UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA · h = ancho del pico medido al 50% de la altura total del...
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Cromatografía de líquidos de alta resolución
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA
Dra. Beatriz Hernández Carlos
NOVIEMBRE 2013Análisis Químico Cuantitativo
Reservorio de la fase móvil
Bomba
Filtro
Medidor de presión
Columna
Sistema de datos
Introducción de la muestra
Registrador Detector
Colector de fracciones
Sistema cromatográfico
Análisis Químico Cuantitativo
Sistema CLAR isocrático típico
Análisis Químico Cuantitativo
MECANISMOS DE SEPARACIÓN
Análisis Químico Cuantitativo
FASE NORMAL VS FASE REVERSA
LAS SUSTANCIAS MÁS POLARES ELUYEN AL FINAL EN FASE NORMAL Y ELUYEN PRIMERO EN FASE REVERSA
Análisis Químico Cuantitativo
ADSORCIÓN PARTICIÓNMECANISMO DE SEPARACIÓN
Análisis Químico Cuantitativo
SUSTANCIAS POLARES COMO EL FENOL INTERACCIONAN MEJOR CON LA FASE POLAR DE SÍLICA GEL QUE EL FENOL TRISUSTITUIDOAnálisis Químico Cuantitativo
Schematic of the analyte distribution between mobile phase, adsorbed organic layerand adsorbent surface in the presence of ionic and ionpairing equilibria. B: neutral formof basic analyte; BH+: protonated basic analyte; BH−A: ion-paired protonated basicanalyte; Subscript (a) denote adsorbed acetonitrile layer; subscript (s) denoteadsorption on the surface of adsorbent.
Análisis Químico Cuantitativo
Mecanismos de retención en Cromatografía de líquidos
de alta resolución
Fase móvil Fase móvil Fase móvil
Fase estacionaria
Capa adsorbida
de ACN o MeOH
B BH+
BHA
Ba BHa+ BHAa
Bs BHs+ BHAsBs BHs+ BHAs
B BH+ BHA
B BH+ BHA
partición
B BH+ BHA
B BH+ BHA
adsorciónadsorción
adsorción
Análisis Químico Cuantitativo
Las moléculas pequeñas entran al laberinto de conductos de las ciclodextrinas mientras que las grandes pasan de largo y salen primero de la columna
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Cromatograma típico
tR = tiempo de retención
t´R = tiempo de retención para el pico no retenido
t´R = tR - tM = tiempo de retención ajustado
wh = ancho del pico a ½ de la altura del pico
Wb = ancho del pico determinado en la base
Análisis Químico Cuantitativo
wb = ancho del pico en la base (wb = 4s)
wh = ancho del pico medido al 50% de la altura total del
pico
wi = ancho del pico medido en el punto de inflexión ej 60.7
% de la altura total del pico
Análisis Químico Cuantitativo
Desviación estándar relativa = s / tR
N = n = (tR/s)2 = 16 (tR/wb)2 = 5.545 (tR/wh)
2
H = L/n altura equivalente para un plato teóricoL = longitud de la columna (mm)
Análisis Químico Cuantitativo
Resolución
Rs = Dt/(wb1 + wb2)1/2 = 2Dt/ wb1 + wb2
Factor de capacidad (factor de retención):
k = t´R/tM = (tR – tM)/tM
Factor de separación o selectividad (describe la
posición relativa de dos picos)
= t´R(B)/t´R(A) = kB/kA
Análisis Químico Cuantitativo
Ejemplo
Se tienen dos columnas de 25 cm x 2.6 mm DI en las cuales el mismo soluto
es analizado.
En la columna A, el tiempo de retención 416.4 s, wh = 1.7 mm ó 10.2 s
En la columna B, el tiempo de retención es 481.2 s y wh = 13.2 s
Prediga cuál es la columna más eficiente
Respuesta
nA = 9241; hA = 0.027 mm
nB = 7369; hB = 0.034 mm
Análisis Químico Cuantitativo
Rs = Dt/(wb1 + wb2)1/2
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
LA SEPARACION
Para que ocurra la separación deberá ocurrir
1. Los componentes de la muestra deberán ser retenidos en la
columna
2. Los componentes de la muestra deberán ser separados unos
de otros
3. Los componentes de la muestra deberán tener picos
relativamente angostos
Análisis Químico Cuantitativo
Calidad del pico
Desviación estándar relativa = s/tR
porque la forma del pico ó s depende del flujo
N = n = (tR/s)2
Número de platos teoricos = eficiencia de la columna
N = a (tR/w)2
Método a
wb 16
wh 5.54
wi 4
Análisis Químico Cuantitativo
Problema 2. Haddad y colaboradores encontraron los siguientes factores de capacidad para la separación en fase reversa de salicilamida (k´r sal) y cafeína (k´caf)
% v/v metanol
30 35 40 45 50 55
K´sal 2.4 1.6 1.6 1.0 0.7 0.7
K´caf 4.3 2.8 2.3 1.4 1.1 0.9
Explique los cambios del factor de capacidad ¿Qué ventajas tienen el uso de una fase móvil con menor porcentaje de metanol? ¿Existe algún inconveniente?El factor de capacidad muestra el grado de retención de la muestra por la columna, entonces la cafeína tiene mayor afinidad por la fase reversa. El mayor contenido de metanol provoca menor retención de las muestras, por lo que el factor de capacidad disminuye.
Análisis Químico Cuantitativo
Tiempo de retención , t´R ajustadotM tiempo muerto
Constante de distribuciónCs concentración en la fase estacionaria
Factor de retención
Retención relativa
Volumen de retención
Análisis Químico Cuantitativo
Problema 4. Suponga que tiene que separar una mezcla de ácido benzoico, aspartame (en fase reversa) y cafeína en un refresco de soda dietético. Dispone de la información siguiente:
Compuesto tr en fase móvil acuosa tamponada a un pH de
3.0 3.5 4.0 4.5
Ácido benzoico 7.4 7.0 6.9 4.4
Aspartame 5.9 6.0 7.1 8.1
cafeína 3.6 3.7 4.1 4.4
PreguntA 1. Explique el cambio del tiempo de retención de cada compuestoRespuesta: El pKa del ácido benzoico determina la concentración de formas ácida o básica del analito, a pH más ácidos se retiene más la muestra porque la concentración de forma ácida (RCOOH) del ácido benzoico se incrementa y ésta es más afín a la C18 que la forma básica (RCOONa), la cual es más afín al agua o bufferPregunta 2. Represente el tiempo de retención en relación con el pH de cada componente en una misma gráfica e identifique el pH con el que se logrará una separación aceptable (siguiente página)
Análisis Químico Cuantitativo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
separacion en buffer
Ácido benzoico Aspartame cafeína
pH
tR
La separación de los tres analitos será en pH de 3 o 3.5, pero no de 4 porque los tR de dos son iguales y los picos salen juntos, así como a pH de 4.5.
Análisis Químico Cuantitativo
Problema 3. La concentración de residuos de plaguicidas en productos agrícolas como, por ejemplo, en las naranjas , puede determinarse con GC-EM. Los residuos de plaguicidas se extraen de la muestra usando cloruro de metileno y los extractos se concentran hasta un volumen muy pequeño. La calibración se hace usando antraceno como patrón interno. En un estudio para determinar las ppb de heptaclor epóxido en naranjas, se trituro una muestra de 50 g de corteza de naranja y se extrajo con 50 mL de diclorometano. Tras eliminar los materiales insolubles, se redujo el volumen y se adicionó el patrón interno, finalmente se diluyo a 10 mL. El análisis de la muestra demostró una relación pico área (Aanal/Aint) de 0.108. Un conjunto de patrones de claibración , todos con la misma cantidad de antraceno que la muestra, dio el siguiente resultado.
Ppb epóxido de heptaclor Aanal/Aint
20 0.065
60 0.153
200 0.637
500 1.554
1000 3.198
Indique la concentración de epóxido de heptaclor (en nanogramos/gramo) en las naranjas Análisis Químico Cuantitativo
y = 311.85x + 6.291R² = 0.9997
0
200
400
600
800
1000
1200
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Ppb epóxido de heptaclor
ppb
Aanal/Aint
39.97 ppb39.97 mg/1000 g39.97 ng/g
Análisis Químico Cuantitativo
Representación esquemática de las contribuciones a la
anchura de los picos y el resultado cromatográfico
Desigualdad del flujo:
A1 Efecto del tamaño de partícula
A2 Efecto de la no uniformidad del
empaque
Difusión
B1 Flujo muy bajo
B2 Flujo típico
Transferencia de masa
C1 en una partícula grande
C2 En una partícula pequeña
Análisis Químico Cuantitativo
Gráfica de van Deemter
u = promedio de la velocidad lineal de la fase móvil
H = altura del plato
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
FASE ESTACIONARIA
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
MODO DE ANALISIS
CROMATOGRÁFICO
FASE
ESTACIONARIA
FASE MOVIL
SOLUBILIDAD POLARIDAD O ACIDEZ
Insoluble en
agua
No polar
Moderadamente polar
Polar
Partición(fase unida)
Fase reversa
C18 Metanol o
ACN/agua
Agua /ACNC18
Adsorción Sílica gel
n-heptano/CHCl3Fase normal Sílica gel
desactivada
Partición
(fase
unida)
Fase
reversa
C8 Agua/ACN
Fase
normal
CN n-
heptano/isopropa
nol
Análisis Químico Cuantitativo
MUESTRAMODO DE ANALISIS
CROMATOGRÁFICO
FASE
ESTACIONARIA FASE MOVIL
SolubilidadPolaridad o acidez
Solu
ble
en
agu
aBásico
Fuerte Intercambio iónico
Intercambiador catiónico
Na2HPO4 0.01-0.1 M
Débil Partición, fase reversa
Fase unida C18 Agua + ácido hexanosulfónico0.005M/MeOH
ÁcidoFuerte Intercambio
iónico
Intercambiador aniónico
Na2HPO4 0.01-0.1 M
Débil Partición, fase reversa
Fase unida C18 Agua + hidróxido de tetrabutilamonio0.005M/MeOH
Análisis Químico Cuantitativo
Columnas de nueva generación: con soporte de centro fundido de silicaque da una resolución (separación de analitos) comparada a un soporte de tamaño de partícula de 2 micras pero sin la desventaja de desarrollar presiones muy elevadas en el sistema cromatográfico
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
www.phenomenex.com/kinetex
Análisis Químico Cuantitativo
PrevailÁrea superficial 350m2/gCarga C18 15-17%
EconosphereÁrea superficial 200 m2/gCarga de C18 10%
Cromatogramas de la separación de los glicósidos de M. helleri en columnas C18 tipo Econosphere (superior) y Prevail (inferior). Columnas 250 x 4 mm, 5 micras, MeOH/H2O (55:45), 0.5 ml/min
Análisis Químico Cuantitativo
Disolventes
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Serie elutrópica
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo
Capacidad de intercambio de intercambiadores iónicos en función del pH
Análisis Químico Cuantitativo
Fase móvil
Tamaño de
partícula
mm
D.I. Columna
mm
Fase móvilViscosidad de la fase móvil
mPa.s
Presiones típicas
mPa lb/in2
5 4.6 Agua 1.0 10-15 1450-2175
10 2.6 10-12 1450-1740
10 4.6 2.5 290-725
37 2.6 0.5-2 72.5-290
5 4.6 N-hexano 0.33 3-5 435-725
10 2.6 3-4 435-580
10 4.6 0.7-1.6 101-232
37 2.6 0.2-0.7 29-101
1mPa.s = 1 cP1 Pa = Newton/m2 =1 x 10-5 bar; 1 bar = 0.9869 atm = 14.5038 psi = 1.0197 kg/cm2
Análisis Químico Cuantitativo
Capacidad de intercambio de intercambiadores iónicos en función del pH
Análisis Químico Cuantitativo
MODO Fase
estacionariaSuperficiefuncional
Fases móviles comunes
Aplicaciones típicas
Ad
sorc
ión Sílica gel
Hexano, cloroformo, isopropanol
éteres, esteres,porfirinas, micotoxinas, vitaminas liposolubles
AlúminaHexano,cloroformo, isopropanol
Aminas
Si O Si
OHOH
Al O
OH
Al
OH
Fases estacionarias y fases móviles frecuentemente usadas
Análisis Químico Cuantitativo
MODO Fase
estacionariaSuperficiefuncional
Fases móviles comunes
Aplicaciones típicas
Par
tici
ón
Fase
no
rmal
Amino -NH2 Hexano,
cloroformo,
isopropanol
Azucares. Esteroides,
nitrocompuestos
Ciano -CN Hexano,
cloroformo,
isopropanol
Nitrocompuestos,
aminoácidos
Diol Glicildoxietil
metoxi-silano
Agua, Na2HPO4
0.1M
Proteínas, péptidos,
surfactantes acuosos
Fase
rev
ersa
RP-2 Dimetilsilano Agua, acetonitrilo,
metanol
Aminas, fenoles,
vitaminas solubles en
agua
RP-8, C8 Octilsilano Agua,
acetonitrilo,
metanol
Catecolaminas,
esteroides, aceites
esenciales
RP-18, ODS Octadecilsilano Agua,
acetonitrilo,
metanol
Analgésicos, ftalatos,
poliaromáticos
Análisis Químico Cuantitativo
MODO Fase
estacionariaSuperficiefuncional
Fases móviles comunes
Aplicaciones típicas
Inte
rcam
bio
ión
ico
Intercambiador
catiónico fuerte
Ácido sulfónico Na2HPO4 0.01-0.1M Vitaminas solubles en
agua, purinas,
aminoácidos,
nucleósidos.
Intercambiador
aniónico fuerte
Amina cuaternaria Na2HPO4 0.01-0.1M Nucleótidos
Intercambiador
aniónico débil
-NH2 Na2HPO4 0.01-0.1M Colorantes de
alimentos,
carbohidratos
Excl
usi
ón
Gel acuoso Divinilbencensulfo
nato
agua Proteínas, péptidos,
azúcares
Gel orgánico Divinilbenceno Cloroformo,
tetrahidrofurano
Polímeros
Sílica de poro
controlado
Silica gel Tetrahidrofurano,
alcoholes, agua
Polímeros,
compuestos
biológicos
Vidrio de poro
controlado
Vidrio poroso Tetrahidrofurano,
alcoholes, agua
Compuestos
biológicos
Análisis Químico Cuantitativo
Tipo Grupo funcional del empaque
Muestras Rangotípico del pH
Anión Fuerte Sal de amonio cuaternaria
Aniones libres de ácidos o salesbásicas
1-10
Débil Sal de amina Ácidos fuertes y moderadamente fuertes, bases débiles
4-8
Dietil amino etil Proteínas 1-13
Catión Fuerte Sal sódica del ácido sulfónico
Cationes libres de ácidos o sales de bases
1-10
Débil Ácido carboxílico Bases fuertes y moderadamentefuertes, ácidos débiles
4-8
Carboximetil Proteínas 1-13
Separaciones de intercambio iónico
Análisis Químico Cuantitativo
Separaciones en tres columnas diferentes de 5 mezcla de derivados aromáticos (a, b, c, d y e). Columna de PBBColumna de C18 y Columna F13C9Todas de fase reversa
Análisis Químico Cuantitativo
OBJETIVOS
DECISIONES
DETECTOR COLUMNA FASE MOVIL CONDICIONES PREP.
MUESTRA
PREC. Y
EXACTITUDRESOLUCIÓN VELOCIDAD SENSITIVIDAD REPRODUC.
APLICACIÓN
Análisis Químico Cuantitativo
Análisis Químico Cuantitativo