UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA

MOLINA

ESCUELA DE POSGRADO MAESTRÍA EN

PRODUCCIÓN ANIMAL

“DETERMINACIÓN DE LA RESERVA OVÁRICA EN ALPACAS

MEDIANTE LA CONCENTRACIÓN DE LA HORMONA ANTI-

MÜLLERIANA (AMH) EN EL PLASMA SANGUÍNEO”

Presentado por:

RENSSON HOMERO CÉLIZ YGNACIO

TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAGÍSTER SCIENTIAE EN

PRODUCCIÓN ANIMAL

Lima – Perú

i

ÍNDICE GENERAL

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………...1

II. REVISIÓN DE LITERATURA…………………………………………………...3

2.1 LAS ALPACAS Y SU IMPORTANCIA PARA EL PERÚ……………………….3

2.2 FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA ALPACA HEMBRA…………………..3

2.2.1 Anatomía del ovario de alpaca………………………………………………........4

2.2.2 Foliculogénesis en alpaca…………………………………………………….......4

2.2.3 Ovulación en alpacas……………………………………………………………..5

2.3 RESERVA OVÁRICA……………………………………………………………..7

2.3.1 Reserva de folículos primordiales………………………………………………..7

a. Diferenciación de las células germinales primordiales………………….............8

b. Establecimiento de los folículos primordiales ……………………………..........8

2.3.2 Reserva de folículos pre-antrales……………………………………………….11

a. Reclutamiento folicular………………………………………………………...11

b. Activación de los folículos primordiales……………………………………….13

2.3.2 Reserva de folículos Antrales…………………………………………………...15

a. Crecimiento de folículos independientes de gonadotropinas…………………...15

b. Formación de folículos dependientes de gonadotropinas………………………16

2.4 EVALUACIÓN DE LA RESERVA OVÁRICA…………………………………17

2.4.1 Conteo de folículos antrales……………………………………………………..17

2.4.2 Marcadores endocrinos……………………………………………………….17

a. Concentración de la hormona Folículo Estimulante (FSH)…………………….17

b. Concentración de la hormona Inhibina…………………………………………18

c. Concentración de la hormona Anti.Mülleriana…………………………...19

2.5 NUTRICIÓN EN LA RESERVA OVÁRICA……………………………………22

III. MATERIALES Y METÓDOS…………………………………………………24

3.1 LUGAR……………………………………………….………………………...24

3.2 ANIMALES……………………………………………..………………………24

3.3 MATERIALES………………………………………….………………………25

3.3.1 Equipos……………………………………………………………………….24

3.3.2 Reactivos e insumos………………………………………………………….24

3.3 ESTUDIOS REALIZADOS……………………………………………………..26

ii

3.4.1 Estudio I: Validación de la concentración de AMH en plasma de alpacas….25

3.4.2 Estudio II: Determinación de la concentración de AMH durante la onda

folicular……………………………………………………………………………….26

3.4.3 Estudio III: Correlación de la concentración de AMH y el conteo de folículos

antrales………………………………………………………………………………..26

3.4.4 Estudio IV: Expresión de la hormona AHM en los folículos en crecimiento

………………………………………………………………………………………..27

3.5 DEFINICIONES OPERACIONALES…………………………………………..28

3.5.1 Colección y procesamiento de muestras……………………………………..28

a. Ovarios………………………………………………………………………28

b. Plasma……………………………………………………………………….29

3.5.3 Sincronización de la onda folicular………………………………………….29

3.5.4 Visualización de folículos antrales por histología………………………..…30

3.5.5 Ensayo Hormonal………………………………………………………..….31

3.5.6 Inmunohistoquímica de AMH……………………………………………....32

3.6 ANALISIS ESTADÍSTICO…………………………………………………...33

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………..35

4.1 Validación de la concentración de AMH en plasma de alpacas……………….34

4.2 Determinación de la concentración de AMH durante la onda folicular……....34

4.3 Correlación de la concentración de AMH y el conteo de folículos antrales…..36

4.4 Expresión de la hormona AHM en los folículos en crecimiento……………...37

V. CONCLUSIONES……………………………………………………………….42

VI. RECOMENDACIONES…...…………………………………………………..43

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………………..……………………...44

VIII. ANEXOS……………………………………………………………………...57

iii

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Figura 1. Comparación de ovogénesis y foliculogénesis durante la vida de diferentes

mamíferos………………………………………………………………………………10

Figura 2. Línea de tiempo del desarrollo de células germinales en el ratón …………...11

Figura 3: Representación esquemática del desarrollo de la foliculogénesis en el ovario

de un ser humano……………………………………………………………………….12

Figura 4. Citoquinas y factores de crecimiento en la señalización durante la transición

entre folículo primordial- folículo primario….………………………………………...14

Figura 5: AMH es secretada por folículos pre-antrales y antrales….………………….21

Figura 6. Vía de señalización de la AMH………………………..……………….........22

Figura 7: Curva estándar utilizada en la cuantificación de AMH………………….......35

Figura 8. Paralelismo en las curvas de las muestras diluidas………………………….36

iv

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO I. Datos utilizados en la validación de la hormona Anti-Mülleriana…………57

ANEXO II. Datos para evaluar el comportamiento de la hormona Anti Mülleriana

durante la onda folicular……………………………………………………………….58

ANEXO III. Datos para evaluar la correlación entre el conteo de folículos antrales y la

concentración de la hormona Anti-Mülleriana………………………………………..61

RESUMEN

El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo determinar concentración de la

hormona Anti Mülleriana en el plasma sanguíneo de alpacas hembras. La metodología

utilizada fue mediante técnica Elisa sándwich, usando un kit comercial AnshLabs rata/ratón

AMH ELISA específico para ratones. Para la validación de este kit en alpacas, se utilizó

diluciones seriadas de líquido folicular de alpacas hembras, plasma de alpacas macho

castrados y plasma de alpacas hembras adultas, observándose linealidad y paralelismo con

respecto a la curva estándar.

Al evaluar la concentración de la hormona Anti Mülleriana durante la onda folicular, se

observa datos muy variados entre los individuos. Sin embargo no presentan ningún patrón

asociado con la onda folicular. La concentración de hormona AMH en el plasma de alpacas,

está fuertemente correlacionado (r=0.6) con el conteo de folículos antrales. Presentando

valores máximos de 3.129 ng/ml correspondientes a

Palabras clave: reserva ovárica, alpacas, folículos antrales, Anti-Mülleriana.

1

I. INTRODUCCIÓN

La crianza de alpacas constituye una de las principales actividades en el desarrollo socio

económico de la población alto andina del Perú. Estos animales cuentan con una notable

adaptabilidad a las difíciles condiciones medioambientales cambiantes en los territorios

altoandinos (Quispe et al., 2009). No obstante esta situación, este importante recurso

zoogenético no es aprovechado de manera adecuada, lo cual obliga a desarrollar y aplicar

tecnologías de avanzada para acelerar la mejora de su calidad genética, solventando los

factores limitantes que frenan el avance técnico productivo y reproductivo.

Con la creciente preocupación en todo el mundo sobre el cambio climático y la seguridad

alimentaria, es fundamental contar con estrategias nutricionales para mejorar los resultados

reproductivos debido a los cambios previstos en la disponibilidad de alimento (IPCC, 2014).

Los pastos naturales en las zonas alto andinas tienden a soportar cada vez menor carga

animal, debido al mal manejo de los pastos y a los constantes cambios climáticos que afectan

estas zonas (LAS II, 2010). Lo que conlleva a una subnutrición, en especial durante las

primeras etapas de vida, repercutiendo de esta manera en la capacidad reproductiva futura

de las alpacas. En las últimas décadas se ha avanzado en el conocimiento de la fisiología

reproductiva de las alpacas, gracias al estudio de muestras obtenidas de camal (San Martin

et al., 1968), o técnicas más sofisticadas como laparotomía (England y Foote, 1971),

laparoscopia (Bravo y Sumar, 1989), ecografía transrectal (Vaughan et al., 2004) y análisis

hormonales (Aba y Forsberg, 1995). Al estudiar la foliculogénesis de alpacas, hay evidencia

de que el número de folículos en la reserva ovárica se correlaciona con su fertilidad (Ireland

et al., 2007). El establecimiento de esta reserva ovárica se da en la vida fetal y es influenciada

por la nutrición de la hembra gestante (Mossa et al., 2013; Bernal et al., 2010).

La importancia de conocer si la inadecuada nutrición repercute directamente en la fertilidad

de la descendencia es fundamental. Para ello es importante validar distintos métodos para

evaluar la reserva ovárica, (pequeños folículos en el ovario dependientes de gonadotropinas)

(Burns et al., 2005; Monniaux et al., 2014). Una disminución en la reserva ovárica, será un

indicativo de que su potencial reproductivo es menor.

1

La Hormona Anti Mülleriana, se ha venido empleando en la última década como un

biomarcador para evaluar la fertilidad de las hembras, evaluando de manera la concentración

de AMH en el plasma sangüineo y relacionándolo con la fertilidad de estos individuos

(Monniaux et al., 2014). La concentración de la hormona anti-Mülleriana (AMH) es el mejor

marcador endocrino para la población de pequeños folículos antrales tanto en seres humanos

(La Marca et al., 2010), como en rumiantes (Rico et al., 2009; Lahoz et al., 2012; Monniaux

et al., 2014). La estrecha relación existente entre el conteo de folículos antrales y la

concentración plasmática de la AMH (Broer et al., 2011) se explica por el hecho de que la

expresión de AMH está estrictamente restringida a las células de la granulosa de folículos

en crecimiento, es decir en células de la granulosa del folículo preantal más grande y del

folículo antral más pequeño (Pelusso et al., 2014).

Conociendo que la reserva ovárica influye en la fertilidad de la hembra, se hace necesario

plantear estrategias adecuadas para mitigar los efectos negativos que ejerce el cambio

climático sobre la fertilidad de alpacas.

Por lo tanto, el objetivo general del presente trabajo es determinar si la concentración de la

hormona AMH en el plasma sanguíneo es influenciado por la reserva ovárica de alpacas..

Los objetivos específicos son:

- Validar la metodología para determinar la concentración plasmática de hormona

Anti-Mülleriana (AMH) en el plasma de alpacas mediante un kit Elisa-AMH

comercial.

- Evaluar el comportamiento de la concentración hormona Anti-Mülleriana durante la

onda flicular en alpacas.

- Determinar la correlación entre la concentración de hormona Anti-Mülleriana

(AMH) con la población de folículos antrales en ovarios de alpaca.

- Evaluar la expresión de la hormona Anti-Mülleriana (AMH), en células de la

granulosa de folículos en ovarios de alpaca.

3

II. REVISION DE LITERATURA

2.1 LAS ALPACAS Y SU IMPORTANCIA PARA EL PERÚ

La crianza de alpacas es la principal actividad económica de más de 300.000 familias

campesinas de la zona alto andina del Perú. No obstante, estos criaderos utilizan sistemas de

manejo tradicionales, dificultando de esta manera la obtención de resultados productivos

competitivos. La población nacional de alpacas se estima, según el censo nacional del INEI,

en unos 3,7 millones y el 80% de ellas (aproximadamente 3 millones) se encuentran

principalmente en las zonas alto andinas de Perú (Puno, Arequipa, Cuzco, Ayacucho,

Huancavelica y Apurímac), de las que alrededor del 80% son alpacas Huacaya, 12% Suri y

el 7% cruzados (INEI, 2012); el resto se ubica principalmente en Bolivia y Chile, aunque se

han introducido con éxito en Australia, Canadá, Inglaterra, Francia, Nueva Zelanda y

Estados Unidos.

A pesar de que el Perú alberga la mayor parte de la población mundial de alpacas, el

beneficio económico que se obtiene es muy reducido. Los mejores retornos económicos se

pueden lograr a través de la investigación en profundidad sobre la biología de esta especie y

mediante la aplicación de los conocimientos adquiridos entre los criadores de alpaca (Sumar,

2007). La importancia de incluir la actividad de crianza en las alpacas como prioritaria para

el crecimiento nacional radica en: es una actividad típica de las condiciones de producción

altoandinas, su análisis y su promoción pueden ayudar a superar los límites inherentes a la

situación del sector agropecuario andino, b) contribuye significativamente a la economía de

muchas familias de las zonas altoandinas, c) el Perú tiene la mayor población de alpacas en

Sudamérica, y d) es una actividad con un gran potencial económico aún inexplotado (Brenes

et al., 2001).

2.2 FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA ALPACA HEMBRA

El conocimiento de la fisiología reproductiva de las alpacas se basa en gran medida en los

datos obtenidos en camellos y llamas. Estas especies domesticadas se clasifican como

animales de ovulación inducida (San Martin et al, 1968; Adams y Ratto, 2013). En ausencia

de un estímulo por parte del macho, las alpacas hembras pueden

4

permanecer con el folículo dominante por hasta 36 días con sólo ocasionales periodos de

anestro que no son más de 48 horas (San Martin et al., 1968). La edad exacta en la que las

alpacas llegan a la pubertad no está claramente definido. Los primeros informes indican que

las alpacas son sexualmente receptiva y capaz de ovular a los 12 meses de edad (Novoa et

al., 1972), pero se han reportado preñeces desde los 3 meses de edad (Vaughan y Tibary,

2006). Las tasas de ovulación, la fertilización y el desarrollo embrionario de alpacas de un

año son similares a los de alpacas adultas (Fernández-Baca et al., 1972). La función ovárica

se mantiene relativamente poco conocido en camélidos. En las últimas décadas se han

empleado nuevas tecnologías para el estudio de la foliculogénesis y la ovulación en alpacas.

El uso de la ecografía transrectal (Vaughan et al., 2004) y ensayos hormonales (Aba y

Forsberg, 1995), dos técnicas relativamente poco invasivas y que brindan información

detallada del desarrollo ovárico.

2.2.1 ANATOMÍA DEL OVARIO DE ALPACA

La función primaria del ovario en los mamíferos es producir y preparar los ovocitos

competentes para la fertilización y el desarrollo embrionario, y la secreción de

hormonas esteroideas. La actividad y desarrollo de los folículos ováricos son

regulados mediante las gonadotropinas secretadas por el eje hipotálamo-hipófisis.

Los ovarios de las alpacas varían con la edad y su contenido de folículos y cuerpos

lúteos. Según Sato y Montoya (1990) su longitud oscila entre los 5 y 12 mm y su

peso entre los 1,9 y 2,4 g. El aspecto ovalado del ovario es debido a la presencia de

folículos maduros y, sobre todo, de cuerpos lúteos. Un largo pliegue del ligamento

ancho del útero (mesosalpinx), denominado bursa ovarii, rodea completamente cada

ovario y al cuya proporción apical forma un amplio orificio circular que comunica

con la fimbria del oviducto (Bravo et al., 2000). Los ovarios son envueltos por un

pliegue peritoneal llamado mesovario, una parte del ligamento ancho. Los ovocitos

están localizados en una rica área vascularizada debajo de la túnica albugínea en el

límite del área medular-cortical, rodeado por células del estroma, vasos sanguíneos

y nervios (Vaughan et al., 2011).

2.2.2 FOLICULOGÉNESIS EN ALPACA

El inicio de la foliculogénesis se produce inmediatamente después de que los

primeros folículos se forman, y continúa hasta el final del periodo reproductivo (12-

18 años en alpacas), incluso a través de embarazo y la lactancia (Adams et al., 1990).

5

Los folículos son además degenerados durante el desarrollo fetal debido a que la

falta de la hormona folículo estimulante (FSH) no es compatible con un mayor

desarrollo folicular (Rajkovic et al., 2006). El patrón de ondas foliculares en las

alpacas es apoyado por crecimientos periódicos en el número de folículos y la

aparición de un folículo dominante, que alcanza un diámetro de 7 mm (Adams et al.,

1990; Vaughan et al., 2004). Cultivo de folículos dominantes ≥6 mm son capaces de

ovular (Adams et al., 1990), mientras que los folículos más pequeños regresionan

(Bravo et al., 1991).

Una onda folicular involucra el reclutamiento y la aparición sincrónica de una

cohorte (8 a 10) de folículos antrales con un diámetro aproximado de 2-3mm

(Vaughan, 2011) seguido por el crecimiento continuo de por lo general uno (folículo

seleccionado), pero a veces dos o tres folículos de hasta 3-5mm de diámetro. El

folículo destinado a convertirse en dominante continúa el crecimiento, mientras que

los otros miembros de la cohorte (folículos subordinados) retroceden por atresia

(Adams et al., 1990; Vaughan et al., 2004). Los folículos antrales son evidentes en

camellos en 32-36 semanas de gestación (Marai et al., 1990).

La dinámica folicular en alpacas se divide en cuatro fases: crecimiento (2-4 mm),

selección (5-6 mm), dominancia (>7mm) y atresia (Bravo y Sumar, 1989). Algunos

estudios muestran que la distribución de los folículos dominantes es de forma

homogénea en ambos ovarios (Vaughan et al., 2004), pero otros indican hay una

variación, siendo el número de folículos del ovario izquierdo mayor al del derecho.

El cuerpo lúteo, no afecta la cantidad de folículos en crecimiento (Del Campo et al.,

1996).

2.2.3 OVULACIÓN EN ALPACAS

En las alpacas se presenta una ovulación inducida, en el cual se tiene que presentar

el estímulo del macho desencadenando el aumento de LH y la consiguiente

ovulación. El apareamiento no necesariamente es el factor que desencadena la

ovulación en alpacas, Fernández-Baca et al., 1970 observó que señales visuales,

auditivas, olfativas, y físicas, incluyendo la vocalización por el macho también

contribuyen a que la hembra ovule sin coito ( Fernández-Baca et al., 1970 ). Estos

datos han contribuido a la hipótesis de un factor inductor de ovulación de origen

neuroendocrino. Se ha estudiado que el principal reflejo neuroendocrino es

6

provocado por una proteína presente en el plasma seminal (Adams y Ratto 2001).

Ratto et al., 2011, determinaron que se trata de un proteína de tipo β-NGF (Factor de

crecimiento neural) y que tiene un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Este

factor inductor de la ovulación (OIF), sumado a la estimulación mecánica del cuello

uterino por el pene durante el coito son los principales responsables del reflejo

neuroendocrino de la ovulación. Este estímulo provoca una repentina y gran

liberación de GnRH (Kauffman y Rissman de 2006).

El pico de la Hormona Leutinizante (LH) se produce después de 2-3 horas después

del apareamiento y se mantiene a niveles basales hasta 12 horas después del coito

(Aba y Forsberg, 1995). Como en los demás mamíferos, el pico de LH desencadena

la reanudación de la meiosis en el ovocito, la alteración de la cohesión de células del

cumulus, la rotura de la pared folicular para liberar el complejo cumulus-ovocito y

una disminución de niveles plasmáticos de estradiol durante un periodo de

aproximadamente 24 h (Vaughan, 2001). En caso haya ocurrido la fecundación, las

células de la granulosa que quedan en el folículo se luteinizan y formar un cuerpo

lúteo, que producirá progesterona necesario para la preparación de útero y el

mantenimiento del embarazo (Powell et al., 2007).

Es importante mencionar, que la capacidad de los folículos para responder a la LH y

posteriormente de ovular, depende del diámetro y estado de desarrollo del folículo

dominante en el momento del apareamiento: folículos dominantes entre 6 y 15 mm

de diámetro son capaces de ovular (Vaughan et al., 2004). El intervalo entre el

apareamiento y la ovulación es de aproximadamente 30 h (rango 24-36 h) en la alpaca

(Ratto et al., 2006 ) y no se ve afectada por el diámetro del folículo en el momento

de acoplamiento (Adams et al., 1990 ). A pesar de que la mayoría de preñeces en la

alpaca se localizan en el cuerno uterino izquierdo (Fernández-Baca et al., 1970 y

Adams et al., 1990), la ovulación se puede producir en cualquier punto aparte del

hilio, con la misma frecuencia en los ovarios izquierdo y derecho (Vaughan y Tibary,

2006). De dos a 5 días post-coito, se desarrolla un cuerpo lúteo en el sitio de la

ovulación del ovario asu vez esto se asocia con el aumento de los niveles de

progesterona en el plasma de 4 a 6 días después del apareamiento (Aba et al.,

1995 y Ratto et al., 2006). Existe una estrecha relación temporal entre el diámetro

del cuerpo lúteo, medido por ecografía o palpación rectal, y la progesterona en el

plasma sanguíneo. El cuerpo lúteo alcanza un diámetro máximo de 8-15 mm con la

7

salida máxima de progesterona 7-9 días después del apareamiento (Aba et al.,

2000). La presencia de un cuerpo lúteo en alpacas se asocia generalmente con un

nivel de progesterona en circulación mayor a 2 ng/ml (Aba et al., 1995). Las hembras

que no conciben, pasan a ser sexualmente receptivas, aproximadamente de 12 a 14

días después del apareamiento, disminuyendo de esta manera los niveles de

progesterona (<2 ng/ml). El reclutamiento de los folículos y una nueva onda folicular

comienza poco después de la ovulación (Adams et al., 1990). El folículo dominante

en las alpacas en la primera ola después del apareamiento se detecta a través de

ultrasonido 2 días después de la ovulación (Ratto et al., 2003). La presencia de un

cuerpo lúteo, y elevada concentración de progesterona en plasma, altera la dinámica

de la onda folicular en alpacas, acortando el intervalo entre las ondas y la reducción

del diámetro folicular en cada onda folicular (Aba et al., 2005).

2.3 RESERVA OVÁRICA

La reserva ovárica es un término ampliamente utilizado que se ha mantenido en gran medida

sin definir, y, hasta incluso mal definido. Lo que generalmente se conoce como reserva

ovárica, en realidad representa sólo una pequeña parte de la reserva ovárica total, compuesta

en su mayoría por folículos que no están en crecimiento y folículos en crecimiento, estos

últimos en una menor cantidad y presentes después del reclutamiento inicial (Gleicher et al.,

2011). En este documento se hará referencia al grupo de folículos que están en crecimiento,

tienen una cavidad antral y son funcionales.

Después del establecimiento del pool de folículos primordiales, ocurre la activación del

ovocito primario, hay crecimiento folicular que termina en la formación de una segunda

reserva: pequeños folículos con una cavidad antral, dependientes de gonadotropinas y que

constituyen una reserva dinámica para la ovulación (Monniaux et al., 2014). Al evaluar su

tamaño, ya sea por conteo directo o mediante marcadores de la expresión de determinadas

proteínas, se correlaciona con la fertilidad del individuo (Burns et al., 2005; Silva-Santos et

al., 2013).

2.3.1 RESERVA DE FOLÍCULOS PRIMORDIALES

Los folículos primordiales o folículos que no están en crecimiento son la unidad

funcional de la reproducción, cada uno compuesto por una única célula germinal

rodeado por células somáticas. Durante la vida reproductiva, la reserva ovárica total

8

disminuye progresivamente debido a la atresia de folículos, así como el

reclutamiento, maduración y ovulación (Pelosi et al., 2015).

a. Diferenciación de las células germinales primordiales

Las células somáticas y las células precursoras de los ovogonias (células

germinales primordiales-CGPs) se desarrollan a partir de microambientes

diferentes. Durante la gastrulación en el desarrollo embrionario humano,

Ginsburg et al., 1990 observaron que la pequeña población de CGPs se

desarrolla en un compartimento extra-embrionario, ubicado en la base de la

alantoides del endodermo de la pared dorsal del saco vitelino. Estudios en

ratones muestran que las etapas críticas para el desarrollo de las CGPS son

la especialización, migración y proliferación de las CGPs (Pelosi et al., 2015).

La especialización depende de la señalización de proteínas morfogenéticas

del hueso (BMP), tales como BMP4, BMP2 y BMP8, las cuales actúan desde

el ectodermo extraembrionario (Pelosi et al., 2011). Posteriormente, la

expresión Blimp1 permite que el grupo de CGPs se mantengan especializadas

inhibiendo la diferenciación a células mesodérmicas (Ohinata et al., 2005).

Luego de la especialización de las CGPs, comienzan a migrar hacia su destino

final, la gónada (Kurilo, 1981). Es durante esta migración que las CGPs

comienzan a proliferar, y continúan su multiplación durante la colonización

de la gónada (Baker, 1963). Genes Nanos son importantes para la

especificación y la migración de las CGPs. La ablación de Nanos3 provocó

defectos en la migración y la proliferación de CGPs de ratón, lo que conduce

a la esterilidad (Tsuda et al., 2003).

b. Establecimiento de los folículos primordiales

En las especies de mamíferos que han sido examinados, antes del nacimiento

se producen procesos como mitosis de la ovogonia e inicio de la profase

meiótica, pero el momento de la detención meiótica, formación del folículo,

y el inicio del crecimiento del folícular (es decir, la activación del folículo)

varía de especie a especie (Figura 1). En el ovario humano, los primeros

folículos primordiales se detectan en la mitad de la gestación y en los roedores

2-4 días post-parto (Sforza y Forabosco 1998). En bovinos, el pool de

9

folículos primordiales es establecido durante el segundo trimestre de

gestación.

La migración de CGP ocurre desde el epitelio del saco vitelino hasta colonizar

la cresta gonadal, proceso altamente controlado y dirigido por la secreción de

citoquinas pleiotrópicas y factores de crecimiento (Kunwar et al., 2006). A la

llegada a la cresta gonadal las células germinales migran hacia el interior para

formar cordones primitivos tanto medulares y sexuales, en los que pierden su

movilidad y se convierten en estructuras interconectas y rodeadas de células

somáticas: ovogonia (Sathananthan et al., 2000). La ovogonias se encuentran

agrupadas juntas en nidos ovogoniales las cuales están conectados por

puentes intercelulares, a todo este conjunto se le denomina quistes de la línea

germinal (Pepling 2006). Proteínas GDFs (Factor de diferenciación de

crecimiento) y BMPs, tales como GDF9 y BMP15 están implicados en la

ruptura de las interacciones intercelulares entre ovogonias (Yan et al., 2001).

10

Figura 1. Comparación de ovogénesis y foliculogénesis durante la vida de diferentes

mamíferos. Barra azul: inicio de la meiosis y formación de la reserva de folículos

primordiales, barra verde: foliculogénesis antes de la pubertad y barra naranja:

foliculogénesis y la aparición de la ovulación. (Tomado de Monniaux et al., 2013)

Después de una serie de mitosis, las ovogonias entran en las primeras etapas

de meiosis I. Borum, 1961, mostró en ovarios de ratón que los ovocitos

proceden de forma sincronizada a través del leptoteno, cigoteno, y etapas del

paquiteno de la profase I durante el último tercio de la gestación (Figura 2).

En mutantes femeninos, para determinados genes involucrados en la división

y reparación celular como Spo11 (Baudat et al., 2000), Dmc1 (Pittman et al.,

1998) y Atm (Barlow et al., 1998), las células germinales primordiales no

progresan más allá de la etapa de paquiteno de la profase I y posteriormente

mueren. En otro estudio, Paredes et al., 2005 observó que la inhibición de

SCP1 (una proteína del compleja sinaptonemal) causó la llegada prematura a

la fase de diplotene de la meiosis y la aceleración de la formación del pool de

folículos primordiales, lo que sugiere una relación entre la fase del ciclo

celular y el desarrollo del folículo primordial.

En ratones, poco después del nacimiento, los ovocitos se detienen en la etapa

de diploteno de la Profase I, los nidos de los ovocitos se rompen y se forman

los folículos primordiales. Las células somáticas invaden la corteza de la

medula y rodean los nidos ovogoniales y son circundadas en una capas de

células aplanadas, denominadas células de la pregranulosa, que se cree que

derivan del mesonéfrico, o de las células del epitelio superficial (McNatty et

al., 2000). Esas células en la gónada interior parecen ser los primeros ovocitos

en reactivar la meiosis, mientras que los ubicados en la periferia son los

últimos en hacerlo (van Wezel y Rodgers 1996) y esto puede tener

consecuencias en la activación del folículo primordial.

Es posible que el tamaño del pool de folículos primordiales esté influenciado

por el entorno que se desarrolla el feto antes y durante el tiempo de gestación

(Mossa et al., 2013). En el ganado vacuno, los esteroides ováricos fetales

(estradiol y progesterona) son reguladores negativos tanto para la formación

del folículo primordial como para la activación e inicio del crecimiento

folicular (Fortune et al., 2013). Por tanto, factores externos que alteren la

11

producción o acción de esteroides pueden afectar también el tamaño de la

reserva ovárica (Veiga-Lopez et al. 2012).

Figura 2. Línea de tiempo del desarrollo de células germinales en el ratón. Células

germinales (amarillo) y células somáticas (rojo) se muestran para resumir eventos que se

producen durante el desarrollo temprano de las células germinales de ratón. (dibujo tomado

de Pepling, 2006).

2.3.2 RESERVA DE FOLÍCULOS PRE-ANTRALES

Una vez formados la población de folículos primordiales, estos puede permanecer

inactivos durante meses (ratones) o durante muchas décadas (humanos), o incluso no

se utilizan en absoluto durante la vida reproductiva. Pelosi et al., 2015 plantea dos

mecanismos por los cuales se puede mantener el pool de folículos, por ende la reserva

ovárica: (a) el mantenimiento de la quiescencia y la supervivencia de las células

primordiales, y (b) la supresión de la activación de las células primordiales (Reddy

et al., 2010). El proceso de activación va a permitir que los folículos primordiales

entren a una etapa de continuo crecimiento.

a. Reclutamiento folicular

El término reclutamiento se ha utilizado con frecuencia por diferentes

investigadores para describir dos importantes pero distintos puntos de

12

inflexión durante el desarrollo folicular. El primero corresponde al

reclutamiento folicular continuo, en el cual los folículos primordiales son

reclutados de una manera continua para su posterior desarrollo hasta que

tienen una pequeña cavidad antral, mientras que el segundo corresponde al

reclutamiento cíclico en el cual los incrementos en la FSH circulante durante

cada ciclo reproductivo permite reclutar una cohorte de folículos antrales para

alcanzar la fase preovulatoria Figura 3. (McGee y Hsueh, 2000).

Figura 3. Representación esquemática del desarrollo de la foliculogénesis en el ovario de

un ser humano (Tomado de Broer et al., 2014). Dotación y mantenimiento, reclutamiento

inicial, maduración, atresia o reclutamiento cíclico, ovulación, y agotamiento. Se muestra

la acción de hormonas que actúan inhibiendo (AMH e Inhibina B) e induciendo (FSH) el

desarrollo de los folículos.

En el reclutamiento continuo, ocurre la transición de folículos primordiales a

folículos primarios, proceso denominado activación folicular, lo cual resulta

en cambios morfológicos y fisiológicos, tanto del ovocito como de las células

somáticas que lo rodean. El volumen de los ovocitos aumenta en gran medida,

y las células de la pre-granulosa aplanadas que rodean los ovocitos se

diferencian y proliferan en las células de la granulosa cúbicas. Después, los

folículos activados crecen lentamente (crecimiento folicular basal), su tasa de

13

crecimiento está estrechamente relacionado con la proliferación de las células

de la granulosa. La mayoría de los folículos activados sufren atresia (Polosi

eta l., 2015). El reclutamiento continuo está bajo el control de factores de

crecimiento de origen paracrino, y es un proceso gonadotrofina

independiente, aunque la hormona estimulante del folículo (FSH) puede

ejercer un efecto mitogénico (indirecto) sobre las células de la granulosa,

mediante la potenciación de la expresión de factores de crecimiento o

receptores de factor de crecimiento (McGee y Huseh 2000).

En el reclutamiento cíclico, el crecimiento folicular es rápido y se produce

por el aumento significativo de la cavidad antral (crecimiento folicular

terminal). Durante este reclutamiento sólo un número limitado de folículos

llegan a sobrevivir, los restantes sufren un proceso de atresia. Los ovocitos en

estos folículos completan su crecimiento, adquieren la zona pelúcida, y están

competentes para reanudar la meiosis (Tsafriri et al., 1997). En las alpacas,

como en todas las especies mono-ovulatorias, sólo uno de estos folículos, el

"folículo dominante", generalmente se selecciona para la ovulación de un

ovocito plenamente competente de cada ciclo, mientras que los otros folículos

antrales seleccionados son los “folículos subordinadas” y sufren atresia. El

reclutamiento cíclico es estrictamente dependiente de la gonadotropinas. FSH

juega un papel determinante en la diferenciación de las células de la granulosa

y la supervivencia. Estas acciones están mediadas o moduladas de manera

importante por factores paracrinos, en particular esteroides y factores de

crecimiento (Broer et al., 2014)

b. Activación de los folículos primordiales

La activación de los folículos primordiales implica un cambio

conformacional en las células de la granulosa, es decir, pasan de ser células

aplanadas o escamosas a cúbicas. Algunos folículos completan la división

meiótica y se desarrollan los folículos secundarios alrededor del final de la

primera semana postnatal. Por el contrario, en las especies de interés más

práctico, como los rumiantes domésticos y los seres humanos, la detención

meiótica, la formación del folículo, y el inicio del crecimiento del folículo, se

produce antes del nacimiento y es mucho menos sincrónica que en los

roedores (Pepling, 2006).

14

La capacidad de los folículos para ser activados está vinculado con la división

celular del ovocito (profase I de la meiosis). Los efectos inhibidores del

estradiol sobre la activación de folículo se correlacionan con la inhibición de

la progresión de la profase I. Ovarios bovinos fetales en fase meiótica

producen hormonas esteroides y la producción varía considerablemente

durante la gestación y en un patrón consistente con la hipótesis de que inhiben

la formación del folículo y la capacidad de los folículos recién formadas para

ser activados in vivo (Fortune et al. 2013). La activación de los folículos

primordiales es un proceso altamente regulado y dinámico con comunicación

bidireccional entre el ovocito y el compartimento somático (Zhang et al.,

2014).

La hormona Anti-Mülleriana (miembro de la superfamilia de los TGF)

producido en las células de la granulosa de folículos en estados tempranos

(Durlinger et al., 2002). Esta hormona tiene un papel importante durante la

foliculogénesis: durante el reclutamiento continuo inhibe la transición de los

folículos primordial a folículos primarios, mientras que en la fase de

reclutamiento cíclico es un antagonista a la capacidad de respuesta de la FSH

(Pelosi et al., 2015).

Figura 4. Citoquinas y factores de crecimiento en la señalización durante la transición entre

folículo primordial- folículo primario. Las flechas verdes son promotores del desarrollo y

las flechas rojas son inhibidores de la activación del folículo. Abreviaturas: AMH, Hormona

15

Anti-Mülleriana; BMP, proteína morfogenética ósea; FGF, factor de crecimiento de

fibroblastos; GDF, factor de diferenciación de crecimiento; GDNF, factor neurotrófico

derivado de la glia; KGF, factor de crecimiento de queratinocitos; KL, ligando KIT; LIF,

factor inhibidor de leucemia; SDF, el factor derivado de células del estroma. Figura tomado

de McLaughlin y Mclver, 2009

2.3.3 RESERVA DE FOLÍCULOS ANTRALES

El desarrollo de los folículos primarios hasta folículos con pequeña cavidad antral

involucra crecimiento en volumen del ovocito así como el aumento en el número de

células de la granulosa y células tecales (Monniaux et al., 2014). Estos procesos están

regulados, inicialmente, por factores de crecimiento y proteínas de señalización las

cuales participan en la interacción ovocito-células somáticas de los alrededores lo

que conlleva a un buen desarrollo del folículo (Eppig, 2001). En todos mamíferos,

la cavidad antral se forma cuando el folículo en crecimiento alcanza un diámetro

entre 200 y 300 µm, este crecimiento se da por la acumulación del fluido derivado

de la sangre que fluye a través de los capilares de la teca y productos de secreción de

las células foliculares (hialuronanos y proteoglicanos) generando así una gradiente

osmótica que participa en el crecimiento del antro (Rodgers e Irving-Rodgers, 2010).

Los folículos dependientes de gonadotropinas adquieren un diámetro folicular

determinado, específico de cada especie: 200 µm en roedores, 1 mm en el cerdo, 2

mm en el ganado ovino, de 3 a 5 mm en los seres humanos y vacas, y alrededor de

10 mm en el caballo (Monniaux et al., 1997). Por debajo de este diámetro, los

pequeños folículos antrales constituyen un grupo de folículos de gonadotropina-

sensibles, que es la reserva para la ovulación y biotecnologías de ovario.

Una vez que el folículo adquiere receptores funcionales de FSH, estos pueden

responder a las gonodotropinas para luego seguir procesos de maduración y

prepararse para la ovulación. Sólo una pequeña cantidad de folículos ováricos

sobreviven al proceso de maduración, la mayor parte se pierde por el camino en un

proceso de muerte celular programada denominado atresia (Johnson, 2003).

a. Crecimiento de folículos independientes de gonadotropinas

Desde la foliculogénesis temprana hasta la etapa de folículos pre-antrales

parece estar dirigido por señales dentro del ovario y es independiente de la

estimulación con gonadotropinas. También hay comunicación dentro del

16

ovario entre oocitos, granulosa y células de la teca (Parker y Schimmer,

2006). Los miembros de la superfamilia Factor de crecimiento transformante

beta (TGF-B) intervienen activamente en el crecimiento del folículo. Entre

ellos, GDF9 y BMP15 tienen funciones similares, implicadas en la progresión

de la maduración del folículo (Yan et al., 2001). La ablación de GDF9 en

ratones provoca un bloqueo en el crecimiento del folículo en la estadio

primario ocasionando una posterior infertilidad (Yan et al., 2001). Además,

GDF9 induce activamente la proliferación de células de la granulosa;

formación de las capas de la teca y la biosíntesis de andrógenos por parte de

estas (Solovyeva et al, 2000). Por el contrario, la ablación de BMP15 en el

ratón no da como resultado la infertilidad, sin embargo, los ratones son

subfértiles, tienen un tamaño reducido de la camada, y muestran un deterioro

de la ovulación y la fertilización, lo que sugiere un papel predominante de

BMP15 en el período peri-ovulatoria (Yan et al., 2001).

b. Formación de folículos dependientes de gonadotropinas

La regulación del crecimiento folicular, después del crecimiento del folículo

antral, es un proceso dependiente de gonadotropinas que ocurre después de la

pubertad y que corresponde a la iniciación de las ondas foliculares, selección

de folículos dominantes y maduración de los folículos pre-ovulatorios

(Monniaux et al., 1997). Las gonadotropinas secretadas por la glándula

pituitaria desarrollan un complejo sistema de alimentación/ retroalimentación

con los ovarios, conocido como el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas, lo que

permite a los folículos crezcan más allá de las etapas de pre-antrales

tempranas (Rajkovic et al., 2006). La maduración de los folículos ováricos a

un estado preovulatorio abarca no sólo un aumento explosivo de la

proliferación de células de la granulosa contenidas en el folículo, sino también

la diferenciación celular. Como consecuencia, el folículo desarrolla un antro

lleno de líquido (Rodgers e Irving-Rodgers, 2010).

Entre los marcadores para la formación del antro, tenemos: expresión de la

subunidad α de la hormona inhibina, que tiene una expresión de

retroalimentación negativa hacia la glándula pituitaria anterior reprimiendo

de esta manera la producción de FSH (Woodruff et al., 1987); aumento de la

producción de estrógenos que resulta en gran medida debido a la expresión

17

de la proteína P-450 aromatasa (aromatasa), enzima que convierte la

testosterona a estrógenos; aumento de la expresión de deshidrogenasa 3β-

hidroxiesteroide involucrada en la conversión de colesterol en pregnenolona,

y aumento de la expresión de receptores de membrana para la hormona

leutinizante (LH) necesario para la ovulación (Park et al., 2004).

2.4 EVALUACIÓN DE LA RESERVA OVÁRICA

La evaluación de la reserva ovárica puede ser realizada por dos métodos diferentes: ecografía

ovárica que proporciona estimaciones precisas de número de folículos antrales, y la medición

de los marcadores endocrinos que dan una estimación indirecta del tamaño de la reserva.

2.4.1 CONTEO DE FOLÍCULOS ANTRALES (AFC)

El conteo de folículos antrales es un método directo para cuantificar la cantidad de

folículos con cavidad antral. Ireland et al. (2008) mostraron que el AFC está

positivamente relacionado con el número de folículos y ovocitos sanos en los ovarios

de vacas. La población de pequeños folículos antrales se mantiene en un equilibrio

dinámico, con salidas numéricamente compensadas por las entradas, y el tamaño de

equilibrio de esta reserva dinámica es específica de cada individuo (Burns et al.,

2005; Rico et al., 2012).

AFC ha sido utilizado para predecir la respuesta ovárica de un individuo a

tratamientos a base de gonadotropinas, por tanto, es una herramienta muy utilizada

en la biotecnología de producción de embriones de granja (Broer et al., 2014).

2.4.2 MARCADORES ENDOCRINOS

Se han utilizado diversos marcadores basados en la expresión de determinadas

proteínas y su correlación con la reserva ovárica de folículos en crecimiento. La

inhibina B y la AMH son ejemplos de medidas directas, ya que se producen durante

el desarrollo folicular, independientemente de la estimulación folicular. Medidas

indirectas incluyen FSH, LH y estradiol las cuales se basan en la producción de otras

hormonas a través de un proceso de realimentación (Monniaux et al., 2014).

a. Concentraciones de hormona folículo estimulante (FSH)

18

FSH, también conocida como folitropina, es una hormona glicoproteíca que

consta de dos subunidades distintas: una subunidad α presente también en

hormonas glicoproteicas relacionadas como la LH. FSH se produce en células

gonadotrópicas de la pituitaria anterior, y su síntesis y secreción está regulada por

señales neurales y gonadales (Padmanabhan et al., 2002)

FSH es esencial para la foliculogénesis, especialmente para el crecimiento de los

folículos antrales durante las ondas foliculares en el ganado. La glándula pituitaria

produce la FSH que estimula el crecimiento del folículo. Niveles de FSH son

mínimos al comienzo del ciclo estral y luego aumentan. Esto hace que crezca un

folículo y que madure el ovocito que contiene. A medida que esto ocurre, el

folículo libera estradiol. A su vez, estos niveles mayores de estradiol inducen a la

glándula pituitaria que produzca menos FSH (Kumar et al, 1999).

Al evaluar la población de folículos dominantes durante la onda folicular en

vacunos, se observa que el número está correlacionado positivamente con las

concentraciones séricas de la FSH (López et al., 2005). Sin embargo, Ireland et

al., 2007 mostraron que las concentraciones séricas de FSH se asocian

inversamente con el número de folículos totales durante la onda en novillas.

Asimismo, numerosos estudios reportan que el aumento de la concentración sérica

de FSH está asociados con el agotamiento de la reserva ovárica, disminución de

la capacidad de respuesta a la estimulación de gonadotropinas, reducción en el

éxito de la FIV o disminución de la fertilidad durante el envejecimiento ovárico

en las mujeres (Scheffer et al, 2003) y en bovinos (Malhi et al,. 2005).

La desventaja de utilizar FSH como un indicador de la reserva ovárica, es su alta

variabilidad durante la onda folicular. Kwee et al., 2004 mostraron que en mujeres

las mediciones de FSH son muy variables intra e inter-ciclo estral. En mujeres con

un ciclo regular, la concentración de FSH puede servir como predictor de la

reserva ovárica, sólo si tiene niveles muy altos de esta hormona, por tanto como

una prueba de asesoramiento solo será útil para un porcentaje bajo de mujeres

(Broekmans et al., 2006)

b. Concentraciones de hormona Inhibina

La inhibina es una glicoproteína heterodimérica secretada por los folículos en

crecimiento. Tienen una acción paracrina y la forma activa tiene un peso

19

molecular de 30 kDa. La secreción de la FSH por la pituitaria es regulada por

la acción de las inhibinas mediante la via inhibina-activina-folistaina (Knight

2012).

Dos formas de inhibina han sido identificadas (Robertson et al., 2012). La

inhibina A, secretada principalmente por los folículos dominantes y el cuerpo

lúteo. Las concentración no se mantienen constantes durante el ciclo estral,

van variando a lo largo de la onda folicular y está relacionado al crecimiento

del folículo dominante (fase folicular) y al patrón de la progesterona (fase

luteal) (Robertson et al., 2012). Se ha demostrado una relación recíproca entre

la inhibina A y el FSH en el suero (Welt et al., 1997) a través de la transición

luteal-folicular.

La inhibina B por el contrario, es el producto de los folículos en desarrollo

temprano. Sus niveles están elevados tempranamente en la fase folicular del

ciclo estral, disminuyen a través de la fase folicular tardia, ovulatoria y luteal

del ciclo. Sin embargo, en contraste con la inhibina A, se observó una relación

inversa entre la inhibina B y la FSH, en particular en la fase folicular

(Robertson et al., 2009 y Welt, 2002).

Inhibina B es utilizado para evaluar la reserva ovárica, en mujeres con valores

muy bajos se correlaciona con pobres respuestas a la superovulación y una

pérdida de éxitos de fecundación (Frattarelli et al., 2000). También se observa

que una disminución de la inhibina B probablemente precede al aumento de

la concentración de FSH (Lee et al., 2008). En los niveles de umbral muy

bajos, la exactitud en la predicción de una respuesta pobre y no embarazo es

sólo moderado (Lie et al., 2012) y por lo tanto su uso rutinario no se puede

recomendar.

c. Concentración de hormona Anti Mülleriana (AMH)

La hormona Anti-Mülleriana, también llamada sustancia inhibidora de

Müller (MIS), es una glicoproteína homodimérica unida por puentes

disulfuro, formándose de esta manera en una estructura dimérica con un

peso molecular de 140 kDa (Cate et al., 1986). AMH se somete a un

procesamiento proteolítico en un sitio de escisión monobásico para generar

20

un dímero de 110 kDa N-terminal y un dímero de 25 kDa C-terminal

(Pepinsky et al., 1988).

AMH es un miembro de la familia factor de crecimiento transformante β

(TGF β) (Visser et al., 2001). La homología de AMH con otros miembros

de esta familia está restringido al fragmento C-terminal, el dominio

bioactivo de la molécula (MacLaughlin et al., 1992). Como otros

miembros de esta familia, el dominio C-terminal de AMH interactúa con

un complejo receptor quinasa transmembrana de serina/treonina, que

contiene componentes de tipo I y de tipo II. El receptor de tipo II,

AMHRII, se ha identificado claramente y es específico del AMH (di

Clemente et al., 1994). Las mutaciones dentro del dominio C- terminal de

AMH afectan la unión de AMH a su receptor afectando de esta manera la

correcta señalización (Belville, et al 2004).

La hormona Anti Mülleriana se sintetiza en las gónadas de una gran

variedad de especies como el pescado (Western et al. 1999), anfibios

(Kodama et al. 2015), aves (Smith et al. 1999), reptiles (Western et al.,

1999,), marsupiales (Juengel et al. 2002) y mamíferos euterios (Josso et

al. 1993). En todas estas especies, la producción de AMH es de las células

que nutren, protegen y regulan las células germinales: las células de Sertoli

de los testículos y las células de la granulosa del ovario. Esto sugiere que

la AMH tiene papeles antiguos en la filogenia como un regulador de las

células germinales (Morinaga et al. 2007).

Durante la foliculogénesis, AMH se expresa en las células de la granulosa,

inmediatamente después de reclutamiento inicial y continúa aumentando

hasta que alcanzan la etapa de folículos pre-antrales y pequeños antrales.

A partir de entonces, la expresión de AMH disminuye y se convierte en

indetectable durante el reclutamiento cíclico (Visser et al., 2012). La

expresión de AMH está ausente en los folículos atrésicos, y en particular,

se considera un inhibidor de intra-ovario de atresia folicular (Visser et al.,

2007).

AMH actúa para inhibir la transición de folículos primordiales a folículos

primarios, manteniendo de esta manera la reserva de folículos primordiales

21

(Visser y Themmen, 2005). El uso de sistemas de cultivos in vitro, en el

desarrollo folicular de ratón, ha informado que la AMH inhibe el

crecimiento del folículo estimulada por FSH, mediante la disminución de

la sensibilidad de los folículos ováricos a la FSH (Figura 5) (Durlinger et

al., 2002 y Visser y Themmen, 2014).

Figura 5. AMH es secretada por folículos pre-antrales (líneas discontinuas) y

antrales (líneas continuas). Se ha postulado que inhibe el reclutamiento de

folículos primordiales (a: reclutamiento inicial) y el crecimiento de folículos FSH-

dependientes (b: reclutamiento cíclico). (Figura tomada de Broekmans et al.,

2008, modificaciones de Visser et al., 2005).

La señalización de los miembros de la familia TGFβ se realiza mediante un

complejo receptor quinasa tipo serina/treonina (Visser et al., 2001) que

consiste de un receptor tipo II de ligando específico y receptores tipo I más

generales, conocidos como proteínas quinasas similares al receptor de

activina (ALKs) (Kevennaar et al., 2006). El complejo receptor activado

fosforila y activa proteínas Smad. La señalización downstream (aguas abajo)

de AMH es mediada a través Smad1, Smad5 y Smad8. Tras la activación de

estos Smads específicos del receptor, se forma un complejo común con

Smad4, que se transloca al núcleo y regula la transcripción de genes

(Gouedard et al., 2001) (Figura 6). Aunque todos los miembros de la familia

TGFβ comparten este mecanismo molecular, existen dos modos distintos de

señalización, uno representado por la TGFβs y activinas y el otro por las

BMPs, GDFs y AMH (Clarke et al., 2001). Para AMH, ha sido identificado

un receptor tipo II (AMHRII) y se ha demostrado ser específica y necesaria

22

para la señalización de AMH (Baarends et al., 1995). La función canónica

de los receptores tipo II es la activación de los receptores tipo I, que inician

la señalización downstream (aguas abajo) (Moustakas y Heldin 2009).

Figura 6. Vía de señalización de la AMH, propuesta por Visser et al., 2005. AMH activa

Smad1, Smad5 o Smad8 a través de un complejo receptor que contiene AMHRII y ALK2,

ALK3 o ALK6. Tras la activación de las Smads específicos del receptor (R-Smads), se forma

un complejo con el Smad4. Este complejo se transloca al núcleo y regula la transcripción de

genes.

La concentración de la hormona anti-Mülleriana (AMH) es el mejor marcador

endocrino para la población de pequeños folículos antrales tanto en los seres

humanos (La Marca et al., 2010), así como en rumiantes (Rico et al., 2009;

Lahoz et al., 2012; Monniaux et al., 2014). La estrecha relación existente

entre el conteo de folículos antrales y la concentración plasmática de la AMH

(Broer et al., 2011) se explica por el hecho de que la expresión de AMH está

estrictamente restringida a las células de la granulosa de folículos en

crecimiento, es decir en células de la granulosa del folículo preantal más

grande y del folículo antral más pequeño (Pelusso et al., 2014).

2.5 NUTRICIÓN Y RESERVA OVÁRICA.

Las alteraciones en la nutrición durante los períodos críticos de gestación afectan el

crecimiento, fisiología y metabolismo de la descendencia en la vida posnatal (McMillen et

23

al., 2001). Impactos de la restricción de nutrientes durante la primera mitad de gestación en

ovejas influyen en la reducción del crecimiento fetal, mala calidad de la lana y aumento de

la presión sanguínea (Vonnahme et al., 2006) Además los efectos de la nutrición durante el

embarazo sobre el desarrollo vital de la descendencia, han sido relacionados principalmente

a enfermedades como hipertensión, diabetes, obesidad y enfermedades renales (Langley-

Evans, 2006).

Estos trabajos sirvieron de base para que Robinson et al. (2006) detallaron un resumen de

los efectos nutricionales sobre la calidad de ovocitos. En el cual se muestra que una

desnutrición materna durante el desarrollo del pool de folículos primordiales compromete

todo el crecimiento folicular. La desnutrición en este momento reduce el número de folículos

que emergen y por lo tanto el número disponible de folículos a ovular. Mossa et al. (2013)

vinculan la desnutrición materna transitoria con una reserva ovárica disminuida, así como el

potencial de fertilidad subóptimo, independiente de las alteraciones en el peso al nacer o el

crecimiento postnatal (Fortune et al., 2013).

24

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 LUGAR

El estudio se realizó en dos regiones de la Sierra del Perú, Pasco (Pasco, Ninacaca,

Camal Municipal de Ninacaca) a una altitud de 4 141 m.s.n.m. (10°51'42'‘ -76°06'47'‘)

con temperatura promedio de 6.1°C y precipitaciones de 0 a 2.50 mm; Puno (Melgar,

Umachiri, Centro de Investigación y Producción Chuquibambilla) a una altitud de 3974

m.s.n.m. (70°47’50°O – 14°47’37°S) con temperaturas promedios máxima y mínima de

18.5 y -8°C respectivamente, con precipitaciones de 0 a 2.10 mm.

El procesamiento de muestras se llevó a cabo en el laboratorio de Inmunología de la

Universidad Peruana Cayetano Heredia.

3.2 ANIMALES

La recolección de muestra se realizó en dos etapas, la primera consistió en colectar

ovarios y plasma de alpacas del camal municipal de Ninacaca (Pasco) de alpacas

sacrificadas; y la segunda, colectar muestras de plasma de alpacas vivas después de la

sincronización de la onda folicular.

Los ovarios (n=40) se colectaron post-mortem de alpacas con 4 dientes y condición

corporal de 3.5 (escala 1-5). Los ovarios seleccionados debían tener folículos en

crecimiento, y en caso de presentar cuerpo lúteo se descartaron del estudio.

Los animales utilizados durante la sincronización folicular (n=15) fueron mantenidos en

las instalaciones de la CIP Chuquibambilla (Universidad Nacional del Altiplano-Puno).

Fueron seleccionados teniendo en cuenta los siguientes criterios: que no se encuentren

gestando, mayores de tres años, adecuado tamaño y apariencia no patológica del tracto

reproductivo al examen rectal. Los animales se mantuvieron en pastoreo sobre pastura

natural.

25

3.3 MATERIALES

3.3.1 Equipos

- Microscopio óptico

- Cámara para microscopio

- Lectora Elisa

- Micrótomo

- Estufa

- Balanza electrónica

- Centrifuga

- Vortex

- Agitador de microplacas

- Ecógrafo

3.3.2 Reactivos e insumos

- Agua bidestilada

- Suero de burro (Abcam)

- Ovoalbumina de pollo (Sigma)

- Buffer fosfato tamponado PBS (Merck Millipore)

- Etanol absoluto (Merck Millipore)

- Xilol (Merck Millipore)

- Paraformaldehido (Merck Millipore)

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- Hematoxilina (Merck Millipore)

- Eosina (Merck Millipore)

- Tween 20 (Sigma)

- Triton X-100 (Sigma)

- Entellan (Merck Millipore)

- Citrato de sodio (Sigma)

- Peróxido de hidrógeno 30 % (Sigma)

- Buseralina 0.08mg/ml (Conceptal)

- Anticuerpo policlonal anti-AMH en cabra (Santa Cruz Biotecnology)

- Anticuerpo anti-cabra IgG-Biotinilado en burro (Santa Cruz Biotecnology)

- Estreptovidina marcado con HRP (KPL)

- Kit AMH ELISA rata/ratón (AnshLab)

- 3,3-diaminobencidina DAB (DAKO)

- Poli-L-lisina (Sigma)

- Parafina sintética (Paraplast)

- Castetes de inclusión.

- Micropipetas (2-200 ul)

- Tubos falcon (15 y 50 ml)

- Vaso de precipitado

- Láminas portaobjetos

- Laminillas cubreobjetos

- Cuchillas para micrótomo (Leica)

- Tubos vacutainer con EDTA (BD)

- Microviales de 2 ml (Corning)

- Tubos de 1.5 ml (Axis)

- Aguja de calibre 20´´ x 1 pulgada.

3.4 ESTUDIOS REALIZADOS

3.4.1 ESTUDIO I: VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA LA MEDICIÓN

DE CONCENTRACIÓN DE AMH EN PLASMA DE ALPACAS

Para validar el ensayo de AMH plasmática en alpacas, se evaluó el paralelismo

de diferentes concentraciones de AMH (Ireland et al., 2008) presentes en el

plasma de alpacas hembra (pool n= 5), en el líquido folicular de ovarios en

27

crecimiento de alpacas hembra (pool n= 5), en el plasma de alpacas macho

castrados (pool n= 5) y en el plasma de rata hembra (pool n=5), con la curva

estándar de AMH.

3.4.2 ESTUDIO II: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE AMH

DURANTE LA ONDA FOLICULAR

Para observar si existe variaciones variación en la concentración de la hormona

Anti-Müleriana durante la dinámica folicular de la alpaca, se realizó la

sincronizóación de la onda folicular con la utilización deusando una dosis única

de la hormona análoga a GnRH, que induciráinductora de ovulación en animales

que tiene folículos dominantes mayores a 7 mm (Vaughan et al., 2004),). Para

ello se utilizaráon alpacas mayores de 3 años (n=8) de la CIP Chuquibambilla

(Universidad Nacional del Altiplano-Puno) a las que se les fueron colectadas

muestras dey la sangre fue colectada cada 3 días, durante el periodo de12 días

(después de la colocarción de la hormona), o hasta que el nuevo folículo

dominante alcance el diámetro >7 mm.

3.4.3 ESTUDIO III: CORRELACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE AMH Y

EL CONTEO DE FOLÍCULOS ANTRALES

Se utilizó ovarios de alpacas sacrificadas en camal (n=35), de las cuales por

histología se obtuvo el total de folículos antrales. Folículos antrales son aquellos

que tienen 3 o más capas de células de la granulosa y tienen una cavidad antral

(Cahill et al., 2009). El conteo de folículos antrales (CFA) por par de ovarios se

determinó para cada animal. Se dividió en dos grupos: Hembras con un alto (A-

Alto) o bajo (B-bajo) número de folículos antrales.

El número de folículos por grupo (A-Alto o B-Bajo) se define mediante el número

medio de folículos antrales por animal ± 1 Desviación estándar (Silva-Santos et

al., 2014). Los animales con un CFA intermedio, fueron eliminados para obtener

un análisis más detallado.

Alpacas con CFA-Alto (A-Alto) = µ +1

Alpacas con CFA-Bajo (B-Bajo) = µ-1

Donde µ: es la media de folículos antrales contados de toda la población

estudiadada.

28

Las muestras de plasma correspondiente a los animales de cada grupo se

seleccionaran y se observó si el tipo de correlación existente.

3.4.4 ESTUDIO IV: EXPRESIÓN DE LA HORMONA AMH EN LOS

FOLÍCULOS EN CRECIMIENTO

Se evaluó ovarios obtenidos de alpacas sacrificadas en camal (n=15), se utilizó cortes

de ovarios de 6 micras de folículos en diferentes estadios, para determinar si la expresión

de AMH está restringida a las células de la granulosa de folículos en crecimiento u otros

tipos de folículos. De acuerdo a la disposición de las células de la granulosa y contenido

de los folículos (Ireland et al., 2008), se dividirá en los siguientes grupos:

- Grupo a: Folículos primordiales, ovocito compacto rodeado de una sola capa de

células de la granulosa aplanadas.

- Grupo b: Folículos preantrales, ovocito rodeado por más de unacapa de células de

la granulosa cúbicas.

- Grupo c: Folículos antrales, ovocito rodeado por 6 o más capas de células de la

granulosa cúbicas con una teca interna formando la cavidad antral.

3.5 DEFINICIONES OPERACIONALES

3.5.1 COLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

a. Ovarios

Los ovarios fueron colectados inmediatamente después del sacrificio del animal.

Se realizaron las medidas de longitud, altura y profundidad; y el peso de cada

uno. Luego se fijaron en paraformaldehido al 4%, y, 24 horas más tarde se

lavaron con agua corriente para luego colocarse en etanol al 70%.

Los ovarios se reducen a la mitad longitudinalmente y se colocaron en casetes,

los casetes se pasan automáticamente por etanol al 90%, 96%, absoluto y xilol

para la eliminación del fijador, deshidratación y la posterior inclusión en parafina

sintética (Histosec® pastillas Merck) a 56 y 57 ºC. A continuación, se elaboraron

los bloques de tejidos en parafina utilizando una unidad formadora. A partir de

los bloques se obtuvieron secciones de tejido en parafina de 6µm de grosor

29

mediante un microtomo de rotación (Leica). Para la tinción con hematoxilina y

eosina (H-E), y la posterior inmunohistoquímica, las secciones se desparafinaron

en Xilol y siguieron un proceso de hidratación pasando por una serie de alcoholes

de gradación decreciente hasta el agua.

b. Plasma

El plasma se recuperó a partir de la sangre venosa colectada inmediatamente

después del sacrificio del animal y colocandose en tubos vacuteiner con EDTA

de 4 ml. En el caso de animales vivos, la sangre se obtuvo mediante punción de

la vena yugular externa en tubos vacutainer de 4ml con EDTA y una aguja de

calibre 20´´ x 1 pulgada, con una frecuencia de cada 3 días durante 15 días.

Las muestras de sangre se centrifugaron (Centrifuge PLC, Gemmy Industrial) a

3000 rpm x 15 min, separando los glóbulos rojos del plasma sanguíneo. A

continuación, el plasma se extrae del tubo de recogida de sangre y se deposita en

un microvial (Corning® de 2ml), se rotulan y guarda en nitrógeno líquido para

el posterior transporte. Se guardó las muestras de plasma en congeladoras a -

20°C.

3.5.2 SINCRONIZACIÓN DE LA ONDA FOLICULAR.

Se realizaron observaciones ecográficas cada 24 horas a los 20 animales seleccionados

desde dos días antes de la selección para la aplicación hormonal (Día 0). Para ello, se

utilizó ecografía transrectal usando un ecógrafo portátil modelo Medison SV 600 con

transductor lineal de 7.5 MHz de frecuencia, seleccionando 10 alpacas que presenten

folículos con tamaño ≥7 mm de diámetro, y sin la presencia de cuerpo lúteo en ninguno

de los ovarios.

Posteriormente, las alpacas con un folículo dominante recibieron una dosis única de 8µg

de Buserelina (Conceptal®, 1 ml contiene 0.0042 mg de acetato de Buserelina) a las

5:00 am y 24 horas después para inducir la ovulación, la ovulación fue confirmada por

ultrasonografía transrectal. Todas las alpacas seleccionadas fueron evaluadas cada 3 días

empleando ultrasonografía transrectal a fin de seguir la onda folicular, hasta que se

observe un nuevo folículo de 7 mm en cualquiera de los ovarios.

Al inicio del presente trabajo, se separaron 20 alpacas adultas con edad media de 3.72

años y una condición corporal media de 3.43. Se realizó el ultrasonido para observar

30

cuales presentan el folículo dominante. El 75 % de alpacas (15/20) presentaron folículo

dominante (>7 mm), las cuales ingresaron al estudio. Para sincronizar la onda folicular,

los 15 animales seleccionadosrecibieron una dosis única de Buseralina a las 6 a.m. del

día 0 para la sincronización del ciclo. De las 15 alpacas con tratamiento hormonal,

respondieron correctamente al análogo de gonadotropinas 12 (80%), esto se observoó

mediante una nueva ecografía a las 48h post inyección hormonal. Estas 12 alpacas

fueron evaluadas por ultrasonido cada 3 días hasta que presenten nuevamente el folículo

dominante (> 7mm). Al momento del ultrasonido se extrajo 10 ml de sangre en tubos

bacuteirner con EDTA. Al día doce después del tratamiento con el análogo de

buseralina, 8 de las 12 alpacas presentaron nuevamente un folículo dominante.

3.5.3 VISUALIZACIÓN DE FOLÍCULOS ANTRALES POR HISTOLOGÍA:

Después de la inclusión de los ovarios en parafina, se cortaron en un micrótomo (Leica)

en un espesor de 4 µm y todas las secciones se montaron en láminas con Poly-l-lisina.

Se tiñeron con la tinción de Hematoxilina-Eosina.

Protocolo de tinción con Hematoxilina-eosina a temperatura ambiente (Lillie et al.,

1974):

- En primer lugar, se colocó las secciones de tejido en el portaláminas en una

estufa a 56°C durante 20 minutos.

- Se desparafinó las secciones mediante 4 cambios de xileno, 2 minutos cada

uno.

- Se hidrató con 2 cambios de etanol 100% durante 3 minutos cada uno, luego

por etanol al 95% y 80% durante 1 minuto cada uno. Luego se enjuagó con

agua destilada.

- La tinción se realizó con Hematoxilina (Merck Milllipore) por 2 minutos.

Inmediatamente después, se lavó con abundante agua de caño por 5 min.

- Las secciones fueron colocadas por 30 segundos en alcohol ácido al 1%, y

después se lavó con agua corriente por 1 min.

- Luego las secciones fueron colocadas por 30 segundos en agua amoniacal 0,2%

y se lavó con agua corriente por 5 min.

- Las secciones fueron colocadas por 2 min. en etanol 90% y luego en eosina

alcohólica al 1% por 30 segundos.

- Las secciones fueron deshidratas con cambios de etanol 80%, 90%, 96% y

Absoluto por 1 minuto cada uno. Se deja secar.

31

- Las secciones se colocan por 3 min en xilol y se montan con una gota de xiilol-

entellan 1:1 por lámina y se cubren con cubreobjetos.

Se observó al microscopio óptico, y clasificó según su morfología. Los folículos se

clasificaron de la acuerdo a estudios publicados anteriormente (Cushman, 1999). El

nucleolo del ovocito se utilizó como marcador para cada folículo para evitar contar dos

veces los folículos. Folículos antrales son aquellos que tienen 3 o más capas de células

de la granulosa y tienen una cavidad antral (Cahill et al., 2009).

Los folículos fueron considerados degenerados o atrésicos si tenían uno o más de los

siguientes aspectos: un núcleo de ovocito condensado, un ovocito encogido, cuerpos

picnóticos en las células de la granulosa y baja densidad celular. Sobre la base de estos

parámetros, se evaluaron morfológicamente sólo folículos sanos (Lucci et al., 2002)

3.5.4 ENSAYO HORMONAL:

Las concentraciones plasmáticas de AMH (ng/ml) se cuantificaron utilizando el kit

comercial de inmunoensayo (AnshLabs rata/ratón AMH ELISA AL-113. Webster, TX),

el cual fue validado en el presente estudio. El ensayo tuvo un rango analítico de 0.23 a

15 ng/ml (catálogo del producto). Las muestras y reactivos del Kit se descongelaron y

atemperaron a 25°C. Los estándares, las muestras (plasma de alpaca) y el control

negativo (plasma de alpacas macho castrados) se realizaron por duplicado. El kit de

inmunoensayo es de tipo sándwich cuantitativo de tres pasos y se realizó según

indicaciones del fabricante.

En primer lugar, se coloca 50 ul de la muestra, estándares y el control negativo en los

pocillos de las placas de microtitulación las cuales están recubiertas del anticuerpo anti-

AMH inmovilizado. Luego se agrega 50 ul de buffer de ensayo a cada pocillo. Las

placas se incubaron con agitación de 600 rpm en un agitador de microplacas por dos

horas a temperatura ambiente (25°C). Después de la primera incubación las placas se

lavaron con la solución de lavado. Se añade 100 ul de solución con anticuerpo anti-

AMH biotinilado. Las placas se incubaron con agitación de 600 rpm por una hora a

temperatura ambiente. Luego de la segunda incubación y posterior lavado, los pocillos

se incuban con 100 ul de solución que contiene estreptovidina conjugada con HRP

(horseradish peroxidase). Las placas se incubaron con agitación de 600 rpm por 30

minutos a temperatura ambiente. A continuación de la tercera incubación y del lavado,

32

los pocillos se incubaron 100 ul de solución TMB (Tetramethylbenzidine) en un buffer

con peróxido de hidrógeno. Las placas se incubaron con agitación de 600 rpm por 10

minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 100 ul de solución de

detención (solución ácida) a cada pocillo y se determinó la absorbancia en un Lector

Elisa a 450 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la concentración

de AMH en las muestras y estándares (AnshLabs, 2014).

3.5.5 INMUNOHISTOQUÍMICA DE AMH.

Se utilizó una de las seccione fijadas del ovario, descritas anteriormente. Se realizó el

siguiente procedimiento:

- En primer lugar, se colocó las secciones de tejido en el portaláminas en una estufa

a 56°C durante 40 minutos.

- Se desparafinó las secciones de tejido en las portaláminas mediante 2 cambios

de xileno, 5 minutos cada uno.

- Se hidrató con 2 cambios de etanol 100% durante 3 minutos cada uno, etanol al

95% y 80% durante 1 minuto cada uno. Luego se enjuagó con agua destilada.

- Precalentar en un vaso de precipitado, 600 ml de buffer citrato de sodio (0.01 M,

ph=6) hasta que la temperatura llegue a 84 °C. Se sumergió los portaobjetos con

las secciones de tejido y se incubó durante 15 minutos.

- Se retiró el vaso de precipitado que contiene los portaobjetos y se dejó enfriar por

1h.

- Las secciones fueron lavadas con solución tamponada de fosfato (PBS ph=7.3)

tres veces por 5 min cada uno.

- Las secciones fueron incubadas con 3% de peróxido de hidrógeno en metanol,

durante 30 min, para bloquear la peroxidasa endógena.

- Después de lavar 3 veces (5 minutos cada uno) con PBS, las secciones se

incubaron con 0.1% de ovoalbúmina de pollo y 5% de suero de burro en PBS-

tritón 0.05% durante 1h para bloquear las uniones no específicas.

- Las secciones fueron lavadas con PBS cuatro veces por 5 min cada uno.

- Después incubar con un anticuerpo primario policlonal cabra anti-AMH (sc-6886,

Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) con una dilución de 1:500

en PBS-triton 0.05% y 10% suero de donkey, durante la noche a 4 °C. El control

se incubará sin la presencia de anticuerpo primario.

33

- Las secciones fueron colocadas a temperatura ambiente y se lavaron con PBS

cinco veces por 5 min cada uno.

- Las secciones asignados para la detección de AMH se incuban con anticuerpo

secundario burro anti-cabra IgG-biotinilado (sc-2023, Santa Cruz de

Biotecnologías, Santa Cruz, CA) diluido 1:500 en PBS durante 1 h.

- Las secciones fueron lavadas con solución tamponada de fosfato (PBS) cinco

veces por 5 min cada uno. Luego se incubaron con estreptavidina marcado con

HRP (KPL) diluido 1:500 en PBS durante 1h.

- Finalmente las secciones fueron lavadas con solución tamponada de fosfato (PBS)

cinco veces por 5 min cada uno.

- La detección de AMH se realizó utilizando 0.1% de 3,3-diaminobencidina (DAB)

diluido en Buffer sustrato (Dako) durante 1 min. Luego de ver el marcaje se lavó

con abundante agua destilada.

- Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina, deshidratadas, y se montan

con una gota de xiilol-entellan 1:1 por lámina y se cubren con cubreobjetos.

Las secciones se analizaron y se puntuaron usando un microscopio Zeiss Axioplan 2

(Alemania). El análisis se realizó de acuerdo a lo reportado por Weenen et al., 2002 (en

humanos), Durlinger et al., 2002 (en ratones), Ball et al., 2008 (en equinos), Campbell

et al., 2012 (en ovejas), Uzumcu et al., 2006 (en rata), Polat et al., 2015 (en bovinos).

Estos reportes evalúan la intensidad relativa del marcaje de la AMH con respecto al

control.

Las células de la granulosa de cada folículo se puntuaron negativo (1) si ninguna tinción

estaba presente en comparación con secciones de tejido de control adyacentes. Si la

tinción estuvo presente sólo en algunas células de la granulosa, el folículo se anotó

`débilmente positivo" (2). Los folículos se puntuaron positivo (3) si la tinción específica

AMH estaba presente en casi todas o todas las células de la granulosa. Cuando las

células de la granulosa de un único folículo tiñeron mucho más fuerte que células de la

granulosa en otros folículos en el mismo portaobjetos, se puntúo este folículo

fuertemente positivo (4). Imágenes fueron tomadas con una cámara Pro Coolsnap y el

software ImageProâ Plus (Media Cybernetics, Inc., EE.UU.).

34

3.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Este es un estudio del tipo no experimental, transeccional descriptivo y es una

caracterización primaria, la cual consiste en la toma de datos solo por cada estudio, se

determinaron las medidas de tendencia central (promedio) y las medidas de dispersión

(desviación estándar, coeficiente de variación, valores máximos y mínimos).

Se utilizó un análisis de varianza para determinar las concentraciones de AMH, el número

de folículos en los ovarios, el peso del ovario y la longitud y altura ovárica diferían entre los

animales con diferentes conteo folicular durante la onda foliculare. La prueba de Turkey se

utilizó para determinar si existían diferencias estadísticas.

35

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Estudio I. Validación de la metodología para la medición de la concentración

de AMH en plasma de alpacas

Utilizando una serie de diluciones que partían de una concentración inicial de 21,5 ng/ml se

obtuvo la curva estándar correspondiente al Kit AnshLabs rata/ratón AMH ELISA AL-113.

A partir de estas diluciones, el valor máximo de densidad óptica fue de alrededor de 2,036.

El rango del AMH estándar usado es de 0.022- 2.036 ng/ml (Anexo I). El límite de

detección, definido como la media de las absorbancias del blanco + 2 Desviación estándar,

fue 0.039 ng/ml (Figura 7).

Figura 7. Curva estándar utilizada en la cuantificación de AMH, en el plasma sanguíneo de

alpacas.

Además el kit fue validado tomando como referencia los trabajos de Keveenar et al.(2005),

Ireland et al. (2008) y Nagashima et al. (2016) utilizando el paralelismo entre las

absorbancias de la curva estándar, y las diluciones seriadas de la muestra en estudio.

Como se observa en la figura 8, se encontró paralelismo en las concentraciones de AMH de

las diluciones seriales del plasma y líquido folicular de alpaca con la curva estándar del Kit

AMH ratón. La curva de dilución fue lineal para cada muestra (R2>0.99). Los niveles de

AMH fueron indetectables en el plasma sanguíneo de alpacas macho castrados (Anexo I).

36

Figura 8. Paralelismo en las curvas de las muestras diluidas. Los datos presentados son

resultado de las diluciones seriales de ( ) estándar; ( ) plasma de alpaca; ( ) líquido folicular;

( ) alpacas castradas.

El paralelismo entre las curvas señala que los anticuerpos utilizados en el ensayo de

inmunoabsorbancia ligado a enzimas (ELISA), presentes en el Kit AMH ratón, reconocen

de manera específica las moléculas de AMH del plasma sanguíneo de alpaca (Ireland et al.,

2008).

4.2 Estudio II: Determinación de la concentración de AMH durante la onda folicular

En la actualidad, es limitada la predicción y el control avanzado y preciso de los ciclos

reproductivos en las alpacas por ende el uso de tecnologías de reproducción asistida son

limitados; por tanto, es primordial evaluar el comportamiento de la concentración de la

AMH, durante la onda folicular. Por ello, se trabajó en un ambiente controlado, en el cual se

podía evaluar y seguir la onda folicular de las alpacas, al mismo tiempo que se extraía sangre

para su posterior evaluación.

0.0001

0.001

0.01

0.1

1

10

0.1 1 10 100

Ab

sorb

anci

a

ng/ml AMH

Validación de AMH

37

Al análisis conjunto, no se encontró variación entre las concentraciones de AMH durante la

onda folicular (Anexo II). Es decir, no se encontraron diferencias (P<0,01) en la

concentración de AMH a lo largo de los 12 días estudiados (Tabla 1).

Concentración de la hormona AMH durante la onda folicular en alpacas

Alpaca Variables Días de evaluación (Media ±ES)

0 3 6 9 12

n=8 [AMH] 1.605±1.2a 1.700±1.3 a 1.639±1.3 a 1.600±1.3 a 1.393±1.2 a

Tabla 1. Concentración de la Hormona AMH durante la onda folicular en alpacas. a. Letras iguales dentro de fila indican que las medias de concentración de AMH no son

significativamente diferentes (p<0,01) durante la onda folicular de alpacas.

Contrario a este estudio, en vacunos Rico et al., 2011 observaron cambios significativos en

la concentración sérica de AMH durante el ciclo estral; con un pico en el primer día de estro,

seguido de una disminución rápida a niveles básicos en el día 6, que luego aumentó

gradualmente hacia el subsiguiente estro. Paralelamente, algunos estudios realizados en

humanos, a sugieren una expresión estable a lo largo del ciclo menstrual (La Marca et al.,

2006 y Tsepelidis et al., 2007), mientras que otros muestran que las mujeres con AMH basal

más alta exhiben mayor variabilidad de AMH durante el periodo periovulatorio (Hehenkamp

et al., 2006, Sowers et al., 2010).

La circulación estable de la AMH encontrada en las alpacas, así como la variación observada

en los valores basales entre los individuos, enfatiza la necesidad de cuidado especial en el

uso de la AMH como marcador reproductivo.

4.3 Estudio III: Correlación de la concentración de AMH y el conteo de folículos

antrales

Una vez obtenido los valores de conteo de folículos antrales por cada animal (n=40). Se

seleccionó en dos grupos, los de alto conteo folicular (Alto-AFC) y bajo conteo folicular

(Bajo –AFC). El número de folículos por grupo (A-Alto o B-Bajo) se define mediante el

número medio de folículos antrales por animal (u) ± 1 Desviación estándar (DS) (Silva-

Santos et al., 2014). Para el grupo de Alto-AFC (u+1DS), el valor de cohorte fue 25, es decir,

se seleccionaron las alpacas con 25 o más folículos antrales (Anexo III). Para el grupo de

Bajo-AFC (u-1 DS), el valor de cohorte fue de 10, es decir se seleccionaron alpacas con 10

o menos folículos antrales. El número de de Alpacas con A-Alto (≥ 25 folículos) fue de 11,

38

B-Bajo (≤ 10 folículos) fue de 10. Los animales con una CFA intermedio (11-23 folículos)

fueron eliminados para obtener un análisis más detallado. Las muestras de plasma

correspondiente a los animales de cada grupo se seleccionaran y se observó el tipo de

correlación existente.

Conteo de folículos antrales en Alpacas

Parámetros foliculares BAJO-AFC (n=11) ALTO-AFC (n=10)

AFC 9±1.33a 28.27±2.83b

Peso del ovario (g) 3.29±0.34 a 0.98±0.34b

Longitud del ovario (cm) 1.18±0.31 a 1.54±0.4a

Altura del ovario (cm) 1.12±0.40 a 1.41±0.38a

Profundidad del ovario (cm) 1.02±0.33a 1.14±0.20 a

Tabla 2. Parámetros ováricos y clasificación de las alpacas según el conteo de folículos

antrales.

a,b: Letras distintas dentro la fila indican que las medias de los parámetros evaluados son

significativamente diferentes (p<0,01).

Figura 8. La concentración media de AMH por animal se representó en relación con el

número promedio de folículos antrales r = coeficiente de correlación y n = número total de

animales.

En la Figura 8, se observa la correlación positiva (r=0.6) entre el número de folículos antrales

y la concentración de hormona antimülleriana por alpaca estudiada.

Esta correlación positiva también observó Irlenad et al., 2008, al analizar el conteo de

folículos antrales mediante ultrasonografía en ovarios de vacunos.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 10 20 30 40

AM

H (

ng/

ml)

AFC

Correlacion AFC-AMH

r=0.67

n= 21

39

El conteo de folículos antrales es un método directo para cuantificar la cantidad de folículos

con cavidad antral. Ireland et al. (2008) mostraron que el AFC está positivamente

relacionado con el número de folículos y ovocitos sanos en los ovarios de vacas. La

población de pequeños folículos antrales se mantiene en un equilibrio dinámico, con salidas

numéricamente compensadas por las entradas, y el tamaño de equilibrio de esta reserva

dinámica es específica de cada individuo (Burns et al., 2005; Rico et al., 2012).

AFC ha sido utilizado para predecir la respuesta ovárica de un individuo a tratamientos a

base de gonadotropinas, por tanto, es una herramienta muy utilizada en la biotecnología de

producción de embriones de granja (Broer et al., 2014).

4.4 Estudio IV: Expresión de la hormona AMH en los folículos en crecimiento

Este es el primer estudio que demuestra un patrón variable en la intensidad y distribución de

la expresión de la hormona AMH en folículos ováricos de alpacas mediante el análisis

inmunohistoquímico. La hormona AMH se localizó en los ovocitos y las células de la

granulosa (de folículos primordiales a folículos antrales).

Se observó una tinción tenue en folículos primordiales (Figura 9c). La expresión aumenta

en los folículos preantrales (9d), en el cual la gran parte de células de la granulosa están

fuertemente teñidas, lo que indica una alta expresión de esta hormona. En los folículos

antrales (9e), la expresión es igualmente muy fuerte, sin embargo varía de acuerdo al

diámetro de los folículos antrales. Asi, en folículos antrales grandes, la expresión disminuye

(Figura 9f). Los folículos atrésicos no mostraron tinción para la expresión de AMH. Los

criterios para un folículo atrésicos son desaparición de las células de la granulosa y presencia

de picnosis nuclear. En conclusión, el patrón de expresión de la hormona Anti- Mülleriana

en los ovarios de alpaca es similar a lo observado en otras especies, expresándose en mayor

porcentaje en las células de la granulosa de folículos en crecimiento.

La mayoría de los estudios demostraron la ausencia de expresión de AMH en los ovocitos

de todas las categorías foliculares y de los folículos primordiales (Durlinger et al., 2002,

Weenen et al., 2004, Rico et al., 2011). Sin embargo, los estudios realizados con primates

(Stubbs et al., 2005, Modi et al., 2006, Amorim et al., 2013) han reportado hallazgos

similares a nuestros resultados, ya que la expresión de AMH se observó en ovocitos y

folículos primordiales. Las diferencias en la sensibilidad de los métodos utilizados, tales

como los tipos de anticuerpos (policlonales vs monoclonales) y la especificidad, los

diferentes fijadores y los protocolos de tinción podrían contribuir al contrastante de

resultados (Rocha et al., 2016)

40

Weenen et al., 2010, observaron que la expresión de AMH no se observó en los folículos

primordiales de varios de mujeres sanas y cíclicas, mientras que el 74% de los folículos

primarios mostraron al menos una señal débil en las células de la granulosa. El nivel más

alto de expresión de AMH estaba presente en las células de la granulosa de folículos

secundarios, preantrales y antrales menores de <4 mm de diámetro. En los folículos antrales

más grandes, la expresión de AMH desapareció gradualmente.

Figura 9. Microfotografías de la la inmunohistoquímica de la Hormona antiMulleriana

(AMH). (a) Control positivo de la expresión de la hormona Anti Mülleriana. (b) Control

a b

c d

e f

41

negativo, sin el anticuerpo AMH, por lo cual observamos la no expresión de la AMH. (c)

Folículos primordiales con expresión muy tenue. (d) folículo preantral con fuerte

expresión de AMH. (e) folículo antral grande fuertemente expresado. (f) folículo antral

con debil inmunotinción.

42

V. CONCLUSIONES

1. La concentración de Anti Mülleriana en el plasma de alpacas, se puede determinar

mediante un kit comercial desarrollado para su evaluación en ratones.

2. La cantidad de la hormona Anti Mülleriana durante la onda folicular es muy variable

entre individuos; sin embargo, no se observa ningún patrón relacionado con la onda

folicular.

3. Existe correlación positiva entre el número de folículos antrales y el nivel de

concentración de la hormona Anti Mülleriana en alpacas.

4. Los folículos preantrales y antrales expresan de manera homogénea la presencia de la

hormona Anti Mülleriana en las células de la granulosa en alpacas.

43

VI. RECOMENDACIONES

1. Realizar muestreos de plasma de alpaca con intervalos menos separados y utilizando

una mayor cantidad de animales. Esto permitirá obtener una evaluación más precisa del

comportamiento de la concentración de la hormona Anti Mülleriana durante la onda

folicular.

2. Realizar el conteo de folículos antrales mediante ultrasonido, permitiendo evaluar el

número de folículos antrales de animales vivos.

3. Realizar la inmunotinción en folículos ováricos diferenciándolos de los folículos

antrales pequeños de los folículos antrales grandes, permitirá obtener la expresión de

AMH de una manera más detallada.

4. Realizar investigaciones de esta naturaleza y utilizando lo aprendido en este trabajo

como base para implementar nuevas metodologías en el estudio de la fisiología

reproductiva de las alpacas.

44

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Aba, M; Miragaya, M; Chavess, MG; Capdeville, EF; Rutter, B; Agüero, A. 2005.

Effect of exogenous progesterone and eCG treatment on ovarian follicular dynamics in

vicunas (Vicugna vicugna). Anim. Reprod. Sci. 86: 153–161.

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pregnant llamas and alpacas. Acta Vet. Scand. 36(4): 489-498.

Aba, MA; Kindahl, H; Forsberg, M; Quiroga, M; Auza, N. 2000. Levels of progesterone

and changes in prostaglandin F (2alpha) release during luteolysis and early pregnancy

in llamas and the effect of treatment with flunixin meglumine. Anim. Reprod. Sci. 59

(1–2): 87–97.

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expression in the ovary. Mol Endocrinol 1: 561–568.

Yan, C; Wang, P; DeMayo, J; DeMayo, FJ; Elvin, JA; Carino C. 2001. Synergistic roles

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function. Mol Endocrinol 15: 854-866.

Zhang, H; Risal, S; Gorre, N; Busayavalasa, K; Li, X; Shen, Y; Bosbach, B;

Brannstrom, M; Liu, K. 2014. Somatic cells initiate primordial follicle activation and

govern the development of dormant oocytes in mice. Curr Biol 24:2501-2508.

57

VIII. ANEXOS

ANEXO I. Datos utilizados en la validación de la hormona Anti-Mülleriana

Lectura de absorbancias y concentraciones de AMH para la obtención de la

curva estándar.

Calibradores Conc.

(ng/ml)

Concentración

observada

(ng/ml)

Pocillo

Densidad

Optica

(OD)

Promedio

(DO) SD CV

B 0.34

0.195 B1 0.033 0.028 0.008 27.6

Range? B2 0.022

C 0.67

0.298 C1 0.037 0.042 0.007 16.9

0.533 C2 0.047

D 1.34

1.742 D1 0.115 0.107 0.012 10.8

1.478 D2 0.099

E 2.69

2.97 E1 0.199 0.195 0.005 2.4

2.877 E2 0.192

F 5.38

5.348 F1 0.387 0.382 0.006 1.7

5.241 F2 0.378

G 10.75

12.472 G1 1.067 0.887 0.254 28.7

8.881 G2 0.707

H 21.5

21.801 H1 2.106 2.074 0.045 2.2

21.258 H2 2.042

SD: Desviación estándar

CV: Coeficiente de variación

Lectura de absorbancias y concentraciones de muestra empleada en la

validación del kit comercial (Kit AMH-ELISA/ratón)

Muestra

µl

Pocillo OD Rango

Conc.

(ng/ml)

Avg

Conc

(ng/ml) SD CV Dilución AdjConc

CT-1 80 H6 0 R Range? Range?

Range? Range? 1 Range?

H7 -0.059 R Range?

CT-2 60 F5 -0.037 R Range? Range?

Range? Range? 1 Range?

F7 -0.07 R Range?

CT-3 50 G5 -0.034 R Range? Range?

Range? Range? 1 Range?

G7 -0.079 R Range?

CT-4 25 D7 -0.048 R Range? Range?

Range? Range? 2 Range?

E7 -0.047 R Range?

CT-5 12.5 B7 -0.046 R Range? Range?

Range? Range? 4 Range?

C7 -0.05 R Range?

CT-6 6.25 A7 0 R Range? Range? Range? Range?

8 Range? H5 -0.01 R Range?

CT-7 3.13 F6 -0.027 R Range?

Range? Range? Range? 16 Range? G6 -0.042 R Range?

FF-1 50 E5 3.854 R 35.96 35.96 0 0 1 35.96

58

E6 3.854 R 35.96

FF-2 5 D5 3.426 R 32.601

33.071 0.666 2 10 330.714 D6 3.545 R 33.542

FF-3 1 C5 0.739 9.212

10.903 2.392 21.9 50 545.149 C6 1.08 12.594

FF-4 0.5 B5 0.401 5.511

4.671 1.187 25.4 100 467.089 B6 0.264 3.831

FF-5 0.25 A5 0.207 3.078

2.38 0.988 41.5 200 475.919 A6 0.111 1.681

FF-6 0.1 H3 0.076 1.087

1.013 0.105 10.3 400 405.142 H4 0.068 0.939

PL-1 80 A3 0.412 5.644

5.391 0.357 6.6 1 5.391 A4 0.369 5.139

PL-2 60 B3 0.015 R Range?

Range? Range? Range? 1 Range? B4 0.013 R Range?

PL-3 50 C3 0.048 0.543

0.586 0.06 10.2 1 0.586 C4 0.052 0.628

PL-4 25 D3 0.11 1.659

1.844 0.262 14.2 2 3.689 D4 0.134 2.03

PL-5 12.5 E3 0.087 1.28

1.203 0.109 9 4 4.811 E4 0.078 1.126

PL-6 6.25 F3 0.041 0.386

0.361 0.036 9.9 8 2.887 F4 0.039 0.336

PL-7 3.13 G3 0.016 R Range?

Range? Range? Range? 16 Range? G4 0.019 R Range?

CT: Muestra de plasma de Alpacas machos castrados

FF: Líquido folicular del ovario de alpacas

PL: Plasma de Alpacas hembras adultas.

Range?: Las absorbancias de las muestras están fuera del rango marcado por la

curva estándar.

ANEXO II. Datos para evaluar el comportamiento de la hormona Anti

Mülleriana durante la onda folicular

Animales utilizados en la sincronización de la onda folicular

Alpaca Edad CC

Diametros de folículos (FD) ó Cuerpo

Luteo (CL) (mm) Presentan

FD en

Día 0

Respues

ta a

GnRH

Desarrollo

F.D en

Día 12 Día 0

(F.D)

Día 3

(C.L)

Día

6

Día

9

Día 12

(F.D)

Alpaca

1A

12S-

343F 3.5 3.5 8 9 8 si si si

Alpaca

2A

11s-

171E 4 3.25 7 8 7 si si si

Alpaca

3A

11s-

110E 4 3.75 8 9 8 si si si

59

Alpaca

4A

12s-

87E 3.5 3 10 10 8 si si si

Alpaca

5A

12s-

143E 3.5 3.5 8 10 9 si si si

Alpaca

6A

13s-

466F 3 3.75 8 11 7 si si si

Alpaca

7A

12S-

269E 3.5 3.5 8 8 8 si si si

Alpaca

8A

11s-

003X 4 3.25 9 9 9 si si si

Alpaca

9A

11S-

68E 4 3.5 7 9 - si si no

Alpaca

10A

12S-

258E 3.5 3.5 9 10 - si si no

Alpaca

11A

11S-

226E 4 3.25 8 9 - si si no

Alpaca

12A

11S-

119E 4 3.75 7 8 - si si no

Alpaca

13ª

11S-

31D 4 3.5 8 - si no

Alpaca

14ª

11S-

383F 4 3 9 - si no

Alpaca

15ª

12S-

123E 3.5 3.25 7 - si no

Alpaca

16ª

11S-

207E 3.5 3.75 - no

Alpaca

17ª

11S-

375F 4 3.5 - no

Alpaca

18ª

12S-

182E 3.5 3.25 - no

Alpaca

19ª

11s-

334F 4 3.5 - no

Alpaca

20ª

12s-

362F 3.5 3.5 - no

Absorbancias y concentración de AMH de los animales usados en la

sincronización folicular

Muestra Pocilli OD R Conc

(ng/ml)

AvgConc

(ng/ml) SD CV

Alpaca

1A

DIA 0 A3 0.157

1.100

1.094 0.009 0.800 A4 0.155 1.087

Dia 3 B3 0.16

1.126

1.180 0.076 6.400 B4 0.173 1.233

Dia 6 C3 0.175

1.251

1.289 0.053 4.100 C4 0.185 1.327

Dia 9 D3 0.068

0.372

0.396 0.035 8.700 D4 0.074 0.420

Dia 12 E3 0.134

0.915

0.856 0.084 9.800 E4 0.119 0.796

Alpaca

2A Día 0

F3 0.161

1.138 1.197 0.083 7.000

F4 0.176 1.256

60

Dia 3 G3 0.149

1.041

1.030 0.016 1.600 G4 0.147 1.018

Dia 6 H3 0.071

0.394

0.421 0.039 9.300 H4 0.077 0.449

Dia 9 A5 0.13

0.886

0.815 0.100 12.300 A6 0.113 0.745

Dia 12 B5 0.189

1.365

1.391 0.038 2.700 B6 0.196 1.418

Alpaca

3A

DIA 0 C5 0.121

0.814

0.809 0.007 0.900 C6 0.12 0.804

Dia 3 D5 0.158

1.114

1.105 0.013 1.200 D6 0.156 1.095

Dia 6 E5 0.122

0.821

0.781 0.057 7.300 E6 0.112 0.740

Dia 9 F5 0.155

1.089

1.046 0.060 5.700 F6 0.145 1.004

Dia 12 G5 0.028

0.400

0.450 0.071 15.713 G6 0.029 0.500

Alpaca

4A

DIA 0 H5 0.378

2.864

2.821 0.061 2.200 H6 0.367 2.778

Dia 3 A7 0.059

1.667

1.788 0.170 9.534 A8 0.065 1.908

Dia 6 B7 0.808

2.907

3.004 0.136 4.544 B8 0.664 3.100

Dia 9 C7 0.275

2.049

2.041 0.011 0.500 C8 0.273 2.033

Dia 12 D7 0.159

1.900

1.925 0.035 1.837 D8 0.16 1.950

Alpaca

5A

DIA 0 E7 0.255

1.892

1.917 0.036 1.900 E8 0.262 1.943

Dia 3 F7 0.296

2.211

2.192 0.027 1.200 F8 0.291 2.173

Dia 6 G7 0.344

2.590

2.567 0.033 1.300 G8 0.338 2.544

Dia 9 A9 0.283

2.112

2.030 0.116 5.700 A10 0.262 1.947

Dia 12 B9 0.117

0.774

0.819 0.064 7.800 B10 0.128 0.865

Alpaca

6A

DIA 0 C9 0.127

0.863

0.847 0.023 2.700 C10 0.123 0.830

Dia 3 D9 0.22

1.607

1.545 0.088 5.700 D10 0.204 1.482

Dia 6 E9 0.193

1.389

1.412 0.032 2.300 E10 0.198 1.435

Dia 9 F9 0.257 1.908 1.970 0.088 4.5

61

F10 0.273 2.032

Dia 12 H7 0.204

1.543

1.596 0.075 4.696 H8 0.219 1.649

Alpaca

7A

DIA 0 G9 0.033 0.230

0.235 0.007 3.009 G10 0.034 0.240

Dia 3 H9 0.032 0.225

0.238 0.018 7.443 H10 0.035 0.250

Dia 6 A11 0.016 R 0.044

0.042 0.003 6.734 A12 0.027 0.040

Dia 9 B11 0.024 0.141

0.146 0.006 4.374 B12 0.025 0.150

Dia 12 H11 0.019 R 0.080

0.078 0.003 3.626 H12 0.018 0.076

Alpaca

8A

DIA 0 C11 0.516

3.949

3.922 0.038 1.000 C12 0.509 3.895

Dia 3 D11 0.573

4.396

4.523 0.180 4.000 D12 0.606 4.650

Dia 6 E11 0.125

3.800

3.600 0.283 7.857 E12 0.133 3.400

Dia 9 F11 0.575

4.410

4.353 0.080 1.800 F12 0.561 4.297

Dia 12 G11 0.577

4.023

4.030 0.009 0.228 G12 0.579 4.036

Anexo III. Datos para evaluar la correlación entre el conteo de folículos

antrales y la concentración de la hormona Anti-Mülleriana

Datos de las alpacas colectadas del camal.

ALPACA

Fecha y

Lugar de

Colección

Dentición Ovario Peso

(g)

Morfometría (cm) Total

AFC

Clasifi-

cación Long. Altura Prof.

Alpaca 1B 20/02/15-

Ninacaca 4d OD 3.9 1.1 0.9 1.1 32 A

Alpaca 2B 20/02/15-

Ninacaca 4d OI 3.5 1.3 1.5 1.2 30 A

Alpaca 3B 20/02/15-

Ninacaca 4d OD 1.2 1.5 1 1.1 10 B

Alpaca 4B 13/03/15-

Ninacaca 4d OI 1.45 1 1 0.5 16 I

Alpaca 5B 13/03/15-

Ninacaca 4d OI 0.9 1 1 1.5 10 B

Alpaca 6B 14/03/15-

Ninacaca 4d OI 1.2 1.5 1.4 1 13 I

Alpaca 7B 14/03/15-

Ninacaca 4d OD 2.1 2.3 2.5 1.8 19 I

Alpaca 8B 21/03/15-

Ninacaca 4d OI 1.45 0.8 0.6 0.4 12 I

62

Alpaca 9B 21/03/15-

Ninacaca 4d OD 3.4 1.5 2 1.3 29 A

Alpaca

10B

21/03/15-

Ninacaca 4d OD 2.8 1.8 1.5 1.5 26 A

Alpaca

11B

21/03/15-

Ninacaca 4d OD 2.6 1.8 1.3 1 23 I

Alpaca

12B

21/03/15-

Ninacaca 4d OI 2.9 1.7 1.4 1 25 A

Alpaca

13B

22/03/15-

Ninacaca 4d OD 3.2 1.3 0.9 0.8 26 A

Alpaca

14B

22/03/15-

Ninacaca 4d OD 1.35 1 1 0.9 10 B

Alpaca

15B

22/03/15-

Ninacaca 4d OI 2.95 1.2 1.4 1 25 A

Alpaca

16B

22/03/15-

Ninacaca 4d OI 3.2 1.2 0,8 1 27 A

Alpaca

17B

27/03/15 -

Ninacaca 4d OD 2.35 2.4 1.3 1.3 16 I

Alpaca

18B

27/03/15 -

Ninacaca 4d OI 1.1 0.6 0.5 0.5 9 B

Alpaca

19B

27/03/15 -

Ninacaca 4d OI 2 1.2 1 0.8 11 I

Alpaca

20B

27/03/15 -

Ninacaca 4d OD 3.4 1.8 1.4 1 27 A

Alpaca

21B

10/04/15 -

Ninacaca 4d OI 1.9 1.5 1.2 1 18 I

Alpaca

22B

10/04/15 -

Ninacaca 4d OD 3.7 1.5 2 1.3 32 I

Alpaca

23B

10/04/15 -

Ninacaca 4d OI 1.1 1.4 2 1.6 11 I

Alpaca

24B

10/04/15 -

Ninacaca 4d OD 1 1.5 2 1.3 10 B

Alpaca

25B

10/04/15 -

Ninacaca 4d OD 0.75 1.6 1.5 1.5 8 B

Alpaca

26B

10/04/15 -

Ninacaca 4d OD 1.5 1.5 2 1.4 14 I

Alpaca

27B

10/04/15 -

Ninacaca 4d OI 0.9 1 0.9 0.7 8 B

Alpaca

28B

11/04/15 -

Ninacaca 4d OD 0.55 0.9 1 0.8 6 B

Alpaca

29B

11/04/15 -

Ninacaca 4d OI 2.8 1 1 0.5 20 I

Alpaca

30B

11/04/15 -

Ninacaca 4d OI 3.25 2.5 1.1 1.3 32 A

Alpaca

31B

25/04/15 -

Ninacaca 4d OI 1.4 1.1 1.6 1 14 I

Alpaca

32B

25/04/15 -

Ninacaca 4d OD 2.75 1.5 1.2 1.3 20 I

Alpaca

33B

25/04/15 -

Ninacaca 4d OD 2.1 1.1 1 0.9 18 I

63

Alpaca

34B

25/04/15 -

Ninacaca 4d OI 1.9 1.1 1.5 1 12 I

Alpaca

35B

25/04/15 -

Ninacaca 4d OD 2.4 1.6 1 1 21 I

Alpaca

36B

16/05/16-

Ninacaca 4d OD 1.2 1.2 1.2 0.9 10 B

Alpaca

37B

16/05/16-

Ninacaca 4d OD 0.85 1.3 1.1 1 9 B

Alpaca

38B

16/05/16-

Ninacaca 4d OI 1.3 0.8 0.6 0.5 11 I

Alpaca

39B

24/05/16-

Ninacaca 4d OD 1.75 1.6 1.2 1.1 14 I

Alpaca

40B

24/05/16-

Ninacaca 4d OD 3.2 2 1.3 1.2 20 I

OD: Ovario Derecho

OI Ovario Izquierdo

A: AFC-Alto = µ+1DS

B: B-Bajo = µ-1DS

I: Alpacas con folículos antrales intermedio entre A y B

Donde:

µ: media de folículos antrales de todo la población estudiada=17.6

DS: desviación estándar=7.86

Entonces:

A: Todas las alpacas con folículos ≥ 25

B: Todas las alpacas con folículos ≤ 10

I: Todas las alpacas entre 11 y 24 folículos

1. Absorbancias y concentraciones de AMH, de plasma de alpacas obtenidas de camal

Muestra Pocillo OD R Conc AvgConc SD CV

Alpaca 16B B5 0.13 1.114

1.121 0.011 1 B6 0.132 1.129

Alpaca 30B H5 0.294 2.371

2.364 0.011 0.5 H6 0.292 2.356

Alpaca 22B B7 0.233 1.895

2.032 0.193 9.5 B8 0.268 2.168

Alpaca 10B E5 0.225 1.838

1.772 0.094 5.3 E6 0.208 1.705

Alpaca 9B E7 0.19 1.566

1.499 0.095 6.3 E8 0.172 1.432

Alpaca 1B C7 0.414 3.313

3.129 0.261 8.3 C8 0.368 2.944

Alpaca 2B A3 0.15 1.262

1.257 0.007 0.6 A4 0.149 1.252

Alpaca 13B A5 0.115 0.996 1.002 0.01 1

64

A6 0.116 1.009

Alpaca 20B A7 0.167 1.39

1.101 0.409 37.2 A8 0.09 0.811

Alpaca 12B E3 0.152 1.278

1.252 0.036 2.9 E4 0.145 1.226

Alpaca 37B H3 0.063 0.608

0.604 0.006 1 H4 0.062 0.6

Alpaca 25B D3 0.035 0.405

0.475 0.1 21 D4 0.054 0.546

Alpaca 36B D7 0.035 0.401

0.499 0.138 27.7 D8 0.061 0.596

Alpaca 14B C3 0.099 0.879

0.899 0.029 3.2 C4 0.104 0.92

Alpaca 5B G3 0.097 0.867

0.851 0.022 2.6 G4 0.093 0.835

Alpaca 28B C5 0.032 0.381

0.37 0.016 4.2 C6 0.029 R 0.359

Alpaca 18B G5 0.073 0.686

0.737 0.072 9.8 G6 0.087 0.788

Alpaca 24B F5 0.076 0.707

0.667 0.056 8.4 F6 0.065 0.627

Alpaca 3B B3 0.075 0.702

0.66 0.058 8.8 B4 0.064 0.619

Alpaca 27B D5 0.033 0.391

0.398 0.01 2.6 D6 0.035 0.405

Alpaca 15B F3 0.141 1.194

1.22 0.036 3 F4 0.148 1.245

2. Conteo de folículos antrales y concentración de AMH de alpacas obtenidas de

Camal.

Alpaca AFC AMH (ng/ml) SD CV

A-AFC

Alpaca 1B 32 3.129 0.261 8.3

Alpaca 2B 30 1.257 0.007 0.6

Alpaca 9B 29 1.499 0.095 6.3

Alpaca 10B 26 1.772 0.094 5.3

Alpaca 12B 25 1.252 0.036 2.9

Alpaca 13B 26 1.002 0.01 1

Alpaca 15B 25 1.22 0.036 3

Alpaca 16B 27 1.121 0.011 1

Alpaca 20B 27 1.101 0.409 37.2

Alpaca 22B 32 2.032 0.193 9.5

Alpaca 30B 32 2.364 0.011 0.5

B-AFC

Alpaca 3B 10 0.66 0.058 8.8

65

Alpaca 5B 10 0.851 0.022 2.6

Alpaca 14B 10 0.899 0.029 3.2

Alpaca 18B 9 0.737 0.072 9.8

Alpaca 24B 10 0.667 0.056 8.4

Alpaca 25B 8 0.475 0.1 21

Alpaca 27B 8 0.398 0.01 2.6

Alpaca 28B 6 0.37 0.016 4.2

Alpaca 36B 10 0.499 0.138 27.7

Alpaca 37B 9 0.604 0.006 1