Validacion de tecnicas para deteccion de sangre, sangre humana y grupo sanguineo ABO

INTRODUCCIN:El hallazgo de sangre en manchas obtenidas en las escenas de las investigacionesforenses juega un papel fundamental en la resolucin de los casos criminales. Adems de laidentificacin de sangre proveniente de un ser humano se puede tipificar el grupo sanguneoal que pertenece y posteriormente realizar anlisis de ADN [1].

Entre las tcnicas ms utiliza-das estn las de Luminol, Fenolftalena y Piramidn, como indicadoras de la existencia de san-gre, Takayama para confirmar su presencia, Inhibicin de la Aglutinacin para comprobar si lasangre es humana y Absorcin-Elucin para determinar el grupo ABO de la muestra [2].Aunque son ampliamente utilizadas es importante establecer su sensibilidad y efectividadcuando las muestras han sido sometidas a diferentes condiciones ambientales en diferentessoportes en vista que la mayora de casos en criminalstica presentan evidencias biolgicas dediversos orgenes [3].Con el fin de evaluar estas tcnicas y determinar la capacidad de los procedimientos paraalcanzar un resultado confiable se sometieron muestras conocidas a diferentes condiciones detemperatura, clase de soporte, dilucin, ambiente y tiempo de exposicin.MATERIAL Y MTODO:1.

Muestras, soportes y condiciones.Se procedi a realizar manchas patrn con unamuestra conocida para evaluar la efectividad de los procedimientos frente a diferentes soportes,temperaturas, tiempo, contaminantes y diluciones para analizar la sensibilidad de la tcnica. Se tom muestra de sangre por puncin venosa en tubo con anticoagulante EDTA y posteriormente seprocedi a realizar manchas sobre Algodn, Tela de Algodn, Seda, Lino, Satn, Jean delgado y Jeangrueso. Se expuso a una temperatura de -20, 4, 37 y 60 C por periodos de tiempo de 24 horas,una semana y un mes.2. Test de Piramidn, Fenolftaleina, Luminol.Pretratamiento de las muestras. En tubos de ensayo de 16 x 100 mm marcados con elnmero de radicacin del laboratorio y nmero de muestra se coloc un fragmento de la manchade 0,5 x 0,5 cm y se agreg 1 ml de solucin salina al 0.85%, dejando por el tiempo que seanecesario para separar la mancha del soporte.Test de Piramidn. A 3 gotas de la muestra pretratada se le adicionaron 3 gotas de losreactivos de Piramidn, cido actico y perhidrol evidenciando la reaccin por un cambio decolor. (+) = coloracin violeta, (-) = sin cambio de color [2].Test de Fenolftalena y Luminol. Estas tcnicas se realizaron con el mtodo descrito porCox, M en 1991 [3] para Fenolftalena y Castello, A et al. en 2002 [4] para Luminol.Interferencia de sustancias similares a la sangre. Con el fin de evaluar la interferencia desustancias que puedan generar resultados falsos positivos en la tcnica de Piramidn se hicieronmanchas sobre tela de algodn de la siguientes Frutas: Banano, Cereza, Ciruela, Durazno, Fresa,Limn, Mandarina, Manzana, Meln, Mora, Naranja, Pera, Pia y Uva roja; Verduras: Cebolla,Rbano, Papa, Espinaca, Uva verde, Aguacate, Frjol rojo, Repollo, Zanahoria, Coliflor, Maz, Apio,Pepino Cocohombro, Berenjena, Ajo, Lechuga, Tomate, Remolacha y Pimentn; Otras sustancias:Vino tinto, Salsa de tomate, Caf, Gelatina, Bebida carbonatada y xido; Fluidos biolgicos comosaliva y orina.MR. Villegas et al.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005268

Validacin de tcnicas para deteccin de sangre, sangre humana y grupo sanguneo ABO en diferentes soportes y condiciones con fines forenses.Manchas lavadas. Simultneamente se tom una muestra de sangre por puncin venosaen tubo con anticoagulante de citrato de sodio y se realizaron cuatro manchas sobre tela de algo-dn las cuales fueron sometidas a un lavado con agua nicamente, con agua y jabn, agua y blan-queador y a la ltima se le adiciono aceite de cocina.Sensibilidad de las pruebas. Se tomaron muestras de sangre por puncin venosa en tubocon anticoagulante EDTA, a cuatro personas con hemoclasificacin A, B, AB y O, a las que se leshizo diluciones seriadas base 10, a partir de una dilucin 1/10, as: 1/100, 1/500, 1/1.000, 1/ 5.000,1/10.000. De estas se hicieron manchas sobre algodn para la prueba de Piramidn.

Ya obtenidaslas diluciones de cada grupo sanguneo se hicieron manchas por triplicado sobre diferentes sopor-tes como: Algodn, Tela de algodn y Papel Filtro. Para las pruebas de Piramidn, Fenolftaleina yLuminol. Para la prueba de deteccin de sangre por quimioluminiscencia (Luminol) se adicionaronotras diluciones adems de las ya mencionadas: 1/100.000, 1/500.000, 1/1.000.000.3. Test de Takayama.Muestras, soportes y condiciones. Se tom muestra de sangre por puncin venosa entubo con anticoagulante EDTA y posteriormente se procedi a realizar manchas sobre Algodn, Telade Algodn, Seda, Lino, Satn, Jean delgado y Jean grueso. Se expuso a una temperatura de -20,4, 37 y 60 C por periodos de tiempo de 24 horas, una semana y un mes. A las manchas de 24horas se sometieron a ambientes cerrados, abiertos y en un recipiente con tierra negra.Sensibilidad de la prueba. Se tomaron muestras de sangre por puncin venosa en tubocon anticoagulante EDTA, a personas con hemoclasificacin de los cuatro grupos sanguneos del sis-tema ABO (A, B, AB, O), a las que se les hizo diluciones seriadas a partir de 1/10, as: 1/100, 1/500,1/1.000, 1/ 5.000, 1/10.000.Test de Takayama. Con una hoja de bistur se hizo un raspado de la mancha con el fin deobtener pequeas escamas, las cuales se colocaron entre lmina y laminilla. Luego se agreg porcapilaridad una gota del reactivo de Takayama dejando en reposo de 10 a 20 minutos. Se observal microscopio con objetivo de 10X y 40X incluyendo controles positivos y negativos.4. Determinacin de sangre humana en manchas. Inhibicin de la aglutinacin.Muestras, soportes y condiciones. Las mismas del mtodo de Takayama.Sensibilidad de la prueba. Igual que en el test de Piramidn.Prueba de Inhibicin de la aglutinacin. Se titul el suero de Coombs y se seleccionaronlas 2 diluciones que demostraron mejor lectura. La muestra pretratada (Ver test de Piramidn) sepuso en contacto con las diluciones escogidas y glbulos rojos sensibilizados al 2%. Se realizaroncontroles con sangre humana, sangre animal y solucin salina al 0.85%.5. Absorcin - Elucin.Muestras, soportes y condiciones. Igual al test de Piramidn.Mtodo de absorcin-elucin. Esta prueba se llev acabo siguiendo el descrito por Nishi,K en 1985 [5].RESULTADOS:Los resultados se muestran en las tablas 1 a 9.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005269

MR. Villegas et al.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005270Tabla 1. Resultado de la prueba de Piramidn. + = Test positivo, la mancha puede corresponder a sangre, - = Testnegativo, +* = El test fue positivo pero con reaccin retardada, N.P.= No Procesado. rea cerrada, abierta o enterra-do se refiere a que la muestra fue dejada en esa condicin durante 24 horas antes de ser procesada.Tabla 2. Anlisis de muestras con los test de Piramidn, Luminol y Fenolftaleina sometidas a diferentes procedimien-tos de limpieza. N.P = No se proces.Tabla 3. Sensibilidad de los test de Piramidn, Fenolftaleina y Luminol en diferentes soportes. + = Test positivo,- = Test negativo y N.P. = No se proces.

Validacin de tcnicas para deteccin de sangre, sangre humana y grupo sanguneo ABO en diferentes soportes y condiciones con fines forenses.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005271Tabla 4. Resultado del Test de Takayama. + = Test positivo, la mancha corresponde a sangre, - = Test negativo,N.P.= No Procesado.Tabla 5. Tabla 5. Sensibilidad del test de Takayama en diferentes soportes. + = Test positivo, - = Test negativo yN.P. = No se proces.

MR. Villegas et al.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005272Tabla 6. Resultado de la Inhibicin de la aglutinacin para determinar sangre humana en manchas. -/-: Indica quecorresponde a sangre humana. +/+ Indica que no corresponde a sangre humana.Tabla 7. Sensibilidad de la tcnica de Inhibicin de la aglutinacin. -/-: Indica sangre humana, +/-: Dudoso, +/+: Nocorresponde a sangre humana.Tabla 8. Absorcin-elucin para determinacindel grupo sanguneo ABO. La mancha utilizadaperteneca en todos los casos al grupo O.O = Concuerda con el resultado esperado,INC = Inconcluyente.

Validacin de tcnicas para deteccin de sangre, sangre humana y grupo sanguneo ABO en diferentes soportes y condiciones con fines forenses.

DISCUSIN:El test de Piramidn demostr ser una excelente prueba presuntiva en diferentes soportesy condiciones. Los resultados indican que hay que ser cuidadoso en su interpretacin cuando lasmuestras han sido enterradas. No se observaron resultados falsos positivos al analizar sustancias conapariencia similar a la sangre. Para manchas que han sido sometidas a lavado con agua o detergentesel Luminol se muestra superior en su deteccin al Piramidn.Cuando se compara la sensibilidad de los 3 test presuntivos se observa que el ms sensi-ble es el Luminol (Hasta 1/500.000) seguido de Fenolftaleina (Hasta 1/5.000). Estos resultados sonsimilares a los descritos por Cox, M. en 1991 para Fenolftalena.El test de Takayama se ve afectado cuando la muestra ha sido expuesta a temperaturas altassin importar el tiempo de exposicin.

La inhibicin de la aglutinacin se vio alterada cuando lasmuestras fueron enterradas y su soporte era Seda o Satn. La sensibilidad de las dos pruebas ante-riores es muy baja, detectando presencia de sangre y sangre humana en muestras diluidas hasta1/100. Se confirma que se requiere abundante cantidad de muestra para obtener un resultadoconfiable.La tcnica de Absorcin-elucin para determinar el grupo sanguneo se vio afectada princi-palmente por el soporte de tela Jean delgada o gruesa. La temperatura de almacenamiento elevada(60C) solo alter el algodn luego de un mes de recogida la muestra. Katsuji, N. et al. report quelos antgenos son termoestables inclusive cuando han sido purificados. El tiempo de almacenamientono afect los resultados confirmndose lo referido por el mismo artculo. La sensibilidad de estaprueba se ve afectada cuando las muestras son diluidas en concordancia con otros reportes dondese encuentran resultados discrepantes cuando se trabaja con muestras hmedas [12].CONCLUSIONES:Las pruebas presuntivas y confirmatorias son una herramienta til en el estudio de manchasde sangre en casos de investigacin judicial.El Luminol se constituye como la prueba ms apropiada en el estudio de posibles manchasde sangre sobre los test de Piramidn y Fenolftaleina.Las pruebas confirmatorias no se ven afectadas por las condiciones de exposicin de lasmuestras o el soporte pero su sensibilidad es baja.AGRADECIMIENTOS:A la empresa VERITAS Qumica Forense por el suministro de los reactivos para los test deLuminol y Fenolftaleina. Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005273Tabla 9. Sensibilidad de la tcnica de Absorcin-elucin para determinacin del grupo sanguneo ABO.A, B, AB u O = Concordancia con el resultado esperado segn cada grupo evaluado, INC = Inconcluyente.

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Page 8BIBLIOGRAFA:1. Budowle B., Leggitt JL., Defenbaugh DA, Keys KM, Malkiewicz, SF.The Presumptive Reagent Fluorescein for Detection of DiluteBloodstains and Subsequent STR Typing of Recovered DNA. JForensic Sci. 2000; 45(5): 1090-1092.2. Gisbert JA., Villanueva E. Medicina legal y toxicologa. 6a Ed.Masson, Barcelona, 2004.3. Cox M. A Study of the Sensitive and Specificity of Four PresumptiveTests for Blood. J Forensic Sci. 1991; 36(5): 1503-1511.4. Castell PA, lvarez SM, Feucht M, Verd-Pascual F.A. Revelado deManchas Latentes: Efectividad del Luminol y Evaluacin de su EfectoSobre el Estudio del DNA. Cuad Med Forense. 2002; 28: 33-36.5. Nishi K, Ito N, Mizumoto J, Wada K, Tsuji T, Kimura A. Reliabilityof blood grouping of aged blood to direct hemagglutinationmethods and absorption elution method. Nippon Hoigaku Zasshi.1985; 39(2): 131-137.6. Escrito HTML: Serology Forensic. Recuperado el 21 Jul. 2006http://faculty.ncwc.edu/toconnor/425/425lect13.htm.7. Castell A, lvarez M. Estudio de la Especificidad del Luminol.Revista Brasilera de Medicina Legal. 2004; 3(5).8. Castell A, Verd PF. Critical Revision of Presumptive Tests forBloodstains. Forensic Science Communications. 1999; 1(2).9. Della Manna A, Montpetit S. A Novel Approach to ObtainingReliable PCR Results from Luminol Treated Bloodstains. J ForensicSci. 2000; 45(4): 886-890.10. Gross AM, Harris KA, Kaldun GL. The Effect of Luminol onPresumptive Tests and DNA Analysis Using the Polymerase ChainReaction. J Forensic Sci. 1999; 44(4): 837-840.11. Kent JM, Elliot DA, Miskelly GM. Inhibition of Bleach-InducedLuminol Chemiluminescence. J Forensic Sci. 2003; 48(1): 64-67.12. Nishi K, Rand S, Nakagawa AY, Yamasaki S, Yamamoto Y,Kobayashi A, Kane M, Morimoto A, Spalthoff H, Annuss B. ABOBlood Typing from Forensic Materials - Merits and demerits ofdetection methods utilized in our laboratories, and biological sig-nificance of the antigens. Anil Aggrawals Internet Journal ofForensic Medicine and Toxicology [serial online],2005;6(2). http://www.geradts.com/anil/ij/vol_006_no_002/papers/paper001.htmlMR. Villegas et al.Cuad Med Forense, 11(42), Octubre 2005274

Por Mauricio

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