UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA MAESTRÍA EN … y p… · Utilizar ciclodextrinas con el...

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA

MAESTRÍA EN CIENCIAS PRODUCTOS

NATURALES Y ALIMENTOS

“ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO

DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS, Y LA ELUCIDACIÓN

ESTRUCTURAL DE LOS COMPLEJOS ”

PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN

PRESENTA

I.A. ARMANDO TORRALBA GONZÁLEZ

2 DE AGOSTO DEL 2013

DIRECTORA DE TESIS

DRA. EDITH GRACIELA GONZÁLEZ

MONDRAGÓN

CO-DIRECTOR DE TESIS

DR. RAFAEL ZUBILLAGA LUNA

1

ÁCIDO FERÚLICO

2

• Pertenece al grupo de los polifenoles

• Es derivado del ácido cinámico

INTRODUCCIÓN

Kikugawa et al., 2012

ÁCIDO FERÚLICO

3

Se encuentra en

la pared celular de

material vegetal

Forma enlaces entre:

• Ligninas

• Polisacaridos

• Glucósidos

Ácido

Ferúlico

INTRODUCCIÓN

Kikugawa et al., 2012

APLICACIONES DEL AF

4

En el área de salud y farmaceutica:

• Antiinflamatorio

• Capacidad de acomplejar proteínas

• Antimicrobianas

• Acción quimiopreventiva

En la industria alimentaria:

• Antioxidante

• Precursor de la vainillina

• Ingrediente en formulación de

alimentos funcionales

Vainillina

INTRODUCCIÓN

Urbaniak y Szela, 2013

CARACTERÍSTICAS DEL ÁCIDO

FERÚLICO

5

La estructura molecular del AF le confiere:

1. Baja solubilidad en agua

2. Inestabilidad por su sensibilidad a la luz y

calor

3. Sabor astringente y amargo

Esto limita su uso en alimentos y en

medicamentos orales

INTRODUCCIÓN

Munin, 2011

ESTABILIZAR EL ÁCIDO FERÚLICO

6

Sintetizar derivados de AF por

esterificación.

Utilizar ciclodextrinas con el fin de

encapsular a la molécula.

Métodos para proteger y solubilizar al ácido ferúlico

INTRODUCCIÓN

Kikugawa et al., 2012, Munin, 2011

CICLODEXTRINAS

7

Son oligosacáridos cíclicos

INTRODUCCIÓN

Unidas por enlaces α-(1,4)

De 6, 7, 8 o más unidades de glucopiranosa.

Valle, 2003

PROPIEDADES DE LAS

CICLODEXTRINAS

8

INTRODUCCIÓN

Valle, 2003

USO DE LAS CICLODEXTRINAS

9

CD’s utilizadas para acomplejar al AF:

① Antioxidantes

② Fármacos

INTRODUCCIÓN

Uso en:

Alimentos

Productos farmacéuticos

Cosméticos

Bioconversión

Embalaje y la industria textil

10

Los estudios que se han realizado son los siguientes:

USO DE CICLODEXTRINAS

ACOMPLEJANDO AF

INTRODUCCIÓN

11

INTRODUCCIÓN

Como se acomplejan las moléculas

El factor estérico

Interacciones termodinámicas

CD:

①Tamaño de la cavidad

Molécula huésped:

①Tamaño

②Grupos funcionales

FUNDAMENTO DEL ACOMPLEJAMIENTO

Castronuovo y Nicolli, 2006


12

Interacciones de van der Waals

Reordenamiento de las moléculas

Puentes de hidrógeno

Interacciones hidrófobicas

INTRODUCCIÓN

13

F ormation of complexes

Cyclodextrins in aqueous

solutions welcome “guest

molecules”, other than water, in

their hydrophobic cavities (Szejtli,

1998). The interaction of a CD

and a guest molecule has usually a

molar ratio of 1:1, but other kinds

of interactions can be found, as

showed in figure 3 (Stella et al.

2008). This complex formation

can then increase the solubility of

some drug molecules (Stella et al.

2008 and Loftsson et al. 1996).

Throughout the formation of

complexes between cyclodextrins

and drug molecules, no breakages

of covalent bonds are noticed, but

what leads to the formation of

such complexes is the release of

water molecules from the cavity

of the cyclodextrins,

hydrophobic interactions,

hydrogen bonding, among others (Loftsson 2004). Complexes formed by HP-0.6-β-CD and β-CD

with some bile salts: glycocholate (GC), glycodeoxycholate (GDC) and glycochenodeoxycholate

(GCDC) are the most relevant complexes for this report.

2.2. Bile Salts

Figure 4 : Cholesterol conversion to 7-hydroxy-Cholesterol (Stamp & Jenkins, 2008)

This section will explain the basic and important aspects of BS while also distinguishing the

difference between what is known as BS and bile acid (BA).

Figure 3: Formation of complexes

(http://www.nature.com/nrd/journal/v3/n12/images/nrd1576-f3.jpg)

No sigue un

patrón común

Tamaño relativo

cavidad

Tamaño

molécula huésped

INTRODUCCIÓN


Paulon et al., 2009

MÉTODO DE ACOPLEJAMIENTO

14

INTRODUCCIÓN

Coprecipitación

Extrusión

Acomplejamiento por suspensión

Acomplejamiento por pegado

Valle, 2003

METODOS DE RECUPERACIÓN DEL

COMPLEJO

Centrifugación

Separación con papel filtro con un tamaño

de poro de 0.45 mm

El complejo se recupera en estado sólido

15

INTRODUCCIÓN

ANÁLISIS DE LOS COMPLEJOS DE INCLUSIÓN

CON CD

Termodinámico

• Calorimetría de titulación isotérmica (ITC)

• Espectroscopía de fluorescencia

• Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)

Estructura

• Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

• Difractometría de Rayos X

• Espectrocopía infrarroja y Raman

• Microscopía electrónica de barrido

• Espectrofotometría UV-Vis

16

INTRODUCCIÓN

Singh et al., 2010

CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN

ISOTÉRMICA (ITC)

Equipo de ITC

17

Paulon et al., 2009, Krishnakumari y Nagaraj, 2012

INTRODUCCIÓN

Calor liberado o absorbido

Se da en proporción directa

a la cantidad de

uniones producidas

CURVA DE TITULACIÓN

18

INTRODUCCIÓN

Paulon et al., 2009

4.1 HP-0.6-β-CD

Figure 8: (a) the raw data and enthalpy with fitted line for HP-0.6-β-CD and GC for 25°C, replica 1; (b) the

raw data and enthalpy with fitted line for HP-0.6-β-CD and GDC for 25°C, replica 1; (c) the raw data and

enthalpy with fitted line for HP-0.6-β-CD and GCDC for 25°C, replica 2. This illustrates the diference in

binding properties.

4.1.1 Binding Constant – K

Graphs indicating the K value for temperature 25, 30, 40 and 50ºC are shown below. All

temperature points show a decrease in K value, shifting the complexation equilibrium favoring

the reactants as temperature increases. It seems that GC has the highest decrease in K compared

to GDC and GCDC, where GC has decreased by 50%, GDC 30% and GCDC 32% from 25ºC to

50ºC. The CIs are smallest for GCDC and are largest for GC. This may be due to GCDC binding

more strongly with the CD, which gives a better “S” shaped curve when the ITC integrates the

peaks (observed in figure 8c). This can give a more accurate “one set of sites” iteration of the

data points.

K at T=25ºC (M-1) K at T=50ºC (M-1) Diff. %

GC 1380 680 700 50,72

GDC 3440 2420 1020 29,65

GCDC 43700 29400 14300 32,72Table 4: The table shows the difference and the decrease of the K value for the three BS from 25ºC to 50ºC.

Cada adición produce una reacción

liberando o absorbiendo calor.

El calorímetro mide la energía por unidad

de tiempo (μcal s-1) que debe ser aplicado

a la celda de muestra para mantener la Tº

constante

Después de una serie de adiciones los

sitios de unión disponibles de la CD se

saturan.

Gráfico de la unión entre una sal biliar

con HP-βCD a 30ºC

OBTENCIÓN DE PARAMETROS

TERMODINÁMICOS

19

Para obtener la energía libre de Gibbs y a la entropía se

utilizan las siguientes ecuaciones

INTRODUCCIÓN

a sigmoidal curve. This plot provides enough information to estimate ΔH°, Ka and the

stoichiometry of reaction, if the initial concentrations of the reactants are known (Ladbury and

Chowdhry, 1996). Heat absorbed or released after each injection is proportional to the change of

concentration of a bound ligand, described in the following equation:

Q = V* ΔH° * Δ[L]bound

Equation 1: Cumulative heat

where V- reaction volume, ΔH° – enthalpy of binding.

For a reaction with one type of binding site for the molecule – M + nL ↔ MLn (for one type of

binding site n=1) and the cumulative heat can be calculated as follows:

Equation 2: Cumulative heat (Holdgate, 2001).

Data plotting and fitting is obtained by plotting the 1st derivative of Q with respect to [L]total

against the molar ratio [L]total/[M]total (Holdgate, 2001). As equation shows, Q is dependent on Ka,

ΔH° and N. Those parameters can be obtained by fitting a line to data points (Ladbury and

Chowdhry, 1996).

Further on, when ΔH° and Ka values are known, the magnitudes of ΔG° and ΔS° can be

calculated from the following relationship:

ΔGo = ΔHo - T ΔSo = -RTlnKa

Equation 3: Standard Gibbs free energy

Along with ΔG°, ΔH° and ΔS°, it is also possible to measure ΔCp – the change of heat capacity or

specific heat. ΔCp is used to predict the change of the other three parameters according to

different temperatures. The relationship is as follows:

Equation 4: Change in heat capacity (Holdgate, 2001).

ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO DE

ACOMPLEJAMIENTO

20

INTRODUCCIÓN

Cambios de

entalpía y

entropía

Formación de

los complejos

impulsada por

Posibles

enlaces

formados

Negativos

Entalpía

Fuerzas de

• van der Waals

• puentes de

hidrógeno

Positivos

Entropía

Principalmente

• Fuerzas

hidrofóbicas

PARÁMETROS TERMODINÁMICOS OBTENIDOS POR ITC ACOMPLEJANDO CON

CICLODEXTRINAS

21

INTRODUCCIÓN

IR

22

En la formación de complejos: 1. Los picos pueden cambiar de posición

2. Disminuir o desaparición de algunas bandas

Análisis por IR de un modelo hipotetico de medicamento puro (A), ciclodextrina (B),

mezcla fisica de ambos (C) y el complejo (D).

(Takahashi et al., 2012)

LUZ ENERGÍA ENERGÍA

ENERGÍA

ESPECTROFLUORÓMETRO

FLUORESCENCIA

ÁCIDO FERÚLICO

Titulación con

ciclodextrinas y

monitoreo de los

cambios en la intensidad

de fluorescencia

INTRODUCCIÓN

ESPECTRO

EMISIÓN

LONGITUD DE ONDA

INT

EN

SID

AD

DE

FL

UO

RE

SC

EN

CIA

ESPECTRO

EXITACIÓN

310 nm excitación

330 nm emisión

FLUORESCENCIA

Obtener la longitud de onda máxima

de excitación, para obtener la mayor

señal de intensidad de emisión de

fluorescencia

INTRODUCCIÓN

Ejemplo de acomplejamiento entre AF

y βCD

Zhang, et al., 2010

OBTENCIÓN DEL VALOR DE KU

25

Ecuación modificada de

Benesi–Hildebrand

① Curva de titulación fluorometríca

② Ajustar mediante un modelo

matemático la curva de titulación

③ Obtener Ku

④ Posteriormente calcular ΔGuo

Zhang, et al., 2010

INTRODUCCIÓN

HP-β-CD

β-CD


y βCD

INCREMENTO EN LA INTENSIDAD DE

FLUORESCENCIA

26

Zhang et al., (2010)

INTRODUCCIÓN

Espectro de emisión de fluorescencia.

AF (1X10-5M) en presencia de β-CD (0-5X10-3 M)


y βCD

ESTUDIO DE RMN

27

INTRODUCCIÓN

Identificación de la parte de la

molécula huésped que se incluye en la

cavidad de CD

Volume 12, Issue 1, January – February 2012; Article-002 ISSN 0976 – 044X

International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research Page 12 Available online at www.globalresearchonline.net

The modification of some of the bands representing the guest molecule is indicative that only part of the molecule has been encapsulated by CD. The portion that has not been complexed is responsible for the presence of any unchanged bands

56.

However, it is important to emphasize that when complexation occurs, the bands representing CD remain unchanged, and if the guest molecule does not present a very characteristic band, the changes may be imperceptible

1. Some authors report difficulty in

interpreting results due to the lack of a band representing the guest molecule that produces noticeable changes

40,57,58. There are still other authors who have

obtained inconclusive results59,60

.

Recent studies employing IR to evaluate the formation of inclusion complexes are presented in Table 2.

NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE

Nuclear magnetic resonance (NMR) is a technique that has been widely employed to determine the formation of inclusion complexes, because it has the advantage of being able to reveal the structure of the complex by identifying the part of the host molecule that is included in the CD cavity

1.

There are six protons in CD that can be used in the analysis of the NMR spectra of hydrogen (HNMR): three located in the outer surface (H1, H2 and H4), two in the cavity (H3 and H5), H3 near the wider exit and H5 near the narrow side. The last proton, H6, is closer to the narrow output of the cavity. The changes that occur in CD are usually in H3 and H5 and sometimes in H6, depending on the depth that the guest molecule enters the CD cavity

76,77, as illustrated in Figure 3.

Figure 3: Hypothetical model of analysis by HNMR of CD (A) and inclusion complex (B).

Due to the formation of chemical bonds, when complexation occurs, signal changes take place in CD and guest molecule spectra60,78.

Another technique employed in the characterization of CD complexes is carbon 13 NMR (C13NMR). The results reveal the part of the guest molecule that has been encapsulated by CD, complementing the HRMN information

79.

Recent studies that use NMR to assess the formation of inclusion complexes are presented in Table 3.

CONCLUSION

A complete characterization of drug-cyclodextrin inclusion complex can be obtained using several analytical techniques as described in a previous review - part I. The analytical tools described in this review can show important details of the molecules whose, in addition with other techniques as phase solubility diagrams, dissolution studies and scanning electron microscopy can generate a more complete characterization of the formed complexes.

REFERENCES

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2. Corti G, Capasso G, Maestrelli F, Cirri M, Mura P, Physical-chemical characterization of binary systems of metformin hydrochloride with triacetyl-β-cyclodextrin,J. Pharm. Biomed. Anal., 45, 2007,

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3. Patel RP, Patel MM, Solid-state characterization and dissolution properties of lovastatin hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion

complex, Pharm. Tech., 31, 2007, 72-82.

4. Mura P, Bettinetti GP, Cirri M, Maestrelli F, Sorrenti M, Catenacci L,

Solid-state characterization and dissolution properties of Naproxen–Arginine–Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ternary system,Eur. J. Pharm. Biopharm., 59, 2005, 99-106.

5. Aleem O, Kuchekar B, Pore Y, Late S, Effect of β-cyclodextrin and hydroxypropyl β-cyclodextrincomplexation on physicochemical properties and antimicrobial activity of cefdinir, J. Pharm. Biomed. Anal., 47, 2008, 535-540.

6. Ribeiro LSS, Ferreira DC, Veiga FJB,Physicochemical investigation of the effects of water-soluble polymers on vinpocetinecomplexation with β-cyclodextrin and its sulfobutyl ether derivate is solution and

solid state, Eur. J. Pharm. Sci., 20, 2003, 253-266.

7. Zhang X, Zhang Y, Zhong D, Chen Y, Li S, Investigation and Physicochemical characterization of clarithromycin-citric acid-cyclodextrins ternary complexes, Drug Dev. Ind. Pharm., 33, 2007, 163-171.

8. Toropainen T, Velaga S, Heikkilä T, Matilainen L, Jarho P, Carlfors J, Lehto VP, Järvinen T, Järvinem K, Preparation of budesonide/γ-

cyclodextrin complexes in supercritical fluids with a novel SEDS method. emulsion based formulations, J. Pharm. Sci., 95, 2006, 2235-2245.

9. Vajna B, Farkas I, Farkas A, Pataki H, Nagy Z, Madarász J, Marosi G, Characterization of drug-cyclodextrin formulations using Raman mapping and multivariate curve resolution, J. Pharm. Biom. Anal.,

56, 2011, 38-44.

10. Patil AL, Pore YV, Kuchekar BS, Late SG, Solid-state characterization and dissolution properties of bicalutamide-β-cyclodextrin inclusion

complex, Pharmazie, 63, 2008, 282-285.

11. Scalia S, Coppi G, Iannuccelli V,Microencapsulation of a cyclodextrin complex of the UV filter, butyl

28

ESTUDIO DE RMN

• Tres situados en la

superficie exterior (H1,

H2 y H4)

• Dos en la cavidad (H3 y

H5)

• H6, está más cerca de

la salida estrecha de la

cavidad

Hay seis protones en las CD’s que se

pueden utilizar en el análisis

Modelo hipotético de análisis por RMN de CD de (A) y el complejo de

inclusión (B).

(Takahashi et al., 2012)

INTRODUCCIÓN

JUSTIFICACIÓN

Es relevante acomplejar al ácido ferúlico con ciclodextrinas ya que le brindará mayor solubilidad en soluciones acuosas y mayor estabilidad en el transcurso de su almacenamiento.

Los parámetros termodinámicos obtenidos por las técnicas de ITC y de espectroscopía de fluorescencia permitirán establecerán las fuerzas intermoleculares que gobiernan el proceso de inclusión del ácido ferúlico dentro de las ciclodextrinas.

Por otro lado el tener la estructura del acomplejamiento proporcionará información acerca de cómo esta unido estructuralmente el ácido ferúlico en las ciclodextrinas.

29

HIPÓTESIS

El ácido ferúlico presenta una estructura molecular

que permitirá la inclusión con determinada facilidad y

con asosiaciones específicas en cada una de las

ciclodextrinas (α, β, γ). Así mismo los métodos de ITC,

fluorescencia, IR y RMN permitirán obtener

información de la termodinámica y de la estructura del

proceso de acomplejamiento del ácido ferúlico con las

ciclodextrinas (α, β, γ).

30

OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar los parametros termodinamicos del

proceso de encapsulamiento del acido ferulico

con ciclodextrinas, y la elucidacion estructural

de los complejos.

31

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

32

1. Realizar el analisis termodinamico del proceso de

acomplejamiento entre la ciclodextrina y el acido ferulico

utilizando la tecnica de calorimetria de titulacion isotermica

2. Obtener los parametros termodinamicos mediante el

ajuste de la curva de titulacion: la constante de union (Ku),

la entalpia (ΔHuo) y la estequiometria de union (n).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

33

3. Calcular la energia libre de Gibbs (ΔGuo) y la entropia

(ΔSuo) a partir de los parametros anteriores.

4. Investigar la posibilidad de determinar la constante de

union (Ku) del acido ferulico acomplejado con las CD,

empleando una tecnica de fluorescencia.

5. Elucidar la estructura la estructura de los complejos

del acido ferulico con las diferentes ciclodextrinas,

mediante resonancia magnetica nuclear (RMN)

unidimensional y bidimensional homonuclear.

METAS

34

1. Determinar los parametros termodinamicos

propios del proceso de acomplejamiento del acido

ferulico con las ciclodextrinas (α, β, γ) mediante

calorimetria de titulacion isotermica (ITC).

2. Determinar la contante de union (Ku) mediante

una titulacion fluorimetrica para contar con una medicion

alternativa.

3. Obtener la estructura de los complejos del acido

ferulico con las diferentes ciclodextrinas.

METODOLOGÍA

35

1.-Determinar el disolvente a emplear

Metanol (50 y 100%), Etanol (60, 70 y 100%),

NaOH (5 y 10%) Amortiguador de fosfatos 100 mM en un intervalo

de pH de 8 a 12

2.- Generar los espectros de IR

Mezclando 1mM de ácido ferúlico con las

diferentes ciclodextrinas 1 mM,

usando como disolvente metanol al

100%.

3.- Obtener los diagramas de fase-

solubilidad

Mediante la técnica descrita por Higuchi y

Connors del ácido ferúlico con la

ciclodextrinas al 100%.

4.- Realizar el analisis termodinamico del

proceso de acomplejamiento

utilizando la tecnica de calorimetria de

titulacion isotermica

36

METODOLOGÍA 5.- Obtener los

parametros termodinamicos

mediante el ajuste de la curva de titulacion:

constante de union (Ku), entalpia (ΔHu

o) y la estequiometria de union

(n)

6.- Calcular la energia libre de

Gibbs (ΔGuo) y la

entropia (ΔSuo)

mediante las relaciones

termodinamicas estandar 7.- Determinar la

constante de union (Ku)

Del acomplejamientoe

mpleando la tecnica de

fluorescencia

8.- Elucidacion estructural

De los complejos acido ferulico-CD

por espectroscopia

de RMN

37

Solubilizar

Se logró solubilizar el ácido ferúlico en

NaOH al 5 y 10 % (pH 12.0)

Amortiguador de fosfatos 100 mM, en el intervalo de pH de 9.0 a 12.0

No fue posible solubilizar

El ácido ferúlico en etanol

Las tres ciclodextrinas en

metanol

RESULTADOS

ESPECTROS DE IR DE LOS COMPLEJOS CD-

AF

38

RESULTADOS

C:\OPUS_7.0.129\MEAS\ciclodextrinas acomplejadas.12 ciclodextrinas acomplejadas Instrument type and / or accessory



03/06/2013

03/06/2013

03/06/2013

500100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

50

60

70

80

90

100

Tra

nsm

itta

nce [

%]

Page 1/1

Azul=Complejo AlfaCD-AF

Rojo=AlfaCD

Rosa=AF




03/06/2013

03/06/2013

03/06/2013

500100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Tra

nsm

itta

nce [

%]

Page 1/1


AF

39

RESULTADOS

Azul=Complejo BetaCD-AF

Rojo=BetaCD

Rosa=AF




03/06/2013

03/06/2013

03/06/2013

500100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Tra

nsm

itta

nce [

%]

Page 1/1


AF

40

RESULTADOS

Azul=Complejo GamaCD-AF

Rojo=GamaCD

Rosa=AF

CONCLUSIONES PARCIALES

41

1. Se logró disolver tanto el ácido ferúlico (3.0

mM) como a las ciclodextrinas (1 mM),

utilizando amortiguador de fosfatos 100

mM, pH 9.0, con agitación constante

durante 24 h a 30°C.

2. Se obtuvieron los espectros de IR para los

polvos del ácido ferúlico, cada una de las

ciclodextrinas así como para los

complejos.

CRONOGRAMA TRIMESTRAL DE ACTIVIDADES

42

43

CRONOGRAMA TRIMESTRAL DE ACTIVIDADES

GRACIAS

POR SU

ATENCIÓN

DIAPOS DE APOYO

“Por que determinar humedad de la ciclodextrinas”

La hidratacion de las CD’s es inebitable, los problemas que

pueda causar esto es:

Introducir variaciones en la medición de los parámetros

termodinámicos utilizando el calorímetro al incroporar màs agua

al medio de reacción.

El calor absorbido o liberado después de cada inyección es

proporcional a la variación de la concentración de un ligando

unido

45

CONDICIONES DE LA

EXPERIMENTACIÓN CON ITC

Acido ferulico 1X10-3 M

Ciclodextrinas (α-CD, β-CD, γ-CD) 1X10-2 M

Las condiciones de los experimentos seran:

20 inyecciones de 1.5 μl de solucio n de ciclodextrina en la celda

de muestra que contiene la solucio n de a cido ferulico.

El intervalo de tiempo entre las inyecciones sera de 300

segundos.

La velocidad de agitacio n sera de 310 rpm

La temperatura de la celda sera de 25 ºC

46

ESTUDIO DE SOLUBILIDAD

47

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