sự, betulin được phản ứng với các acid

anhydride trong dung môi CH2Cl2, ở nhiệt độ phòng từ 23-26 giờ để tạo thành các

este 60, 61 [61]. Các ester tạo thành tác dụng với ethylclorua format, dung môi

CH2Cl2, xúc tác triethylamine ở 0oC trong 60 phút thu được hai sản phẩm 62, 63

tương ứng. Tiếp tục cho thêm triethylamine và AZT vào trong bình phản ứng và

khuấy ở 0oC trong 60 phút, sau đó nâng lên đến nhiệt độ phòng trong 12 giờ, nhận

được các hợp chất 64, 65 (Sơ đồ 1.4). Điều đáng chú ý là hai hợp chất lai AZT với

betulin (64, 65) đều có hoạt tính chống HIV cao hơn rất nhiều so với các thuốc

kháng HIV truyền thống như Zidovidin (AZT), Lamivudin (3TC), Stavudin (d4T)

với 0,1 µM < EC50 < 0,3µM.

Sơ đồ 1.4. Chuyển hóa nhóm 28-OH của betulin tạo dẫn xuất 64, 65 [61]

1.4.1.2. Chuyển hoá thành ketone, acid, oxime, amine

Đây là các chuyển hóa được quan tâm đến trong các dẫn xuất của betulinic

acid. Betulinic acid được oxy hoá bằng CrO3/pyridine thành ketone (66), sau đó sản

phẩm này phản ứng với hydroxylamine cho oxime (67), khử hoá 67 với NaBH4 cho

amine (68) (Sơ đồ 1.5) [62].

40

Sơ đồ 1.5: Chuyển hoá nhóm 3β-OH của betulinic acid

thành ketone, oxime, amine [62]

Trong một công bố năm 2013, C. B. Leopoldo và các cộng sự đã chỉ ra khả

năng chống ung thư của hợp chất betulonic acid (66) mạnh hơn rất nhiều so với

betulinic acid trên hầu hết các dòng tế bào được thử với IC50 từ 5,97 đến 14,0μM

[59].

Betulinic acid (55) ngoài được tìm thấy từ nhiều loài Betula (Betulaceae), nó

còn được bán tổng hợp từ betulin (54) qua hợp chất 3-oxo-betulinic acid (69) với độ

chọn lọc betulinic acid lên đến 85% và 15% còn lại là 3-epi-betulinic (70) (Sơ đồ

1.6) [57], [63]. Kết quả nghiên cứu cho thấy chất 55 có nhiều hoạt tính ưu việt hơn

rất nhiều so với 54.

Sơ đồ 1.6. Tổng hợp acid betulinic từ betulin [57], [63]

41

1.4.1.3. Chuyển hóa thành carbamate

Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của betulinic acid và các dẫn xuất của

nó, Rita C.Santos đã tiến hành tổng hợp hàng loạt các dẫn xuất cacbamate theo Sơ

đồ 1.7 [64]. Từ betulinic acid (55) và 3-oxo-betulinic acid (69) khi cho tác dụng với

1,1’-cacbonylbis(2’-metylimidazole) (CBMI) trong THF khan hoặc tác dụng với

1,1’-cacbonyl-di(1,2,4-triazole) (CDT) trong THF khan nhận được các chất 71, 73,

74. Trong đó, 71 và 74 có khả năng gây độc trên dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

PC-3 ở người với nồng độ ức chế tối thiểu IC50 lần lượt là 1,1 và 1,8 µM.

HO

55

O

OH

O

71

O

N

N

NO

NN

N

CDT

THF khan, N2,

T¸c nh©n Jone,aceton, 0oC

O

69

O

OH

O

74

O

N

N

N

CBMI, THF, N2

O

O

OHHO

O2, t-BuOK, t-BuOH

40oC

HO

CDT, THF, N2

O

73

O

OOH

O

N

N

H3C

72

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất carbamate của betulinic acid [64]

Năm 2010, Harish Komera và cộng sự đã tiến hành tổng hợp các dẫn xuất

carbamate của betulin (54) (75-79) bằng phản ứng với ethyl isocyanate và phenyl

isocyanate trong dung môi chloroform, phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 60oC

trong 48h (Sơ đồ 1.8) [65]. Theo kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của

các dẫn xuất mới trên 15 dòng tế bào ung thư, các chất 75 và 78 đều có khả năng ức

chế tế bào ung thư phổi.

42

Sơ đồ 1.8. Chuyển hóa các dẫn xuất carbamate của betulin [65]

1.4.2. Chuyển hoá nhóm isopropenyl

Chuyển hóa ở nối đôi ∆ 20(29) ở nhóm isopropenyl của một số triterpene

khung lupane cũng đã được quan tâm nghiên cứu nhiều nhằm tạo ra các hợp chất

mới có hoạt tính sinh học thú vị.

1.4.2.1. Khử hoá nối đôi ∆ 20(29)

Phản ứng khử hoá nối đôi này của betulinic acid được thực hiện dưới áp suất

khí H2 với xúc tác Pd-C để cho dihydrobetulinic acid (80) (Sơ đồ 1.9). Trong một

nghiên cứu, Fumio Hashimoto và các cộng sự đã chỉ ra 80 và một số dẫn xuất của

nó có cũng có khả năng chống được HIV [65], [66].

Sơ đồ 1.9: Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid [65], [66]

43

1.4.2.2. Oxy hoá nối đôi ∆ 20(29)

Để phản ứng này chỉ xảy ra ở nối đôi ∆ 20(29) thì trước khi tiến hành cần phải

bảo vệ nhóm 3β-OH khỏi tác nhân oxi hóa bằng cách acetyl hóa nhóm OH này

(56.1). Hợp chất 56.1 có thể bị oxy hoá bởi SeO2 cho aldehyde 81 hoặc bởi ozone

cho ketone 83. Sau đó sản phẩm aldehyde lại được khử về ancol 82. Trong số này

các dẫn xuất 81, 82 đã được phát hiện có hoạt tính chống viêm và kìm hãm sự phát

triển của khối u [67], [68].

Sơ đồ 1.10. Oxi hóa nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid [67], [68]

1.4.2.3. Chuyển hoá ở vị trí allyl của nối đôi

Trong một nghiên cứu công bố năm 2011, Keduo Qian và các cộng sự đã

tổng hợp được một số dẫn xuất mới của betulinic acid (Sơ đồ 1.11) và nghiên cứu

về khả năng ức chế proteasome của chúng hay nói cách khác là khả năng ức chế

khối u bằng cách ngăn chặn sự phát triển của tế bào [69], [70]. Kết quả cho thấy, hai

dẫn xuất 86, 87 có khả năng ức chế proteasome mạnh với IC50 tương ứng là 1,56 và

1,80μM, gấp 3 đến 4 lần so với những hợp chất ức chế proteasome đã được biết đến

là Ac-Leu-Leu-Met-CHO (LLM-F) và lactacystin.

44

COOH

AcO

56.1

AcO

84

1. CO2Cl22. Leucine methyl este

O

HN

O

OMe

AcO

85

O

HN

O

OMe

Br

NBS/acetonitrile

AcO

86: R =

O

HN

O

OMe

R

O(H2C)2 Br

87: R = O(H2C)2 Cl

1. Nucleophilic/NaH, THF2. MeOH–H2O

Sơ đồ 1.11. Chuyển hóa vị trí allyl của nối đôi tạo hợp chất 85- 87 [69], [70]

1.4.3. Chuyển hóa nhóm 28-COOH

Chuyển hoá ở nhóm 28-COOH được đặc biệt quan tâm và là chuyển hoá

chính với số lượng dẫn xuất nhiều hơn cả. Các sản phẩm thu được của quá trình

chuyển hóa ở nhóm 28-COOH có thể là este hoặc amide.

1.4.3.1. Chuyển hóa thành ester

Yibi và các cộng sự khi tiến hành nghiên cứu rễ loài Pulsatilla chinensis, một

loài cây thuốc dùng để điều trị các bệnh như sốt rét, lỵ amip, cai nghiện…trong y

học cổ truyền Trung Quốc, đã phân lập được hợp chất 23-hydroxy betulinic acid

(88) - chất này có khả năng chống ung thư, HIV rất tốt, thậm chí còn cao hơn cả

betulinic acid ở dòng tế bào ung thư phổi. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp

một số dẫn xuất este hóa ở vị trí 28-COOH của nó (92.(1-6)) (Sơ đồ 1. 12) và

nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của chúng [71]. Kết quả cho thấy, tất cả các

dẫn xuất này đều có hoạt tính mạnh hơn so với chất ban đầu trên 5 dòng tế bào ung

thư gồm ung thư phổi A-549, ung thư hắc tố da B16, ung thư não SF-763, ung thư

45

gan BEL-7402 và ung thư thần kinh chuột C6, đặc biệt hợp chất 92.1 còn có khả

năng ức chế tế bào ung thư gan H22 ở chuột tương tự với cyclophosphamide.

Sơ đồ 1.12. Tổng hợp một số dẫn xuất ester của 23-hydroxy betulinic acid [71]

1.4.3.2. Chuyển hóa thành amide

Đây là hướng phản ứng chính được sử dụng để chuyển hóa nhóm 28-COOH.

Những dẫn xuất amide này thường mang đến những hoạt tính lý thú hơn so với các

hợp chất ban đầu và đang nổi lên như là một lớp chất mới có tác dụng ức chế đặc

biệt chống lại virus HIV-1 theo phương thức hoàn toàn mới [72], [73].

Năm 1994, Mayaux và Bouseau đã đăng ký bản quyền cho một chất kháng

HIV kí hiệu là RPR 103611 (93) cũng là một dẫn xuất amide của betulinic acid ở C-

28 [74].

Trong một công bố năm 2008, Weihong Lai và cộng sự đã đưa ra dẫn xuất

amide của betulinic acid là A43-D (96) được tổng hợp theo Sơ đồ 1.13 có khả năng

46

chống HIV-1 rất cao [75].

Sơ đồ 1.13. Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid [75]

47

CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu

• Mẫu rễ cây Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) được thu hái tại tỉnh Lâm

Đồng, Việt Nam vào tháng 8 năm 2012. Tên khoa học do TS. Nguyễn Tiến Hiệp –

Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

xác định. Tiêu bản số CPC-4711 được giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

• Mẫu cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) được thu

hái ở Mai Châu, Tỉnh Hòa Bình, Việt Nam vào tháng 10 năm 2009. Tên khoa học

do CN. Ngô Văn Trại, Viện Dược liệu, Bộ Y tế xác định. Tiêu bản được giữ tại

Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.1.2. Hóa chất

• Sắc ký lớp mỏng phân tích: Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck

60F254, có độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột thường: silica gel cỡ hạt 197 – 400 mesh

(0,040 – 0,063 mm) cho cột đầu. Sắc ký cột nhanh: silica gel cỡ hạt 70 – 200 mesh

cho cột tiếp theo. Sắc ký cột pha đảo: RP-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20

Merck. Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như

n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng.

• Các hóa chất dùng cho quá trình tổng hợp hữu cơ của hãng Merck (CHLB

Đức) hoặc Aldrich (Mỹ).

2.1.3. Thiết bị

• Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy IMPACT-

410, Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ

48

Việt Nam.

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500

[499,84 MHz (1H-) và 125 MHz (13C-); TMS (δ = 0,0); CD3OD (δ = 49,0); CDCl3

(δ = 77,0)] tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và

máy Varian Unity 300 [300 MHz (1H-) và 75 MHz (13C-); TMS (δ = 0,0); CD3OD

(δ = 49,0); CDCl3 (δ = 77,0)] tại Viện Sinh hóa Thực vật Halle, CHLB Đức.

• Phổ khối ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa

học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AMD 402 (Đức).

• Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS Varian

(USA), tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

• Sắc ký khí gắn khối phổ GC/MS được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký

khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N tại Phòng

thí nghiệm trọng điểm, khoa Hóa học, ĐH Vinh, Nghệ An. Thiết bị Agilent

Technologies HP 6890N ghép nối khối phổ (Mass Selective Detector Agilent HP

5973 MSD). Cột HP-5MS có kích thước 0,25µm x 30m x 0,25mm và HP1 có kích

thước 0,25µm x 30m x 0,32mm. Xác nhận các cấu tử được thực hiện bằng cách so

sánh các dữ kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã được công bố có trong thư

viện Willey/Chemstation HP.

• Điểm chảy được đo bằng máy đo điểm chảy VEB Analytik Dresden HMK

73/4470 (Đức), Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

• Năng suất quay cực được đo trên thiết bị Jasco P-2000 Polarimeter serial

A060161232, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết tách

2.2.1.1 Phương pháp chiết tách các chất từ loài Thông lá dẹt

Mẫu thực vật được làm sạch các tạp chất cơ học, sấy khô ở nhiệt độ 40-500C,

49

xay nhỏ và ngâm chiết bốn lần bằng hỗn hợp dung môi MeOH - H2O (80:20) ở nhiệt độ

phòng.

Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất thấp, dịch nước còn lại được chiết lần

lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, EtOAc, n-BuOH bằng

phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng. Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới

áp suất thấp thu được các cặn chiết n-hexane, EtOAc, n-BuOH tương ứng.

Cặn chiết n-hexane được xác định thành phần hóa học bằng phương pháp

GC-MS.

Cặn chiết EtOAc và n-BuOH được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột

với các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18, sephadex LH-20 với các hệ

dung môi thích hợp.

2.2.1.2. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương

Mẫu thực vật được làm sạch khỏi các tạp chất cơ học, sấy khô ở nhiệt độ

400C, xay nhỏ và ngâm chiết bốn lần bằng hỗn hợp dung môi MeOH-H2O (85:15) ở

nhiệt độ phòng.

Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất thấp, dịch nước còn lại được chiết lần

lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, CH2Cl2 bằng phương

pháp chiết phân bố lỏng-lỏng. Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất

thấp thu được các cặn chiết n-hexane, ATC1 tương ứng.

Dịch nước còn lại được thủy phân với NaOH 4N trong ethanol ở 80oC trong

8 giờ. Sau đó, hỗn hợp sản phẩm được trung hòa với HCl 1N và chiết với CH2Cl2.

Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn chiết ATC2.

Phân lập cặn chiết ATC1, ATC2 thu được bằng phương pháp sắc ký cột với

các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18 với các hệ dung môi thích hợp.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp

phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng

hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC,

50

COSY, NOESY …).

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis [76], [77]

• Chủng vi sinh vật kiểm định: Chủng vi sinh vật gây bệnh ở người là vi khuẩn

Bacillus subtilis (Bs) (ATCC 6633)

• Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton

Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar).

• Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ

- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu

và mục đích thử.

- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng

độ).

- Mẫu ban đầu có nồng độ 40mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác

nhau (256μg/ml; 64μg/ml; 16μg/ml; 4μg/ml; 1μg/ml) để thử hoạt tính với các chủng

vi sinh vật.

- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử.

- Lấy 10 μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200μl

dung dịch vi sinh vật, ủ ở 370C. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá

trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự

phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế

bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.

• Chất đối chứng: Kháng sinh Ampicilin với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 -

2μg/ml.

(Thực hiện ở Viện Sinh hóa thực vật Halle - CHLB Đức).

2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào [78], [79]

• Các dòng tế bào: Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC

51

gồm:

- KB (Human epidermic carcinoma) - ung thư biểu mô.

- HepG2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan.

- LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.

- MCF - 7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.

• Phương pháp: Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư

Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc,

phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở

điều kiện in vitro.

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường

nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần

cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối).

Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác

nhau.

• Thử độc tế bào:

- Cho 200μl dung dịch tế bào ở nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa

96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF-7, KB;

môi trường DMEM cho LU-1.

- Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho

đạt đến nồng độ cuối cùng là 128μg/ml; 32μg/ml; 8μg/ml; 2μg/ml; 0,5μg/ml. Ủ

trong điều kiện 370C, 5% CO2 trong 3 ngày.

- Giếng điều khiển gồm 200μl dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế bào/ml, ủ ở

370C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50μl MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi

cấy không huyết thanh), ủ 370C 4 giờ.

- Loại bỏ môi trường, thêm 100μl DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng

540nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

• Tính kết quả:

52

GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển (Growth Inhibition).

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy

tính table curve.

(Thực hiện ở Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam).

2.2.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa: Thực hiện theo phương pháp DPPH [80], [81]

• Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do

được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính

chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng

phương pháp đo quang ở bước sóng λ = 517nm.

• Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong methanol

(MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt

được một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1µg/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở

370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở

bước sóng 517nm.

• Tính toán: % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức

sau:

EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của

chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

• Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang

học:

53

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH

y = 0.3225x + 0.0241R2 = 0.9938

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

1.6000

1.8000

0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000Nồng độ DPPH mM

Mật

độ

quan

g họ

c (O

D)

(Thực hiện ở Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam).

54

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM

3.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)

Khi nghiên cứu loài Thông lá dẹt, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sơ bộ các

cặn chiết từ mẫu lá và mẫu rễ của loài này trên sắc ký lớp mỏng. Kết quả cho thấy,

sắc ký đồ của các cặn chiết của mẫu rễ cho nhiều vết rõ ràng hơn so với các cặn

chiết của mẫu lá. Ngoài ra, khi tiến hành phân lập chất từ cặn chiết n-hexane của lá

thì thu được β-sitosterol glucoside và β-sitosterol, hai chất thường gặp trong nhiều

loài thực vật. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn mẫu rễ loài này để nghiên cứu kỹ hơn.

Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết rễ Thông lá dẹt

Dịch nước còn lại

Chiết với n- BuOH (3 lần)


Dịch n-BuOH

Cất loại dung môi Cặn n-BuOH

(20g)


Chiết với EtOAc (3 lần)

Dịch EtOAc

Cất loại dung môi Cặn EtOAc

(75g)

Chiết với MeOH:Nước (80:20) (4 lần)

Dịch MeOH

Cất loại dung môi


Chiết với n-hexane (3 lần)

Dịch n-hexane

Cất loại dung môi Cặn n-hexane

(3g)

Rễ loài Thông lá dẹt (1,1kg)

55

Mẫu rễ Thông lá dẹt đã sấy khô (1,1kg), nghiền nhỏ được ngâm chiết bốn lần

trong hỗn hợp MeOH/nước (80:20), ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi

MeOH dưới áp suất giảm, dịch nước còn lại được chiết phân lớp lần lượt với n-

hexane, EtOAc và n-BuOH (mỗi loại chiết 1,5l x 3lần). Cất loại dung môi của các

dịch chiết thu được dưới áp suất giảm thu được 3; 75 và 20g cặn các chiết tương

ứng (Sơ đồ 3.1).

3.1.1. Cặn chiết n-hexane

Hoà tan 1,5mg cặn chiết n-hexane đã được làm khô bằng Na2SO4 khan trong

1ml n-hexane tinh khiết loại dùng cho sắc ký và phân tích phổ. Việc phân tích được

thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS với cột mao

quản chuyên dụng. Chương trình nhiệt độ với điều kiện 60oC/2 phút; tăng nhiệt độ

4oC/1 phút cho đến 220oC, sau đó lại tăng nhiệt độ 20o/phút cho đến 260oC; với He

làm khí mang. Việc xác nhận các cấu tử được thực hiện bằng cách so sánh các dữ

kiện phổ MS của chúng với phổ chuẩn đã được công bố có trong thư viện

Willey/Chemstation HP. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1.

3.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc)

3.1.2.1. Phân lập chất

Cặn chiết EtOAc (60g) được tiến hành trên sắc ký cột silica gel với các hệ

dung môi giải hấp là n-hexane-CH2Cl2 gradient (80:20 → 10:90) và sau đó là hệ

dung môi CH2Cl2-MeOH gradient (98:2 →90:10) thu được 12 phân đoạn, ký hiệu

PKE1→PKE12.

Phân đoạn 2 (PKE2) xuất hiện kết tinh màu vàng trong hỗn hợp dung môi

CH2Cl2-MeOH. Lọc kết tinh và rửa với n-hexane thu được hợp chất PK2 (45mg).

Dung dịch còn lại của phân đoạn PKE2 được cất loại dung môi rồi đưa lên cột silica

gel, giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (95:5) thu được hợp chất PK1

(120mg).

Phân đoạn 6 (PKE6) được tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với

dung môi giải hấp là MeOH thu được 10 phân đoạn, ký hiệu PKE6.1 → PKE6.10.

Trong đó có hai phân đoạn chính là PKE6.6, PKE6.8. Tinh chế tiếp phân đoạn

56

PKE6.6 trên sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi giải hấp là MeOH thu được

hợp chất PK3 (97mg) và phân đoạn PKE6.8 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung

môi giải hấp là CH2Cl2-MeOH (9:1) thu được hợp chất PK4 (70mg).

Phân đoạn 3 (PKE3), phân đoạn 4 (PKE4) đều thấy xuất hiện kết tinh màu

vàng trong hỗn hợp dung môi CH2Cl2-MeOH. Lọc kết tinh và rửa với CH2Cl2 thu

được hợp chất PK5 (70mg) từ phân đoạn PKE4 và hợp chất PK6 (50mg) từ phân

đoạn PKE3.

Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt được

biểu diễn ở Sơ đồ 3.2.

Sơ đồ 3.2. Phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt

CC, Sephadex MeOH

Kết tinh CH2Cl2/ MeOH

PK6 (50mg)

PK5 (70mg)

PK2 (45mg)

PK1 (120mg)

CC, SiO2 CH2Cl2-MeOH

(95:5)

PK3 (97mg)

PK4 (70mg)

CC, SiO2 CH2Cl2-MeOH

(90:10)

CC, Sephadex MeOH

PKE6.6 PKE6.8



Cặn chiết EtOAc (60g)

CC, SiO2 1. n-hexane-CH2Cl2 (80:20 → 10:90) 2. CH2Cl2-MeOH (98:2 →90:10)

PKE1 PKE7-12 PKE2 PKE3 PKE4 PKE5 PKE6

57

3.1.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được

• Tectochrysin (PK1): C16H12O4, chất rắn vô định hình, màu vàng, đnc 160-

162oC (EtOAc-MeOH).

Rf = 0,50 (CH2Cl2:MeOH = 98:2), hiệu suất 0,011% (so với mẫu rễ khô).

IR (KBr, ν, cm-1): 3073, 2850, 1666, 1609, 1493, 1346, 1162, 1038, 860.

ESI-MS (positive ion): m/z 269,1 [M+H]+.

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR được đưa ra ở Bảng 4.2.

• Pinostrobin (PK2): C16H14O4, tinh thể hình kim, không màu, đnc 98-100oC

(CH2Cl2-EtOAc), [αD]25 = -25o (MeOH, c =1).



• Pinobanksin (PK3): C15H12O5, chất rắn vô định hình, màu vàng, đnc 174-

176oC (CH2Cl2-MeOH), [αD]25 = +25o (MeOH, c =0,4).


IR (KBr, ν, cm-1): 3437, 3106, 2980, 1627, 1469, 1372, 1273, 1171, 1080,

997, 839.



• Galangin (PK4): C15H10O5, Chất rắn vô định hình, màu vàng, đnc 214-

216oC.

Rf = 0,30 (CH2Cl2: MeOH = 98:2), hiệu suất 0,006% (so với mẫu rễ khô).

IR (KBr, ν, cm-1): 3507, 2895, 1621, 1511, 1372, 1272, 997, 824.


Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR được đưa ra ở Bảng 4.5

• Strobopinin (PK5): C16H14O4, tinh thể hình kim, màu vàng, đnc 226-228oC

58

(EtOAc), [αD]25 = -52o (MeOH, c =1,0).


IR (KBr, ν, cm-1): 3363, 2883, 1623, 1505, 1431, 1263, 1153, 1069, 985, 817.


• Cryptostrobin (PK6): C16H14O4, tinh thể hình kim, màu vàng, đnc 200-

201oC (EtOAc-MeOH), [αD]25 = -35o (MeOH, c =0,6).


IR (KBr, ν, cm-1): 3126, 2948, 1642, 1587, 1440, 1303, 1112, 988, 817.


3.1.3. Cặn chiết n-butanol (n-BuOH)

Khảo sát sơ bộ cho thấy phần lớn trong phân đoạn n-BuOH là các hợp chất

dạng keo, tan trong hỗn hợp dung môi MeOH-H2O (1:1) nhưng lại khó tan trong

dung môi khác. Trước khi tiến hành phân lập các chất, cặn chiết n-BuOH được chiết

loại sơ bộ các tạp chất bằng cách hòa tan hoàn toàn cặn chiết bằng hỗn hợp dung

môi MeOH-H2O (1:1), sau đó chiết với hỗn hợp CH2Cl2-EtOH (2:1), cất loại dung

môi thu được 12g cặn chiết n-BuOH(E).

12g cặn n-BuOH(E) được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột sephadex LH-

20 với dung môi giải hấp là MeOH thu được 6 phân đoạn, ký hiệu PKB1 → PKB6.

Khảo sát các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy hầu hết các hợp chất chính

của các phân đoạn đã được tìm thấy từ cặn chiết EtOAc, chỉ có phân đoạn PKB2

(4,6g) cho vết có Rf khác với các chất đã phân lập. Vì vậy, cặn này được chọn để

tiếp tục tiến hành tinh chế.

Phân đoạn PKB2 được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi lần

lượt là CH2Cl2-MeOH (9:1); CH2Cl2-MeOH-H2O (9:1:0,05); CH2Cl2-MeOH-H2O

(9:1:0,1), thu được 10 phân đoạn PKB2.1→PKB2.10. Tiếp tục làm sạch phân đoạn

PKB2.2 bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi giải hấp là MeOH thu được

64mg chất PK7, dạng rắn, màu trắng.

59

Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-BuOH của rễ Thông lá dẹt

được thực hiện theo Sơ đồ 3.3.

Sơ đồ 3.3. Phân lập chất PK7 từ cặn chiết n-BuOH của rễ Thông lá dẹt

• Isolariciresinol (PK7): C20H24O6, chất rắn vô định hình, màu trắng, đnc 155-

157oC (CHCl3-MeOH), [αD]25 = +55o (MeOH, c =0,55).

Rf = 0,45 (CH2Cl2:MeOH:H2O = 9:1:0,2), hiệu suất tách 0,006% (so với mẫu

rễ khô).

IR (KBr, ν, cm-1): 3453, 2934, 2863, 1721, 1606, 1514, 1457, 1273, 1023,

874.

HR-ESI-MS: m/z 383,1470 [M+Na]+ (tính toán cho công thức C20H24O6Na+ là

383,1471).

Cặn chiết n-BuOH (20g)

PKB1 PKB2 PKB3-6

1. Hòa tan trong MeOH-H2O (1:1) 2. Chiết với CH2Cl2-EtOH (2:1) 3. Cất loại dung môi

Cặn n-BuOH(E) (12g)

CC, SiO2 1. CH2Cl2-MeOH (9:1) 2. CH2Cl2-MeOH-H2O (9:1:0,05) 3. CH2Cl2-MeOH-H2O (9:1:0,1)

CC, Sephadex LH-20 MeOH

PK7 (64mg)

PKB2.1 PKB2.2 PKB2.3-2.10 CC, Sephadex LH-20 MeOH

60


3.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.)

3.2.1. Phân lập các hợp chất từ loài Ngũ gia bì hương

3.2.1.1. Quá trình phân lập

Sơ đồ 3.4. Quy trình chiết mẫu Ngũ gia bì hương

Mẫu thân và lá loài Ngũ gia bì hương đã sấy khô (3,7kg), nghiền nhỏ được

ngâm chiết bốn lần trong hỗn hợp MeOH-H2O (85:15) ở nhiệt độ phòng. Sau khi

Chiết với MeOH-H2O (85:15) (3 lần)


1. NaOH 4N, 80oC, 8h 2. HCl 1N 3. Chiết với CH2Cl2 (3 lần)

Dịch CH2Cl2

Cất loại dung môi Cặn ATC2

(50g)


Chiết với CH2Cl2

(3 lần) Dịch CH2Cl2

Cất loại dung môi Cặn ATC1

(55g)


Dịch MeOH

Cất loại dung môi

Dịch nước

Chiết với n-hexane (3 lần)

Dịch n-hexane

Cất loại dung môi Cặn n-hexane

(32g)

Thân và lá Ngũ gia bì hương

(3,7kg)

61

cất loại dung môi MeOH dưới áp suất giảm ở 40oC, dịch nước còn lại được chiết

phân lớp lần lượt với n-hexane và CH2Cl2. Cất loại dung môi của các dịch chiết

dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng, cặn n-hexane (32g) và cặn

dichlorometan 1 (ATC1) (55g). Thủy phân dịch nước còn lại bằng dung dịch NaOH

4N trong EtOH ở 80oC trong 8h. Cất loại EtOH, acid hóa bằng HCl 1N, sau đó chiết

với CH2Cl2. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm được 50g cặn chiết dichlorometan

2 (ATC2) (Sơ đồ 3.4).

Cặn chiết ATC1 (55g) được đưa lên cột silica gel giải hấp bằng hệ dung môi

CH2Cl2-MeOH gradient MeOH từ 0 đến 100% thu được 20 phân đoạn ký hiệu

ATC1.1→ATC1.20.

Từ phân đoạn 2 (ACT1.2) và phân đoạn 4 (ACT1.4) tiến hành sắc ký cột

silica gel với dung môi giải hấp là CH2Cl2-EtOAc (80:20) thu được 8,2g chất AT1

và 7,8g chất AT2.

Từ phân đoạn 3 (ACT3) cũng tiến hành sắc ký cột silica gel với dung môi

giải hấp là CH2Cl2-EtOAc (80:20) thu được 3 phân đoạn chính, ký hiệu ATC1.3.1

→ ATC1.3.3. Phân đoạn ACT1.3.2 được làm sạch lại bằng sắc ký cột pha đảo RP –

18 với hệ dung môi MeOH-H2O (80:20) thu được chất AT3 (42mg).

Tương tự tiến hành phân lập hai hợp chất AT1, AT2 từ cặn chiết ATC2

(50g) bằng sắc ký cột lặp lại với hệ dung môi thích hợp, đã phân lập được 1,2g AT1

và 1,4g AT2.

Như vậy, từ hai cặn chiết dichlorometan đã phân lập được hai chất có hàm

lượng lớn AT1 (9,4g), AT2 (9,2g) và từ cặn chiết chưa thủy phân ACT1 đã phân

lập được hợp chất AT3 (42mg).

Quá trình phân lập các hợp chất từ các cặn chiết CH2Cl2 của loài Ngũ gia bì

hương được biểu diễn ở Sơ đồ 3.5

62

Sơ đồ 3.5. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichlorometan

của loài Ngũ gia bì hương

AT2 (7,8g)

Cặn chiết ATC1 (55g)

ATC1.1

CC, SiO2 CH2Cl2-MeOH (100:0 → 0:100)

CC, SiO2 CH2Cl2-EtOAc

(80:20)

AT1 (8,2g)

AT2 (9,2g)

ATC1.3.1

CC, RP-18 MeOH –H2O

(80:20)

AT3 (42mg)

ATC1.2 ATC1.3 ATC1.4 ATC1.5-1.20

CC, SiO2 CH2Cl2-EtOAc (80:20)


(80:20)

ATC1.3.2 ATC1.3.3

AT1 (9,4g)

AT1 (1,2g)

AT2 (1,4g)


(80:20)

CC, SiO2 CH2Cl2-EtOAc (80:20)

ATC2.2 ATC2.3 ATC2.4-2.15 ATC2.1

CC, SiO2 CH2Cl2-MeOH (100:0 →0:100)

Cặn chiết ATC2 (50g)

63

3.2.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được

• 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1):C29H44O4,

chất rắn vô định hình, màu trắng, đnc 182-184oC (EtOAc-MeOH), [αD]25 = +25o

(MeOH, c = 0,38).

Rf = 0,5 (CH2Cl2:MeOH = 100:3), hiệu suất 0,26% (so với mẫu khô).

ESI-MS (positive ion): m/z 479,2 [M+Na]+

ESI-MS (negative ion): m/z 455,5 [M-H]-.


• 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2): C29H46O4,

chất rắn vô định hình, màu trắng, đnc 223-225oC (EtOAc-MeOH), [αD]25 = +16o

(MeOH, c =0,52).

Rf = 0,35 (CH2Cl2:MeOH = 100:3), hiệu suất 0,25% (so với mẫu khô)




• 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3): C30H46O5, chất

rắn vô định hình, màu trắng, đnc 218-220oC (EtOAc-MeOH), [αD]25 = +26o

(MeOH, c =0,25).

Rf = 0,4 (CH2Cl2:MeOH = 100:3), hiệu suất 0,04 % (so với mẫu khô).

HR-ESI-MS: m/z 487,3424 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

C30H46O5 là 487,3423).


3.2.1.3. Tổng hợp các dẫn xuât của hai chất AT1, AT2

3.2.1.4. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1

Tổng hợp các dẫn xuất của AT1 được thực hiện theo Sơ đồ 4.1

64

a. Tổng hợp các dẫn xuất ester của AT1

Các phản ứng tạo ester được thực hiện giữa nhóm hydroxyl ở C-11 của AT1 với

một số acid anhydride như acetic anhydride, phthalic anhydride, glutaric anhydride,

succinic anhydride.

24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT4):

Hòa tan 1,465g (3,2mmol) chất AT1 trong hỗn hợp 5ml pyridine và 3ml

acetic anhydride. Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24h. Sau đó cất loại

pyridine và acetic anhydride dư dưới áp suất giảm thu được cặn rắn màu trắng. Cặn

này được hòa tan trong CH2Cl2 và rửa bằng 10ml dung dịch HCl 5%, sau đó rửa 3

lần với nước, làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi, sản phẩm thô được làm

sạch bằng cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 98:2 thu đuợc 1,35g chất

AT4 ở dạng rắn, màu trắng, hiệu suất 85%.

FT-IR (KBr): 3430, 2960, 1728, 1691, 1641, 1458, 1374, 1235, 1021, 894



24-nor-11α-O-phthalyl-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT5):

Hỗn hợp của 160mg (0,35mmol) hợp chất AT1, 200mg (1,64mmol) 4-DMAP và

260mg (1,75mmol) phthalic anhydride trong 10 ml pyridine được đun nóng ở 60oC

trong 8h. Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội đến nhiệt độ phòng, cho thêm nước và

chiết 3 lần với EtOAc. Trung hòa dịch chiết bằng dung dịch HCl 1N, rửa lại với nước,

làm khan và cất loại dung môi. Sản phẩm thô được tinh chế bằng cột silica gel với hệ

dung môi CH2Cl2: MeOH = 100:4 thu được 137mg chất AT5 ở dạng chất rắn màu

trắng, hiệu suất 65%.

FT-IR (KBr): 3491, 2954, 1714, 1600, 1456, 1282, 1124, 1069, 889 cm-1.

ESI-MS (positive ion): m/z 626,9 [M+Na]+.


1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7,85 và 7,54 (4H,-C6H4-); 5,56 (1H, m, H-11);

65

4,80 (1H, s, H-29A); 4,64 (1H, s, H-29B); 3,05 (1H, s, H-19).

Tương tự AT5, các chất AT6 và AT7 được tổng hợp với các thông số của phản

ứng như sau:

Bảng 3.1. Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT6, AT7

Chất AT1 (mg/mmol)

Acid anhydride (mg/mmol)

Pyridine (ml)

4-DMAP (mg/mmol)

LSP (mg)

H (%)

AT6 160/0,35 glutaric anhydride 200/1,75

10 200/1,64 134 67

AT7 160/0,35 succinic anhydride 175/1,75

10 200/1,64 127 65

24-nor-11α-O-glutaryl-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT6):



1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5,26 (1H, dt, J= 11,0 và 5,5 Hz, H-11); 4,75

(1H, s, H-29A); 4,61 (1H, s, H-29B); 2,97-3,04 (m, 1H, H-19); 1,67 (3H, s); 1,07

(3H, s); 1,04 (3H, s); 1,01 (3H, s).

13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 213,9; 182,1; 178,5; 171,8; 149,6; 110,5;

72,9; 56,2; 56,1; 53,2; 50,5; 48,7; 46,4; 44,9; 42,3; 42,2; 42,1; 42,0; 37,7; 37,3;

36,9; 36,8; 34,1; 33,5; 32,6; 31,9; 30,3; 29,4; 21,9; 19,9; 19,1; 16,8; 14,3; 12,2.

24-nor-11α-O-succinyl-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT7):


1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 5,28 (1H, dt, J = 11,0 và 5,5 Hz, H-11); 4,74

(1H, s, H-29A); 4,60 (1H, s, H-29B); 3,00-2,96 (1H, m, H-19); 1,67 (3H, s); 1,07

(3H, s); 1,04 (3H, s); 1,04 (3H, s); 1,01 (3H, s); 0,99 (3H, d, J=6,5 Hz).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 214,2; 182,4; 178,0; 171,1; 149,5; 110,4;

73,3; 56,2; 53,3; 50,6; 48,8; 46,4; 44,9; 42,3; 42,2; 41,9; 37,7; 37,3; 36,9; 33,6;

32,5; 31,9; 30,4; 29,7; 29,4; 28,9; 21,8; 19,2; 16,8; 14,3; 13,9; 12,2.

66

b. Tổng hợp dẫn xuất dioxo của AT1

Nhóm hydoxyl ở vị trí C-11 của AT1 dễ dàng bị oxi hóa bởi tác nhân Jones -

dung dịch chứa 200mg CrO3 trong 20ml H2SO4 20%. Quá trình oxi hóa được thực

hiện bằng cách hòa tan 91mg hợp chất AT1 bằng 10ml acetone và cho từ từ vào tác

nhân oxi hóa. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 4h. Sau phản

ứng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm, dịch còn lại được chiết bằng EtOAc

(50ml). Rửa pha hữu cơ 3 lần với nước cất (3x20ml), làm khan bằng Na2SO4 và cất

loại dung môi, tinh chế sản phẩm bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:

EtOAc = 5: 1 thu được 60mg chất AT8 ở dạng chất rắn màu trắng, hiệu suất 67%.

24-nor-3,11-dioxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT8)



1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz): 0,94 (3H, s); 0,98 (3H, d, J = 6,5

Hz); 1,21 (3H, s); 1,39 (3H, s); 1,69 (3H, s); 2,95-3,02 (1H, m); 4,66 (1H, s); 4,79

(1H, s).

13C-NMR (75 MHz, CDCl3, δ, ppm): 11,4; 13,4; 14,5; 18,1; 19,5; 21,7; 29,1;

30,3; 31,8; 32,1; 35,8; 36,7; 37,4; 39,5; 39,6; 42,6; 44,0; 44,3; 44,9; 46,2; 48,8;

53,5; 56,2; 62,1; 110,8; 148,8; 181,7; 211,0; 213,2.

c. Tổng hợp các dẫn xuất amide của AT1

Từ dẫn xuất AT4 và AT8 tiếp tục thực hiện phản ứng với các amine nhằm

tạo ra các dẫn xuất amide.

• Chuyển hóa qua dẫn xuất AT4:

Methyl N-[24 – nor - 11α – acetoxy – 3 – oxo – lup - 20(29) – ene – 28 - oyl]-11-

aminoundecanoate (AT9):

Hòa tan 49mg (0,1mmol) hợp chất AT4 vào hỗn hợp gồm 0,1ml oxalyl

chloride trong 3ml CH2Cl2. Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 48h.

Cất loại CH2Cl2 và oxalyl chloride dư dưới áp suất giảm, chất rắn còn lại được hòa

67

tan bằng dung dịch chứa 50μl triethylamine trong 5ml CH2Cl2. Dung dịch thu được

đem nhỏ từ từ vào dung dịch chứa 64mg NH2(CH2)10COOCH3 (0,3mmol) trong 5ml

CH2Cl2 và hỗn hợp phản ứng được khuấy 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản

ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp sản phẩm 30ml CH2Cl2 rồi rửa với nước (3x20ml),

làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Tiếp tục tinh chế sản phẩm trên cột

silicagel với hệ dung môi n-hexane : EtOAc = 4:1 thu được 59mg chất AT9 ở dạng

chất rắn màu trắng, hiệu suất 85%.




C43H70NO6 là 696,52031).

Tổng hợp tương tự AT9, các chất AT10, AT11, AT12 cũng được tạo thành

từ phản ứng chuyển hóa AT4 với các tác nhân, tỉ lệ và hiệu suất phản ứng như ở

Bảng 3.2:

Bảng 3.2. Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT10 – AT12


(COCl)2/ CH2Cl2 (ml/ml)

Amine/CH2Cl2

(mmol/ml) (C2H5)3N/ CH2Cl2

(μg/mmol)

LSP (mg)

H (%)

AT10 49/0,1 0,1/3 NH2(CH2)4CH3NH2 2/5

50/5 41 68

AT11 49/0,1 0,1/3 NH2(CH2)9NH2 2/5

50/5 46 72

AT12 49/0,1 0,1/3 NH2(CH2)3OH 0,3/10

50/5 37 67

N - [24-nor-11α-acetoxy-3-oxo - lup-20(29)-ene-28-oyl] - 1,5 - diaminohexane

(AT10):

ESI-MS (positive ion): m/z 597,6 [M+H]+


1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz): 0,91 (3H, d, J = 7,0 Hz); 0,99

(3H, d, J = 7,0 Hz); 1,07 (3H, s); 1,66 (3H, s); 1,97 (3H, s); 3,09-3,13 (1H, m);

68

3,15-3,25 (2H, m); 4,58 (1H, s); 4,74 (1H, s); 5,21-5,24 (1H, m); 5,72-5,76 (1H, m).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ, ppm): 12,2; 14,2; 17,1; 19,5; 21,9; 22,0;

27,4; 29,3; 30,7; 31,5; 32,8; 33,7; 35,9; 37,4; 37,8; 38,3; 39,5; 42,0; 42,3; 42,4;

45,0; 46,2; 48,2; 49,7; 50,9; 53,3; 55,5; 72,9; 110,0; 150,1; 169,7; 175,7; 213,7.

N - [24-nor - 11α-acetoxy-3-oxo - lup-20(29)-ene-28-oyl] - 1,9-diaminononane

(AT11)

IR (KBr, ν, cm-1): 3404, 2944, 2859, 1731, 1647, 1528, 1371, 1249, 1025,

885.


ESI-MS (negative ion): m/z 637,7 [M-H]- .


C40H67N2O4 là 639,51008).


(3H, s); 1,04 (3H, s); 1,07 (3H, s); 1,30 (3H, s); 1,67 (3H, s); 1,97 (3H, s); 4,58 (1H,

s); 4,74 (1H, s); 5,23 (1H, dt, J = 11,0 và 5,5 Hz); 5,59 (1H, t, J = 4,5 Hz).


26,8; 26,9; 29,2; 29,3; 29,5; 29,8; 30,7; 32,7; 33,3; 33,6; 33,7; 35,9; 37,4; 37,7;

38,3; 39,2; 42,0; 42,2; 42,3; 44,9; 46,2; 49,6; 50,7; 53,3; 55,4; 72,8; 109,9; 150,1;

169,7; 175,5; 213,8.

N - [24-nor-11α-acetoxy-3-oxo - lup-20(29)-ene-28-oyl] - 3-amino-1-propanol

(AT12):


C34H54NO5 là 556,40020).


(3H, s); 1,07 (6H, 2хs); 1,67 (3H, s); 1,98 (3H, s); 2,70-2,76 (1H, m); 3,02-3,07

(1H, m); 3,46 (2H, m); 3,69-3,70 (2H, m); 4,59 (1H, s); 4,74 (1H, s); 5,19 (1H, dt, J

= 11,0 và 5,0 Hz); 6,20 (1H, t, J = 5,5 Hz).

69


22,0; 29,3; 30,6; 32,1; 32,8; 33,6; 33,7; 36,0; 36,7; 37,3; 37,7; 38,4; 42,0; 42,3;

42,5; 44,9; 46,1; 49,2; 50,9; 53,2; 55,8; 60,1; 73,1; 110,1; 149,9; 170,0; 177,1;

213,7.

N-[24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oyl]-3-amino-1-propanol

acetate (AT13):

Dẫn xuất acetat AT13 là sản phẩm của quá trình acetyl hóa chất AT12 bằng

acetic anhydride. Hòa tan 56mg (0,1mmol) chất AT12 trong hỗn hợp gồm 0,1ml

acetic anhydide và 1ml pyridine. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng

trong 12h. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, cặn rắn thu được được hòa tan bằng

CH2Cl2 và trung hòa với dung dịch HCl 1N. Pha hữu cơ được rửa với nước (3 lần),

làm khan và cất loại dung môi. Tinh chế sản phẩm thô trên sắc ký cột silica gel với

hệ dung môi n-hexane : EtOAc = 4:1 thu được 52 mg chất AT13 ở dạng chất rắn

màu trắng, hiệu suất 87%.


C36H56NO6 là 598,41076).


(3H, s); 1,04 (3H, s); 1,07 (3H, s); 1.67 (3H, s); 1,97 (3H, s); 2,08 (3H, s), 3,23-3,28

(1H, m), 3,32-3,37 (1H, m); 4,11-4,19 (2H, m); ,58 (1H, s); 4,74 (1H, s); 5,23 (1H,

dt, J = 11,0 và 5,0 Hz); 6,01 (1H, t, J = 5,5 Hz).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ, ppm): 12,2; 14,1; 14,2; 16,9; 19,4; 20,9,

21,8; 21,9; 28,9; 29,2; 30,6; 32,7; 33,5; 33,6; 35,8; 35,9; 37,3; 37,7; 38,2; 41,9;

42,2; 42,3; 44,9; 46,1; 49,6; 50,8; 53,2; 55,4; 62,0; 72,8; 109,9; 150,0; 169,6; 171,3;

175,8; 213,6.

• Chuyển hóa qua dẫn xuất AT8:

Hỗn hợp của 91mg (0,2mmol) chất AT8 và 0,2 ml oxalyl chloride trong 10

ml CH2Cl2 được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 48h. Cất loại CH2Cl2 và oxalyl

chloride dư dưới áp suất giảm thu được cặn rắn khô. Hòa tan cặn này bằng dung

dịch chứa 50μl triethylamine trong 5ml CH2Cl2. Dung dịch thu được được nhỏ từ từ

70

vào hỗn hợp gồm 390mg (3mmol) NH2(CH2)7NH2 trong 5ml CH2Cl2. Hỗn hợp

phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24h. Thêm vào hỗn hợp sản phẩm 30

ml CH2Cl2, rồi rửa với nước (3x20ml), làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi

thu được sản phẩm thô AT14.

Dẫn xuất AT14 sau khi tổng hợp được tiếp tục chuyển hóa với các tác nhân

khác nhau tạo thành các hợp chất AT15, AT16, AT17 với các tác nhân, tỉ lệ và hiệu

suất phản ứng như sau:



Acid anhydride (mg/mmol)

Pyridine (ml)

4-DMAP (mg/mmol)

LSP (mg)

H (%)

AT15 56/0,1 acetic anhydride 20,5/0,2

5 13/0,1 32 52

AT16 56/0,1 succinic anhydride 20/0,2

5 13/0,1 38 58

AT17 56/0,1 tetrahydrophthalic anhydride 30,5/0,2

5 13/0,1 39 55

Hỗn hợp phản ứng gồm AT14, anhydride của acetic (hoặc: succinic,

tetrehydrophthalic), 4-DMAP trong 5ml pyridine được đun hồi lưu trong 12h. Sau

khi phản ứng kết thúc, cho thêm nước và chiết với CH2Cl2 (2 lần), trung hòa dịch

chiết bằng dung dịch HCl 1N, rửa lại với nước, làm khan với Na2SO4 và cất loại

dung môi. Sản phẩm thô được tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane

: EtOAc = 4:1.

[N-[24-nor-3,11-dioxo-lup-20(29)-ene-28-oyl]-7-aminoheptyl]-carbamoyl

methane (AT15):




Hz); 1,19 (3H, s); 1,67 (3H, s); 1,98 (3H, s); 3,17-3,27 (4H, m); 4,63 (1H, s); 4,77

(1H, s); 5,57 (1H, s); 5,64 (1H, t, J = 5,70 Hz).

71


26,6; 26,7; 28,6; 28,9; 29,4; 29,6; 30,6; 32,2; 33,6; 35,8; 37,4; 38,2; 38,5; 39,1;

39,5; 39,7; 42,6; 44,0; 44,4; 44,8; 46,0; 49,7; 53,6; 55,4; 62,1; 110,4; 149,5; 170,1;

175,4; 210,8; 213,3.


succinic acid (AT16):




Hz); 1,19 (3H, s); 1,39 (3H, s); 1,67 (3H, s); 3,19-3,28 (4H, m); 4,64 (1H, s); 4,76

(1H, s); 5,78 (1H, t, J = 5,5 Hz); 6,23 (1H, t, J = 5,5 Hz).


26,6; 28,4; 29,0; 29,2; 29,5; 30,2; 30,6; 31,1; 32,3; 33,7; 35,9; 37,4; 38,3; 38,7;

39,3; 39,6; 39,7; 42,7; 44,1; 44,4; 45,0; 46,1; 49,7; 53,6; 55,6; 62,2; 110,5; 149,4;

172,6; 176,0; 211,0; 213,1.

[N-[24-nor - 3,11-dioxo – lup - 20(29)-ene - 28-oyl] -7-aminoheptyl] -carbamoyl

tetrahydrophthalic acid (AT17):




(3H, s); 1,38 (3H, s); 1,67 (3H, s); 2,92-3,07 (4H, m); 3,19-3,32 (4H, m); 4,64 (1H,

s); 4,76 (1H, s); 5,67-5,78 (2H, m); 6,65 (1H, s).


27,6; 27,8; 28,4; 28,9; 29,0; 29,4; 30,5; 32,2; 33,6; 35,8; 37,4; 38,2; 38,6; 38,7;

39,1; 39,6; 39,8; 40,6; 41,9; 42,7; 44,0; 44,4; 44,9; 46,1; 49,6; 53,5; 55,5; 62,1;

110,5; 124,7; 126,6; 149,4; 174,2; 174,3; 175,8; 211,1; 213,2.

72

3.2.1.5. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2

Các dẫn xuất của AT2 được tổng hợp theo Sơ đồ 4.2

a. Tổng hợp dẫn xuất ester của AT2

Hai nhóm 3-OH và 11-OH của hợp chất AT2 dễ dàng bị acetyl hóa với

acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng tạo dẫn xuất ester AT18.

24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT18)

Hòa tan 460mg (1,0mmol) chất AT2 trong 5ml pyridine và 3ml acetic

anhydide. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24h. Cất loại dung

môi dưới áp suất giảm, cặn rắn thu được được hòa tan hoàn toàn bằng CH2Cl2 và

trung hòa với dung dịch HCl 1N. Pha hữu cơ được rửa với nước (3 lần), làm khan,

cất loại dung môi và làm sạch sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

n-hexane : EtOAc = 8:1 thu được 466mg chất AT18 ở dạng chất rắn màu trắng,

hiệu suất 86%.



1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz): 0,83 (3H, d, J= 7,0 Hz); 0,89

(3H, s); 0,99 (3H, s); 1,07 (3H, s); 1,68 (3H, s); 1,96 (3H, s); 2,09 (3H, s); 2,37 (1H,

m); 3,03 (1H, m); 4,60 (1H, s); 4,75 (1H, s); 4,85 (1H, d, J= 2,0 Hz); 5,22 (1H, dt,

J= 11,0 và 6,0 Hz).


21,4; 22,0; 26,3; 29,4; 30,5; 32,1; 32,6; 33,5; 33,8; 35,8; 36,8; 36,9; 38,1; 42,3;

42,4; 45,8; 46,4; 48,9; 50,5; 56,2; 72,8; 74,5; 110,2; 149,6; 170,1; 171,1.

b. Tổng hợp các dẫn xuất amide của AT2

Tương tự như quá trình amide hóa hợp chất AT1, đầu tiên acyl hóa AT2 với

acetic anhydride trong pyridine tạo thành dẫn xuất diacetyl AT18, sau đó nhóm acid

ở C-17 của chất này được chuyển hóa thành các amide.

73

24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-amide (AT19):

Hòa tan 54mg (0,1mmol) chất AT18 trong 0,1ml oxalyl chloride và 3ml

CH2Cl2, khuấy ở nhiệt độ phòng. Sau 48h, hỗn hợp phản ứng được cất loại CH2Cl2

và oxalyl chloride dư dưới áp suất giảm. Chất rắn còn lại được hòa tan trong 10ml

THF và nhỏ từ từ vào 10ml dung dịch amoniac 25% ở 0oC, sau đó khuấy qua đêm ở

nhiệt độ phòng. Trung hòa hỗn hợp phản ứng với HCl 1N rồi chiết với ethyl acetate,

làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Cặn thu được tiếp tục được làm sạch trên

cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 9:1 thu được 42mg chất AT19, ở

dạng chất rắn màu trắng, hiệu suất 78%.



1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz): 0,82 (3H, d, J = 6.5 Hz); 0,89

(3H, s); 1,02 (3H, s); 1,06 (3H, s); 1,67 (3H, s); 1,95 (3H, s); 2,08 (3H, s); 3,07 (1H,

dt, J = 11,0 và 4,0 Hz); 4,58 (1H, s); 4,74 (1H, s); 4,84 (1H, d, J = 2,5 Hz); 5,22

(1H, dt, J = 11,0 và 5,5 Hz); 5,60 (2H, br s).


21,4; 22,0; 26,3; 29,2; 30,6; 32,8; 33,5; 33,9; 35,8; 38,1; 38,2; 42,4; 45,8; 46,1;

49,5; 50,6; 55,6; 72,9; 74,4; 110,0; 150,0; 169,9; 171,0; 178,6.

Chuyển hóa tạo các dẫn xuất amide của hợp chất AT2 cũng hoàn toàn tương

tự như ở hợp chất AT1. Từ dẫn xuất AT18 đã thực hiện chuyển hóa thành các dẫn

xuất AT20, AT21, AT22, AT23 với các tác nhân, tỉ lệ và hiệu suất phản ứng như

Bảng 3.4:



(COCl)2/ CH2Cl2 (ml/ml)

Amine/CH2Cl2

(mmol/ml) (C2H5)3N/ CH2Cl2

(μg/mmol)

LSP (mg)

H (%)

AT20 54/0,1 0,1/3 NH2(CH2)10COOCH3 0,3/5

50/5 55 75

AT21 54/0,1 0,1/3 NH2(CH2)4CHCH3NH2 3/5

50/5 44 68

74

AT22 54/0,1 0,1/3 NH2(CH2)9NH2 3/5

50/5 45 65

AT23 54/0,1 0,1/3 NH2(CH2)3OH 0,3/5

50/5 43 72

Methyl-N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-11-amino

undecanoate (AT20)




C45H74NO7 là 740,5465)


(3H, s); 1,00 (3H, s); 1,06 (3H, s); 1,94 (3H, s); 2,06 (3H, s); 2,30 (2H, t, J = 7,5

Hz); 2,66-2,72 (1H, m); 3,08-3,19 (m, 2H); 3,25-3,32 (m, 1H); 3,67 (3H, s); 4,57

(1H, s); 4,74 (1H, s); 4,84 (1H, d, J = 2,5 Hz); 5,22 (1H, dt, J = 11,0 và 5,5 Hz),

5,57 (1H, t, J = 5,5 Hz).


21,4; 22,0; 25,0; 26,3; 27,0; 29,1; 29,2; 29,5; 29,9; 30,8; 32,9; 33,5; 33,9; 34,1;

35,8; 35,9; 38,1; 39,3; 42,4; 42,5; 45,9; 46,3; 49,8; 50,7; 51,4; 55,5; 72,9; 74,5;

109,9; 150,2; 169,8; 171,0; 174,3; 175,6.

N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,5-diaminohexane (AT21)




C39H65N2O5 là 641,48935).


(3H, s); 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz); 0,99 (3H, s); 1,05 (3H, s); 1,66 (3H, s); 1,94 (3H,

s); 2,08 (3H, s); 3,06-3,08 (2H, m); 3,18-3,28 (2H, m); 4,57 (1H, s); 4,73 (1H, s);

75

4,84 (1H, d, J = 2,0 Hz); 5,19-5,21 (1H, m); 5,97-5,99 (1H, m).


21,3; 22,0; 26,3; 29,2; 30,8; 32,8; 33,5; 33,9; 35,8; 38,1; 42,4; 42,5; 45,9; 46,3;

49,7; 50,7; 55,6; 73,0; 74,4; 111,0; 150,2; 169,9; 171,0; 176,0.

N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,9-diaminononane (AT22)




C42H71N2O5 là 683,53630).


(3H, s); 1,00 (3H, s); 1,06 (3H, s); 1,69 (3H, s); 1,94 (3H, s); 2,09 (3H, s); 3,08-3,13

(1H, m); 3,15-3,19 (1H, m); 3,25-3,29 (1H, m); 4;57 (1H, s); 4,74 (1H, s); 4,84 (1H,

d, J = 2,0 Hz); 5,21 (1H, dt, J = 11,0 và 5,5 Hz); 5,64 (1H, t, J = 5,5 Hz).


21,3; 22,0; 26,8; 27,0; 29,2; 29,3; 29,5; 29,8; 30,8; 32,4; 32,9; 33,5; 33,8; 33,9;

35,8; 36,0; 38,1; 38,4; 39,2; 41,7; 42,4; 42,5; 45,9; 46,3; 49,8; 50,7; 55,5; 72,9;

74,4; 109,9; 150,2; 179,8; 171,0; 175,6.

N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-3-aminopropanol-1 (AT23)


C36H58NO6 là 600,42641).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ, ppm, J/Hz): 0,82 (3H, d, J = 6,6 Hz); 0,.89

(3H, s); 1,03 (3H, s); 1,06 (3H, s); 1,67 (3H, s); 1,95 (3H, s); 2,08 (3H, s); 3,03 (1H,

dt, J = 11,0 và 4,0 Hz); 3,42-3,46 (2H, m); 3,68-3,71 (2H, m); 4,59 (1H, s); 4,74

(1H, s); 4,85 (1H, d, J = 2,5 Hz); 5,18 (1H, dt, J = 11,0 và 5,5 Hz); 6,20 (1H, t, J =

5,5 Hz).


21,4; 22,0; 26,3; 29,3; 30,7; 32,2; 33,0; 33,5; 33,8; 34,1; 35,9; 36,1; 36,8; 38,1;

76

38,5; 42,5; 42,7; 45,9; 46,2; 49,3; 50,8; 55,9; 60,2; 73,2; 74,4; 110,1; 149,9; 170,2;

171,0; 177,1.

N - [24-nor - 3α,11α-diacetoxy – lup - 20(29)-ene - 28-oyl] - 3-amino-1-propanol

acetate (AT24)

Dẫn xuất amide AT23 có chứa nhóm hydroxyl trong phân tử, dễ dàng tham

gia phản ứng acetyl hóa tạo dẫn xuất AT24. Hỗn hợp gồm 60mg (0,1mmol) chất

AT23 và 0,1 ml acetic anhydride trong 1ml pyridine được khuấy ở nhiệt độ phòng

trong 12h. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được cất loại dung môi

dưới áp suất giảm. Cặn rắn thu được được hòa tan hoàn toàn bằng CH2Cl2 và trung

hòa với dung dịch HCl 1N. Dịch CH2Cl2 được rửa với nước (3 lần), làm khan và cất

loại dung môi. Sản phẩm thô được tinh chế trên sắc ký cột silica gel với hệ dung

môi n-hexane : EtOAc = 3:1 thu được 56mg hợp chất AT24 ở dạng chất rắn màu

trắng, hiệu suất 87%.


C38H60NO7 là 642,43698).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 0,81 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,89 (3H, s); 0,99

(3H, s); 1,06 (3H, s); 1,67 (3H, s); 1,94 (3H, s); 2,07 (3H, s); 2,08 (3H, s); 2,65-2,71

(1H, m); 3,08-3,13 (1H, m); 3,21-3,27 (1H, m); 3,32-3,37 (1H, m); 4,10-4,19 (2H,

m); 4,57 (1H, s); 4,74 (1H, s); 4,84 (1H, d, J = 2,5 Hz); 5,22 (1H, dt, J = 11,0 và 6,0

Hz); 5,91 (1H, t, J = 6,5 Hz).


20,9; 21,3; 22,0; 26,3; 29,0; 29,2; 29,7; 30,8; 32,9; 33,5; 33,7; 34,0; 35,9; 36,0;

38,1; 38,3; 42,4; 42,5; 45,9; 46,3; 49,8; 50,7; 55,5; 62,0; 72,9; 74,4; 109,9; 115,8;

150,1; 169,8; 171,0; 171,4; 175,9.

Hai dẫn xuất diacetate AT19, AT20 tiếp tục được thủy phân đưa về hợp chất

AT25, AT26 có 3α-OH và 11α-OH.

24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-amide (AT25)

Hỗn hợp phản ứng gồm 27mg (0,05mmol) chất AT19 và 0,5ml dung dịch

77

NaOH 4N trong 5ml dung dịch của THF/CH3OH (1:1) được khuấy ở nhiệt độ

phòng trong 12 giờ. Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm, cặn còn lại được

hòa tan trong nước cất và trung hòa bằng HCl 2N đến pH = 7. Chiết với CH2Cl2,

dịch chiết được rửa với nước, làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi, tinh chế

sản phẩm bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane: EtOAc = 2:1 thu được 17

mg chất AT25, chất rắn màu trắng, hiệu suất 75%




(3H, s); 0,98 (3H, s); 1,00 (3H, s); 1,69 (3H, s); 2,64 (1H, m); 3,09 (1H, dt, J = 11,0

và 4,5 Hz); 3,70 (1H, d, J = 2,5 Hz); 3,96 (1H, dt, J = 11,0 và 5,0 Hz); 4,61 (1H, s);

4,76 (1H, s); 5,69 (1H, br s); 5,87 (1H, br s).


29,2; 30,6; 33,9; 34,2; 34,6; 35,6; 36,4; 37,9; 38,2; 38,5; 42,2; 42,3; 44,9; 46,2;

49,2; 53,4; 55,6; 70,8; 71,6; 109,8; 150,2; 179,4.

N-[24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-11-aminoundecanoic acid

(AT26)

Lấy 37 mg hợp chất AT20 (0,05 mmol) và tiến hành thủy phân tương tự như

với hợp chất AT19 thu được 26mg chất AT26, chất rắn màu trắng, hiệu suất 82%.




(3H, s); 0,98 (3H, s); 1,00 (3H, s); 1,68 (3H, s); 2,32 (2H, t, J = 7,5 Hz); 3,12-3,18

(2H, m); 3,24-3,29 (1H, m); 3,71 (1H, d, J = 2,0 Hz); 3,97 (1H, dt, J = 10,5 và 5,0

Hz); 4,60 (1H, s); 4,76 (1H, s); 5,66 (1H, t, J = 5,5 Hz).


24,9; 26,9; 29,1; 29,2; 29,4; 29,8; 30,8; 33,9; 34,2; 34,3; 34,7; 35,7; 36,6; 38,1;

38,4; 38,6; 39,2; 42,3; 42,4; 45,0; 46,5; 49,6; 53,5; 55,5; 71,0; 71,8; 109,8; 150,4;

78

176,0; 178,5.

c. Tổng hợp dẫn xuất nitrile của AT2

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu đã tiến hành chuyển hóa hợp chất AT2 thành dẫn

xuất cyanua ở vị trí C-28 qua hợp chất AT19.

24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-nitrile (AT27)

Lấy 108mg (0,2mmol) chất AT19 và 65mg (0,5mmol) 4-DMAP hòa tan

trong 10ml CH2Cl2. Sau đó thêm vào hỗn hợp này dung dịch chứa 0,1ml acetyl

chloride trong 5ml CH2Cl2. Hỗn hợp phản ứng được khuấy trong 15 phút ở nhiệt độ

phòng. Sau khi phản ứng kết thúc, 10ml HCl 1N được thêm vào, dịch CH2Cl2 được

rửa với dung dịch NaHCO3 (20mlx3), làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi,

tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi là n-hexane: EtOAc =

4: 1 thu được 82mg chất AT27 ở dạng rắn màu trắng, hiệu suất 78%.



(3H, s); 1,05 (3H, s); 1,15 (3H, s); 1,67 (3H, s); 1,96 (3H, s); 2,08 (3H, s); 2,17-2,21

(1H, m); 2,66 (1H, dt, J = 11,0 và 5,5 Hz); 4,65 (1H, s); 4,78 (1H, s); 4,85 (1H, d, J

= 2,5 Hz); 5,21 (1H, dt, J = 11,0 và 5,0 Hz).


21,3; 21,9; 26,3; 28,8; 29,5; 31,1; 32,0; 33,5; 34,0; 35,7; 35,9; 38,1; 39,8; 42,2;

42,3; 45,8; 48,0; 48,8; 49,0; 50,5; 72,4; 74,3; 111,4; 123,1; 147,4; 169,8; 170,9.

79

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả từ loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)

4.1.1. Thành phần hóa học của cặn n-hexane

Cặn chiết n-hexane thu được từ rễ loài Thông lá dẹt chiếm 0,27% (so với

mẫu rễ khô), có đặc điểm sánh, trong và màu vàng nhạt, có mùi đặc trưng của tinh

dầu thông. Theo một số tài liệu đã công bố, tinh dầu của một số loài thuộc chi Pinus

có khả năng ức chế tế bào ung thư, giảm mỡ máu, kháng nấm…[82][83]. Khảo sát

sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy cặn chiết n-hexane chủ yếu là chất kém phân

cực, vì vậy cặn chiết này được tập trung xác định thành phần hóa học bằng phương

pháp sắc ký khí gắn khối phổ (GC-MS) và cho kết quả ở Bảng 4.1.

Bảng 4.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của cặn chiết n-hexane bằng phương pháp GC-MS

TT Hợp chất Thời gian lưu (RT, phút)

Hàm lượng (%)

1 α-terpineol 13,332 1,02

2 1-tert-butyl-1,5-cyclooctadiene 20,038 0,23

3 α-amorphene 20,839 0,22

4 δ-cadiene 21,962 0,28

5 Nerolidol 22,871 13,79

6 α-copaene 24,839 1,10

7 Farnesol 22,022 0,50

8 (E,E)-α-farnesene 25,354 1,08

9 α-bisabolol 25,640 0,63

10 Caryophylla-2(12),6(13)-dien-5-one 26,310 0,32

11 (+)α-atlantone 27,580 2,31

12 Todomatuic acid 33,079 4,10

13 Trans-Octadec-9-enoic acid 34,486 0,98

14 Octadecanoic acid 34,875 0,43

15 O-(3,5-dimethoxyphenyl)-2-phenylethene 36,260 8,18

80

Theo số liệu ở Bảng 4.1, từ cặn chiết n-hexane đã xác định được 15 hợp

chất, trong đó có mặt của α-terpineol (1,02%), một hợp chất đặc trưng của tinh dầu

thông và chất thơm như nerolidol (13,79%).

4.1.2. Các chất phân lập được từ cặn EtOAc

Từ cặn chiết EtOAc, đã phân lập được 6 chất PK1-PK6 sạch. Cả sáu chất

này đều hấp thụ ánh sáng dưới đèn tử ngoại (254nm) và hiện màu vàng hoặc đỏ với

thuốc thử Vanilin/H2SO4 khi hơ nóng và được dự đoán là các hợp chất flavonoid.

Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ (cộng hưởng từ hạt

nhân, phổ khối, phổ hồng ngoại) và so sánh với các số liệu đã công bố.

4.1.2.1. Tectochrysin (PK1)

Hợp chất PK1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ khối ESI-

MS xuất hiện tín hiệu pic ion phân tử ở m/z 269,1 [M+H]+ và kết hợp với số liệu

phổ NMR đã xác định được công thức phân tử của PK1 là C16H12O4.

Từ dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của PK1 cho thấy phân tử chất này có

một nhóm methoxyl (δC 56,3; OCH3), 15 nguyên tử C còn lại đặc trưng cho khung

cơ bản của nhóm flavonoid gồm 8 nhóm methine (8xCH, trong đó có 7 nhóm CH

nhân thơm: δC 92,7-129,0 ppm) và 1 nhóm CH olefinic (δC 105,3); 7 cacbon bậc 4

trong đó có một tín hiệu nhóm cacbonyl (C-4) ở δC 181,9. Phổ 1H-NMR phù hợp

với dữ kiện phổ 13C-NMR. Phía trường thấp (δH 6,32 ÷ 8,03 ppm), xuất hiện tín

hiệu của 8 proton, trong đó có 7 tín hiệu của hai vòng nhân thơm A, B và một tín

hiệu singlet của proton olefinic ở δH 6,94 (s,H-3). Cặp doublet ở δH 6,32 và 6,69

(mỗi tín hiệu 1H, d, J = 2,0 Hz, H-6/H-8) chỉ ra rằng hai proton này ở vị trí meta-

với nhau hay nói cách khác vòng A bị thế ở C-5, C-7. Trong khi đó, tín hiệu của 5

proton thơm của vòng B ở δH 8,03 ppm (2H, d, J = 7Hz, H-2’/H-6’) và δH 7,53-7,59

ppm (3H, m, H-3’, H-4’, H-5’) cho thấy vòng B không bị thế. Sự có mặt của nhóm

81

methoxy trong phân tử được khẳng định qua tín hiệu proton ở δH 3,83 ppm và

cacbon ở δC 56,0 ppm. Ngoài ra, phổ 1H-NMR phía trường thấp còn có tín hiệu

singlet ở δH = 12,76 ppm, đặc trưng cho nhóm OH có liên kết cầu hydro nội phân tử

[84] và như vậy, nhóm OH phải gắn ở C-5 (OH-5) vì nếu nhóm OH gắn ở C-7 (OH-

7), thì tín hiệu này sẽ là singlet rộng tù và ở phía trường cao hơn (δH 9,5-9,6 ppm).

Từ đó có thể suy ra nhóm methoxy ở vị trí C-7. So sánh với số liệu đã công bố, các

số liệu phổ NMR của PK1 phù hợp với phổ của 5-hydroxy-7-methoxyflavone ở

từng vị trí tương ứng (Bảng 4.2). Qua phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với tài

liệu, cấu trúc của hợp chất PK1 được xác định là 5-hydroxy-7-methoxyflavone

(tectochrysin) [84], [85]. Tectochrysin được coi là tác nhân chống ung thư

(antineoplastic agent) và thường được tìm thấy trong các loài thuộc chi Pinus và

một số loài thực vật khác [6].

Bảng 4.2. Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK1 và tectochrysin [85] Vị trí

PK1 Tectochrysin δHa,b

δC a,c δH# δC#

2 - 162,6 - 164,3 3 6,94 s 105,3 6,69 s 106,1 4 - 181,9 - 182,5 5 - 163,3 - 162,5 6 6,32 d(2,0) 98,0 6,38 d(2,5) 98,4 7 - 165,3 - 165,9 8 6,69 d(2,0) 92,7 6,52 d(2,5) 92,9 9 - 157,3 - 158,1

10 - 104,8 - 105,9 1’ - 132,0 - 131,6 2’ 8,03 d(7,0), 2H 126,3 7,89 m, 2H 126,5 6’ 3’ 7,53-7,59 m, 3H 129,0 7,53 m, 3H 129,3 5’ 4’ 128,5 132,0

OMe 3,83 s 56,0 3,89 s 56,0 OH 12,76 br s - 12,69 s -

a Đo trong DMSO-d6, b 500 MHz, c 125 MHz- # Số liệu phổ của tectochrysin đo trong CDCl3 [85]

82

Hình 4.1. Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK1

Hình 4.2. Phổ 1H-NMR của chất PK1 (500 MHz, DMSO-d6)

2O

OH O

O1

345

6

78

9

10

1'

2'

3'4'

5'

6'A

B

C

[M+H]+

83

Hình 4.3. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK1 (125 MHz, DMSO-d6)

4.1.2.2. Pinostrobin (PK2)

Hợp chất PK2 thu được ở dạng tinh thể không màu. Dữ liệu phổ NMR của

PK2 có nhiều nét tương đồng với dữ liệu phổ PK1. Tương tự PK1, trên phổ 1H-

NMR của PK2 cũng thấy xuất hiện tín hiệu của một nhóm methoxy tại δH 3,83 (3H,

s) và 7 proton thơm (δH 6,07 ÷ 7,52 ppm). Cặp doublet ở δH = 6,11 và 6,07 ppm

(mỗi tín hiệu 1H, d, J = 2,0 Hz) cho thấy hai proton này ở vị trí meta- với nhau (H-

6/H-8). Cụm tín hiệu ở δH 7,37-7,52 (5 H, m) cho thấy vòng B không chứa nhóm

thế. Từ dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất PK2 cho thấy phân tử chất

này có 16 nguyên tử cacbon, bao gồm: 1 nhóm CH3; 8 nhóm CH trong đó 7 nhóm

CH của vòng thơm; 6 cacbon bậc 4 trong đó một tín hiệu nhóm ketone cacbonyl (δC

84

197,7; C-4) và 1 nhóm methylene CH2. So sánh với PK1, phổ của chất PK2 thiếu

một tín hiệu của cacbon bậc 4, thay vào đó là sự xuất hiện thêm một tín hiệu của

nhóm methylene (δC 44,2). Bên cạnh đó, là sự dịch chuyển của nhóm CH về phía

trường cao (ΔδC -24,8ppm) và nhóm cacbonyl ở trường thấp hơn (ΔδC +15,8 ppm).

Điều này gợi mở AT2 là dạng hydro hóa của vị trí C-2/C-3 của PK1. Cấu trúc PK2

còn được khẳng định thêm trên phổ 1H-NMR. Cụm ba tín hiệu doublet của doublet

ở δH 3,15 ppm (dd, J = 17,0 Hz và 13,5 Hz, H-3A), δH 2,83 ppm (dd, J = 17,0 Hz và

2,5 Hz, H-3B) và δH 5,51 (dd, J = 13 Hz và 2 Hz, H-2) là các tín hiệu của proton

được xem là vân tay nhận dạng của các hợp chất thuộc khung flavanone [86]. Các

số liệu phổ của hợp chất PK2 được đưa ra ở Bảng 4.3. Qua phân tích các dữ liệu

phổ và so sánh với số liệu đã công bố [86], cấu trúc của hợp chất PK2 được xác

định là 5-hydroxy-7-methoxyflavanone (pinostrobin, glyyunnanin). Chất này

thường được tìm thấy trong chi Pinus và nhiều loài khác và gần đây (2014) cũng

được tìm thấy từ cây Cajanus cajan (L.) [87]. Do có nhiều hoạt tính như chống ung

thư và một số bệnh dạ dày, đường ruột… nên pinostrobin đã được Kevin J Hodgetts

tổng hợp bằng con đường hóa học [88].

Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK2 và pinostrobin [86]

Vị trí

PK2 Pinostrobin δHa,b

δCa,c δH# δC#

2 5,51 dd 80,5 5,39 dd (12,84;2,76) 79,0

3 3,15 dd (17,0;13,5) 2,83 dd (17,0;2,5)

44,2 3,06 dd (15,14; 12,84) 2,79 dd (14,68; 2,76)

43,2

4 - 197,7 - 195,7

5 - 164,4 - 162,7

7 - 169,5 - 167,8

6 6,11 d (2,0) 95,9 6,05 d (2,72), 2H

95,0

8 6,07 d (2,0)) 95,0 94,1

9 - 165,2 - 164,0

10 - 104,1 - 103

1’ - 140,3 - 138,3

85

2’ 7,52 d (7,0), 2H 127,3

7,41 m, 5H 126,0

6’

3’

7,37-7,45 m, 3H 130,3

5’

4’ 129,7 128,8

OMe 3,83 s 56,3 3,83 s 56,3 aĐo trong CD3OD, b500 MHz, c125 MHz, # Số liệu phổ của pinostrobin đo trong CDCl3 [86]

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của chất PK2 (500 MHz, CD3OD)

Hình 4.5. Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK2 (500 MHz, CD3OD)

86

Hình 4.6. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK2 (125 MHz, CD3OD)

4.1.2.3. Pinobanksin (PK3)

Hợp chất PK3 thu được dạng chất rắn màu vàng. Trên phổ hồng ngoại cho

đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl tại νmax 3437cm-1, nhóm carbonyl tại νmax

1627cm-1.

Phổ 13C-NMR của chất PK3 cho tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon bao gồm

9 cacbon của nhóm methine (9xCH) và 6 cacbon bậc 4 trong đó 1 cacbon của nhóm

cacbonyl (δC 198,1 ppm). So sánh với PK2, phổ 1H-NMR của PK3 cũng có cặp tín

hiệu doublet ở δH 5,93 và 5,96 ppm (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 2,0 Hz) và cụm tín hiệu

của 5 proton ở δH 7,42 (3H; m); δH 7,55 (2H, dd, J =8,0 và 2,0 Hz). Như vậy, PK3

có cấu trúc vòng A, B tương tự như chất PK2, vòng A bị thế ở C-5, C-7 và vòng B

không có nhóm thế. Tuy nhiên trên phổ 1D-NMR của chất PK3 không thấy tín

87

hiệu của nhóm methoxy và độ dịch chuyển của C và H có sự thay đổi ở vòng C.

Theo đó, pic ở δH 3,15 và 2,83/ δC 44,2 của PK2 đã được thay thế bằng pic doublet

ở độ dịch chuyển δH 4,55/ δC 73,7 của PK3. Điều này gợi ý một proton của nhóm

methylene đã được thay thế bằng nhóm oxymethine. Điều này được chứng minh

thêm qua pic ion phân tử ở m/z 273,1 [M+H+] ứng với công thức phân tử của PK3

là C15H12O5 ở phổ khối ESI-MS.

Ngoài ra, cặp doublet ở δH 4,55 (H-2) và 5,08 (H-3), có cùng hằng số tương

tác (J = 11,5 Hz) cho thấy H-2 và H-3 ở dạng trans với nhau. Độ dịch chuyển hóa

học của C-2 (δC 85,0) và C-3 (δC 73,7) phù hợp với số liệu phổ 13C-NMR ở từng vị

trí tương ứng của 3,5,7-trihydroxyflavanone có cấu hình 2S, 3R (Bảng 4.4). Chất

PK3 có năng suất quay cực [αD]25 = +25o (MeOH, c =0,4), cùng dấu với (2S), (3R)-

3,5,7-trihydroxyflavanone (pinobanksin, [αD]25 = +15o (MeOH, c =2) [4], khẳng

định thêm cấu hình này của PK3. Qua phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với số

liệu đã công bố [4], cấu trúc của hợp chất PK3 được xác định là 3,5,7-

trihydroxyflavanone (pinobanksin) và có cấu hình (2S,3R).

Bảng 4.4. Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK3 và số liệu của pinobanksin [4] Vị trí PK3 Pinobanksin

δHa,b δCa,c

δC# 2 5,08 d (11,5) 85,0 83,5 3 4,55 d (11,5) 73,7 72,5 4 - 198,1 196,0 5 - 164,4 163,6 6 5,96 d (2,0)) 97,5 96,9 7 - 168,7 167,5 8 5,93 d (2,0) 96,4 96,0 9 - 165,3 163,0 10 - 101,8 100,5 1’ - 138,5 138,5 2’ 7,55 dd (8,0;2,0), 2H 128,9 127,6 6’ 3’ 7,42 m, 3H 129,4 128,6 5’ 4’ 129,9 129,2

a Đo trong CD3OD, b500 MHz, c125 MHz # Số liệu phổ của pinobanksin đo trong CDCl3 [4]

88

Hình 4.7. Phổ khối FT-IR của chất PK3

Hình 4.8. Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK3

[M+H]+

89



2O

OH O

HO1

34

56

78

9

10

1'

2'

3'4'

5'

6'

OH

A C

B

90

Hình 4.11. Phổ 13C-NMR của chất PK3 (125 MHz, CD3OD)

4.1.2.4. Galangin (PK4)

Hợp chất PK4 thu được ở dạng rắn, có màu vàng. Phổ 13C-NMR của PK4 có

tín hiệu của 15 cacbon đặc trưng cho hợp chất có khung flavone, bao gồm: 7 cacbon

nhóm CH và 8 cacbon bậc 4 trong đó có một cacbon của nhóm cacbonyl (δC177,6

ppm). Chất này cho pic ion phân tử ở m/z 271,0 [M+H]+ trên phổ ESI-MS và có ít

hơn 2 đơn vị mu so với PK3, gợi ý đây là dẫn xuất dehydro của PK3. Kết hợp dữ

liệu phổ MS với phổ 13C-NMR và DEPT cho phép dự đoán công thức phân tử của

PK4 là C15H10O5. Phổ 1H-NMR của PK4 có cụm tín hiệu của 5 proton thơm ở δH

8,18 (2H, d, J = 8,0 Hz; H-2’/6’) và 7,48 (dd, J = 2,0; 8,0, H-3’/H-5’) và δH 7,48

(1H, d, J =7,0, H-4’) cho thấy vòng B không nhóm thế giống như các chất PK1-

91

PK3. Cặp doublet ở δH 6,19 và 6,39 có hằng số tương tác J = 2,0 Hz là tín hiệu của

2 proton ở vị trí meta với nhau ở vòng A và như vậy 2 nhóm hydroxy gắn ở C-5 và

C-7. So sánh với số liệu phổ của chất PK1, chất này không có tín hiệu singlet của

H-3. Kết hợp dữ liệu phổ NMR với công thức phân tử (C15H10O5), cho phép kết luận

nhóm OH còn lại phải gắn ở C-3. Các số liệu phổ của chất PK4 phù hợp với phổ

của 3,5,7-trihydroxyflavone ở từng vị trí tương ứng (Bảng 4.5). Qua phân tích các

dữ liệu phổ và so sánh với số liệu của PK1, ta có thể khẳng định cấu trúc của PK4

thuộc nhóm flavone như PK1 nhưng C-3, C-7 đều gắn với nhóm OH hay nói cách

khác hợp chất PK4 được xác định là 3,5,7-trihydroxyflavone (galangin). Galangin

được coi là tác nhân kháng khuẩn, chống viêm khá triển vọng vì nó không độc và

thường được tìm thấy trong nhiều cây thuốc phổ biến ở các bài thuốc dân tộc [89].

Bảng 4.5. Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK4

Vị trí

PK4 Vị trí

PK4

δHa,b δCa,c

δHa,b δCa,c

2 - 158,4 1’ - 146,9

3 - 138,4 2’ 8,18 d (8,0), 2H 127,2

4 - 177,6 6’

5 - 162,6 3’ 7,48 dd (2,0; 8,0), 2H

129,7

6 6,39 d (2,0) 99,4 5’

7 - 165,9 4’ 7,48 d (7,0), 1H 129,6

8 6,19 d (2,0) 94,6 OMe - -

9 - 158,4 OH - -

10 - 103,3 aĐo trong CD3OD, b500 MHz, c125 MHz,

92

Hình 4.12. Phổ ESI-MS (positive ion) của chất PK4

Hình 4.13. Phổ 1H-NMR của chất PK4(500 MHz, CD3OD)

2O

OH O

HO1

34

56

78

9

10

1'

2'

3'4'

5'

6'

OH

A C

B

[M+H]+

93

Hình 4.14. Phổ 13C-NMR của chất PK4 (125 MHz, CD3OD)

4.1.2.5. Strobopinin (PK5)

Hợp chất PK5 được phân lập ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng. Nhóm

hydroxyl trong phân tử được đặc trưng bởi dải hấp thụ rộng trong vùng 3383cm-1

trên phổ FT-IR. Ở phổ này cũng cho đỉnh hấp thụ mạnh ở νmax 1623cm-1 cho thấy

sự tồn tại của nhóm cacbonyl trong phân tử.

Tương tự như PK3, chất PK5 cũng có cấu trúc của một flavanone. Phổ 13C-

NMR và DEPT cho biết PK5 có 16 nguyên tử cacbon, bao gồm 6 cacbon bậc 4

trong đó có một cacbon thuộc nhóm cacbonyl keton (δC 197,7); 7 cacbon của nhóm

CH với 6 nhóm CH vòng thơm; 1 nhóm methylene (δC 44,1) và 1 nhóm methyl

(δC7,7). Trên phổ 1H-NMR của PK5 thấy xuất hiện cụm tín hiệu của 5 proton thơm

94

ở δH 7,35-7,42 ppm gợi ý vòng B không có nhóm thế và singlet của một proton

thơm ở δH 6,00 cho thấy vòng A bị thế ở 5 vị trí. Mặt khác, chất này còn có thêm tín

hiệu của một nhóm methyl gắn vào nhân thơm (δH1,98 3H, s/ δC 7,7), cho phép dự

đoán nhóm methyl này gắn ở vòng A. Hai proton của nhóm methylene xuất hiện ở

δH 2,80 và 3,05ppm (mỗi tín hiệu 1H, dd, J =13,0;17,0, H-3A, H-3B) và doublet

kép ở δH 5,44 ppm (dd, JH2/H-3B = 3,0; JH2/H-3A = 13,0) là của H-2.

Từ những dữ liệu phổ NMR phân tích ở trên và so sánh với các dữ liệu phổ

đã công bố cho thấy nhóm methyl gắn ở vị trí C-6 [90], [91]. Số liệu phổ của chất

này phù hợp ở từng vị trí tương ứng với phổ của 5,7-dihydroxy-6-methyl-flavanone

(strobopinin). Chất PK5 có năng suất quay cực [αD]25 = -52o (MeOH, c =1,0) và có

cùng chiều quay cực với chất (2S)-5,7-dihydroxy-6-methyl-flavanone [(2S)-

strobopinin [αD]25 = - 90,4o (CHCl3, c =0,05)] [86]. Như vậy, PK5 chính là(2S)-

strobopinin, chất thuộc nhóm C-methyl flavan-4-ones thường được tìm thấy trong

thực vật [5], [6].

Bảng 4.6. Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK5 và (2S)-strobopinin [86]

Vị trí PK5 (2S)-Strobopinin

δHa,b δCa,c

δH# δC#

2 5,44 dd (JH2/H3B = 3,0; JH2/H3A=13,0) 80,1 5,52 dd (JH2/H3B = 3,0;

JH2/H3A= 12,5) 79,9

3 2,80 dd (13,0; 17,0) 3,05 dd (13,0; 17,0)

44,1 2,97 ddd (3,0; 12,5; 17,0), 2H 43,8

4 - 197,7 - 196,9

5 - 161,4 - 161,6

6 - 104,7 - 103,1

7 - 166,4 - 165,1

8 6,00 s 96,4 6,08 s 95,2

9 - 163,0 - 162,5

95

10 - 103,3 - 104,9

1’ - 140,7 - 140,2

2’

7,42 m

127,2

7,38-7,58 m

127,3 6’

3’ 129,7 129,5

5’

4’ 129,6 129,4

6-Me 1,98 s, 3H 7,7 1,99 s, 3H 7,1

5-OH - - 12,44 br s -

7-OH - - 9, 52 br s - a Đo trong (CD3OD), b500 MHz, c125 MHz # Số liệu phổ của (2S)- strobopinin đo trong acetone-d6 [86]

Hình 4.15. Phổ FT-IR của chất PK5

96



97


4.1.2.6. Cryptostrobin (PK6)

Hợp chất PK6 kết tinh tinh thể dạng hình kim, màu vàng. Phổ NMR của chất

PK6 cũng cho các tín hiệu đặc trưng của flavanone, có 16 nguyên tử cacbon, trong

đó có một nhóm methyl (δH 2,05/δC7,0), cụm tín hiệu của 5 proton ở δH 7,35-7,42

ppm (δC 127,3-129,6) (Bảng 4.7) cho thấy vòng B không có nhóm thế. Để xác định

cấu trúc của PK6 chúng tôi tiến hành so sánh dữ liệu phổ của chất này với dữ liệu

phổ của chất PK5 và các dữ liệu phổ đã được công bố [92]. Chất này có phổ NMR

khá giống với PK5, chỉ khác nhau chủ yếu ở C-8 và C-6, gợi ý cho thấy đây là một

đồng phân của PK5 có vị trí nhóm thế thay đổi ở vòng A. Tín hiệu singlet ở δH 6,00

gợi ý cho thấy vòng A phải có năm nhóm thế, như vậy nhóm methyl có thể gắn ở C-

8 thay vì ở C-6 như ở PK5. Điều này được khẳng định thêm qua độ dịch chuyển

98

hóa học của C-6 ở phía trường cao hơn (δC 95,3; ∆δC -9,4 ppm) và C-8 ở phía

trường thấp hơn (δC 105,5; ∆δC +9,1 ppm) và nhóm methyl ở δC 7,0 (∆δC +0,7 ppm)

so với PK5. Sự khác biệt trên chỉ có thể là do nhóm CH3 gắn vào C-8 mà không

phải ở C-6 như PK5. Ngoài ra, dữ liệu phổ NMR ở C-2 và các cacbon ở vòng B của

hai chất này hoàn toàn giống nhau. Bên cạnh đó, PK5 và PK6 có cùng nguồn gốc

tự nhiên trong quá trình sinh tổng hợp nên chúng tôi dự đoán hai hợp chất có cùng

cấu hình ở C-2 là S. Điều này được khẳng định thêm qua năng suất quay cực của

chất PK6: [αD]25 = -35o (MeOH, c =0,6) và cùng chiều với chất (2S)-5,7-dihydroxy-

8-methyl-flavanone [(2S)-strobopinin: [αD]25 = -33,1o (MeOH, c =1,1)] [6]. Như vậy

cấu trúc của hợp chất PK6 được xác định là (2S)-5,7-dihydroxy-8-methyl-flavanone

[(2S)-cryptostrobin]. Số liệu phổ của chất PK6 hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ

đã công bố [92] (Bảng 4.7). Chất này thường được tìm thấy trong gỗ của các loài

Pinus.

Bảng 4.7. Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK6 và (2S)-Cryptostrobin [92] Vị trí PK6 (2S)-Cryptostrobin

δHa,b δCa,c

δH# δC# 2 5,41 dd (JH2/H3B =3,0;,

JH2/H3A=13,0) 80,4 5,57 dd (JH2/H3B =5,0; JH2/H3A=12,0) 79,6

3 2,76 dd (3,0; 17,0) 3,07 dd (13,0; 17,0) 44,3

2,98 ddd (3,0; 12,0; 17,0), 2H

43,6

4 - 197,4 - 197,2 5 - 162,1 - 161,0 6 6,00 s 95,3 6,05 s 96,4 7 - 166,1 - 165,3 8 - 105,5 - 103,3 9 - 162,6 - 162,9 10 - 103,1 - 104,1 1’ - 140,6 - 140,4 2’

7,35-7,42 m

127,3

7,35-7,62 5H, m

127,1 6’

3’ 129,7 129,5

5’ 4’ 129,6 129,3

99

8-Me 1,96 s 7,0 2,00 s 7,9 5-OH - - 12,12 br s - 7-OH - - 9, 56 br s -

a Đo trong (CD3OD), b500 MHz, c125 MHz # Số liệu phổ của (2S) Cryptostrobin đo trong acetone-d6 [92]

Hình 4.19. Phổ 1H-NMR của chất PK6 (500MHz, CD3OD)

Hình 4.20. Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK6 (500MHz, CD3OD)

100

Hình 4.21. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK6 (125MHz, CD3OD)

4.1.3. Chất phân lập được từ cặn chiết n-BuOH

Hợp chất PK7 dạng chất rắn màu trắng đã phân lập được từ cặn chiết n-

BuOH. Kết hợp dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR và pic ion phân tử ở m/z 383,1470 [M+Na]+

(tính toán cho công thức C20H24O6 Na+ là 383,1465) ở phổ khối phân giải cao (HR-

ESI-MS), đã xác định được công thức phân tử của chất PK7 là C20H24O6.

Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy chất PK7 có tín hiệu của 20 nguyên tử

cacbon, bao gồm 7 cacbon bậc 4 (7xCq) trong đó có bốn cacbon bậc 4 nối với oxy

(oxy-quartenary carbon, δC 145,1 - 148,9 ppm); 8 nhóm methine (8xCH) trong đó

101

có 5 nhóm methine của vòng thơm (δC 112,3 - 123,1); 3 nhóm methylene (3xCH2),

trong đó có 2 nhóm oxymethylene (δC 62,3; 66,0 ppm); 1 tín hiệu có cường độ lớn

gấp đôi của 2 nhóm methoxy (δC 56,36 ppm, 2xC). Phổ 1H-NMR của PK7 phù hợp

với số liệu phổ 13C-NMR và DEPT. Sự xuất hiện các tín hiệu proton ở δH 6,68 (1H,

br s, H-2) và hai proton có tương tác ortho ở δH 6,76 (1H, d, J = 8,0, H-5) 6,63 (1H,

d, J = 8,0, H-6) cho thấy chất này có chứa vòng thơm bị thế ở C-1, C-3 và C-4.

Ngoài ra, hai singlet ở δH 6,22 (1H, s, H-5’) và 6,66 (1H, s, H-2’) cho biết vòng B

bị thế ở bốn vị trí C-1’, C-3’, C-4’ và C-6’. Kết hợp các dữ liệu phổ cho thấy hợp

chất này có những dữ liệu phổ đặc trưng của lớp chất lignan có vòng thơm gắn tại

C-7.

Vị trí chính xác của các nhóm hydroxyl methylene, methoxy được xác định

qua tương tác ở phổ HMBC. Dựa vào sự tương tác mạnh của H-7’với C-9’; H-8’

với C-9’ và H-7 với C-9; H-8 với C-9 cho thấy có một nhóm hydroxyl methylene

gắn vào C-8’; nhóm thứ hai gắn với C-8. Hai nhóm methoxy được xác định ở vị trí

C-3 và C-3’ dựa trên sự tương tác proton của các nhóm methoxy với C-3 và C-3’.

Bên cạnh đấy, có thể khẳng định vòng A gắn với vòng C tại C-7 thông qua tương

tác của H-2 với C-7; H-6 với C-7. (Hình 4.22).

Hình 4.22. Một số tương tác chính trong phổ HMBC của chất PK7

Cấu hình tương đối của các trung tâm bất đối (C*) được xác định dựa vào

hằng số tương tác trong phổ 1H-NMR và dữ liệu phổ NOESY. Tương tác của H-

7’β/H2-9’ và H-8/H2-9’ trên phổ NOESY cho thấy nhóm hydroxyl methyl ở C-8’ có

cấu hình β. Tương tác của H-7/ H-8’ cũng cho thấy nhân thơm gắn với C-7 có cấu

hình β. Điều này được khẳng định thêm qua độ chuyển dịch khác nhau của C-7

102

(∆δC -1,67 ppm) so với cấu hình α của đồng phân PK7a (Bảng 4.8). Bên cạnh

tương tác H-2/H-8 ở phổ NOESY thì tín hiệu doublet của H-7 (δH 3,79 d) và H-8

(δH 1,79, tt) trên phổ 1H-NMR cho cùng một hằng số tương tác lớn (J = 11 Hz ), cho

thấy hai proton này ở khác phía đối với nhau, và khẳng định được nhóm methylene

ở C-8 có cấu hình α.

Hình 4.23. Một số tương tác chính

trong phổ NOESY của chất PK7

Hình 4.24. Chất burselignan (PK7a)

Dữ liệu phổ của chất PK7 hoàn toàn phù hợp với phổ của isolariciresinol ở

từng vị trí tương ứng và chất này được xác định chính là isolariciresinol (Bảng 4.8)

[93], [94]. Gần đây isolariciresinol và một đồng phân lập thể của nó là burselignan

(PK7a) cùng được tìm thấy từ loài Bursela tonkinensis của Việt Nam [93].

Bảng 4.8. Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK7, (+)-Isolariciresinol và Burselignan [93], [94]

Vị trí

PK7 (+)-Isolariciresinol Burselignan δHa,b

δCa,c δH# δC# δH# δC#

1 - 138,5 138,6 - 135,9

2 6,68 br s 113,8 6,66 d(1;8) 113,8 6,70 d(1;7) 115,2

3 - 148,9 149,0 - 148,2

4 - 145,7 145,9 - 145,8

5 6,76 d(8;0) 115,9 6,73 d(8;0) 115,9 6,66 d(8;1) 115,4

6 6,63 d(8;0) 123,1 6,60 dd(1,8;8) 123,2 6,46 dd(1,7; 8,1) 124,0

7α 7β

3,8d d (11) 48,1* 3,79 d(10,7)

48,1 4,21 d(3,2)

46,5

103

8 1,79 tt(3,7;11) 48,1* 1,75 tt(3,9;10) 48,0 2,07 m 44,7

9α 9β

3,42 dd(4;11) 3,66 m

62,3 3,38 dd(3,9;11) 3,65 dd(4,5;11)

62,2 3,38 dd(6,7;10,6) 3,53 dd(6,0;10,4)

63,4

1' - 128,9 129,0 - 128,4

2' 6,66 s 112,3 6,64 s 112,4 6,71 s 112,3

3' - 147,0 147,2 - 147,8

4' - 145,1 145,3 - 145,5

5' 6,22 s 117,3 6,17 s 117,3 6,36 s 117,0

6' - 134,0 134,2 - 133,0

7’α 7’β

2,78 d(7;5),1H 2,79 d(7;5),1H 33,5

2,77 d(7;7) 33,6

2,65 dd(9,3;16,7),1H 2,96 dd(4,3;16,7),1H 33,1

8' 2,01 m 40,0 1,99 m 40,0 2,07 m 35,5

9' 3,70 m 66,0 3,66 m 65,9 3,58 dd(4,6; 7) 65,8

3-OMe 3,81 s 56,36* 3,76 s 56,3 3,76 s* 56,3

3'-OMe 3,78 s 56,39* 3,79 s 56,4 3,84 s* 56,3

* Tín hiệu có thể trao đổi trong cùng một cột a Đo trong CD3OD, b500 MHz, c125 MHz # Số liệu phổ của isolariciresinol và burselignan đo trong CD3OD [93], [94]

Hình 4.25. Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất PK7

[M+Na]+

104



HO

O

OH

O

OH

OH

2

34

9'

97

7'1'

2'

3'

4'5'

8

8'

A

BC

105

Hình 4.28. Phổ HSQC của chất PK7

Hình 4.29. Phổ HMBC của chất PK7

106

Hình 4.30. Phổ NOESY của chất PK7

***Nhận xét về thành phần hóa học loài Thông Lá dẹt

Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam và là lần thứ hai trên thế giới (lần đầu từ năm

1966), thành phần hóa học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) được

công bố. Kết quả của luận án cho thấy loài Thông lá dẹt có chứa nhiều flavonoid,

lớp chất thường được tìm thấy từ chi này. Ngoài 6 flavonoid, một hợp chất lignan là

isolariciresinol đã được phân lập và xác định. Trong 7 hợp chất phân lập được,

galangin và isolariciresinol là hai hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này.

Theo tài liệu năm 1966, một số chất chỉ được nhận dạng qua sắc ký khí gắn

khối phổ (GC-MS) và phổ 1H-NMR, do vậy rất có thể chúng có hàm lượng rất bé

không thu nhận được trong quá trình chiết, tách - điều này giải thích nguyên nhân vì

sao so với công bố năm 1966, một vài hợp chất đã không được nhận dạng.

Theo như nhiều tài liệu đã công bố, các hợp chất flavonoid có nhiều hoạt tính

sinh học quý báu và hoạt tính chống oxi hóa là một hoạt tính đặc trưng của lớp chất

107

này. Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy hai chất pinostrobin và tectochrysin đều

có khả năng ức chế tế bào ung thư vú, còn hai hợp chất strobopinin và crytostrobin

có hoạt tính chống lại các vi khuẩn Staphylococcus aureus (ATCC 25923) và

aeruginosa (ATCC 27853) [95], [96], [97]. Với hai hợp chất lần đầu phân lập được

từ loài này, galangin ngoài khả năng kháng khuẩn tốt còn có khả năng ức chế lại

enzyme oxi hóa khử thuộc nhóm polyphenol oxidase (OPD) và isolariciresinol có

khả năng chống oxi hóa rất mạnh, thậm chí còn cao hơn cả vitamin E và butylated

hydroxytoluene (BHT) [89], [98]. Ở nồng độ 2,5 μg/ml, nếu Vitamin E chỉ ức chế

được 18,7% zymosan, hợp chất kích hoạt polymorphonuclear leukocytes (PMNL)

để tạo ra oxy gốc tự do, thì hợp chất isolariciresinol có thể ức chế lên đến 23,8%.

4.2. Kết quả từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.

Merr.)

4.2.1. Các hợp chất được phân lập và xác định từ loài Ngũ gia bì hương

Từ cặn chiết CH2Cl2 của thân và lá loài Ngũ gia bì hương ba hợp chất

triterpene khung lupane đã được phân lập và xác định, trong đó hai hợp chất AT1,

AT2 thu được với hàm lượng khá cao, được sử dụng làm nguyên liệu đầu cho quá

trình chuyển hóa sau này và một hợp chất mới AT3, lần đầu tiên được phát hiện

trong thiên nhiên.

4.2.1.1. 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1)

Hợp chất AT1 phân lập được dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho

pic ion phân tử tại m/z 479,2 [M+Na]+ và 455,3 [M-H]-. Kết hợp với số liệu phổ 13C-NMR, DEPT công thức phân tử của AT1 được dự đoán là C29H44O4.

Phổ 1H-NMR của AT1 cho các tín hiệu của bốn nhóm methyl bậc bốn [δH

108

0,998 (3H, s); 1,02 (3H, s); 1,20 (3H, s); 1,70 (3H, s)], một nhóm methyl bậc hai [δH

0,997 (3H, d, J = 6,0 Hz), hai proton olefinic [δH 4,77 (1H, s); 4,64 (1H, s)] và một

nhóm oxymethine [δH 4,02 (1H, dt, J = 10,5 và 5,0 Hz)]. Phổ 13C-NMR và DEPT

cho tín hiệu của 29 cacbon gồm một nhóm ketone (δC 214,3s), một nhóm caboxylic

acid (δC 181,6), hai cacbon olefinic (δC 110,3 và 149,7), một cacbon oxymethine (δC

70,6), năm nhóm methyl, chín cacbon methylene, sáu cacbon methine và bốn

cacbon bậc bốn. Từ các số liệu phổ trên, cho phép dự đoán chất AT1 là một hợp

chất 24-nor-lupane triterpene. So sánh các dự liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất

này với số liệu phổ trong tài liệu tham khảo [19], [22] (Bảng 4.9), cấu trúc của hợp

chất AT1 được xác định là 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid.

Bảng 4.9. Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của AT1 và 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid [19]

Vị trí

AT1 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid

δHa,b δCa,c δH# δC#

1 42,3 43,0 2 37,6 38,1 3 214,3 212,7 4 45,0 45,1 5 53,2 53,8 6 22,0 22,3 7 33,9 34,4 8 42,1 42,3 9 53,9 54,4 10 38,1 38,6 11 4,02 (1H, dt, J = 10,5; 5,0) 70,6 4,10 (1H, dt, J = 10,5; 5,5) 70,0 12 37,8 38,3 13 37,3 37,7 14 42,4 42,8 15 29,6 30,2 16 32,1 32,9 17 56,3 56,6 18 48,6 49,4 19 46,7 47,5 20 149,7 150,9 21 30,5 31,3 22 36,9 37,4 23 0,997 (3H, d, J = 6,0) 12,1 1,04 (3H, d, J = 6,5) 12,4 24 - - - -

109

25 0,998 (3H, s) 13,8 1,06 (3H, s) 13,8 26 1,02 (3H, s) 17,0 1,06 (3H, s) 17,5 27 1,20 (3H, s) 14,5 1,06 (3H, s) 14,7 28 181,6 178,8 29 4,77 (1H, s); 4,64 (1H, s) 110,3 4,58 (1H, m); 4,78 (1H, m) 110,1 30 1,70 (3H, s) 19,4 19,6

a Đo trong CDCl3, b500 MHz, c125 MHz # Số liệu phổ của 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid đo trong pyridine – d5 [19]

Hình 4.31. Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất AT1

Hình 4.32. Phổ 1H-NMR của chất AT1 (500 MHz, CDCl3)

[M+Na]+

[M+H]+

110

Hình 4.33. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT1 (125MHz, CDCl3)

4.2.1.2. 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2)

Hợp chất AT2 được phân lập ở dạng bột màu trắng. Kết hợp số liệu phổ 13C-

NMR và DEPT và pic ion phân tử tại m/z 481,1 [M+Na]+ và 457,4[M-H]- ở phổ

khối ESI-MS, công thức phân tử của AT2 được dự đoán là C29H46O4.

Từ các dữ kiện phổ khối ESI-MS, 1H-, 13C-NMR cho thấy chất AT2 có cùng

cấu trúc khung với AT1 và là một triterpene acid khung lupane. Tuy nhiên, so với

phổ của AT1, phổ 1D-NMR của chất AT2 không có tín hiệu của nhóm cacbonyl ở

vị trí C-3 mà thay vào đó là sự xuất hiện một nhóm oxymethin [δH 3,97 (1H, s), δC

111

71,8]. Nhóm hydroxyl được xác định ở vị trí 3α nhờ vào tín hiệu của H-3 dạng

singlet vì nếu là 3β thì phải ở dạng dt. So sánh các số liệu phổ của AT2 với tài liệu

[19] (Bảng 4.10), cho phép xác định chất AT2 chính là 24-nor-3α,11α-dihydroxy-

lup-20(29)-ene-28-oic acid.

Bảng 4.10. Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của AT2 và 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid [19]

Vị trí

AT2 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid

δHa,b δCa,c δH# δC# 1 32,1 35,0 2 29,2 30,7 3 3,72 (1H, s) 71,8 3,88 (1H, m) 70,9 4 34,7 36,6 5 44,9 45,6 6 20,4 17,8 7 34,2 35,8 8 42,2 42,7 9 53,4 54,1 10 38,5 39,3 11 3,97 (1H, dt, J=10,5;4,5) 70,9 4,10 (1H, dt, J = 11,0;5,0) 70,3 12 36,9 38,6 13 37,4 37,8 14 42,3 42,9 15 28,8 30,1 16 30,5 33,0 17 56,3 56,6 18 48,6 49,5 19 47,6 47,6 20 149,8 150,9 21 29,4 31,3 22 35,7 37,5 23 0,93 (3H, d, J = 7,0) 13,1 1,08 (3H, d, J = 6,5) 12,1 24 - - - - 25 0.95 (3H, s) 14,5 0,98 (3H, s) 13,6 26 0.98 (3H, s) 17,2 1,05 (3H, s) 17,8 27 1.01 (3H, s) 16,9 1,11 (3H, s) 14,7 28 181,8 178,8 29 4,63 (1H, s), 4,77 (1H, s) 110,1 4,60 (1H, m); 4,79 (1H, m) 110,1 30 1,70 (3H, s) 19,4 1,65 (3H, s) 19,6

a Đo trong CDCl3, b500 MHz, c125 MHz # Số liệu phổ của 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid đo trong pyridine [19]

112

Hình 4.34. Phổ ESI-MS của chất AT2

Hình 4.35. Phổ 1H-NMR của chất AT2 (500 MHz, CDCl3)

[M+Na]+

[M+H]+

113

Hình 4.36. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT2 (125MHz, CDCl3)

4.2.1.3. 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3)

Hợp chất AT3 phân lập được có dạng bột màu trắng. Công thức phân tử của

AT3 là C30H46O5 được xác định nhờ pic ion phân tử tại m/z 487,3424 [M+H]+ (tính

toán lý thuyết cho công thức C30H47O5 là 487,3423) ở phổ khối phân giải cao HR-

ESI-MS..Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl tại νmax

3447cm-1, nhóm carbonyl tại νmax 1695cm-1 và nhóm C=C ở νmax 1642cm-1 và

891cm-1.

Phổ 1H-NMR của AT3 cho thấy sự xuất hiện của 2 proton olefinic ở δH 4,65

(1H, br s, H-29A), δH 4,79 (1H, br s, H-29B), hai doublet của nhóm oxymethylene

114

tại δH 3,51 và 3,42 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 10,5); một nhóm oxymethine ở δH 3,86

(1H, dt, J = 11,0 và 5,0 Hz) và 5 singlet của năm nhóm methyl ở δH 0,95; 1,04;

1,09; 1,10; 1,75 ppm. Phổ 13C và DEPT cho thấy trong phân tử có 30 cacbon, bao

gồm một nhóm ketone tại δC 220,9; một nhóm cacboxylic acid ở δC 179,8; một liên

kết đôi ở δC151,5 và 110,6; một nhóm hydroxymethine tại δC 71,1; một nhóm

hydroxymethylene tại δC 68,5; 5 tín hiệu của nhóm methyl tại δC14,8; 17,2; 17,3;

17,4; 19,7 ppm; chín nhóm methylene, năm nhóm methine và năm cacbon bậc

bốn. Từ các dữ liệu phổ ở trên cho thấy hợp chất AT3 là một triterpene acid khung

lupane.

Bảng 4.11. Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của AT3 (CD3OD, 500/125MHz) Vị trí

δH δC Vị trí

δH δC

1 2,39 (m, 1H) 2,47 (m, 1H)

37,2 16 1,48 (m, 1H) 2,29 (m, 1H)

33,3

2 1,68 (m, 1H) 2,78 (m, 1H)

41,8 17 - 57,4

3 - 220,9 18 1,72 (m, 1H) 50,0 4 - 54,0 19 3,08

(dt, J = 10,5;4,5,1H) 48,2

5 2,04 (m, 1H) 48,5 20 - 151,5 6 1,45 (m, 2H) 20,6 21 1,54 (m,1H)

1,95 (m, 1H) 37,9

7 1,47 (m, 1H) 1,98 (m, 1H)

31,7 22 1,52 (m, 2H) 35,1

8 - 43,4 23 3,42;3,51 (dAB, J = 10,5, 2H)

68,5

9 1,64 (d, J = 11,0, 1H) 55,5 24 0,95 (s, 3H) 17,4 10 - 39,1 25 1,04 (s, 3H) 17,3 11 3,86 (dt, J = 11,0;5,0, 1H) 71,1 26 1,10 (s, 3H) 17,2 12 1,32 (m, 1H)

2,02 (m, 1H) 38,3 27 1,09 (s, 3H) 14,8

13 2,53 (m, 1H) 38,6 28 - 179,8 14 - 43,4 29 4,65 (br s, 1H)

4,79 (br s, 1H) 110,6

15 1,25 (m,1H) 1,47 (m,1H)

30,8 30 1,75 (s, 3H) 19,7

115

Vị trí của các nhóm hydroxyl và carboxylic acid được xác định dựa vào phổ

2D-NMR như HSQC, HMBC, H-H COSY và so sánh với tài liệu. Một nhóm

hydroxyl được gắn ở C-11 dựa vào tương tác của H-11 (δH 3,86) với H-9 (δH 1,64)

và H-12 (δH 1,32 và 2,02) trên phổ H-H COSY. Hằng số tương tác của H-9 với H-

11 là J11,9 = Jax,ax = 11,0 Hz, cho thấy nhóm hydroxyl này có cấu hình α. Phổ

HMBC của AT3 xuất hiện tương tác giữa proton của nhóm hydroxymethylene (δH

3,41 và 3,51) với C-3 (δC 220,9), C-4 (δC 54,0), C-5 (δC 48,5) và nhóm methyl tại vị

trí C-4 (δC 17,4). Từ các dữ liệu phổ này, cho phép dự đoán nhóm

hydroxymethylene có thể gắn vào vị trí C-23 hoặc C-24. So sánh độ dịch chuyển

hóa học của cacbon hydroxymethylene và nhóm methyl của AT3 (δC 67,1; 17,0) với

23-hydroxy-3-oxo-urs-12-ene-28-oic (δC 67,0; 17,2) (đo trong cùng dung môi

CDCl3) thấy hoàn toàn đồng nhất (đối với hợp chất: 24-hydroxy betulone (δC là 65,3

và 22,1) [99], [100]. Điều này cho phép khẳng định nhóm hydroxyl ở C-23 của

AT3. Vị trí của nhóm cacboxylic acid được xác định là ở vị trí C-17 dựa vào sự

tương tác của C-28 (δC 179,8) với H-16 (δH 2,29), H-18 (δH 1,72), H-22 (δH 1,52);

và C-17 (δC 57,4) với H-15 (δH 1, 52), H-16 (δH 2,29) trên phổ HMBC (Hình 4.34).

COOH

HHO

O

1

34

24

56

7

8

9

10

1112

1314

15

16

1718

19

20

2122

28

30

29

2625

H2

27

HO23 COSY

HMBCH2

H2

H2

H2

H2

H2

H

Hình 4.37. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3

Từ các dữ liệu phổ đã phân tích ở trên, cấu trúc của chất AT3 được xác định

là 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid. Đây là một hợp chất mới,

lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc.

116

Hình 4.38. Phổ FT- IR của chất AT3

Hình 4.39. Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất AT3

[M+H]+

117

Hình 4.40. Phổ 1H-NMR của chất AT3 (500 MHz, CD3OD)

Hình 4.41. Phổ 1H-NMR (giãn) của chất AT3 (500 MHz, CD3OD)

118

Hình 4.42. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT3 (125 MHz, CD3OD)

Hình 4.43. Phổ HSQC của chất AT3

119

Hình 4.44. Phổ HMBC của chất AT3

Hình 4.45. Phổ COSY của chất AT3

120

*** Nhận xét về thành phần hóa học của loài Ngũ gia bì hương

Ba hợp chất triterpene khung lupane: 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-

ene-28-oic acid (AT1), 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid

(AT2), 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) đã được phân

lập và xác định cấu trúc từ loài Ngũ gia bì hương thu hái tại huyện Mai Châu, tỉnh

Hòa Bình. Trong đó AT3 là một chất mới; 2 chất đã biết AT1, AT2 (AT1 là chất 21

và AT2 là chất 20 đã được nhóm nghiên cứu Ph.D.Ty phân lập được từ năm 1985)

có hàm lượng khá cao (tương ứng là 0,26% và 0,25% so với mẫu khô). Vì vậy,

chúng tôi đã sử dụng AT1 và AT2 làm nguyên liệu đầu để tổng hợp các dẫn xuất

mới và nghiên cứu hoạt tính sinh học của chúng.

4.2.2. Các dẫn xuất chuyển hóa hóa học của hợp chất AT1, AT2

Với mục tiêu nghiên cứu tổng hợp tìm kiếm hoạt chất mới, từ ba hợp chất

phân lập được (AT1, AT2, AT3) đã tổng hợp được 23 dẫn xuất mới. Các dẫn xuất

này được khảo sát hoạt tính nhằm tìm ra chất có hoạt tính cao hướng đến nghiên

cứu ứng dụng.

Từ hai chất AT1 và AT2 chúng tôi đã tổng hợp được 23 dẫn xuất, trong đó

AT1 chuyển hóa ở nhóm 11-OH được 5 dẫn xuất, ở cả hai nhóm 11-OH và 28-

COOH được 8 dẫn xuất; từ AT2 đã tổng hợp được 1 dẫn xuất chuyển hóa hai nhóm

3-OH và 11-OH, 7 dẫn xuất chuyển hóa ở ba nhóm 3-OH, 11-OH và 28-COOH, 2

dẫn xuất chuyển hóa ở nhóm 28-COOH.

121

4.2.2.1. Các dẫn xuất của AT1

Sơ đồ 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1

4.2.2.1.1. Các dẫn xuất ester của AT1

Nhóm OH ở vị trí C-11 của AT1 bị acyl hóa với các acid anhydride như

acetic anhydride, phthalic anhydride, glutaric anhydride, succinic anhydride trong

pyridine ở nhiệt độ phòng hoặc trong pyridine có mặt của xúc tác 4-DMAP ở 600C

thu được các ester AT4, AT5, AT6, AT7 với hiệu suất tương ứng 85%, 65%, 67%,

65%:

122

24-nor-11α-O-glutaryl-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT6):

Dẫn xuất AT6 thu được ở dạng chất màu trắng, cấu trúc được xác định thông

qua phổ khối và phổ NMR. Phổ khối ESI-MS cho pic phân tử ở m/z 593,0 [M+Na]+

và 569,3 [M-H]-, ứng với công thức phân tử là C34H50O7.

Phổ 13C-NMR của AT6 cho tín hiệu của 34 nguyên tử cacbon, trong đó có

một nhóm ketone (C-3) (δC 213,9 ppm); một nhóm cacbonyl este (-OCOC3H6) ở

δC171,8; hai nhóm acid ở δC182.1 ppm (28-COOH) và δC 178.5 (-C3H6COOH); và

một nối đôi ở δC 149,6 (C-20) và 110,5 ppm (C-29); một cacbon của nhóm

oxymethine ở δC 72.9 ppm (C-11). Ngoài ra, trên phổ 1H NMR của AT6 còn xuất

hiện tín hiệu của proton oxymethine được chuyển về phía trường thấp hơn so với

AT1 ở δH 5,26 (1H, dt, J = 11,0 và 5,3 Hz). Điều này chứng tỏ nhóm C11-OH đã bị

acyl hóa với glutaric anhydride và khẳng định sản phẩm AT6 là 24-nor-11α-O-

glutaryl-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid.

Tương tự, từ những dữ liệu phổ của các sản phẩm AT4, AT5, AT7 và so

sánh với chất đầu AT1 cho thấy các hợp chất tổng hợp được đều có cấu trúc đúng

như dự kiến.

123

4.2.2.1.2. Dẫn xuất dioxo của AT1

Phản ứng oxi hóa hợp chất AT1 bằng tác nhân CrO3/H2SO4 tạo ra sản phẩm

dioxo AT8 với hiệu suất 67%.

24-nor-3,11-dioxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT8)

Dẫn xuất AT8 thu được dạng chất rắn màu trắng. So sánh phổ 1D-NMR với

hợp chất AT1 cho thấy AT8 không có tín hiệu của nhóm oxymethine nhưng lại có

thêm một tín hiệu của nhóm cacbonyl (δC 211ppm) bên cạnh nhóm ketone ban đầu

(δC 213,21) trên phổ 13C-NMR và DEPT của nó. Sản phẩm AT8 có công thức phân

tử là C29H42O4 được xác định nhờ vào píc ion phân tử tại m/z 457,2 [M+Na]+ và

453,5[M-H]- trên phổ khối ESI-MS. Qua các dữ liệu phân tích trên cho phép khẳng

định phản ứng oxi hóa AT1 với tác nhân CrO3 đã được thực hiện và tạo thành sản

phẩm mong muốn là 24-nor-3,11-dioxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT8).

4.2.2.1.3. Các dẫn xuất amide của AT1

Sau khi chuyển hóa nhóm 11-OH của AT1 thành các dẫn xuất AT4, AT8,

tiếp tục chuyển hóa ở vị trí 28-COOH nhằm tạo ra các dẫn xuất amide. Đầu tiên

nhóm carboxylic được chuyển về dạng chlorua acid nhờ phản ứng với oxalylchlorid

trong dichlomethan ở nhiệt độ phòng. Cất loại dichlomethan và oxalylchlorid còn

dư, thu được hợp chất acyl chlorid tương ứng. Chất này không cần làm sạch mà

dùng ngay cho phản ứng tiếp theo. Sau đó, tác nhân acyl hóa này dễ dàng phản ứng

với các amine trong môi trường kiềm để tạo thành các dẫn xuất amide.

• Từ hợp chất AT4: Sau khi tạo tác nhân acyl hóa, cho tác dụng với các amine

như methyl 11-aminoundecanoate, 1,5-diamino hexane, 1,9-diaminononane, 1-

amino-2-propanol hoặc 3-amino-1-propanol dư trong CH2Cl2 ở nhiệt độ phòng thu

124

đựợc các dẫn xuất amide AT9, AT10, AT11, AT12 với hiệu suất tương ứng là

85%, 68%, 72%, 67%. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ các dữ liệu

phổ MS và NMR.

AT9

CONH(CH2)10COOCH3

HH3COCO

O

1

34

23

5 67

8

9

10

1112

1314

151617

18

19

20

2122

28

30

29

2625

H227

AT11

CONH(CH2)9NH2

HH3COCO

O

1

34

23

5 67

8

9

10

1112

1314

1516

1718

19

20

2122

28

30

29

2625

H227

1'

Nhóm ancol bậc một của hợp chất AT12 được acetyl hóa với acetic

anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng cho dẫn xuất diacetoxy AT13 với hiệu

suất 87%:

N-[24- nor - 11α-acetoxy – 3-oxo -lup- 20(29) – ene- 28-oyl]-1,5-diaminohexane

(AT10)

Phổ ESI-MS cho pic ion m/z 597,6 [M+H]+ và 595,3 [M-H]-, gợi ý công

thức phân tử của AT10 là C37H60N2O4.

Phổ NMR của nó xuất hiện tín hiệu của một cầu nối amide -CONH- [δH

125

5,76-5,70 (1H, m, -CONH-) và δC 175,7 ppm (-CONH-)]; một nhóm oximethine bị

acyl hóa [δH 5,22 (1H, dt, J = 11,0 và 5,5Hz); δC 72,8 ]; một liên kết đôi tại δC 150,1

và 109,9; một nhóm acetyl [δH 1,97 (3H, s, CH3COO-); δC 169,7 (CH3COO-)] và 6

nhóm methyl ở δH 0,91 (3H, d, J = 7,0 Hz); 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz); 1,04 (3H, s);

1,07 (3H, s); 1,66 (3H, s); 1,97 (3H, s).

Phản ứng amide hóa của AT4 và 1,5-diamino hexane được xác định là xảy

ra ở nhóm NH2 ít bị che chắn hơn (stereo-less-shielded) dựa vào tương tác của

proton amide -CONH- (δH 5,72-5,76, m) với cacbon amide (δC 175,7) và cacbon

methylene (δC 39,5); hai proton methylene (δH 3,15-3,25, m) với cacbon của nhóm

amide (δC 175,7) trong phổ HMBC của AT10.

Kết hợp các số liệu phổ, cấu trúc của AT10 được xác định là N-[24-nor-

11α-acetoxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,5-diaminohexane.

Tương tự chất AT10, các dẫn xuất AT9, AT11 và AT12 nhận được có cấu

trúc đúng như mong muốn.

N-[24-nor - 11α-acetoxy - 3-oxo – lup - 20(29)-ene - 28-oyl]-3-amino-1-propanol

acetate (AT13):

Phổ HR-ESI-MS của dẫn xuất AT13 cho pic ion tại m/z 598,41075[M+H]

(tính toán lý thuyết cho công thức C36H56NO6 là 598,41076), phù hợp với công thức

dự kiến là C36H55NO6.

Ngoài các tín hiệu của một nhóm ketone (δC 213,6), một nhóm amide,

emột nhóm oxymethine bị acyl hóa (δC 169,6) như hợp chất AT12, trên phổ NMR

của AT13 còn xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm acetoxy khác [δH 2,08 (3H, s,

CH3COO-) và δC 171,3 (CH3COO-)]và tín hiệu oxymethylene dịch chuyển về phía

truờng thấp hơn so với AT12 (ΔδC = 0,46 ppm).

Từ các số liệu phổ trên cho phép khẳng định AT13 chính là dẫn xuất

diaxetoxy của AT1, có tên là N-[24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oyl]-

3-amino-1-propanol acetate.

126

• Ngoài ra, các dẫn xuất amide của AT1 còn được tiến hành tổng hợp theo

một cách khác. Từ hợp chất di-oxo AT8 cho phản ứng với (COCl)2 trong

dichloromethane ở nhiệt độ phòng, sản phẩm acyl tạo thành cho tác dụng với 1,7-

diamine heptane cho dẫn xuất N-[24-nor-3,11-dioxo-lup-20(29)-ene-28-oyl]-7-

aminoheptane (AT14). Chất này không cần làm sạch mà dùng ngay cho phản ứng

cộng hợp với các acetic anhydride, succinic anhydride, tetrahydrophthalic

anhydride trong pyridine có mặt của xúc tác 4-DMAP ở nhiệt độ phòng thu được

các sản phẩm AT15, AT16, AT17 với hiệu suất tương ứng là 52%, 58%, 55%.

[N-[24-nor - 3,11-dioxo – lup - 20(29)-ene - 28-oyl] -7-aminoheptyl] -carbamoyl

tetrahydrophthalic acid (AT17):

Công thức phân tử của AT17 được xác định là C44H66N2O6 dựa vào pic ion

phân tử xuất hiện ở m/z 741,4 [M+Na]+ và 717,6 [M-H]- trên phổ ESI-MS.

Trên phổ 1H-NMR của AT17, ở vùng trường thấp cho tín hiệu của bốn

proton gồm hai proton của hai nhóm amide (-CONH-) và hai proton olefin

(-CH=CH-) của đơn vị phthalic acid ở δH 6,65 (1H, t-like, -CONH-); 5,78-5,67 (3H,

m, -CONH- và -CH=CH-). Các dữ liệu này hoàn toàn phù hợp với các tín hiệu phổ 13C-NMR ở δC 124,7; 126,6 tương ứng với hai cacbon của nối đôi trong vòng (-

C6H8-) và δC174,2; 174,3 ứng với hai cacbon của hai nhóm amide (-CONH-). Ngoài

127

ra, phổ 13C-NMR còn có các tín hiệu của các nhóm methylen gắn với nhóm -CONH-

và -COOH ở δH 3,32-3,19 (4H, m); 3,07-2,92 (4H, m).

Từ các số liệu đã phân tích, khẳng định AT17 là [N-[24-nor-3,11-dioxo–

lup-20(29)-ene-28-oyl]-7-aminoheptyl]-carbamoyl tetrahydrophthalic acid.

Tương tự, cấu trúc của hai chất AT15, AT16 cũng được xác định dựa vào

các số liệu phổ MS và 1D-NMR.

4.2.2.2. Các dẫn xuất của AT2

Sơ đồ 4.2. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2

128

4.2.2.2.1. Dẫn xuất ester của AT2

Tương tự như chất AT1, hai nhóm 3-OH và 11-OH của chất AT2 cũng bị

acetyl hóa với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng tạo thành sản phẩm

diacetoxy AT18 với hiệu suất 86%.

24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT18):

Sản phẩm AT18 là dẫn xuất diacetyl hóa của AT2 được khẳng định qua

việc so sánh dữ liệu phổ 1D-NMR của hai hợp chất này. Sự xuất hiện thêm hai

nhóm acetyl ở chất AT18 được thấy rõ qua hai tín hiệu singlet của nhóm methyl ở

δH 1,96 (3H, s); 2,09 (3H, s) và các tín hiệu ở δC 170,1; 171,1ppm (-OCOCH3), và

δC 20,3; 22,0 ppm (-OCOCH3) ở phổ 1H- và 13C-NMR. Ngoài ra, phổ ESI-MS cho

pic ion phân tử ở m/z 565,3 [M+Na]+ và 541,6 [M-H]-, hoàn toàn phù hợp với công

thức phân tử của hợp chất 24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid là

C33H50O6.

4.2.2.2.2. Các dẫn xuất amide của AT2

• Tương tự như đối với AT1, để thực hiện chuyển hóa cả ba nhóm 3-OH, 11-

OH và 28-COOH của hợp chất AT2, đầu tiên tiến hành acetyl hóa hai nhóm OH tạo

dẫn xuất AT18 và sau đó thực hiện phản ứng amide hóa nhóm COOH. Phản ứng

amide dưới tác dụng của các tác nhân khác nhau như NH3, NH2(CH2)10COOCH3,

NH2(CH2)4CHCH3NH2, NH2(CH2)9NH2, NH2(CH2)3OH tạo thành các sản phẩm

tương ứng là AT19, AT20, AT21, AT22, AT23 với hiệu suất lần lượt là 78%, 75%,

68%, 65% và 72%:

129

Methyl – N - [24-nor - 3α,11α-diacetoxy – lup - 20(29)-ene - 28-oyl] -11-amino

undecanoate (AT20):

Từ pic ion cho ở m/z 762,2 [M+Na]+ và 738,5 [M-H]- trên phổ khối ESI-

MS gợi ý công thức của AT20 là C45H73NO7.

Các tín hiệu trên phổ 1D-NMR cho thấy sự có mặt của một nhóm amide

[δH 5,57 (1H, dt, -CONH-); δC 175,6 ppm (-CONH-)] và hai nhóm acetyl ở [δH 2,06

và 1,94 (mỗi tín hiệu ứng 3H, s); δC 169,8 và 171,0]; một nhóm methoxy [δH 3,67

(3H, s)]; nhóm methylene cạnh nhóm este (-CH2COOCH3) ở δH 2,30 (2H, t,

J=7,5Hz). Ngoài ra, còn cho các tín hiệu của hai oxymethine [δH 5,22 (1H, dt, J =

11,0 và 5,5 Hz) và 4,84 (1H, d, J = 2,5 Hz); δC 74,5 và 72,9 ppm]; một nhóm exo-

methylene [δH 4,74 và 4,57 (mỗi tín hiệu ứng 1H, s); δC 150,2 s và 109,9 t].

Từ các dữ liệu phổ trên cho phép khẳng định sản phẩm phản ứng của

AT18 với NH2(CH2)10COOCH3 chính là methyl–N-24-nor-3α,11α-diacetoxy–lup-

130

20(29)-ene-28-oyl]-11-amino undecanoate.

N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,5-diaminohexane (AT21):

Trên phổ NMR của chất AT21 ngoài các tín hiệu tương tự với chất AT18,

còn xuất hiện một cầu nối amit CO-NH [δH 5,60-5,98 (1H, m, -CONH) và δC 176,0 (-

CONH)], một doublet của nhóm methyl tại δH -CHCH3NH2).

Phổ HMBC của AT21 cho thấy sự tương tác của proton của nhóm amide

–CONH- (δH 5,97-5,98; m) và hai proton methylen (δH 3,18-3,28; m) với cacbon

cacbonyl (δC 176,0). Điều này cho phép khẳng định phản ứng amide hóa của AT18

với 1,5-diamin hexane xảy ra ở nhóm NH2 ít bị che chắn.

Phổ ESI-MS của AT21 cho pic ion phân tử ở m/z 641,3 [M+H]+ và 639,4

[M-H]-. Kết hợp các số liệu phổ ESI-MS và NMR, công thức phân tử của AT21 được

xác định là C39H64N2O5. Phân tích số liệu phổ NMR, cấu trúc của AT21 được chứng

minh là N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,5-diaminohexane.

• Nhóm 3’-OH của hợp chất AT23 tham gia phản ứng este hóa với acetic

anhydride trong pyridine thu được dẫn xuất AT24 với hiệu xuất 87%.

N - [24-nor - 3α,11α-diacetoxy – lup - 20(29)-ene - 28-oyl] - 3-amino-1-propanol

acetate (AT24):

So sánh với AT18, phổ 1D-NMR của AT24 xuất hiện thêm các tín hiệu

của nhóm amide [δH 5,91 (1H, t, J = 5,5 Hz, -CONH) và δC175,9 (-CONH-)], nhóm

acetyl (C-4’) [δC 169,8ppm (-OCOCH3); δC 21,3 (-OCOCH3)]. Ngoài ra, công thức

phân tử của AT24 được khẳng định là C38H59NO7 qua pic phân tử ở m/z

642,43693[M+H]+ trên phổ HR-ESI-MS (tính toán cho công thức C38H60NO7 là

642,43698). Từ các dữ liệu phổ đã phân tích cho thấy AT24 hoàn toàn phù hợp với

131

cấu trúc dự đoán là N - [24-nor - 3α,11α-diacetoxy – lup - 20(29)-ene - 28-oyl] - 3-

amino-1-propanol acetate.

• Sau khi chuyển hóa nhóm 28-COOH thành amide, hai hợp chất AT19,

AT20 được thủy phân để loại bỏ nhóm este ở C-3 và C-11 trở về nhóm hydroxy

ban đầu. Từ hợp chất AT19, AT20 thủy phân bằng NaOH 4N trong hỗn hợp

THF:MeOH = 1:1 thu được hai chất AT25, AT26 tương ứng với hiệu suất 75% và

82%. Cấu trúc sản phẩm được xác định nhờ vào các dữ liệu phổ MS và NMR.

N-[24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-11-aminoundecanoic acid

(AT26):

Phổ 1D-NMR của AT26 cho thấy sự có mặt của nhóm amide [δH 5,66

(1H, t, J = 5,5 Hz, NH) và δC 176,0 (C-28)]; nhóm acid (δC178,5). Tuy nhiên, so với

AT20, phổ của AT26 không còn các pic đặc trưng cho các nhóm acetyl (δC 169,8;

171,0 ppm), đồng nghĩa với các nhóm este của AT20 đã được loại bỏ tạo thành hợp

chất AT26. Phổ ESI-MS khẳng định thêm công thức AT20 phù hợp với dự kiến là

C40H67NO5 qua pic ion phân tử ở m/z 664,7 [M+Na]+ và 640,6 [M-H]- .

4.2.2.2.3. Dẫn xuất nitrile của AT2

Theo một số tài liệu công bố, dưới tác dụng của SOCl2 hoặc POCl2 trong

môi trường kiềm, các amide –CONH2 dễ dàng bị dehydrat hóa tạo dẫn xuất nitrile.

Tuy nhiên, ở đây chúng tôi đã tiến hành chuyển hóa AT19 bằng CH3COCl/4-

DMAP ở nhiệt độ phòng, phản ứng dehydrat hóa đã xảy ra và tạo sản phẩm nitrile

AT27 với hiệu suất tương đối cao (78%) chỉ trong thời gian 15 phút.

132

24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-nitrile (AT27):

Giống với hợp chất AT18, trong phân tử của AT27 cho thấy sự xuất hiện

của hai nhóm acetyl [δC 169,8; 170,9ppm (-OCOCH3) và δC 20,1; 21,9 ppm (-

OCOCH3)]. Tuy nhiên, trên phổ 1D-NMR của AT27 không xuất hiện các tín hiệu

của nhóm amide mà thay vào đó là sự xuất hiện của nhóm –CN ở δC 123,1ppm. Cấu

trúc của dẫn xuất cyanua được khẳng định thêm qua pic ion phân tử ở m/z 546,3

[M+Na]+ trong phổ khối ESI-MS, phù hợp với công thức phân tử (C33H49NO4).

4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và chuyển hóa hóa

học

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Các hợp chất phân lập và chuyển hóa học từ hai loài nghiên cứu đã được tiến

hành thử hoạt tính gây độc tế bào với bốn dòng tế bào ung thư người bao gồm ung

thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma), ung thư gan HepG2

(Hepatocellular carcinoma), ung thư phổi LU (Human lung carcinoma) và ung thư

vú MCF-7 (Human breast carcinoma) tại Phòng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa

học. Kết quả thử hoạt tính được trình bày trong Bảng 4.12.

Bảng 4.12. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào

STT

Kí hiệu mẫu

Giá trị IC50 trên các dòng tế bào (µg/ml)

KB HepG2 Lu MCF 7

Các chất phân lập từ rễ loài Thông lá dẹt

1 PK1 >128 >128 >128 >128

2 PK2 >128 >128 >128 >128

133

3 PK3 76,48 25,63 86,85 128

4 PK4 13,8 15,2 54,15 66,28

5 PK5 29,47 13,45 128 >128

6 PK6 17,6 17,84 62,54 113,23

7 PK7 112 77 117,33 >128

Các chất phân lập từ thân và lá loài Ngũ gia bì hương

8 AT1 >128 >128 >128 >128

9 AT2 27,63 23,42 64,72 45,44

10 AT3 >128 >128 >128 >128

Các chất chuyển hóa từ AT1, AT2

11 AT11 13,90 16,21 24,34 18,36

12 AT12 13,53 14,08 18,73 19,64

13 AT13 17,06 18,6 >128 >128

14 AT22 3,65 3,77 4,25 4,42

15 AT23 >128 >128 >128 >128

16 AT24 >128 >128 >128 >128

Chất tham khảo Ellipticin

0,31

0,35

0,45

0,53

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập từ rễ loài Thông lá

dẹt cho thấy PK3, PK4, PK6 đều có hoạt tính đối với cả bốn dòng tế bào KB,

HepG2, LU, MCF7. Đặc biệt, PK4 và PK6 cho kết quả tốt hơn. Ngoài ra, hợp chất

PK5 cũng có khả năng ức chế hai dòng tế bào ung thư người là KB và HepG2 với

IC50 tương ứng là 29,47 và 13,45 µg/ml.

Trong ba hợp chất phân lập được từ thân và lá loài Ngũ gia bì hương (AT1,

AT2, AT3), chỉ có AT2 có hoạt tính với bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm với

giá trị IC50 = 23,42-64,72 µg/ml. Điều thú vị là đã phát hiện được 4 dẫn xuất AT11,

AT12, AT13 và AT22 đều cho hoạt tính cao hơn hai chất đầu AT1 và AT2. Đặc

biệt, dẫn xuất AT22 có khả năng ức chế tăng gấp 6-15 lần so với chất đầu AT2 trên

134

cả 4 dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC50 là KB (3,65µg/ml), HepG2

(3,77µg/ml), LU (4,25µg/ml), MCF7 (4,42µg/ml).

Tóm lại, hợp chất N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,9-

diaminononane (AT22), dẫn xuất chuyển hóa đồng thời ba vị trí 3-OH, 11-OH, 28-

COOH của hợp chất 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2)

được phân lập từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.), có

hoạt tính đáng chú ý với bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung

thư gan HepG2, ung thư phổi LU và ung thư vú MCF-7. Điều này giúp định hướng

cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích ứng dụng hợp chất này trong lĩnh

vực y dược.

4.3.2. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis

Ba chất phân lập được từ loài Ngũ gia bì hương và một số dẫn xuất của

chúng đã được khảo sát hoạt tính kháng chủng gram dương Bacillus subtilis, một

loại khuẩn có khả năng sống sót trong điều kiện nhiệt độ rất cao và thường làm hư

hỏng thực phẩm. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 1µM không có chất nào thể hiện hoạt

tính này nhưng ở c=10µM ba dẫn xuất AT11, AT16, AT18 đều cho hoạt tính mạnh

(Bảng 4.13).

Bảng 4.13. Kết quả hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis

STT Kí hiệu mẫu

% Ức chế sự tăng trưởng tại c = 1 µM

% Ức chế sự tăng trưởng tại c = 10 µM

1 AT1 6 51

2 AT2 15 38

3 AT3 31 46

4 AT4 21 66

5 AT6 31 34

6 AT8 43 61

7 AT9 34 30

8 AT10 37 67

9 AT11 37 87

135

10 AT15 34 39

11 AT16 26 99

12 AT17 35 77

13 AT18 17 91

14 AT19 41 46

15 AT20 34 45

16 AT21 45 70

17 AT22 23 77

18 AT26 37 69

4.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa

Các cặn chiết và hợp chất phân lập được từ loài Thông lá dẹt được tiến hành

thử hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DHHP tại Phòng Hóa sinh ứng dụng

– Viện Hóa học. Kết quả thử hoạt tính được trình bày trong Bảng 4.14.

Bảng 4.14. Kết quả hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH

STT Kí hiệu mẫu Nồng độ chất thử trung hòa 50% gốc tự do (DPPH)-EC50 (µg/ml)

Cặn chiết từ rễ loài Thông lá dẹt 1 Cặn n-Hexane >128

2 Cặn EtOAc >128

3 Cặn n-BuOH 48,24 Chất sạch

4 PK1 >128

5 PK2 >128

6 PK3 >128

7 PK4 122,62 8 PK5 >128

9 PK6 >128

10 PK7 27,12 Chất

tham khảo Resveratrol 8,23

136

Kết quả thử hoạt tính cho thấy, chỉ có cặn BuOH, hợp chất PK4 và PK7 có

hoạt tính chống oxi hóa. Trong đó, cặn BuOH và hợp chất PK7 cho hoạt tính tương

đối mạnh.

137

BẢNG TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN HÓA HÓA HỌC TỪ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU

TT

Ký hiệu

Hiệu suất (%)

CTPT (KLPT) Cấu trúc Chú thích

Rễ Thông lá dẹt (Pinus krempffi Lecomte)

1 PK1 0,011 C16H12O4 (M=268)

Tectochrysin

2 PK2 0,004 C16H14O4 (M=270)

Pinostrobin

3 PK3 0,009 C15H12O5 (M=272)

Pinobanksin

Gây độc tế bào: KB (IC50=76,48) HepG2 (IC50=25,63) Lu (IC50=86,85) MCF7 (IC50=128)

4 PK4 0,006 C15H10O5 (M=270)

Galangin

Lần đầu tiên phân lập từ loài này

Gây độc tế bào: KB (IC50=13,8) HepG2 (IC50=15,2) Lu (IC50=54,15) MCF7 (IC50=66,28) Chống oxi hóa (EC50 = 122,62 µg/ml)

5 PK5 0,006 C15H14O4 (M=258)

Strobopinin

Gây độc tế bào: KB (IC50=29,47) HepG2 (IC50=13,45) Lu (IC50=128)

6 PK6 0,005 C15H14O4 (M=258)

Crytostrobin

Gây độc tế bào: KB (IC50=17,6) HepG2 (IC50=17,84) Lu (IC50=62,54) MCF7 (IC50=113,23)

138

7 PK7 0,006 C20H24O6 (M=360)

Isolariciresinol

Lần đầu tiên phân lập từ loài này

Gây độc tế bào: KB (IC50=112)

HepG2 (IC50=77,0) Lu (IC50=117,33) Chống oxi hóa (EC50 = 27,12 µg/ml)

Thân và lá Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr)

8 AT1 0,26 C29H44O4 (M=456)

COOH

H

H

HO

O

24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-

ene-28-oic acid

9 AT2 0,25 C29H46O4 (M=458)

24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-

ene-28-oic acid

Gây độc tế bào:

KB (IC50=27,63)

HepG2 (IC50=33,42)

Lu (IC50=64,72)

MCF7 (IC50=45,44)

10 AT3 0,04 C30H46O5 (M=486)

11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-

28-oic acid

Chất mới

Dẫn xuất của hợp chất AT1

11 AT4 85 C31H46O5 (M=498)

24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-20(29)-

ene-28-oic acid

Dẫn xuất mới

139

12 AT5 65 C37H48O7 (M=604)

COOH

H

H

HOOCC6H4OCO

O

24-nor-11α-O-phthalyl-3-oxo-lup-

20(29)-ene-28-oic acid

Dẫn xuất mới

13 AT6 67 C34H50O7 (M=570)

24-nor-11α-O-glutaryl-3-oxo-lup-


Dẫn xuất mới

14 AT7 65 C33H48O7 (M=556)

24-nor-11α-O-succinyl-3-oxo-lup-


Dẫn xuất mới

15 AT8 67 C29H42O4 (M=454)

24-nor-3,11-dioxo-lup-20(29)-ene-28-oic

acid

Dẫn xuất mới

16 AT9 85 C43H69NO6 (M=695)

Methyl N-[24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-

lup-20(29)-ene-28-oyl]-11-aminoundecanoate

Dẫn xuất mới

140

17 AT10 68 C37H60N2O4 (M=596)

N-[24- nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-

20(29)-ene-28-oyl]-1,5-diaminohexane

Dẫn xuất mới

18 AT11 72 C40H66 N2O4 (M=638)

N-[24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-

20(29)-ene-28-oyl]-1,9-diaminononane

Dẫn xuất mới


KB (IC50=13,90)

HepG2 (IC50=16,21)

Lu (IC50=24,34)

MCF7 (IC50=18,36) Kháng Basillus subtilis: Ức chế 87% vi khuẩn ở c=10µM

19 AT12 67 C34H53NO5 (M=555)

-N-[24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-

20(29)-ene-28-oyl]-3-amino-1-propanol

Dẫn xuất mới


KB (IC50=13,53)

HepG2 (IC50=14,08)

Lu (IC50=18,73)

MCF7 (IC50=19,64)

20 AT13 87 C36H55 N O6 (M=597)

N-[24-nor-11α-acetoxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oyl]-3-amino-1-propanol

acetate

Dẫn xuất mới

21 AT15 52 C38H60N2O4 (M=608)

[N-[24-nor-3,11-dioxo-lup-20(29)-ene-

28-oyl]-7-aminoheptyl]-carbamoyl methane

Dẫn xuất mới

141

22 AT16 58 C40H62N2O6 (M=666)

CONH(CH2)7NHCO(CH2)2COOH

H

H

O

O


succinic acid

Dẫn xuất mới Kháng Basillus subtilis: Ức chế 99% vi khuẩn ở c=10µM

23 AT17 55 C44H66N2O6 (M=718)

CONH(CH2)7NHCOC6H8COOH

H

H

O

O


tetrahydrophthalic acid

Dẫn xuất mới

Dẫn xuất của hợp chất AT2

24 AT18 86 C33H50O6 (M=542)

COOH

HH3COCO

H3COCOH

24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-

ene-28-oic acid

Dẫn xuất mới Kháng Basillus subtilis: Ức chế 91% vi khuẩn ở c=10µM

25 AT19 78 C33H51NO5 (M=541)


ene-28-amide

Dẫn xuất mới

26 AT20 75 C45H73NO7 (M=739)

Methyl-N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-

20(29)-ene-28-oyl] -11-amino undecanoate

Dẫn xuất mới

27 AT21 68 C39H64N2O5

(M=640)

N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-

ene-28-oyl]-1,5-diaminohexane

Dẫn xuất mới

142

28 AT22 65 C42H70N2O5 (M=682)


ene-28-oyl]-1,9-diaminononane

Dẫn xuất mới


KB (IC50=3,65)

HepG2 (IC50=3,77)

Lu (IC50=4,25)

MCF7 (IC50=4,42)

29 AT23 72 C36H57NO6 (M=599)


ene-28-oyl]-3-aminopropanol-1

Dẫn xuất mới

30 AT24 87 C38H59NO7 (M=641)

N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-3-amino-1-propanol acetate

Dẫn xuất mới

31 AT25 75 C29H47NO3 (M=457)

24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-

ene-28-amide

Dẫn xuất mới

32 AT26 82 C40H67NO5 (M=641)

N-[24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-

ene-28-oyl]-11-aminoundecanoic acid

Dẫn xuất mới

33 AT27 78 C33H49NO4 (M=523)


ene-28-nitrile

Dẫn xuất mới

143

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN 1. Thành phần hóa học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)

• Đây là lần đầu tiên loài Thông lá dẹt được nghiên cứu về thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học ở Việt Nam. Từ rễ của loài này, 7 hợp chất đã được phân lập

và xác định cấu trúc:

- 6 hợp chất flavonoid: Tectochrysin (PK1), Pinostrobin (PK2), Pinobanksin

(PK3), Galangin (PK4), Strobopinin (PK5), Cryptostrobin (PK6).

- 1 hợp chất Lignan: Isolariciresinol (PK7).

Hai chất PK4, PK7 lần đầu được tìm thấy ở loài Pinus krempfii.

• Đã định danh được 15 hợp chất có trong cặn chiết n-hexane bằng phương

pháp phổ GC-MS, trong đó có các hợp chất đặc trưng của tinh dầu thông như α-

terpineol (1,02%) và chất thơm nerolidol (13,79%).

2. Thành phần hóa học của loài Ngũ gia bì hương (Acanthopnax trifoliatus

L.Merr.)

• Từ thân và lá của loài Ngũ gia bì hương đã phân lập và xác định cấu trúc 3

hợp chất triterpene khung lupane, gồm: 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-

28-oic acid (AT1), 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2),

11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3). Trong đó, AT3 là hợp

chất mới và hai chất AT1, AT2 có hàm lượng khá cao (tương ứng 0,25%, 0,26%,

so với mẫu khô).

• Bằng các phản ứng chuyển hóa ở các vị trí khác nhau đã tổng hợp được 23

dẫn xuất mới từ 2 hợp chất có hàm lượng lớn phân lập được từ loài Ngũ gia bì

hương (AT1, AT2), bao gồm:

- Từ AT1: 4 dẫn xuất ester (AT4-AT7); 1 dẫn xuất oxo (AT8) và 8 dẫn xuất

amide (AT9-AT17).

- Từ AT2: 1 dẫn xuất ester (AT18); 8 dẫn xuất amide (AT19-AT26) và 1 dẫn

144

xuất nitrile (AT27).

3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và tổng hợp được từ hai loài

Thông lá dẹt và Ngũ gia bì hương

Tiến hành thử hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis, hoạt tính gây độc tế bào,

hoạt tính chống oxi hóa ở một số cặn dịch chiết, các chất phân lập và tổng hợp

được. Kết quả cho thấy:

- 3 hợp chất (AT11, AT16, AT18) thể hiện khả năng kháng chủng Bacillus

subtilis này ở mức trung bình.

- 9 hợp chất (PK3, PK4, PK6, PK7, AT2, AT11, AT12, AT13, AT22) có

hoạt tính với dòng tế bào ung thư KB, HepG2, LU, MCF7. Đặc biệt, dẫn

xuất AT22 có khả năng ức chế tăng gấp 6-15 lần so với chất đầu AT2 trên

cả 4 dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC50 = 3,65 ÷ 4,42µg/ml.

- Cặn BuOH của loài Thông lá dẹt, hợp chất PK4 và PK7 đều cho hoạt tính

chống oxi hóa. Trong đó, cặn BuOH và PK7 cho hoạt tính tương đối

mạnh.

Trong tổng số 33 chất đã được xác định cấu trúc (10 chất phân lập và 23 chất

chuyển hóa) có 24 chất mới: một chất tự nhiên và 23 dẫn xuất tổng hợp. Bên cạnh

đó, đã tìm được 3 hợp chất có khả năng kháng chủng Bacillus subtilis; 1 cặn chiết

và 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa; 8 hợp chất có khả năng gây độc với bốn

dòng ung thư (KB, HepG2, Lu, MCF7) và trong đó có 1 hợp chất thể hiện hoạt tính

mạnh với giá trị IC50=3,65 – 4,42µg/ml.

KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu chuyển hóa hóa học tiếp theo từ hợp chất có hoạt tính

mạnh AT2 nhằm tìm ra các dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao hơn, định hướng cho

việc ứng dụng trong y dược.

2. Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ các bộ phận

khác như gỗ, vỏ..của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)- một loài đặc hữu

của Việt Nam để có thể đánh giá toàn diện hơn về loài này.

145

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyen Thanh Tam, Dao Duc Thien, Le Thi Hong Nhung, Tran Van Chien,

Tran Van Sung, A new lupane triterpenoid from the arial part of

Acanthopanax trifoliatus, Chemistry of Natural Compounds-Russia, 2013,

49(2), 274-276.

2. Nguyen Thanh Tam, Le Thi Hong Nhung, Dao Duc Thien, Tran Van Chien,

and Tran Van Sung, Synthesis and cytotoxic activity of derivatives of 24-nor-

lupane-triterpenoid acids isolated from Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.,

Chemistry of Natural Compounds-Russia (accepted), đang chờ in.

3. Dao Duc Thien, Lam Hoang Tu, Le Thi Hong Nhung, Tran Van Chien,

Nguyen Thanh Tam, and Tran Van Sung, Lupane triterpenoids from

Acanthopanax trifoliatus-Isolation and chemical transformation, Tạp chí Hóa

học, 2012, 50(5), 609-612.

4. Le Thi Hong Nhung, Trinh Thi Thuy, Nguyen Thanh Tam, Dinh Thi Phong,

Nguyen Tien Hiep, Tran Van Sung, Flavonoids and their biological activities

from the rootbark of Pinus krempfii Lecomte., Tạp chí Hóa học, 2013, 51(5A),

22-26.

5. Le Thi Hong Nhung, Nguyen Thanh Tam, Dao Duc Thien, Tran Van Chien,

Tran Van Sung, Isolation and chemical transformation of lupane triterpenoids

from Acanthopanax trifoliatus, The second VAST-KAST workshop (Vietnam

Academy of Science and Technology – Korean Academy of Science and

Technology), Hanoi, October 28th - 29th, 2013.

6. Le Thi Hong Nhung, Trinh Thi Thuy, Nguyen Thanh Tam, Dinh Thi Phong,

Nguyen Tien Hiep, Tran Van Sung, Chemical constituents from the rootbark

of Pinus krempfii Lecomte and their cytotoxic activity, The second VAST-

KAST workshop (Vietnam Academy of Science and Technology – Korean

Academy of Science and Technology), Hanoi, October 28th - 29th, 2013.

146

7. Đào Đức Thiện, Lê Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thanh Tâm, Trần Văn Sung,

Tổng hợp một số dẫn xuất amide của 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-

ene-28-oic acid chiết tách từ cây Ngũ gia bì hương, Tuyển tập báo cáo Hội

nghị khoa học Viện Hóa học, 2011, 61-64.

147

THE NEW CONTRIBUTIONS OF THE THESIS

- This the first time species Pinus krempfii Lecomte has been studied on the

chemical constituents and biological in Vietnam.

- Seven compounds named Tectochrysin (PK1), Pinostrobin (PK2), Pinobanksin

(PK3), Galangin (PK4), Strobopinin (PK5), Cryptostrobin (PK6), Isolariciresinol

(PK7) were isolated and elucidated from the root of Pinus krempfii Lecomte.

Among these, two compounds PK4 and PK7 were isolated from this species for

the first time.

- The isolated compounds has been studied on biological activities. The results

showed that two compounds PK4 and PK7 have fairly good antioxidant activity

(PK7: EC50 = 27,12 µg/ml); four compounds: PK3, PK4, PK6 and PK7 exhibited

cytotoxic activity on 4 human cancer cell lines including KB, HepG2, Lu MCF7.

- A new lupane-triterpene carboxylic acid named 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-

20(29)-ene-28-oic acid (AT3), together with two known 24-nor-11α-hydroxy-3-

oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1), 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-

28-oic acid (AT2) with high content (0.26 and 0.25% of dried plant material,

respectively) were isolated from the aerial part of Acanthopanax trifoliatus L.Merr.

- Starting from AT1 and AT2, 23 new derivatives, including: 4 ester (AT4-AT7), 1

oxo (AT8), 8 amide (AT9-AT17) derivatives of AT1 and 1 ester (AT18), 8 amide

(AT19-AT26), 1 nitrile (AT27) derivatives of AT2 have been synthesized.

- Some of the synthesized compounds have been selected for the cytotoxicity test on

4 human cancer cell lines including KB, HepG2, MCF7 and Lu and antimicrobial

assay to Bacillus subtilis for the first time. Among these, compounds AT11, AT12,

AT13, AT22 showed stronger cytotoxicity than the parent compounds, especially

compound AT22 are six to fifteen times more active than its lead compound on all

four tested cell lines with IC50 values are 3,65 ÷ 4,42µg/ml. Three compounds

AT11, AT16 and AT18 exhibited inhibitory activity against Bacillus subtilis with

average level.

148

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. E.L.Jr. Little and W.B. Critchfield, Subdivisions of the genus Pinus (pines),

USDA Forest Service Miscellaneous Publications, 1969, 1144.

2. R.A. Price, A. Liston and S.H. Strauss, Phylogeny and systematics of Pinus,

Ecology and Biogeography of Pinus, Cambridge University Press, 1998, 49-68.

3. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Thông hai lá dẹt - loài cây đặc hữu của Việt Nam, Tạp

chí Lâm nghiệp, 1993.

4. Holger Erdtman, Bjarne Kimland, Torbjorn Norin, Wood constituents of

Ducamponius Krempfii (Lecomte) chevalier (Pinus Krempfii Lecomte),

Phytochemistry,1966, 5, 927- 931.

5. Torbjorn Norin, Review article some aspects of the chemistry of the order

Pinales, Phytochemistry, 1971, 11, 1231- 1242.

6. Dictionary of Natural Products, version 18:5, Chapman&Hall/CRC, 2009.

7. Sonia Tourino, Ariadna Selga, Aurora Jimenez, Lluis Julia, Carles Lozano,

Daneida Lizarraga, Marta Cascante and Josep Lluis Torres, Procyanidin Fractions

from Pine (Pinus pinaster) bark: Radical scavenging power in solution, Antioxidant

activity in emulsion and Antiproliferative effect in melanoma cells, Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53, 4728−4735.

8. Maria Jerez, Ariadna Selga, Jorge Sineiro, Josep Lluis Torres, Maria Jose

Nunez, A comparison between bark extracts from Pinus pinaster and Pinus radiata:

Antioxidant activity and procyanidin composition, Food Chemistry, 2007, 100(2),

439–444.

9. Xiao-Yu Su, Zhen-Yu Wang, Jia-Ren Liu, In vitro and in vivo antioxidant

activity of Pinus koraiensis seed extract containing phenolic compounds, Food

Chemistry, 2009, 117(4), 681–686.

149

10. Osman Ustun, Fatma Sezer Senol, Mine Kurkcuoglu, Ilkay Erdogan Orhan,

Murat Kartal, Kemal Husnu Can Baser, Investigation on chemical composition,

anticholinesterase and antioxidant activities of extracts and essential oils of Turkish

Pinus species and pycnogenol, Industrial Crops and Products, 2012, 38, 115-123.

11. Ipek Süntar, Ibrahim Tumen, Osman Ustün, Hikmet Keleş, Esra Küpeli

Akkol, Appraisal on the wound healing and anti-inflammatory activities of the

essential oils obtained from the cones and needles of Pinus species by in vivo and in

vitro experimental models, Journal of Ethnopharmacology, 2012, 139(2), 533-540.

12. Nadia Fekih, Hocine Allali, Salima Merghache, Faïza Chaïb, Djamila

Merghache, Mohamed El Amine, Nassim Djabou, Alain Muselli, Boufeldja Tabti,

Jean Costa, Chemical composition and antibacterial activity of Pinus halepensis

Miller growing in West Northern of Algeria, Asian Pacific Journal of Tropical

Disease, 2013, 4(2), 97-103.

13. Hyeusoo Kim, Byongsoon Lee, Kyeong Won Yun, Comparison of chemical

composition and antimicrobial activity of essential oils from three Pinus species,

Industrial Crops and Products, 2013, 44, 323-329.

14. http://www.vienduoclieu.org.vn/

15. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, 1999, 850.

16. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ TP Hồ Chí Minh, 2000, 2, 512.

17. Fa-Ching Chen, Yuh-Meei Lin, See Lin, Constituents of three-leaved

Acanthopanax, Phytochemistry, 1972, 11, 1496-1497.

18. Ph. D. Ty, M. Lischewski, H.V. Phiet, A. Preiss, T.V. Sung, J. Schmidt, G.

Adam, Two triterpenoid carboxylic acids from Acanthopanax trifoliatus,

Phytochemistry, 1984, 23(12), 2889–2891.

19. M. Lischewski, P.D. Ty, L. Kutschabsky, D. Pfeiffer, H.V. Phiet, A. Preiss,

T.V. Sung, G. Adam, Two 24-nor-triterpenoid carboxylic acids from Acanthopanax

trifoliatus, Phytochemistry, 1985, 24(10), 2355–2357.

http://www.vienduoclieu.org.vn/

150

20. Ph.D. Ty, M. Lischewski, H.V. Phiet, A.Preiss, Ph.V. Nguyen, G. Adam, 3α,

11α-Dihydroxy-23-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid from Acanthopanax trifoliatus,

Phytochemistry, 1985, 24(4), 867-869.

21. Phan Văn Kiệm, Phan Tống Sơn, Châu Văn Minh, Kim Young Ho, Phan

Minh Giang, Phạm Hữu Điển, Nghiên cứu thành phần hóa học cây Ngũ gia bì

hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr., Araliaceae) của Việt Nam, Tạp chí hóa

học, 2003, 41(4), 39-44.

22. Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Xing Fu Cai, Jung Joon Lee, Young Ho

Kim, A New 24-Nor-Lupane-Glycoside of Acanthopanax trifoliatus, Archives of

Pharmacal Research, 2003, 26(9), 706-708.

23. Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Nguyen Tien Dat, Xing Fu Cai, Jung Joon

Lee, Young Ho Kim, Two New Phenylpropanoid Glycosides from the Stem Bark of

Acanthopanax trifoliatus, Archives of Pharmacal Research, 2003, 26(12), 1014-

1017.

24. Phan Van Kiem, Xing Fu Cai, Chau Van Minh, Jung Joon Lee, Young Ho

Kim, Lupane-triterpene Carboxylic Acids from the Leaves of Acanthopanax

trifoliatus, Chem. Pharm. Bull., 2003, 51(12), 1432-1435.

25. Phan Văn Kiệm, Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của cây Ngũ gia bì

hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr. Araliaceae), Luận án tiến sĩ Hóa học,

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam, 2005.

26. Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, Nguyễn Tiến Đạt, Jung Joon Lee, Young

Ho Kim, Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ cây Ngũ gia bì hương. Tạp

chí hóa học, 2005, 43(1), 51-55.

27. Xing Fu Cai, Im Seon Lee, Guang hai Shen, Nguyen Tien Dat, Jung Joon Lee,

Young Ho Kim, Triterpenoids from Acanthopanax koreanum root and their

inhibitory activities on NFAT transcription, Archives of Pharmacal Research, 2004,

27(8), 825- 828.

151

28. Roslida Abdul Hamid, Teoh Hui Kee, Fezah Othman, Anti-inflammatory and

anti-hyperalgesic activities of Acanthopanax trifoliatus (L) Merr leaves,

Pharmacognosy Research, 2013, 5(2), 129-133.

29. Pongtip Sithisarn, Piyanuch Rojsanga, Siripen Jarikasem, Ken Tanaka, Kinzo

Matsumoto, Ameliorative Effects of Acanthopanax trifoliatus on Cognitive and

Emotional Deficits in Olfactory Bulbectomized Mice: An Animal Model of

Depression and Cognitive Deficits, Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine, 2013, 9.

30. Brenda Winkel-Shirley, Flavonoid Biosynthesis. A colorful Model for

Genetics, Biochemistry, Cell biology and biotechnology, Plant Physiology, 2001,

126, 485-493.

31. S.V. Bhat, B.A. Nagasampagi, M. Sivakumar, Chemistry of Natural Products,

Narosa Publishing House, 2008, India.

32. Erich Grotewold, The Science of Flavonoids, Springer Science+Business

Media, Inc, 2006, New York.

33. Z.F. Peng, D. Strackb, A. Baumert, R. Subramaniam, N.K. Goha, T.F. Chiaa,

S.N. Tana, L.S. Chia, Antioxidant flavonoids from leaves of Polygonum hydropiper

L., Phytochemistry, 2003, 62, 219-504.

34. J. Gabrielska, J. Osmianski, R. Zylka, M. Komorowska, Antioxidant activity

of flavones from Scutellaria baicalensis in lecithin liposomes, Zeitschrifts fur

Naturforschung, 1997, 52, 817-823.

35. N.P. Das, T.A. Pereira, Effects of flavonoids on thermal autoxidation of palm

oil: structure activity relationships, Journal of American Oil Chemists Society,

1990, 67, 255-258.

36. M. Makino, Y. Fujimoto, Flavanones from Baeckea frutescens,

Phytochemistry, 1999, 50, 273-277.

152

37. D. Susanti, H.M. Sirat, F. Ahmad, R.M. Ali, N. Aimi, M. Kitajima,

Antioxidant and cytotoxic flavonoids from the flowers of Melastoma

malabathricum L., Food Chemistry, 2007, 103, 710-716.

38. B.Q. Li, T. Fu, Y.D. Yan, N.W. Baylor, F.W. Ruscetti, H.F. Kung, , Inhibition

of HIV by baicalin, Cellular Molecular Biological Research, 1997, 39, 119-124.

39. Y.M. Lin, H. Anderson, M.T. Flavin, Y.H.S. Pai, In vitro anti-HIV activity of

biflavonoids from Rhus succedanea, Journal of Natural Products, 1997, 60, 884-

888.

40. G. Brahmachari, Bio-flavonoids with promising antidiabetic potentials: A

critical survey Opportunity, Challenge and Scope of Natural Products in Medicinal

Chemistry, 2011, 187 - 212.

41. H.K. Sandhar, B. Kumar, S. Prasher, P. Tiwari, M. Salhan, P. Sharma, A

Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids, Internationale

Phamarceutica Sciencia, 2011, 1(1), 25 - 41.

42. T. Nishioka, J. Kawabata, Y. Aoyama, Baicalein, an α-glucosidase inhibitor

from Scutellaria baicalemis II, Journal of Natural Products, 1998, 61, 1413-1415.

43. J.M. Narvez-Mastache, M.L. Garduo-Ramrez, L. Alvarez, G. Delgado,

Antihyperglycemic activity and chemical constituents of Eysenhardtia platycarpa,

Journal of Natural Products, 2006, 69(12), 1687 - 1691.

44. Phan Tống Sơn, Hóa Học Tecpen, Đại học Tổng hợp Amsterdam, 1986.

45. Eberhard Breitmaier, Terpenes, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,

2006, Weinheim.

46. Mohammad Saleem, Lupeol, a novel anti-inflammatory and anti-cancer

dietary triterpene, Cancer Letters, 2009, 285(2), 09–115.

47. M.A. Fernandez, B. Delas Heras, M.D. Garcia, M.T. Saenz, Villar A, New

insights into the mechanism of action of the anti-inflammatory triterpene lupeol,

Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2001, 53 (11), 1533-1539.

153

48. Y. Fukuda, K. Sakai, S. Matsunaga, H. Tokuda, R. Tanaka, Cancer

chemopreventive effect of orally administrated lupane-type triterpenoid on

ultraviolet light B induced photocarcinogenesis of hairless mouse, Cancer Letters,

2006, 240, 94–101.

49. The Merck Index, 13th edn, Merck & Co., Inc., 2001, Whitehouse Station, NJ,

USA.

50. G. Adam, M. Lischewski, H.V. Phiet, A. Preiss, J. Schmidt, Tran Van Sung,

3α-Hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioc acid from Schefflera octophylla,

Phytochemistry, 1982, 21, 1385-1387.

51. Joseph D. Connolly and Robert A. Hill, Triterpenoids, Natural Product

Reports, 2005, 22, 487-503.

52. X.Ma, Y. Zhao, L. Yin, D. Han and C. Ji, Studies on the effect of oleanolic

acid on experimental liver injury, Yao Xue Xue Bao, 1982, 17(2), 93-7.

53. Julius K.Adesanwo, Oluwatoyin O. Makinde, Craig A. Obafemi,

Phytochemical analysis and antioxidant activity of methanol extract and betulinic

acid isolated from the roots of Tetracera potatoria, Journal of Pharmacy Research,

2013, 6(9), 903–907.

54. Y. Kashiwada, F. Hashimoto, L.M. Cosentino, C.H. Chen, P.E. Garett, K.

H.Lee, Betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives as potent anti- HIV

agents, Journal of Medicinal Chemistry, 1996, 39, 1016-1017.

55. Y. Kashiwada, H.K. Wang, T. Nagao, S. Kitanaka, I. Yasuda, T. Fojioka, T.

Yamagashi, L.M. Cosentino, M. Kozuka, H. Okabe, Y. Ikeshiro, C.Q. Hu, E. Yeh,

K.H. Lee, Anti-AIDS Agents 30.Anti-HIV Activity of oleanoic acid, pomolic acid,

and structurally related triterpenoids, Journal of Natural Products, 1998, 55, 1090-

1095.

56. T.G. Halsall and R.T. Aplin, Progress in the Chemistry of Organic Natural

Products (Zechmeister l., ed), Springer, 1964, 22, 153, New York.

154

57. Le Bang Son, A.P. Kaplun, A.A. Shpilevskii, Yu.E. Andiya-Pravdivyi, S. G.

Alekseeva, V.B. Grigor’ev, and V.I. Shvets, The Synthesis of Betulinic Acid from

Betulin and Its Solubilization with Liposomes, Russian Journal of Bioorganic

Chemistry, 1998, 24 (10), 700-705.

58. T. Fujioka, Y. Kashiwada, R.E. Kilkuskie, L.M. Cosentino, L.M. Ballas, J.B.

Jiang, W.P. Janzen, I.S. Chen, K.H. Lee, Anti-Aids Agents, 11. Betulinic Acid and

Platanic Acid as Anti –HIV Principles from Syzigum claviflorum, and the Anti-HIV

Activity of Structurally Related Triterpenoids, Journal of Natural Products, 1994,

57(2), 243-247.

59. Leopoldo C. Baratto, Mariana V. Porsani, Ida C. Pimentel, Adaucto B. Pereira

Netto, Reinhard Paschke, Bras H.Oliveira, Preparation of betulinic acid derivatives

by chemical and biotransformation methods and determination of cytotoxicity

against selected cancer cell lines, European Journal of Medicinal Chemistry, 2013,

68, 121-131.

60. O.B.Kazakova, Betulin and ursolic acid synthetic derivatives as inhibitors of

Papilloma virus, Bioorganic & Medicial Chemistry Letters, 2010, 20, 4088-4090.

61. Nguyễn Văn Tuyến, Đặng Thị Tuyết Anh, Synthesis of new hybrids between

nucleoside HIV-RT inhibitors AZT and triterpenoid, Tạp chí hóa học, 2013,

2C(51), 814-818.

62. P.Pan and R.P.Rastogi, The triterpenoids, Phytochemistry, 1979, 18, 1095.

63. The Merck Index, Eleventh Edition, Published by Merck & Co, Inc., Rahway,

N. J. , U.S.A, 1989, 185.

64. C. R. Santos,J. A. Salvador, S. Marín, M. Cascante, J. N. Moreira, T. C. Dinis,

Synthesis and structure-activity relationship study of novel cytotoxic carbamate and

N-acylheterocylic bearing derivatives of betulin and betulinic acid, Bioorganic &

Medicial Chemistry, 2010, 18(12), 4385-4096.

65. S.B. Mahato and S. Sen, Advances in Triterpenoid Research 1990-1994,

Phytochemistry, 1997, 44(7), 1185-1236.

155

66. Fumio Hasimoto, Yoshiki Kashiwada, L. Mark Cosentino, Chin-Ho Chen,

Patricia E. Garrett, Kuo-Hsiung Lee, Anti-AIDS agents—XXVII. Synthesis and

anti-HIV activity of betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives, Bioorganic

& Medicinal Chemistry, 1997,5(12), 2133-2143.

67. K. Yasukawa, Y. Sy, S. Yamanouchi, M. Takido, T. Akihisa and T. Tamura,

Some lupane-type triterpenes inhibit tumor promotion by 12-O-

tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin,

Phytomedicine, 1995, 4, 309-313.

68. M. Evers, C. Poujade, F. Soler, Y. Ribeill, C. James, Y. LeliÌvre, J.-C.

Gueguen, D. Reisdorf, I. Morize, R. Pauwels, E. De Clercq, Y. HÐnin, A.

Bousseau, J.-F. Mayaux, J.B. Le Pecq, N. Dereu, Betulinic Acid Derivatives: A

New Class of Human Immunnodeficienc Virus Type 1 Specific Inhibitors with a

New Mode of Action, Journal of Medicinal Chemistry, 1996, 39, 1056-1068.

69. Keduo Qian, Sang-Yong Kim, Hsin-Yi Hung, Li Huang, Chin-Ho Chen, Kuo-

Hsiung Lee, New betulinic acid derivatives as potent proteasome inhibitors,

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2011,21(19), 5944–5947.

70. J.Adams, VJ.Palombella, EA.Sausville,J. Johnson, A.Destree, DD.Lazarus,J.

Maas, CS. Pien, S.Prakash, PJ.Elliott, Proteasome inhibitors: a novel class of potent

and effective antitumor agents, Cancer research, 1999, 59 (11), 2615–22.

71. YiBi, Jinyl Xu, Xiaoming Wu, Wencai Ye, Shengtao Yuan, Luyong Zhang,

Synthesis and cytotoxic activity of 17-carboxylic acid modified 23-hydroxy

betulinic acid ester derivatives, Bioorganic & Medicinal Chemitry Letters, 2007,

17(5), 1475–1478.

72. Keduo Qian, Kyoko Nakagawa-Goto, Donglei Yu, Susan L. Morris-Natschke,

Theodore J. Nitz, Nicole Kilgore, Graham P.Allaway, Kuo-Hsiung Lee, Anti-AIDS

agents 73: Structure–activity relationship study and asymmetric synthesis of 3-O-

monomethylsuccinyl-betulinic acid derivatives, Bioorganic & Medicinal chemistry

letters, 2007, 17(23), 6553-6557

156

73. K. Chen, Q. Shi and Y. Kashiwada, D.C. Zhang, C.Q. Hu, J.Q. Jin, H. Nozaki,

R.E. Kilkuskie, E. Tramontano, Y.C. Cheng, D.R. Mcphail, A.T. Mcphail, K. H.

Lee, Anti-aids agents, 6. Salaspermic acid, an anti-HIV principle from Triterygium

wilfordii, and the structure-activity correlation with its related compounds', Journal

of Natural Products, 1992, 55, 340-346.

74. J.F. Mayaux, A. Bousseau, R. Pauwels, T. Huet, Y. HÐnin, N. Dereu, M.

Evers, F. Soler, C. Poujade, E. De Clercq, J.B. Le Pecq, "Triterpene Derivatives that

block Entry of Human Immunodeficiency Virus Type 1 into Cells", Proceedings of

the National Academy of Sciences of the USA, 1994, 91, 3564-3568.

75. Weihong Lai, LiHuang, Phong Ho, Zhijun Li, David Montefiori, Chin-Ho

Chen, Betulinic Acid Derivatives That Target gp120 and Inhibit Multiple Genetic

Subtypes of Human Immunodeficiency Virus Type 1, Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 2008, 52(1), 128-136.

76. Pual Cos, Louis Maes, Jean-BoscoSindambiwe, Arnold J.Vlietinck, Dirk

Vanden Berghe, Bioassay for antibacterial and antifungal activities, Laboratory for

Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical

and Veterinary Sciences, University of Antwerp, Belgium, 2005, 1-13.

77. Franz Hadacek, Harald Greger, Testing of Antifungal Natural Products:

Methodologies, Comparability of Results and Assay Choice, Phytochemical

analysis, 2000, 11, 137-147.

78. R.I. Fresney, Culture of animal Cells, John Wiley & Sons Inc., New York. A

manual of basis techniques, 1993, 3rd Edition.

79. D.A.Scudiero, R.H.Shoemaker, D.P.Kenneth, A.Monks, S.Tierney,

T.H.Nofziger, M.J.Currens, D.Seniff, M.R.Boyd, Evaluation of a soluable

tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using

human and other tumor cell lines, Cancer Research, 1988, 48, 4827-4833.

80. M.Burits and F.Bucar, Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil,

Phytotherapy Research, 2000, 14, 323–328.

157

81. M.Cuendet, K.Hostettmann and O.Potterat, Iridoid glucosides with free radical

scavenging properties from Fagraea blumei, Helvetica Chimica Acta, 1997, 80,

1144–1152.

82. Hyun-Suk Ko, Hyo-Jeong Lee, Hyo-Jung Lee, Eun Jung Sohn, Miyong

Yun, Min-Ho Lee and Sung-Hoon Kim, Essential Oil of Pinus koraiensis Exerts

Antiobesic and Hypolipidemic Activity via Inhibition of Peroxisome Proliferator-

Activated Receptors Gamma Signaling, Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine, 2013, 2013, 131-141.

83. Ismail Amri, Samia Gargouri, Lamia Hamrouni, Mohsen Hanana, Tarek

Fezzani, Bassem Jamoussi, Chemical composition, phytotoxic and antifungal

activities of Pinus pinea essential oil, Journal of Pest Science, 2012, 85(2), 199-207.

84. J.H.Jung and J.L.McLaughlin, 13C-1H NMR long-range coupling and

deuterium isotope effects of flavanones, Phytochemistry, 1990, 9(4), 1271-1275

85. Lam Phuc Khanh, Huynh Khang Truc, Nguyen Truong Thien Kim, Nguyen

Kim Phi Phung, Nguyen Thi Hoai Thu, Chemical constituents from leaves of

Avicennia lanata non ridley, Phamhoang (Avicenniaceae), Tạp chí phát triển

KH&CN ĐH Quốc Gia TP.HCM, 2013, 16(2), 20-25.

86. Hans Haeberlein, Klaus-P. Tschiersch, Triterpenoids and flavonoid from

Leptospermum scoparium, Phytochemistry, 1994, 35(3), 765-768.

87. Neeraj K. Patel, Kamlesh K. Bhutani, Pinostrobin and Cajanus lactone isolated

from Cajanus cajan (L.) leaves inhibits TNF-α and IL-1β production: In vitro and

in vivo experimentation, Phytomedicine, 2014, 21(7), 946-953.

88. Kevin J Hodgetts, Approaches to 2-substituted chroman-4-ones: synthesis of

(−)-pinostrobin, Tetrahedron Letters, 2001, 42(22), 3763-3766.

89. Eckhard Wollenweber, Ruediger Wehde, Marion Doerr, Guenter Lang, Jan F.

Stevens, C-methyl flavonoids from the leaf waxes of some Myrtaceae,

Phytochemistry, 2000, 55, 965-970.

158

90. Sandor Antus, Eva Schidlbeck, Saboo Almad, H.Wagner, Synthesis of

melanervin from melaleuca quinquenervia, the first naturally occurring compound

with a triphenylmethane structure, Tetrahedron, 1982, 38(1), 133-137.

91. O.Seligmann, H.Wagner, Structure determination of melanervin, the first

naturally occurring flavonoid of the triphenylmethane family, Tetrahedron, 1981,

37(15), 2601-2606.

92. Guy Solladie, Nicolai Gehrold, Jean Maignan, Biomimetic synthesis of the

flavanone leridol, revision of the structure of the natural products, European

Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 2309-2314.

93. Aranya Jutiviboonsuk, Hongjie Zhang, Ghee Teng Tan, Cuiying Ma, Nguyen

Van Hung, Nguyen Manh Cuong, Nuntavan Bunyapraphatsara, D. Doel Soejarto,

Harry H.S. Fong, Burselignan Bioactive constituents from roots of Bursera

tonkinensis, Phytochemistry, 2005, 66, 2745-2751.

94. Sebastião Ferreira Fonseca, Jayr de Paiva Campello, Lauro E. S. Barata,

Edmundo A. Rúveda, 13C NMR spectral analysis of lignans from Araucaria

angustifolia, Phytochemistry, 1978, 17(3), 499-502.

95. Jean-Christophe Le Bail, Lucie Aubourg, Gérard Habrioux, Effects of

pinostrobin on estrogen metabolism and estrogen receptor transactivation, Cancer

letters, 2000, 156(1), 37-44.

96. Abdelhakim Ahmed-Belkacem, Alexandre Pozza, Francisco Muñoz-Martínez,

Susan E. Bates, Santiago Castanys, Francisco Gamarro, Attilio Di Pietro and José

M. Pérez-Victoria, Flavonoid structure-activity studies identify 6-prenylchrysin and

tectochrysin as potent and specific inhibitors of breast cancer resistance protein

ABCG2, Cancer research, 2005, 65(11), 4852-4860.

97. C.F.Massaro, M.Katouli, T.Grkovic, H.Vu, R.J.Quinn, T.A.Heard , C.

Carvalho, M.Manley-Harris, H.M.Wallace, P.Brooks, Anti-staphylococcal activity

of C-methyl flavanones from propolis of Australian stingless bees (Tetragonula

carbonaria) and fruit resins of Corymbia torelliana (Myrtaceae), Fitoterapia, 2014,

95, 247-257.

159

98. D.M.Kasote, Flaxseed phenolics as natural antioxidants, International Food

Research Journal, 2013, 20(1), 27-34.

99. M.J.Nunez, C.P.Reyes, I.A.Jimenez, L.Moujir, I.L.Bazzocchi, Lupane

triterpenoids from Maytenus Species, Journal of Natural Products, 2005, 68, 1018-

1021.

100. T.G.Fourie, E.Matthee, F.O.Snyckers, A pentacyclic triterpene acid with anti

ulcer properties from cussonia natalensis, Phytochemistry, 1989, 28(10), 2851-

2852.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Tên luận án: Nghiên cứu hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt (Pinus

krempfii Lecomte) và Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.).

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62.44.27.01.

Họ và tên NCS: Lê Thị Hồng Nhung

Khóa đào tạo: 2010 – 2014

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Trịnh Thị Thủy

2. TS. Nguyễn Thanh Tâm

Tên cơ sở đào tạo: Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Những đóng góp mới của luận án:

- Lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii

Lecomte) ở Việt Nam được công bố.

- Từ rễ của loài Thông lá dẹt đã phân lập và xác định cấu trúc của 7 hợp chất bằng các phương

pháp phổ (IR, MS, NMR), đó là: Tectochrysin (PK1), Pinostrobin (PK2), Pinobanksin (PK3),

Galangin (PK4), Strobopinin (PK5), Cryptostrobin (PK6), Isolariciresinol (PK7). Trong đó, 2

chất Galangin và Isolariciresinol lần đầu được phát hiện từ loài này.

- Kết quả hoạt tính gây độc tế bào ung thư người gồm KB, HepG2, Lu, MCF7 và hoạt tính chống

oxi hóa của các chất phân lập được cho thấy, 2 chất PK4 và PK7 có khả năng chống oxi hóa, đặc

biệt là PK7 có giá trị EC50 là 27,12 µg/ml; 4 chất: PK3, PK4, PK6 và PK7 có khả năng ức chế

sự phát triển của 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm.

- Triterpene khung lupane 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) là chất

mới đã được phân lập và xác định cấu trúc từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus

L.Merr.). Hai chất 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1) và 24-nor-

3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) được phân lập với hàm lượng khá cao

(tương ứng 0,26% và 0,25 % so với mẫu khô).

- Đã tổng hợp được 23 dẫn xuất mới từ 2 chất AT1 và AT2 gồm: 4 dẫn xuất ester (AT4-AT7),

1 dẫn xuất oxo (AT8), 8 dẫn xuất amide (AT9-AT17) của AT1 và 1 dẫn xuất ester (AT18), 8

dẫn xuất amide (AT19-AT26), 1 dẫn xuất nitrile (AT27) của AT2.

- Đây là lần đầu tiên kết quả nghiên cứu về hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis và gây độc tế

bào trên 4 dòng tế bào ung thư KB, HepG2, LU, MCF7 của một số dẫn xuất tổng hợp được công

bố. Kết quả cho thấy 3 chất AT11, AT16, AT18 thể hiện hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis

ở mức trung bình; 4 chất AT11, AT12, AT13, AT22 đều cho hoạt tính cao hơn so với 2 chất

đầu AT1 và AT2. Đặc biệt, dẫn xuất AT22 có khả năng ức chế mạnh, tăng gấp 6-15 lần so với

chất đầu AT2 trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC50 là 3,65 ÷ 4,42µg/ml.

Hà Nội, ngày 30 tháng 9 năm 2014

TẬP THỂ HƯỚNG DẪN

PGS.TS.Trịnh Thị Thủy TS. Nguyễn Thanh Tâm

NGHIÊN CỨU SINH

Lê Thị Hồng Nhung

CƠ SỞ ĐÀO TẠO

THE NEW CONTRIBUTIONS OF THE THESIS Thesis title: Study of chemistry and biological activities of Pinus krempfii Lecomte and

Acanthopanax trifoliatus L.Merr.

Major: Organic Chemistry

Code: 62.44.27.01.

PhD : LeThi Hong Nhung

Supervisor: 1. Assoc. Prof. Trinh Thi Thuy

2. Dr. Nguyen Thanh Tam

Education Insitutions: Institute of Chemistry – Vietnam Academy of Science and

Technology.

The new contributions of the thesis:

- This the first time species Pinus krempfii Lecomte has been studied on the chemical

constituents and biological in Vietnam.

- Seven compounds named Tectochrysin (PK1), Pinostrobin (PK2), Pinobanksin (PK3),

Galangin (PK4), Strobopinin (PK5), Cryptostrobin (PK6), Isolariciresinol (PK7) were

isolated and elucidated from the root of Pinus krempfii Lecomte. Among these, two

compounds PK4 and PK7 were isolated from this species for the first time.

- The isolated compounds has been studied on biological activities. The results showed

that two compounds PK4 and PK7 have fairly good antioxidant activity (PK7: EC50 =

27,12 µg/ml); four compounds: PK3, PK4, PK6 and PK7 exhibited cytotoxic activity on

4 human cancer cell lines including KB, HepG2, Lu MCF7.

- A new lupane-triterpene carboxylic acid named 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-

ene-28-oic acid (AT3), together with two known 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-

ene-28-oic acid (AT1), 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) with

high content (0.26 and 0.25% of dried plant material, respectively) were isolated from the

aerial part of Acanthopanax trifoliatus L.Merr.

- Starting from AT1 and AT2, 23 new derivatives, including: 4 ester (AT4-AT7), 1 oxo

(AT8), 8 amide (AT9-AT17) derivatives of AT1 and 1 ester (AT18), 8 amide (AT19-

AT26), 1 nitrile (AT27) derivatives of AT2 have been synthesized.

- Some of the synthesized compounds have been selected for the cytotoxicity test on 4

human cancer cell lines including KB, HepG2, MCF7 and Lu and antimicrobial assay to

Bacillus subtilis for the first time. Among these, compounds AT11, AT12, AT13, AT22

showed stronger cytotoxicity than the parent compounds, especially compound AT22 are

six to fifteen times more active than its lead compound on all four tested cell lines with

IC50 values are 3,65 ÷ 4,42µg/ml. Three compounds AT11, AT16 and AT18 exhibited

inhibitory activity against Bacillus subtilis with average level.

Hanoi, 30th September 2014

SUPERVISOR

Assoc.Prof. Trinh Thi Thuy Dr. Nguyen Thanh Tam

PhD STUDENT

Le Thi Hong Nhung

EDUCCATION INSTITUTION

VIỆN HOÁ HỌC - Trang chủ - Viện Hóa Học gop moi TV-TA.pdf · Viện Hóa học đã...

Documents

Transcript of VIỆN HOÁ HỌC - Trang chủ - Viện Hóa Học gop moi TV-TA.pdf · Viện Hóa học đã...