UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN DIRECCIÓN GENERAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y

TECNOLÓGICACENTRO MULTIDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIONES

TECNOLÓGICAS

PROGRAMA DE VINCULACIÓN DE CIENTÍFICOS Y TECNÓLOGOSCONACYT

APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y

LA INGENIERÍA GENÉTICA PARA EL

DESARROLLO DE CULTIVARES MEJORADOS

Resistencia a enfermedades fúngicas

Ing. Agr. M.Sc. Cinthia C. CazalEstancia de investigación- Centro de

Investigación Científica de Yucatán

(CICY) 2015.-

INTRODUCCIÓN

Se pueden separar en 3 grupos las actividades realizadas.

Proceso de Transformación Genética de Plantas, utilizando Agrobacterium.-

Amplificación de regiones conservadas para identificación molecular de hongos.-

Identificación de la presencia de un gen regulador de la embriogénesis en Stevia.-

PROCESO DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS DE CAFÉ, UTILIZANDO AGROBACTERIUM.-

Preparación del transgen para la transformación genética de Coffea canephora.Verificación de la integración del gen de interés en un vector.

TÉCNICAS EMPLEADAS Preparación del material vegetal para latransformación genética. Las plantas invitro se pre-acondicionarán por 14 días enpresencia de balance hormonalesespecíficos.

Crecimiento de Agrobacterium: Se ponen a crecer en

medios específicos con antibióticos selectivos para la cepa

en cuestión a ser utilizada. El rango de densidad óptica

óptima es 0,3 a 0,5.

…TÉCNICAS EMPLEADASTransformación genética de Coffea canephora mediante co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens. Se co-cultivará la bacteria y los explantes.

Incubación por 72 horas a 28 °C, en oscuridad.

1 hora en cámara de vacío

Explantes en medio con

Agrobacterium tumefaciens

Corte de las hojas en forma circular

Después de eliminar a la bacteria se procederá al inicio del protocolo de embriogénesis somática de cafeto.

…TÉCNICAS EMPLEADAS

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE HONGOS.-IMPORTANCIA

Una alta diversidad genética se asocia a la capacidad de adaptarse a condiciones cambiantes en su entorno.

REGIONES AMPLIFICADASPrimers Sequence (5′ – 3′) Regiones

ACT-512F ATG TGC AAG GCC GGT TTC GC

Partial actin gene (Carbone & Kohn (1999).

ACT-783R TAC GAG TCC TTC TGG CCC AT

CAL-228F GAG TTC AAG GAG GCC TTC TCC C

Partial CAL gene (Carbone & Kohn (1999).

CAL-737R CAT CTT TCT GGC CAT CAT GG

ITS4 Reverse TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

Internal transcribed spacers (White et al.

(1990).

V9G Forward TTA CGT CCC TGC CCT TTG TA

LR5 Reverse TCC TGA GGG AAA CTT CG

Partial large subunit (LSU) (28S) of the nrRNA

gene operon. Vilgalys & Hester (1990)

O'Donnell (1993).

NL1 Forward GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG

RPB1F AGA CGA TYG AGG AGA TCC AGT T Partial RNA polymerase II largest subunit gene

RPB1R ART CCA CAC GCT TAC CCA TC Klaubauf et al. (2014).

TÉCNICAS EMPLEADAS

1. Optimizar la amplificación de los fragmentos de interés.-

1kb 1 2 3 4 5 6

ITS ±470 pb

51,0°C

52,7°C

55,1°C

56,4°C

58,9°C

60,9°C

51,0

°C

52,7°C

55,1°C

56,4°C

58,9°C

60,9°C

LSU ±729 pb

100pb 1 2 3 4 5 6

55,1°C

60,3°C

62,1°C

63,8°C

66,7°C

68

°C

55,1°C

60

,3°C

62

,1°C

63

,8°C

66

,7°C

68°C

RPB1

_0

09

1 2 3 4 5 6 7 100pb

ACT ±380 pb CAL ± 480 pb

1 2 3 4 5 6 100bp 57 ⁰

C

60,2

⁰C

62,9

⁰C

1 k

b

1 2 3 1kb

RBP1 ±980 pb

…TÉCNICAS EMPLEADAS2. Obtención de productos de PCR

100pb 1 2 3

Leyenda

1. LSU_C-005

2. LSU_C-007

3. LSU_C-012

Leyenda

1. C-016_ACT

2. C-017_ACT

3. C-019_ACT

4. C-021_ACT

100pb 1 2 3 4 1 2 3 100pb

Leyenda

1. RBP1_C-005

2. RBP1_C-007

3. RBP1_C-012

100pb 1 2 3 4

Leyenda

1. C-04_CAL

2. C-05_CAL

3. C-07_CAL

4. C-012_CAL

Leyenda

1. 1. C-04_ITS4

2. C-05_ITS4

3. C-07_ITS4

4. C-012_ITS4

100pb 1 2 3 4

3. Ligación de fragmentos amplificados

…TÉCNICAS EMPLEADAS

…TÉCNICAS EMPLEADAS

2. Transformación

Medio LB

Choque térmico a 42 °C

Reposar en hielo

Células Competentes+Producto

de ligación

Incubar a 37°C

190 rpm

1 hs30 min

LB+antibiótico+XGal+IPTG

Incubar ±18 horas 37°C

…TÉCNICAS EMPLEADAS

…TÉCNICAS EMPLEADAS

PCR-Colonias

…TÉCNICAS EMPLEADASIncubar ±18 horas 37°C

Centrifugar a 8000 rpm

3 min

Temperatura ambientePellet

…TÉCNICAS EMPLEADAS

CA

L_±

48

0 p

b

RPB1

_±

980

pb

ITS4

_±

47

0 p

b

LSU

_±

73

0 p

b

…TÉCNICAS EMPLEADASSecuenciación

IDENTIFICACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN GEN REGULADOR DE LA EMBRIOGÉNESIS EN STEVIA.-Se realizó el diseño de cebadores específicos del gen Serk-1 utilizando la secuencia del fragmento secuenciando.

El diseño de cebadores consiste en buscar una región de la secuencia que cumpla ciertos parámetros (Temperatura de melting (Tm), % GC, entre otros.)

…TÉCNICAS EMPLEADAS

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) denominada RACE por sus siglas eninglés (Rapid amplification of cDNA ends)

…TÉCNICAS EMPLEADAS

…TÉCNICAS EMPLEADAS

POR SU ATENCIÓN

Muchas Graciasemail.: cccazalm86@gmail.com

AGRADECIMIENTOS