USO DEL CULTIVO CELULAR PARA DESARROLLOS EN INMUNOLOGAResumenEl cultivocelulares la tcnica que ha permitido conocer elcomportamientoin vitro de todo tipo declulas, en laactualidadesta tcnica es utilizada para laproduccinde biofrmacos, junto con la estandarizacin de algunosprotocolosque facilita su manejo ha permitido grandes avances en la bsqueda de nuevas curas haenfermedadesque antes se crean incurables. En esta revisin se realiza con el fin de dar a conocer los avances en las aplicaciones del cultivo celular a lainmunologa, se hace la relacin de algunastcnicasdelaboratorioque pueden aplicarse sobre estoscultivosy se ejemplifica lautilidadde las mismas, tomando comomodelodiversos trabajos que estudian las respuestas delsistemainmunolgico frente a diferentes enfermedades haciendo nfasis en el uso de esta tcnica en cncer y la bsqueda devacunas.IntroduccinLa inmunologa es unacienciaque estudia losprocesosmoleculares ycelularesimplicados en la defensa de la integridad biolgica del organismo a travs de la identificacin de las sustancias propias y deteccin de las sustancias extraas y su destruccin. En cada organismo, los mecanismos de defensa son muy diversos y heterogneos, aunque siempre existe una actuacin integrada de todos ellos. Entendemos por respuesta inmune todos aquelloseventosdesarrollados por el sistema inmune al objeto de defender la integridad biolgica delindividuofrente a cualquier agresin (estimulo antignico). La Inmunologa comprende diversas reas: Inmunogentica, Inmunobiologa, Inmunopatologa o Inmunologa clnica, Inmunofarmacologa, Inmunologaveterinaria, etc.Los seres vivos al entrar en contacto con elambientesiempre estn expuestos a diversos factores adversos como generacin de tumores e infecciones debacterias,virus,hongos, etc. Para enfrentar a estos diferentes factores los organismos disponen de un conjunto de elementos especiales, conocido como sistema inmune. La capacidad de defensa se adquiere antes de nacer y se madura y consolida en los primeros aos de la vida fuera del seno materno.El cultivo masivo de lneas celularesanimaleses fundamental para lamanufacturade vacunas virales y diversosproductosbiotecnolgicos. Una de las aplicaciones ms interesantes del cultivo celular ha consistido en la obtencin de productos de uso teraputico que ya han alcanzado elmercadofarmacutico. Los avances logrados en latecnologade cultivo celular han permitido que productos cada vez ms complejos se pongan al alcance del pblico usuario.En esta seccin se presentan los diferentes productos del cultivo celular en orden creciente de complejidad delprocesoinvolucrado. Los productos biolgicos producidos mediante la tecnologa delADNrecombinante en cultivo celular incluyenenzimas,hormonassintticas, inmunobiolgicos (anticuerpos monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancergenos).Las aplicaciones del cultivo celular en la inmunologa se han dado especialmente gracias a laintroduccinde las tcnicas defusincelular en laproduccinde anticuerpos monoclonales, as como en elanlisisde lagenticade laclulasomtica.DiscusinUna de las reas en las cuales se han observado grandes avances con la utilizacin de cultivos de clulas es eldiagnsticode infecciones virales. Dicho diagnstico es posible al buscarsealesde cambios degenerativos conocidos colectivamente como efecto citoptico en cultivos en monocapa de diferentes lneas celulares. El observador experto puede emitir un diagnstico preliminar basndose en la lnea celular implicada, en el tiempode incubacin y en la magnitud del efecto citoptico, aunquepruebasadicionales son necesarias para la identificacin definitiva del virus. (Tavira et al., 2009).Ejemplo de esto son los anlisis teraputico que se han realizado anticuerpos monoclonales contra el Virus delDenguetipo 2 (DENV-2), recordemos que esta enfermedad es de amplia distribucin y que en la actualidad no se le ha encontrado cura, este estudio tuvo comoobjetivoidentificar anticuerpos monoclonales (MAbs) que pueden servir como terapia post-exposicin, se investig en detalle la actividad funcional de un ampliogrupo de nuevos anti-DENV-2mouseMAbs. sitios de unin fueron asignadas por la exhibicin de la levadura de superficie y escapar de la neutralizacin,ensayosde inhibicin de clulas de cultivo se realiza con cepas homlogas y heterlogas, y la actividad profilctica y teraputica se evalu con dosmodelosde ratn. (Sukupolvi et al., 2010)Los resultados obtenidos en esta investigacin sugieren: los anticuerpos producidos contra un genotipo dentro del serotipo DENV-2 puede haber disminuido lapotenciainhibitoria contra genotipos heterlogos. Teniendo en cuenta que esteparadigmatambin parece cierto para DENV-1 y DENV-3 , puede ser crtico evaluar si las respuestas de anticuerpos policlonales generados contra cepas de la vacuna, que son inherentemente atenuada frente a la infeccin natural, neutralizar las cepas de los genotipos heterlogos ms divergentes dentro de un serotipo de forma duradera. (Sukupolvi et al., 2010) In vitro se ha demostrado el papel de los anticuerpos anti dengue, sin embargo ha sido difcil demostrar tales fenmenos en el transcurso de infecciones naturales dada la complejidad de los procesos que ocurren durante las infecciones con DENV-2 no ha permitido, hasta ahora, describir con exactitud los fenmenos fisiolgicos, bioqumicos e inmunolgicos que tienen lugar, lo cual obstaculiza eldesarrollode terapias preventivas y teraputicas. (Sukupolvi et al., 2010)El uso de vacunas de cultivo celular reduce elriesgode reaccin alrgica, ya que no contienen los alrgenos comunes como los presentes en la vacuna 17D la cual??Puede causar efectos adversos graves viscerotrpica y neurotrpica yanafilaxia. Viscerotrpica de la enfermedad es una infeccin fulminante virus 17D en los rganos del hgado y visceral parecido a la adquirida de forma natural lafiebreamarilla. Neurotrpico enfermedad normalmente que sigue la invasin delcerebrodonde el virus de la vacuna puede replicarse. El fundamento para el desarrollo de una nueva vacuna contra la fiebre amarilla ha sido revisado recientemente cabe sealar que la fiebre amarilla, es una enfermedad letal, que se produce en zonas tropicales deAmricadel Sur yfrica. Y las vacunas que en la actualidad se utiliza contienen al virus de manera viva atenuada (17D), este medicamento fue desarrollado en 1936 y es ampliamente utilizado, con aproximadamente 20 millones de dosis distribuidas anualmente. (Monath, et al., 2011)La XRX-001 es una vacuna experimental contra la fiebre amarilla fabricado por Xcellerex de la cepa 17D ?? cultivada en clulas Vero. Virus es purificada apartirde lquido del cultivo, inactivada con -propiolactona, adsorbidos en hidrxido dealuminio0,2% (alumbre), y se formulen con stabilizers. ha demostrado que la vacuna es altamente inmunognica en ratones, hmsters y monos, y ha proporcionado proteccin contra virus de la fiebre amarilla. (Monath, et al., 2011)Se realiz el primer estudio clnico de XRX-001. Y se encontr beneficios potencial de mejora de laseguridadcompensar los ttulos de anticuerpos ms bajos en las decisiones regulatorias que queda por determinar. Debido a su baja incidencia, una reduccin de los efectos adversos graves viscerotrpica y neurotrpica despus dela administracinde la vacuna inactivada no puede ser directamente demostrado en ensayos clnicos y se requieren estudios post-comercializacin. Los prximos pasos necesarios para el desarrollo de la vacuna XRX-001 incluyen laevaluacinde la durabilidad de la respuesta de anticuerpos reportados en el presenteensayoy el inicio de un estudio doble ciego, de fase del estudio clnico. (Monath, et al., 2011)En cuanto a las enfermedades inflamatorias asociadas con la respuesta inmune, un nmero considerable de pacientes presentan sntomas inflamatorios no caractersticos, y constituyen un reto diagnstico y teraputico. Estos casos no caractersticos por lo tanto pueden representar una etapa temprana, o mostrar una presentacin atpica, de un trastorno del tejido conectivo mixto o una infeccin. La determinacin del fenotipo inmune de los linfocitos desangre por citometra de flujo es unprocedimientorutinario de diagnstico para la evaluacin de las enfermedades linfoproliferativas e inmunodeficienciaVIHdel paciente(Jones et al., 2008). Es por esto que elmtodoempleado por citometra de flujo es adecuado para laboratorios de diagnstico clnico, y que promete ser una valiosa fuente deinformacinclnica para pacientes con sntomas inflamatorios inusuales, guiando ms pruebas de diagnstico y proporcionando una base para la terapia Ex juvantibus.Finalmente en cuanto a las respuestas inmunes producidas por contaminantes delmedio ambientegenerados porcombustinincompleta defuentesde carbono, se ha podido demostrar que una variedad dehidrocarburosaromticos policclicos HAP soncancergenos e inmunosupresores. De hecho, los HAP cancergenos, como el benzo [a] pireno, puede suprimir tanto humoral (clulas B) como celular (mediada por clulas T) la respuesta inmune (Allan and Sherr, 2010).La mayora de estos efectos adversos estn mediados por el receptor de aril hidrocarburos (AHR). En algunos casos, la inmunotoxicidad de linfocitos puede estar mediada indirectamente a travs de las clulas accesorias (Allan and Sherr, 2010).Muchos estudios realizados en modelos animales evalan los mecanismos por los que los HAP, y otros ligandos Ahr relacionados (por ejemplo, hidrocarburos halogenados aromticos / Hahs), median la inmunosupresin. Estos estudios revelan que los ligandosAhr suprimen la inmunidad por su capacidad de compromiso prcticamente en todas las etapas de desarrollo de los linfocitos, activacin yfuncinefectora de estudio.Es por esto que el Ahr juega un papel clave en la regulacin inmune y que los ligandos ambientales Ahr pueden comprometer significativamente la inmunidad mediante la alteracin de desarrollo y la funcin de los linfocitos Ahr-dependientes.Se ha caracterizado los efectos de la infeccin por El virus BK (BKV) en leucemia promieloctica nucleares PML-RN en su husped natural, las clulas RPTE. Los resultados muestran que la infeccin por BKV provoc una reorganizacin radical de la LMP-RN, con una disminucin en el nmero PML-NB y un aumento de tamao. Adems, tanto hDaxx y SP100 se encontraron dispersos de PML-RN. Esta reorganizacin requiere BKV la replicacin del ADN, los BKV focos de ADN se encuentran adyacentes a PMLNBs durante la infeccin tarda. Ms importante an, se presenta evidencia de que la reorganizacin de la PML-RN es unaestrategiaque BKV utiliza para desactivar lasfuncionesintrnsecas antivirales de la LMP-RN. En l se ha desarrollado un sistema de cultivo celular en clulas primarias de RPTE humano analizar la infeccin BKV. (Jiang et al., 2011)BKV crece analticamente en estas clulas, y lamorfologade las clulas infectadas por BKV es similar a la observada en PVAN los riones del paciente. Este sistema proporciona un primer paso hacia obtener unaimagencompleta delciclo de vidaBKV. Para definir los factores virales responsables de esta reorganizacin, se analiz la localizacin celular delantgeno del tumor de grandes BKV (TAG) y el ADN viral. TAG localiz con PML-RN durante la infeccin temprana, mientras que un nmero decromosomasBKV fueron junto a la PML-RN durante la infeccin tarda. Se demostrado que est por s sola no era suficiente para reorganizar PML-RN y que la replicacin del ADN viral activa se requiere. Derribo de la protena PML no afectan de manera dramtica el crecimiento BKV en el cultivo. Sin embargo, fue capaz de rescatar el crecimiento de un virus simple del herpesICP0 nulo un mutante cuyo crecimiento defectuoso se debe en parte a su incapacidad para alterar PML-RN. Se tiene lahiptesisde que las funciones de antivirales de la LMP-RN se inactivan travs de la reorganizacin durante el funcionamiento normal infeccin de BKV. (Jiang et al., 2011)Anticuerpos especficos del factor de virulencia derivados de la vacunacin o empleados como agentes teraputicos representan un potencial de defensa contra las enfermedades bacterianas. Los resultados obtenidos describen por primera vez recombinante derivado de los anticuerpos monoclonales contra SEB que poseen alta afinidad y especificidad dedestino, y el potencial teraputico para superantgeno shock inducido por txicos. Estos anticuerpos prevenir la intoxicacin por toxina interfiere con la unin a MHC II y / o TCR. Adems de las aplicaciones potenciales para el tratamiento del sndrome de shock txico, los anticuerpos monoclonales humanos reconociendo SEB u otros superantgenos bacterianos puede ser til si se emplea como tratamiento complementario con antibiticos en el tratamiento de infecciones por S. aureus difcil. (Larkin et al., 2010)Por ejemplo, una combinacin de antibiticos y de inmunoglobulinas fue defendida previamente para la lucha contra las infecciones de S. pyogenes. Este paradigma puede ser eficaz contra la meticilina, as como la vancomicina, las cepas resistentes de S. aureus, ya que muchos aislados en losEstados Unidosproducen superantgenos diversos que incluyen SEB y SEC. Otros enfoques teraputicos basados ??en anticuerpos se han sugerido para el tratamiento de las infecciones por S. aureus. (Larkin et al., 2010)Por ejemplo: un estudio de fase II que emplea un humanizado IgG1 orientacin S. aureus factor aglutinante A (ClfA, una protena de unin a fibringeno) dio lugar a una buenatoleranciapor los pacientes y prometedores resultados clnicos preliminares. Una preparacin IgIV utilizado clnicamente en los recin nacidos contiene anticuerpos contra los componentes de la superficie microbiana que reconocen. (Larkin et al., 2010) Adems de la caracterizacin in vitro de los anticuerpos monoclonales, los ensayos biolgicos consisten en un cultivo de clulas humanas fueron utilizados para predecir los efectos fisiolgicos (es decir, neutralizar la toxina) los efectos de cada anticuerpo. Los dominios Fc aadido a Fab 1 y 3 tuvieron efectos mnimos sobre la IC50 en cultivos celulares, mientras que nativos de larga duracin Mabs 9 y 10 dio lugar a la inhibicin mucho mayor en comparacin con sus homlogos de Fab. (Larkin et al., 2010) Por ltimo, los anticuerpos policlonales se mezclaron de sueros humanos y se utilizan actualmente para el tratamiento de diversas enfermedades como el sndrome de Kawasaki, colitis por Clostridium difficile, virus respiratorio sincitial, citomegalovirus, neuropatas crnicas dysimmune, neuropata desmielinizante inflamatoria crnica polyradiculo, y la poliarteritis nodosa. (Larkin et al., 2010) Estos productos IgIV, naturalmente, varan en potencia de proceso por lotes, representan un riesgo potencial para la transmisin de agentes infecciosos, y los mecanismos deaccingeneralmente no son bien caracterizado. Recombinante poringenieramonoclonal humano anticuerpos dirigidas a los factores de virulencia especficos, tal como se presenta en este estudio, evitar muchas de estas preocupaciones. (Larkin et al., 2010)Otros enfoques teraputicos basados ??en anticuerpos se han sugerido para el tratamiento de las infecciones por S. aureus. Por ejemplo, un estudio de fase II que emplea un humanizado IgG1 orientacin S. aureus aglutinacin factor A (ClfA, una protena de unin a fibringeno) dio lugar a una buena tolerancia por los pacientes y prometedores resultados clnicos preliminares. Una preparacin IgIV utilizado clnicamente en los recin nacidos contiene anticuerpos contra los componentes de la superficie microbiana que reconocen molculas adhesivas de lamatriz(MSCRAMM) que se encuentran en los S. aureus y Staphylococcus epidermidis. En particular, lasprotenasde unin del fibringeno y ClfASDrG (S. epidermidis protena repetir serina-aspartato G) son reconocidos por la IgIV. Es concebible que una combinacin de bien caracterizados anticuerpos monoclonales humanos orientacin toxina de S. aureus (s) y antgenos de superficie puede ser una ms til para el tratamiento de inmunoterapia las infecciones por S. aureus. (Larkin et al., 2010)Las lneas celulares continuas humanasderivadasde tumores slidos se utilizan a menudo para explorar las alteraciones biolgicas y funcionales de las clulas tumorales, la infeccin por Mycoplasma hyorhinis puede jugar un papel importante en el cultivo de lneas celulares de cncer de colon humano que da lugar a considerable aumento de la fraccin celular declulas madredel cncer CSC y se caracteriza por la expresin de CD133 (Mariotti et al., 2010).Es bien conocido que el micoplasma puede tener efectos adversos en los cultivos celulares, tales como alteracin en los niveles de protenas y de ARN ysntesisde ADN, lainduccinde aberraciones cromosmicas, cambios en la composicin de la membrana celular y la modificacin de la morfologa celular (Drexler y Uphoff, 2002 citados por Mariotti et al., 2010). Es por esto que losmtodospara la deteccin, eliminacin y prevencin dela contaminacindeben ser incluidos en el panel bsico de tcnicas deinvestigacinCSC (Mariotti et al., 2010).En cuanto a las clulas T reguladoras (Treg) y los mastocitos (MC) que generalmente son abundantes en el cncer colon rectal (CCR) se puede observar que lainteraccinentre estos dos es conocido por promover la inmunosupresin o la prdida de funciones de las Treg y la autoinmunidad (Blatnera et al., 2010).El aumento de la respuesta inmune anti-tumoral a travs de agotamiento o la inactivacin de Treg es una opcin teraputica atractiva para el tratamiento del cncer (Blatnera et al., 2010).Las clulas T activadas autlogas tambin ejercen un efecto anti-crnico de clulas B de leucemia linftica in vitro e in vivo, la leucemia linfoctica crnica (LLC) se deriva de la acumulacin de antgeno (Ag) y se asocia con anormalidades inmunolgicas graves, tales como hipo-gammaglobulinemia, ladiscapacidadinmunoglobulina (IgE) la formacin decambiodeclasey la disminucin de centro germinal, todos los cuales aumentan la susceptibilidad a las infecciones bacterianas (Di Ianni et al., 2009).La mayora de los tumores slidos contienen muchas clulas no malignas, incluyendo las clulas inmunes y clulas endoteliales, que son importantes en lainflamacin. Las clulas inflamatorias proporcionan proteasas que facilitan la invasin tumoral y la remodelacin de la matriz. (Huang, 2002 Citado por Shiau et al., 2010). Kallistatin es un inhibidor de la proteasa serina que ejerce una gran variedad de efectos biolgicos en las respuestas fisiolgicas y patolgicas, como la regulacin de lapresinarterial, inflamacin y anti-angiognesis. Kallistatin puede prevenir la respuesta inflamatoria al reducir la acumulacin de macrfagos (Chao, 2006 citado por Shiau et al., 2010).La entrega kallistatin gen puede ser lograda mediante laadministracinsistmica de losvectoreslentivirales que lleven el gen kallistatin y asi la expresin del gen puede inhibir el crecimiento del tumor y mejorar la supervivencia en modelos murinos. Al tomar ventajas de los efectos anti-angiognicos y anti-inflamatorio de kallistatin (Shiau et al., 2010).Las clulasmadredebido a sus funciones inmunomoduladoras, mesenquimales (MSC) tienen un gran potencial en aplicaciones clnicas para prevenir el rechazo en el trasplante de rganos y prevenir la enfermedad injerto contra el husped en clulas madre hematopoyticas (TPH). Dado que las clulas dendrticas (DC) juegan un papel importante en lamodulacinde diversas T respuestas de las clulas, incluyendo el rechazo y la enfermedad del injerto contra el huspedEstudios recientes han investigado si las CMM modulan la diferenciacin de CC del CMH y si este efecto podra ser uno de los mecanismos de inmunidad MSC "funciones-modulacin. los resultados demostraron que la diferenciacin de las CMH en pases en desarrollo maduro se inhibe en presencia de MSC. frecuencias similares de los precursores dendrticas en los cultivos, ya sea con o sin MSC, sugiere que la inhibicin de MSC en la diferenciacin de los pases en desarrollo maduro de HSC puede ser debido a la detencin de la maduracin en la etapa precursora dendrticas. Los niveles reducidos de AMP cclico, monofosfato de adenosina cclico (AMPc) y b-catenina en las clulas DC, se detectan, lo que sugiere que la induccin de la apoptosis y la inhibicin de la diferenciacin podra ser la base para la inhibicin de los pases en desarrollo maduro de HSC por MSC.ConclusionesLa aplicacin del cultivo de clulas animales dentro de labiotecnologase ha incrementado en los ltimos aos ya que las ventajas ofrecidas por ste son permitir el plegamiento correcto, brindar una glicosilacin compleja adecuada y totalmente relacionada con la actividad farmacolgica y en el caso de su produccin, secretar los productos al medio de cultivo.En la actualidad, estas ventajas permiten hacer del cultivo de clulas un sistema competitivo a nivel productivo en los pases desarrollados ya que por medio de l es posible obtener vacunas, anticuerpos monoclonales y protenas recombinantes cuyovaloragregado es considerable. EnMxico, debido a la apertura por parte de lasempresasfarmacuticas para la generacin de productos de origen biotecnolgico es necesario brindar informacin bsica a lacomunidadfarmacutica del desarrollo de este tipo de cultivos a lo largo de lahistoriaas como de su clasificacin y usos ms importantes, para facilitar la comprensin de procesos farmacuticos que utilicen este tipo desistemas.