UTILIDAD DE LOS MÉTODOS MOLECULARES EN … · EN BACTERIOLOGÍA APLICADA Y SU IMPACTO CLÍNICO ......
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Dra Daniela CentrónLaboratorio de Investigaciones de Mecanismos de Resistencia a Antibióticos
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología,
Facultad de Medicina,
Universidad de Buenos Aires.
UTILIDAD DE LOS MÉTODOS MOLECULARES
EN BACTERIOLOGÍA APLICADA Y SU IMPACTO CLÍNICO
EN NUESTRO PAÍS
Patógenos frecuentemente reportados
• Staphylococcus aureus• Pseudomonas aeruginosa• Acinetobacter baumannii• Klebsiella pneumoniae• Serratia marcescens• Enterococcus spp.
PREVENCIÓN
Confirmación molecular de bajos niveles de R
Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SAMR)Diagnóstico rápido
Enterococcus resistente a la vancomicina (EVR)
Identificación de resistencias ligadas
Plásmidos, transposones e integrones
Identificación de mecanismos epidémicos
Emergencia de brotes por agentes etiológicos inusuales
ANÁLISIS DE BROTES
Complejo Burkholderia cepacia (BCC)
A. baumannii en un centro hospitalario
Evolución de la resistencia a meticilina en Argentina
Porc
enta
je d
e ba
cter
ias
resist
ente
s
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1975 1980 1985 1990 1995 2000 2002 20082004 2006
1975 a 2008
Potencial de transmisión
Transferencia in vivo de mecA
1º Aislamiento de SAMS de hemocultivos de neonato.2º Portación nasal de SAMR y cepas de S. epidermidis MR
SAMS y SAMR diferían en 1 banda (40Kb) mecA+
ADN mec S. epidermidis idem SAMR
(Wielders CLC y col. Lancet 2001)
Adquisición del gen
Prevenir emergencia de cepas de S. aureus con bajos niveles de R a oxacilina
mecA
Resistencia a TODOS los β-lactámicos
El gen mecA se localiza en el cassettecromosómico SCCmec
SCCmecA
Hay 6 tipos:
I, II, III, IV, V, VI(difieren en tamaño, nº de IS, nº de Tn, determinantes de R, etc)
Prevalencia de los clones mayores de SAMR
Pulsotipo A: clon cordobésPulsotipo B: clon sudamericanoPulsotipo C: clon pediátrico
prev
alen
cia
(%)
(Solá C et al., 2006)
Dinámica de los clones circulantes de SAMR en Argentina
0%
0%
0%
0%
0%
Clon Brasilero
Clon Cordobés
1998 2002
CLON BRASILERO
CLON CORDOBÉS 2004-2008??
HETERORRESISTENCIA??HOMORRESISTENCIA
(Corso A, 1998, 2004; Gardella N, 2005; Jeric P, 2006; Sola C, 2002, 2006, 2008; Tokumoto M, 2007)
Identificar bajos niveles de R a oxacilina en cepas de S. aureus
Informar falsa sensibilidad provoca falla de tratamiento
Informar falsa resistencia provoca alto costo y uso de glicopéptidos
(Corso A, 2004)
Reporte de la “clona uruguaya” de SAMR-CA en Uruguay
2003: Brote en centros carcelarios masculinos: >1000infectados, con másde 12 casos mortales .
Caracterización del brote:
CLON PREDOMINANTE: Mayoría PVL +, SCC IV.
Fenotipo sensible a: TMS, Cipro, Rifa, Genta, Vanco
ALTA VIRULENCIA
(Galiana EID, 2003)
Identificación del SCCmec por multiplex PCR
I II III IVa IVb IVc IVd IVe IVg IVh V VI
(Milheirico C, 2007)
Identificar bajos niveles de R a oxacilina en cepas de S. aureus
Multiplex-PCR
SCCmecIdentificación de clones
SCCmec tipo IV Clon pediátricoH4, H5, H6, H7, H8 (Tokumoto M, 2007)
La vigilancia epidemiológica de los
SCCmec permite PREVENIR en la
identificación de bajos niveles
de R a oxacilina en cepas de S. aureus
y la dispersión de clones
ALTAMENTE virulentos
Generalidades
• Patógeno oportunista
• Endocarditis e ITU
• Infecciones nosocomiales
• E. faecalis/E. faecium
• Multirresistencia
Importancia de la resistencia
• Brotes intrahospitalarios
• Dificultad en su detección por el laboratorio
• Problemas de tratamiento
• Posibilidad de extenderse a otros gram +
Enterococcus spp. multiresistente es declarado patógeno emergente por el CDC 1990
1993
2002
PREVENCIÓN
EVR aislado en
pacientes de
la comunidad
Primer aislamiento de Staphylococcus aureusresistente a la vancomicina portador del determinante
de resistencia de los EVR
EVR
• Fenotipos:EL ALFABETO VAN
VAN A VAN B VAN C VAN EVAN D VAN G VAN F
VAN A VAN B
•Argentina:Se reportan más casos de Enterococcus faecium VanA
(Casellas JM, 1997; Corso A, 2001; Courvalin, 2006; Lopardo HA, 2000; Lopreto C, 2002; Marín, E, 1998; Podestá OS, 1997; Targa L, 1997)
Pacientes infectados con EVR multirresistente
son MUY difíciles de tratar
MÉTODOS FENOTÍPICOS
Limitados para detectar bajos niveles de resistencia a los glicopéptidos
Llevan de 3 a 5 días
Pacientes colonizados por EVR
AISLAMIENTO
DIAGNÓSTICO BASADO EN LA PCR
Disminuye días de aislamiento de pacientes “sospechosos” de ser portadores de EVR
Considerado como el método “gold standard” por algunos autores
(Chen Y, 1998; Coombs G, 1999, Peterson RL, 2002; Roger M, 1999)
Diagnóstico rápido de EVR
Incubación Óptima
Extracción del ADN total Mediante Sistema A o B
Hisopado rectal o
Materia Fecal
Mínimo 4 hsn=110 muestras
H1, H2 y H3
Diagnóstico rápido de EVR
EXTRACCIÓN DEL ADN TOTAL
Sistema BSistema AAjuste de DO (2 x 109 celulas) 1mL cultivo
Lisis
Tratamiento con RNasas
Eliminación de proteínas
Transferencia de ADN
Precipitación
Resuspensión
Buffer de Lisis
Tratamiento con Proteinasa K y agregado de buffer del Kit
Precipitación ADN
Pasajes por columna de purificación
Lavados con soluciones comerciales
Elución (soluciones comerciales)
Soluciones del kit
comercial
Duración: 1:40
Soluciones del kit
comercial Duración: 1:30
1hs con solución del kit1hs con H2O destiladaH2O destilada sin incubación
Diagnóstico rápido de EVR
m1m1 MMCC--CMCMm7m7m6m6m5m5m4m4m3m3m2m2
m1m1 MMCC--m7m7 CVCVm6m6m5m5m4m4m3m3m2m2
1000
1000
600
600
300
300
1045
1045
330450
A B
Muestra M 94% 100%
Muestra P 59% 100%
M+P 83% 100%
Tiempo 8hs 12hs
Medio opt. BEA-v/BHI BEA-v/BHI
El diagnóstico de EVR puede darse dentro de las primeras 12 hs con
alta sensibilidad y especificidad.
Diagnóstico rápido de EVR
PORTACIÓN DE EVR POSITIVO
SE PROSIGUE CON EL AISLAMIENTO DEL PACIENTE
PORTACIÓN DE EVR NEGATIVO
SE PASA AL PACIENTE A LA SALA COMÚN
Transferencia Horizontal de genes, THG
ADN desnudo
Plásmidos
Bacteriófagos
Transposones
Integrones
Secuencias de inserción
Los actores
Identificación molecular de resistencias ligadas
RESISTENCIAS LIGADAS
QUE SE CO-SELECCIONAN
BAJO PRESIÓN ANTIBIÓTICA
Integrones y Resistencia a carbapenemes
blaVIM-2 aacA7 aadA1
blaVIM-2 aac(6´)-Ib aadA1
blaVIM-2
aac(6´)-Ib blaVIM-2
aacA7 blaVIM-2 dfrA aacCA5
Administración de un aminoglucósido
selecciona cepas Ra carbapenemes
(Yum et al, JAC 2002, Lolans, K 2005)
Integrones y Transposones localizados en islas genómicas
Isla genómica SGI1 movilizable en el cromosoma de Salmonella spp..
(Levings RS, J Bact, 2005)
Las BLEE son mucho más frecuentes en Latinoamérica que en otros continentes
Porcentaje de K.pneumoniae productoras de BLEE (1998-2007)
Latinoamérica 45Pacífico Oeste 25Europa 23USA 8Canadá 5
(Arduino SM et al., AAC, 2002, 2003; Di Conza J, et al., 2002; Orman B et al., AAC, 2002)
ISCR1 blaCTX-M-2 orf3aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD
attI1
5CS 3CS CR1 VR2 3CSVR1
intI1 qacE∆1 sul1 orf5
aac(6´)-Ib aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD
1982-1989
2008
Enterobacterias
Selección con Antibióticos
Selección con Antibióticos
Proteína de
Membr
Canal de Porina
Cerrado
Pared Celular
Espacio Periplásmico
Membrana Celular
Proteína de Unión a Penicilina
blaCTX-M-2
Peptidoglicano
Proteína de
Transp
Lipopolisacárido
Canal de
PorinaCerrad
oLipoproteína
β-Lactámico
β-Lactámico
Resistencia al ertapenempor mecanismos combinados
de presenciade blaCTX-M-2 e impermeabilidad
(Lartigue MF, 2007)
Pseudomonas aeruginosa EMERGENCIA DE CARBAPENEMSAS
aac(6´)-Ib blaOXA-2
1982-2004
aac(6´)-Ib orfX qacH
Selección con IMIPENEM
blaVIM-2
blaVIM-2aac(6´)-Ib blaOXA-2
blaVIM-2 aac(6´)-Ib orfX qacH
2004-2006
Identificación molecular de resistencias ligadas
CADA ESPECIE BACTERIANA TIENE RESISTENCIASA ANTIBIÓTICOS LIGADAS CARACTERÍSTICAS
A SU VEZ, ÉSTAS VARÍAN EN CADA REGIÓN GEOGRÁFICA Y A LO LARGO DEL TIEMPO
A. baumannii en un centro hospitalario
Identificación de mecanismos de resistencia
con comportamiento epidémico.
Emergencia de brotes por agentes etiológicos inusuales
B. cepacia (I)
B. multivorans (II)
B. cenocepacia (III)
B stabilis (IV)
B vietnamiensis (V)
B cepacia genomovar (VI)
B. ambifaria (VII)
B. anthina (VIII)
B. pyrrocinia (IX)
B.vanimarisB. mana
Complejo Burkholderia cepacia (BCC)
IDENTIFICACIÓN DE CERTEZA POR BIOLOGÍA MOLECULAR
METODOLOGÍA USADA HASTA 2006
Gen RecA
Reacción de amplificación
Tratamiento con enzimas de restricción
Corrida en gel de Agarosa y visualización recA-RFLP
METODOLOGÍA RECOMENDADA DESDE 2007Metodología: PCR de recA (385 pb o 1043pb) con posterior secuenciación
P1 P2 C+ C-1043 pb
(Jordá Vargas L, 2008)
Características genotípicas de las especies indeterminadas del complejo BCC
recA-RFLP Falsa identificacióncon cebadores
específicos
Mayor homologíaAccession number
Pigmento ß-Hemólisis
H B. cenocepacia B AY228543 - -
Indeterminada Indeterminada AY228543 - -
J B. stabilis AF456112 verdoso +
Indeterminada B. cenocepacia B AF456112 verdoso +
J B. stabilis AF143789 - -
H B. cenocepacia B AF456025 - -
(Jordá Vargas L, 2008)
Curva Epidemiológica del total de los casos estudiadosn=44H10
Distribución de casos
1
45
9
5
0 1
13
4
02
00
2
4
6
8
10
12
14
n°casos
Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio Agosto Sept Octubre Nov Diciembre
(Cornistein W et al., 2008)
Emergencia de brotes por agentes etiológicos inusuales
B. stabilis (IV) n=3
B. vietnamiensis (V) n=6
Especie indeterminada o B. vanimaris (AF456112) n=2
NO ERA UN BROTE DEBIDO A UNA SOLA ESPECIE GENÉTICA,
SINO A TRES DE ELLAS.
Particularmente en los paísescon altos niveles de multirresistencia,
son necesarios estudios prospectivos de
prevención de las infecionesintrahospitalariasen conjunto con
equipos multidisciplinarios para contribuir con nuevas alternativas
terapéuticasa futuro.
LABORATORIO DE INVESTIGACIONES EN MECANISMOS DE RESISTENCIA AANTIBIÓTICOS,
2008
Dra Cecilia Quiroga Dra Silvia PiñeiroDra M. Soledad Ramírez Dra Sonia Arduino
Bioqca A. Karina Merkier Dra Paola JericLic. Nancy Claudia Castañeda Dra Betina OrmanLic. M. Paula Quiroga Lic. Laura RatierLic. Benjamín A. Ramírez Méd. Marcelo Alegre
Est. Paula Scalzo Bioqca LilianJordá VargasEst. Maria Eugenia Barissio
CONICET, UBA, ISID, IUMS, ASM, FUNDACIÓN A. ROEMMERS y ANPCyT
GRACIAS!!!!!Dra Marta Tokumoto, Dr Horacio Lopardo, Dr Carlos Vay, Dra Angela Famiglietti,
Dr Alejandro Petroni, Dra Ana Di Martino, Dra Sara Kaufman,Dr Jaime Kovensky, Dra Elsa Couto, Dra Mariela Paz, Dra Liliana Clara,
Dra Wanda Cornistein, Dra Claudia Rodríguez, Dr Miguel ValvanoDra Liliana Fernández Caniggia, Dra Mariana Catalano
Detección de la resistencia a glicopéptidos
• Difusión en agar: discos de 30 mg, luz transmitida
– Vancomicina: S ≥ 17, I = 15-16, R ≤ 14
– Teicoplanina: S ≥ 14, I = 11-13, R ≤ 10
• CMI (dilución en agar, microdilución, E-test): S ≤ 4, I = 8-16, R ≥32
• Cribado: agar BHI + 4-6 mg/ml de vancomicina: 105-106 ufc/m
• Identificación de la especie: movilidad, pigmento
• Determinación del tipo molecular
Enterococcus Vancomicina Resistente (EVR)
Hisopar placas de BEAS+8ug/ml de Vanco.
Repicar las posibles colonias (negras) en placa BEAS o sangre
Realizar Gram.
Incubar 35º-37º
Cocos + (catalasa neg) Bacilo +
No EVR
PYR y LAP
- y -
- y +
+ y +
Leuconostoc spp.
Pediococcus spp.
Enterococcus spp.
PYR: Pyroglutamico aminopeptidasaLAP: L-Leucina-Beta- Naftilamina
BEAS: Bilis Esculina Azida Sodica
SAMREn las cepas se estudió la resistencia a OXA, cefoxitina (FOX),
eritromicina (ERI), gentamicina (GEN), trimetoprima sulfametoxazol(TMS), rifampicina (RIF), ciprofloxacina (CIP) por el método de
difusión por discos en Mueller Hinton agar, incubación a 35ºC, 24 hs.
Se seleccionaron como probables portadores del SCCmec-IV a las cepas heterorresistentes a OXA (colonias dentro del halo) y
sensibilidad a tres o más de los siguientes antibióticos: RIF, ERI, GEN, CIP, TMS.
La resistencia a OXA fue confirmada por:
•Screening de OXA: Mueller Hinton agar (MHA) + 4% NaCl, incubación a 35ºC, 24 hs.
•CIM a OXA: se utilizó E-test en MHA + 2% NaCl incubación a 35ºC, 24 hs.
Conirmación de heterorresistencia:
•Eficiencia de plaqueo (EP) (Hartman and Tomsz): Se prepararon placas de ATS con 32µg/ml de OXA y placas sin
antibiótico. Se inocularon con 0,5 ml de un inóculo de aproximadamente 1010 UFC/ml. Se incubaron a 35ºC, 96 hs. La
EP se calculó por la relación UFC OXA/UFC S/OXA-
Definición: se consideró heterorresistencia a cepas que presentaban EP < 1%.