UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA ...
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UNIVERSIDAD DE SEVILLA
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA
“ESTUDIO DE TRANSMISIÓN DE PERIODONTOPATÓGENOS ENTRE PAREJAS PRE Y POSTRATAMIENTO PERIODONTAL”
Carmen Bernal Ortega Sevilla, 2015
Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores D. Pedro Bullón Fernández, Dª Lorena López Cerero y Dª María del Carmen Machuca Portillo de la Universidad de Sevilla por su dirección y orientación en el diseño y elaboración de este trabajo.
Departamento de Estomatología Medalla y Encomienda
Facultad de Odontología Orden Civil de Sanidad
D. Pedro Bullón Fernández, Catedrático del Departamento de Estomatología de la
Facultad de Odontología de la Universidad de Sevilla, Dña. Lorena López Cerero,
Profesora Asociada del Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Sevilla, y Dña. María del Carmen Machuca Portillo, Profesora Titular del
Departamento de Estomatología de la Facultad de Odontología de la Universidad de
Sevilla, en calidad de directores del Proyecto de Tesis de la Licenciada en Odontología
Dª. Carmen Bernat Ortega.
CERTIFICAN:
Que el presente trabajo de investigación “ESTUDIO DE TRANSMISIÓN DE
PERIODONTOPATÓGENOS ENTRE PAREJAS PRE Y POSTRATAMIENTO
PERIODONTAL”, ha sido realizado bajo nuestra dirección y cumple todos los requisitos para
optar al Grado de Doctor.
Lo que firman en Sevilla a 13 de Octubre de 2015
Prof. Pedro Bullón Fernández Profa. Lorena López Cerero
Profa. Mª del Carmen Machuca Portillo
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN
1. DEFINICIÓN DE PERIODONTITIS………………………………………………1
2. CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES….………2
2. 1 Características de las principales formas clínicas
3. EPIDEMIOLOGÍA DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES…………9
3.1 Factores de riesgo y de susceptibilidad
3.2 Efectos sistémicos
4. ETIOLOGÍA………………………………………………………………………..21
4.1 Revisión histórica de las teorías sobre la etiología de las
enfermedades periodontales
4.2 Microbiología de las enfermedades periodontales
4.2.1 Características de una bacteria periodontopatógena
4.2.2 Bacterias periodontopatógenas
5. DIAGNÓSTICO……………………………………………………………………42
5.1 Exploración clínica y radiológica
5.2 Importancia del diagnóstico microbiológico en Periodoncia
5.3 Métodos de diagnóstico microbiológico
6. TRANSMISIÓN DE LA ENFERMEDAD………………………………………..50
6.1 Modelos de infección
6.2 Mecanismos de transmisión
6.3 La periodontitis como una enfermedad transmisible
6.4 Posibles vías de transmisión de bacterias periodontales
6.5 Consecuencias de la transmisión
7. PREVENCIÓN……………………………………………………………………..64
II. OBJETIVOS……………………………………………………………………….67
III. HIPÓTESIS………………………………………………………………………..68
IV. PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO………………………………………..…69
V. MATERIAL Y MÉTODOS
1. SELECCIÓN DE PACIENTES…………………………………………………..70
1.1 Criterios de selección
1.2 Cronograma
2. EXPLORACIÓN DE LOS PACIENTES………………………………………...71
2.1 Exploración clínica
2.2 Estudio radiológico
2.3 Tratamiento periodontal
3. EXPLORACIÓN DE LAS PAREJAS…….……………………………………..73
3.1 Exploración clínica
3.2 Estudio radiológico
3.3 Tratamiento perodontal
4. TOMA DE MUESTRAS…………………………………………………………..74
4.1 Toma de muestras en la primera visita de los pacientes
4.2 Toma de muestras al mes y a los seis meses de los
pacientes
4.3 Toma de muestras en la primera visita de las parejas
4.4 Toma de muestras a los seis meses de las parejas
5. PROCESADO DE LAS MUESTRAS………………………………….………..75
5.1 Procedimiento para cultivo microbiológico
5.1.1Composición de los medios
5.1.2 Inoculación en los medios de cultivo
5.1.3 Incubación
5.1.4 Lectura
5.2 Muestras para PCR
5.2.1. Extracción y purificación del ácido nucleico
5.2.2. PCR cuantitativa
5.2.3. Tipificación
6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………………………………………….81
7. ANEXO: Consentimiento informado de los pacientes y sus parejas…..83
VI. RESULTADOS
1. CASUÍSTICA……………………………………………………………………..85
2. SITUACIÓN CLÍNICA PERIODONTAL INICIAL Y RESPUESTA AL
TRATAMIENTO………………………………………………………………….87
3. RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS………………………………………..91
3.1. Resultados de cultivo bacteriano
3.1.1. Cuantificación de recuentos bacterianos en los pacientes y
las parejas antes y después del tratamiento periodontal
3.2. PCR Cuantitativa
3.2.1. Detección y cuantificación de Aa Y Pg en los pacientes y las
parejas antes y después del tratamiento
3.3. Comparación de los resultados de cultivo bacteriano y PCR
cuantitativa
VII. DISCUSIÓN
1. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS Y ESTADO CLÍNICO DE LAS
PAREJAS SELECCIONADAS………………………………………………..113
2.1 . Características demográficas
2.2 . Estado clínico de las parejas seleccionadas
2. TÉCNICAS DE ESTUDIO EMPLEADAS: CULTIVO Y PCR
CUANTITATIVA……………………………………………………………...…115
3. PRESENCIA DE PERIODONTOPATÓGENOS EN EL ÁREA
SUBGINGIVAL Y EN LA SALIVA………………........................................118
4. COMPARACIÓN DE HALLAZGOS CLÍNICOS Y MICROBIOLÓGICOS EN
ENFERMOS PERIODONTALES Y SUS CÓNYUGES…….......................120
VIII. CONCLUSIONES……………………………………………………………..128 IX. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………129
- 1 -
I. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES
1. DEFINICIÓN DE PERIODONTITIS
El término “periodonto” (estructura de sostén dental) engloba cuatro
tejidos blandos y duros distintos: la encía, el cemento radicular, el hueso
alveolar y el ligamento periodontal, que une las dos últimas estructuras.
La periodontitis es una enfermedad inflamatoria del aparato de sostén
dentario. Está caracterizada por una destrucción del tejido conectivo,
ligamento periodontal y del hueso alveolar, que a menudo conlleva la pérdida
de piezas dentarias. El signo de destrucción periodontal es la “bolsa
periodontal” originada por la pérdida de inserción, con proliferación en
profundidad del epitelio de unión y su transformación en epitelio de la bolsa
(Müller-Glauser y Schroeder 1982).
Los factores determinantes para la génesis y progresión de la
destrucción periodontal son, por una parte las características patogénicas de
microorganismos implicados, y por otra, la respuesta del huésped,
considerando como tal su estado inmunitario y sus características genéticas. Y
un aspecto adicional que es la presencia de factores de riesgo, tanto
ambientales (por ejemplo el tabaquismo) como sistémicos (por ejemplo
padecer diabetes) (Kornman y cols 1997a, Salvi y cols 1997). Las
enfermedades periodontales son producidas por la interacción de un agente
microbiano, único o múltiple, considerado como el factor etiológico primario
necesario, pero no suficiente; un huésped más o menos susceptible, y unos
factores de riesgo que van a modular la susceptibilidad o resistencia del
huésped a desarrollar la enfermedad (Page y Kornman 1997).
- 2 -
2. CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES
Desde 1982 (Page y Schroeder), se reconocen bajo el concepto de
“enfermedades periodontales” las alteraciones inflamatorias de la encía y del
periodonto. La gingivitis y la periodontitis son infecciones bacterianas
caracterizadas por la presencia de inflamación y destrucción tisular, reversible
en el caso de la gingivitis e irreversible en la periodontitis.
La clasificación de las enfermedades periodontales está en continua
remodelación, debido a los nuevos hallazgos clínicos y a la investigación.
Hasta hace poco se aceptaba universalmente la nomenclatura de la
American Academy of Periodontology (AAP) de 1989, que establecía cinco
clases: periodontitis del adulto (PA) (I), periodontitis de aparición temprana
(EOP) (II), con otras subdivisiones [periodontitis prepuberal (PP), periodontitis
juvenil (PJ), periodontitis rápidamente progresiva (PRP)], periodontitis asociada
a enfermedades sistémicas (III), periodontitis ulcerativa necrotizante aguda
(GUNA/PUNA) (IV) y la periodontitis refractaria resistente al tratamiento (PR)
(V).
La utilización de esta clasificación presentaba numerosos defectos, ya
que no permitía diferenciar cuadros clínicos con evolución y necesidades
terapeúticas diferentes debido a un considerable solapamiento de las diferentes
enfermedades y un énfasis inapropiado en la edad y en la ratio de progresión
de la enfermedad (Armitage 1999).
A finales de 1999, durante un seminario en Oak-Brook (Illinois, EE.UU),
miembros destacados de la Academia Americana de Periodoncia (AAP) y de la
Federación Europea de Periodoncia (EFP) elaboraron la clasificación (tipos I-
VIII) (Armitage 1999) que se muestra en las tablas 1 y 2.
- 3 -
Tabla 1. Clasificación de las enfermedades y condiciones periodontales
de 1999 (Conferencia internacional de la Academia Americana de
Periodoncia para la clasificación de las enfermedades y condiciones
periodontales, 1999):
I. Enfermedades gingivales
II. Periodontitis crónica
III. Periodontitis agresiva
IV. Periodontitis como manifestación de enfermedades sistémicas
V. Enfermedades periodontales necrosantes
VI. Abscesos del periodonto
VII. Periodontitis asociada con lesiones endodónticas
VIII. Deformidades y condiciones adquiridas o del desarrollo
Tabla 2. Comparación de las clasificaciones de las enfermedades
periodontales de 1989 y 1999.
Modificación de las clasificaciones 1989/99 1989
5 clases
1999
8 tipos
Sustitución del término “Periodontitis del
adulto” por “Periodontitis crónica”
I PA II PC
Sustitución del término “Periodontitis de
aparición temprana” (“early onset”) por
“Periodontitis agresiva”
II EOP
(PP, PJ, PRP)
III PA
Sustitución del término “Periodontitis asociada
a enfermedades sistémicas” por “Periodontitis
como manifestación de enfermedades
sistémicas”
III IV
Sustitución del término “Periodontitis ulcerativa
necrotizante” por “Enfermedades
periodontales necrosantes”
IV GUNA/PUNA V GUN/P
Ampliación: “Enfermedades gingivales” - I
- 4 -
Ampliación: “Abscesos del periodonto” - VI
Ampliación: “Periodontitis asociada con
lesiones endodónticas”
- VII
Ampliación: “Deformidades y condiciones
adquiridas o del desarrollo”
- VIII
Supresión de la “Periodontitis refractaria”
como categoría individual
V PR -
Esta nueva clasificación tampoco está exenta de críticas; Wolf y cols
(2005a) la consideran poco práctica debido a su extensión y a la inexistencia
de abreviaturas para los cuadros clínicos más frecuentes, salvo para PC, PA y
GUN/PUN. Además, la clasificación atribuye la misma importancia a
enfermedades con diferente prevalencia, y apenas tiene en cuenta el carácter
multifactorial (riesgos) de las periodontitis. Mientras que enfermedades
condicionantes de enorme importancia en la actualidad están ausentes
(enfermedades infecciosas como VIH/SIDA), algunas patologías, como el
absceso pericoronal, figuran en lugar destacado.
2. 1 Características de las principales formas clínicas de periodontitis
PERIODONTITIS CRÓNICA O DEL ADULTO
Es la forma más frecuente de periodontitis. Tiene mayor prevalencia en
los adultos, pero también puede hallarse en niños y en adolescentes (Flemming
1999). Se calcula que en la población general el 40% de los mayores de 35
años tiene periodontitis moderada y entre el 4 y el 8% padece periodontitis
avanzada (González y Bullón 1989). Se desarrolla de forma lenta y progresiva,
a partir de una gingivitis durante la pubertad o después de ella, pero los
síntomas, como pérdida ósea y de inserción, no se observan hasta más tarde
(entre los 30 y los 40 años). Suele presentar una evolución lenta (“crónica”),
pudiendo experimentar una exacerbación aguda en cualquiera de sus estadios
con la consiguiente pérdida de inserción.
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Las manifestaciones clínicas más usuales son la inflamación gingival,
sangrado al sondaje en el área de la bolsa gingival, formación de bolsa
periodontal, pérdida de inserción y pérdida de hueso alveolar. Puede
observarse además una hipertrofia o retracción de la encía, exposición de
furcas, aumento de la movilidad dental, desplazamiento y pérdida dental en
algunos casos a edades avanzadas, a no ser que se produzcan recurrencias
debido al debilitamiento del estado inmunitario.
La enfermedad puede manifestarse de manera localizada (tipo IIA) o
bien generalizada (tipo IIB), según haya menos del 30% o más de sitios
afectados en la boca. Es más común una distribución localizada no
homogénea, con defectos óseos más profundos, sobre todo en los molares y
en segundo lugar en los dientes anteriores (Wolf y cols 2005b). La periodontitis
crónica puede clasificarse también conforme a la severidad de zonas
afectadas. La severidad puede diferenciarse según el nivel de pérdida de
inserción clínica en: leve (PIC: 1-2 mm), moderada (PIC: 3-4 mm) o severa
(PIC: 5 mm) (Kinane y Lindhe 2005a).
Dentro de la naturaleza crónica de la inflamación, ha sido objeto de
debate la propia evolución de la enfermedad. En 1984 Socransky y cols
sugirieron un modelo teórico para describir la naturaleza de la progresión de la
enfermedad periodontal: la “hipótesis de los brotes”, según la cual la
periodontitis progresa con episodios sucesivos de exacerbación y remisión. La
pérdida de soporte ocurre en determinados momentos, como episodios
recurrentes, seguidos de períodos de inactividad con inflamación reducida
(Bullón y cols 1993). Se ha llegado al consenso de que es un proceso crónico
con períodos de agudización (Borrell y Papapanou 2005). Factores
adicionales, como el tabaquismo intenso, pueden acentuar la progresión e
influir en la posibilidad de desarrollar o no la enfermedad avanzada (Kinane y
Lindhe 2005a).
El tiempo de evolución es un factor muy importante que va a determinar
el alcance de las lesiones. La prevalencia en la población de la periodontitis
crónica, así como la extensión y la severidad se incrementa con la edad
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(Flemming 1999, Papapanou 1996, Grossi y cols 1995, Grossi y cols 1994), sin
embargo, el momento de inicio y la velocidad de progresión varían entre
diferentes individuos y probablemente estén relacionadas con factores de
riesgo genéticos y ambientales. Teniendo en cuenta el envejecimiento de la
población que se espera que se produzca en los países desarrollados, se
prevee un incremento, aún no estimado, en el número de periodontitis en el
futuro (Loesche y Grossman 2001).
La periodontitis crónica suele ser una forma de enfermedad periodontal
de avance lento que en cualquier estadío puede exacerbarse y generar pérdida
adicional de inserción y de hueso. En un estudio basado en el sitio de la
afección, la incidencia global anual de pérdida de inserción clínica varió entre
0,3% y 4,2% de los dientes (Flemming 1999), lo cual indica que es muy
variable la cantidad de sitios que realmente muestran progresión en un plazo
determinado. La media anual de pérdida de inserción clínica y de pérdida ósea
comunicada varía entre 0,04 y 1,04 mm. La distribución de esta progresión
anual indica que sólo una pequeña proporción de la población muestra una alta
velocidad media de avance de la enfermedad.
PERIODONTITIS AGRESIVA O DE INICIO TEMPRANO
Comprende un grupo de procesos poco frecuentes (ver epidemiología),
a menudo severos y rápidamente progresivos, caracterizados por un comienzo
temprano de los síntomas y con una agrupación de casos dentro de la misma
familia. En el seminario internacional de 1999 sobre clasificación, la
Periodontitis Agresiva fue definida con las siguientes características comunes
principales (Lang y cols):
Historia clínica sin particularidades
Pérdida de inserción y destrucción ósea rápidas
Agrupación familiar
- 7 -
La rapidez en la instauración y desarrollo de las lesiones hace referencia
a la gravedad clínica del proceso, no existiendo un consenso preciso en cuanto
a la cronología.
La periodontitis agresiva está relacionada con la adquisición exógena de
especies bacterianas con factores de virulencia específicos y, además, puede
asociarse a un nivel alto de susceptibilidad del sujeto (Tonetti y Mombelli
1999). El diagnóstico de esta enfermedad requiere descartar que se trate de
una manifestación periodontal de enfermedades sistémicas como
enfermedades hematológicas, neoplasias, infecciones como el SIDA, etc…. Se
distinguen dos formas, una localizada y otra generalizada, según estén
afectados menos o más del 30% de las localizaciones respectivamente.
Entre las características secundarias (Lang y cols 1999) se
consideran:
Que la acumulación de placa y cálculo no concuerda con la gravedad de la
destrucción periodontal.
Que se suele encontrar una proporción elevada de Actinobacillus
actinomycetemcomitans y, en algunos casos, de Porphyromonas gingivalis.
La respuesta quimiotáctica de los neutrófilos es defectuosa
Fenotipo de macrófagos con hiperrespuesta, que incluye la producción elevada
de PGE2 y de IL-1β en respuesta a las endotoxinas bacterianas.
La progresión de la pérdida de inserción y de la pérdida ósea puede ser
autolimitada.
- 8 -
PERIODONTITIS AGRESIVA GENERALIZADA
Es poco frecuente, y habitualmente se diagnostica en menores de 30
años, aunque los pacientes pueden ser mayores. Presenta una tasa de
progresión rápida y una naturaleza episódica pronunciada de la destrucción de
la inserción y del hueso alveolar de soporte. Los factores de riesgo y los
mediadores proinflamatorios que reducen el estado inmunitario pueden agravar
el cuadro clínico. Existe pérdida de inserción interproximal generalizada que
afecta al menos a tres dientes permanentes, que no son primeros molares ni
incisivos. El grado de gravedad y la distribución de la pérdida de inserción son
muy variables. Se produce una pérdida ósea rápida. La encía se encuentra
más o menos inflamada y aparecen síntomas frecuentes de actividad.
En su patogenia destaca un aumento de la migración y una reducción de
la quimiotaxis de los granulocitos neutrófilos y de los monocitos. Asi mismo se
observa una escasa respuesta con anticuerpos séricos contra los agentes
infecciosos (Tonetti y Mombelli 1999).
PERIODONTITIS AGRESIVA LOCALIZADA
Es poco común, y se inicia en la pubertad, aproximadamente a los 13
años; su curso es rápido y con brotes. La presentación suele ser localizada en
primer molar/incisivos con pérdida de inserción interproximal al menos en dos
dientes permanentes, uno de los cuales es un primer molar; no afecta a más de
dos dientes que no son primeros molares o incisivos. En la fase inicial hay
pocos signos de inflamación gingival. Aparecen pérdidas óseas angulares.
También se ha señalado una reducción de la quimiotaxis de los
granulocitos neutrófilos y de los monocitos, una disminución de la fagocitosis
de los neutrófilos que además presentan una carencia de receptores.
Igualmente aparece una enérgica respuesta de anticuerpos séricos contra los
agentes infecciosos. En el suero de estos pacientes se han encontrado
- 9 -
anticuerpos específicos contra la leucotoxina de Actinobacillus
actinomycetemcomitans (Tonetti y Mombelli 1999).
3. EPIDEMIOLOGÍA DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES
La epidemiología de las enfermedades periodontales ha sido y continúa
siendo un tema bastante controvertido. Un requisito fundamental para todo
estudio epidemiológico es contar con una definición precisa de la enfermedad
que se investiga. Uno de los problemas con el que nos enfrentamos para
revisar la epidemiología de esta patología es la disparidad de criterios en la
definición de periodontitis recogida en los estudios epidemiológicos durante
la última década, por lo que los hallazgos de los diferentes grupos
investigadores no son fáciles de evaluar. Resulta difícil comparar distintos
estudios que emplean parámetros diferentes y métodos de medición no
calibrados entre sí. Estas incongruencias en las definiciones afectan
inevitablemente a las cifras conocidas sobre la distribución de la enfermedad.
Las diferencias más importantes entre los diversos estudios radican en
los parámetros y procedimientos de exploración clínica. Un examen clínico
óptimo de las condiciones periodontales debe incluir el sondaje perimetral en
torno a todos los dientes, sin embargo, por razones prácticas, la mayor parte de
los estudios epidemiológicos han empleado métodos parciales de registro. La
discrepancia entre los hallazgos obtenidos por medio del examen parcial o total
de la boca puede ser sustancial. Por ejemplo, Baelum y cols (1993), utilizando
datos de un estudio transversal de 1.121 kenyanos de entre 15 y 65 años,
compararon los resultados de exámenes de la boca completa con los obtenidos
por el uso de 10 dientes índice. El estudio mostró que el registro parcial
infraestima la existencia de bolsas (moderadas o profundas) en todos los
grupos. La proporción de pacientes con bolsas ≥ 6 m que hubieran sido
excluidas si sólo se hubieran explorado los dientes índice fue del 55% en el
grupo de 25-29 años, del 39% (40-44 años) y del 23% (50-54 años). Por ello el
uso del sistema IPCNT (índice periodontal comunitario y de necesidades de
tratamiento) en estudios epidemiológicos de la enfermedad periodontal ha sido
- 10 -
evaluado críticamente en numerosas publicaciones (Papapanou y Lindhe 2005,
Borrell y Papapanou 2005, Jenkins y Papapanou 2001, Andriankaja y cols
2006).
A la heterogeneidad de medidas exploratorias habría que añadir que la
mayoría de los estudios epidemiológicos publicados son estudios
transversales, y no longitudinales. Hay una clara necesidad de estudios
longitudinales prospectivos que dirijan hipótesis a partir de datos de estudios
transversales y que incluyan factores de riesgo establecidos como covariables
junto con nuevas exposiciones de interés, particularmente de trabajos de
investigación diseñados como ensayos controlados o a doble ciego (Borrell y
Papapanou 2005).
Los hallazgos de estudios epidemiológicos realizados en la década de
1950 sobre la periodontitis en adultos, muestran la alta prevalencia de la
enfermedad periodontal destructiva en la población adulta en general y un claro
aumento en la prevalencia de la enfermedad con el envejecimiento. Scherp en
1964, en una revisión sobre la epidemiología de la enfermedad periodontal,
constató que 1º) la enfermedad periodontal parece ser un problema mayor de
salud pública mundial que afecta a la mayoría de la población adulta después
de los 35-40 años; 2º) la enfermedad comienza como gingivitis a edad
temprana y si se deja sin tratar, termina en periodontitis destructiva progresiva;
3º) más del 90% de la variación en la severidad de la enfermedad periodontal
en la población puede explicarse por la edad y por la higiene bucal. Los
principios descritos dominaron hasta finales de la década de 1970.
Los estudios realizados durante la década de 1980 brindaron una
clasificación más completa de las características de especificidad por sitio de la
enfermedad periodontal, y de la alta variación de estados periodontales entre
distintas poblaciones y dentro de ellas. En 1986 Baelum y cols mostraron que
la enfermedad periodontal avanzada no estaba distribuida uniformemente en la
población. El 75% de las localizaciones con pérdida de inserción ≥ 7mm se
encontraba en el 31% de los sujetos. La mayoría de los sujetos examinados
mostraban problemas periodontales mínimos, mientras que un grupo limitado
- 11 -
estaba afectado por enfermedad avanzada. Estos mismos autores, en 1988,
sugirieron que “la enfermedad periodontal destructiva no debe ser contemplada
como una consecuencia inevitable de la gingivitis que en última instancia lleva
a una pérdida de dientes considerable” y requiere una caracterización más
precisa de los rasgos de destrucción periodontal en las personas
particularmente susceptibles.
Varios estudios epidemiológicos publicados en los últimos 20 años
verifican los principios enunciados. Las formas severas de periodontitis
afectan a una minoría de sujetos en los países, en proporciones que no
superan el 10-15% de la población (Papapanou 1996, Albandar y cols 1999). El
porcentaje de estos sujetos aumenta considerablemente con el
envejecimiento y parece alcanzar su pico a los 50-60 años (Horning y cols
1990, Flemming 1999) (tabla 3). El aumento de pérdida de dientes que se
registra en este grupo de edad explicaría la declinación ulterior de la
prevalencia.
Tabla 3. Prevalencia de la periodontitis crónica expresada en porcentajes en sujetos con pérdida de inserción clínica (PIC), comprendidos en diversos grupos erarios (Flemming 1999)
Edad (años) PIC (3-4 mm) PIC ≥ 5 mm
.
18-35 9-35 0,3-6
36-55 18-70 12-27
> 55 44-81 35-51
En un metaanálisis sobre 42 estudios realizados en Europa, Estados
Unidos y en Latinoamérica que emplearon el IPCNT, Miyazaki y cols (1991 a,b)
constataron que, en general, a pesar de la enorme variación en los resultados,
las gingivitis y las periodontitis leves están muy extendidas; y en cambio los
fenómenos de gran pérdida ósea sólo se observan en el 10-15% de la
población. Papapanou y Lindhe (2005) resaltan la dificultad de evaluar hasta
- 12 -
que punto los resultados pueden estar influidos por las limitaciones del sistema
de registro parcial empleado.
La prevalencia de periodontitis severa no se distribuye de manera
uniforme entre las diversas razas, etnias o grupos socioeconómicos. Hay
estudios que parecen indicar una mayor prevalencia de la enfermedad
periodontal en individuos de raza negra de hasta tres veces más (Grossi y cols
1994, 1995). Sin embargo, un análisis detallado de la literatura confirma que
estos hallazgos se podrían achacar a condicionantes socioeconómicos y
culturales en las poblaciones estudiadas. Hobdell (2001), en una revisión de la
literatura, concluye que, el incremento de determinadas enfermedades orales,
entre ellas las enfermedades periodontales destructivas, puede atribuirse en
parte a la creciente disparidad entre poblaciones ricas y pobres, tanto en
ámbitos nacionales como internacionales, que posiblemente se está
exacerbando por la globalización económica.
La enfermedad en los niños y en los adolescentes suele comportarse
de otra forma. La información sobre variantes de periodontitis que afectan a la
dentición primaria (periodontitis prepuberal localizada/generalizada) proviene
de informes de casos clínicos y no hay datos disponibles sobre su prevalencia
y distribución en la población general. Los criterios usados en estudios que
incluyeron muestras de niños (Shlossman y cols 1986, Sweeney y cols 1987)
no son uniformes, de ahí que los datos sobre prevalencia varíen de forma
significativa. Shlossman y cols (1986) utilizaron un valor del nivel de inserción ≥
2mm como punto de referencia y mostraron que en una muestra de indios
pimes hubo una prevalencia de 7,7% en los de 5-9 años y de 6,1% en los de
10-14 años. Sweeney y cols (1987) examinaron radiografías de 2.264 niños de
5-11 años, derivados de una clínica universitaria para el tratamiento
odontológico e informaron que existía una pérdida ósea clara en las
radiografías en uno o más molares en 19 niños (0,8%), 16 de los cuales eran
negros, 2 caucásicos y 1 asiático. En cambio, conocemos datos más precisos
sobre la periodontitis localizada agresiva (LJP). Su prevalencia varía en
poblaciones geográfica o racialmente diferentes. La mayoría de los estudios
- 13 -
muestran una incidencia entre el 0,1 y 0,5% (Saxén 1980, Löe y Brown 1991).
En personas de raza blanca la enfermedad parece afectar más a las mujeres y
la prevalencia es baja (aproximadamente 0’1%). En otras razas y en particular
en la negra, su frecuencia es mayor (probablemente en niveles superiores al
1%) y la relación por sexo parece invertirse, afectando más a varones (Löe y
Brown 1991, Melvin y cols 1991).
En cuanto a la pérdida de dientes, numerosos trabajos publicados
señalan que la gran mayoría de las extracciones hasta los 40-45 años se
deben a caries. Sin embargo, en grupos de edad más avanzada, la enfermedad
periodontal y la caries se igualan. En general, se estima que la periodontitis
provoca el 30-35% de todas las extracciones dentales, mientras que la caries
supone el 50% de estas. Stephens y cols (1991) examinaron las razones para
la extracción dental en 909 pacientes de edades comprendidas entre 14 y 91
años. La caries fue la principal causa (63%), seguida de la periodontitis (34%).
En los grupos de edad adulta, los porcentajes eran aproximadamente los
mismos. Reich y Hiller (1993) llevaron a cabo un estudio para recoger
información sobre las principales causas de pérdida dental en estados del este
de Alemania. La caries fue el motivo de la exodoncia del 20,7% de todas las
extracciones, mientras que la enfermedad periodontal fue la razón de
extracción del 27,3%. De acuerdo con los 68 dentistas participantes en el
estudio alemán, la enfermedad periodontal es el motivo más frecuente de
extracción dental en personas con más de 40 años, mientras que para aquellos
por debajo de esa edad, la caries y las extracciones de terceros molares eran
las razones más frecuentes. En otro estudio, McCaul y cols (2001) observaron
que la caries y sus secuelas era la principal razón de pérdida de todos los tipos
de dientes salvo los incisivos inferiores cuya extracción se debía principalmente
a razones periodontales.
3. 1 Factores de riesgo y de susceptibilidad
El término “factor de riesgo” hace referencia a un aspecto del
comportamiento o del estilo de vida, una exposición al medio ambiente o una
- 14 -
característica congénita o heredada que acompaña a una enfermedad
determinada, según demuestran los estudios epidemiológicos. Puede asociarse
con una mayor probabilidad de manifestación de una enfermedad en particular,
sin que sea necesariamente un factor causal y es, por definición, modificable. A
diferencia de los “factores de riesgo modificables”, los factores inmodificables o
de fondo, como la edad, el sexo o el genotipo son reconocidos como “factores
de susceptibilidad”. En general hay un consenso en la literatura reciente
sobre la identificación de factores de riesgo de periodontitis; sin embargo hay
una falta de ensayos específicamente dirigidos a la distinción entre factores de
riesgo que afectan al comienzo de la enfermedad (factores de riesgo
verdaderos) y aquellos que afectan a su progresión, o incluso factores
pronóstico determinantes del curso de la enfermedad bajo tratamiento. Las
principales características individuales, condiciones clínicas, y enfermedades
sistémicas que han sido investigadas en estudios epidemiológicos como
supuestos factores de susceptibilidad y factores de riesgo modificables,
incluyen edad, sexo, raza, polimorfismos genéticos específicos, estatus
socioeconómico, placa dental, microbiota subgingival específica, tabaco,
diabetes mellitus, obesidad, infección por VIH, osteoporosis y factores
psicosociales (Genco 1996a, Albandar 2002, Borrell y Papapanou 2005).
El tabaco (Gelskey 1999), la diabetes mal controlada (Grossi y Genco
1998) y altos niveles de colonización por bacterias específicas (Genco y
Kornman 1996b) se han señalado como verdaderos factores de riesgo
(Papapanou 1996), mientras que un gran número de factores putativos,
incluyendo polimorfismos genéticos específicos, han sido identificados en
estudios de asociación (Schenkein 2002).
Vamos a revisar a continuación los llamados factores inmodificables o
de fondo. Aunque la prevalencia de la enfermedad periodontal aumenta con la
edad, la relación entre ésta y la periodontitis no está clara. Todos los estudios
que han examinado grandes poblaciones respecto a prevalencia, extensión y
avance de la enfermedad periodontal, han encontrado más enfermedad
periodontal en grupos de edad avanzada (Grossi y cols 1994, 1995). Así por
ejemplo, Mumghamba y cols (1995) en un estudio sobre 1.764 sujetos en
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Tanzania, que evaluó la asociación entre la enfermedad periodontal y diversos
factores de riesgo, mostró que una de los factores principales asociados con la
enfermedad periodontal era la edad, con una odds ratio de 4.06 y 5.05 para los
grupos de edad más avanzados, de 35-44 años y ≥ 45 años respectivamente.
Aunque la pérdida de inserción y de hueso alveolar moderada es común en
personas mayores, la periodontitis severa no es una consecuencia natural del
envejecimiento. La repercusión de la edad puede representar el efecto
acumulativo de la exposición prolongada a verdaderos factores de riesgo
(Papapanou y cols 1991). Borrell y Papapanou (2005), en una revisión de la
literatura, afirman que la “susceptibilidad individual” a la enfermedad
periodontal parece ser más importante que la edad, y sujetos con elevada
susceptibilidad manifiestan la enfermedad a una edad más temprana.
Aunque no hay diferencias inherentes establecidas entre hombres y
mujeres en la susceptibilidad a la periodontitis, los hombres muestran peor
salud periodontal que las mujeres (Burt 1999). En la Third Nacional Health and
Nutrition Examination Survey (NHANES III), U.S., Albandar y cols (1999),
observaron que los umbrales de pérdida de inserción ≥3mm, ≥ 4mm y ≥5mm
se observaron, respectivamente, en el 23%, 44% y 55% más de hombres que
mujeres. Cuando los porcentajes de dientes con pérdida de inserción se
compararon en los dos grupos de género, los porcentajes correspondientes
fueron de 48%, 65% y 93%, respectivamente. Un patrón similar de una
incidencia más elevada de enfermedad en hombres que en mujeres, se
observó en las medidas de profundidad de sondaje y recesión gingival del
mismo estudio. Esto parece ser un reflejo de mejores prácticas de higiene oral
entre las mujeres (Christensen y cols 2003, Albandar y cols 1999). En la
NHANES III, Albandar y cols (1999) encontraron que los hombres como media
tenían un 21% más de dientes con cálculo dental que las mujeres. Borrell y
Papapanou (2005) señalan que es biológicamente posible que existan
diferencias en la respuesta inmuno-inflamatoria del huésped, pero no ha sido
demostrado.
No se han documentado diferencias consistentes entre grupos étnicos
cuando se tienen en cuenta la edad y la higiene oral (Burt 1999). Además la
- 16 -
raza/etnia y el estado socioeconómico están fuertemente relacionados. En un
estudio reciente, encontraron que los sujetos de raza blanca que vivían en
barriadas con nivel socioeconómico bajo tenían cuatro veces más probabilidad
de tener trastornos de salud oral que sus equivalentes en barriadas de alto
nivel (Borrell y cols 2004).
La periodontitis afecta en mayor grado a determinadas familias (en
algunas, el porcentaje de hermanos afectados alcanza el 40-50% [Boughman y
cols 1992]), sobre todo las formas agresivas. En general, se considera que hay
suficiente base científica a favor de la presencia de factores genéticos en la
aparición de periodontitis agresivas, aunque no se dispone de datos de
gemelos y hermanos adoptados que permitan separar la influencia genética del
riesgo de exposición al mismo entorno familiar. En las periodontitis crónicas, en
cambio, la evidencia de la participación genética es menos manifiesta y es
dificíl de discriminar dado el sesgo de la posible existencia de reservorios en el
hogar y transmisión intrafamiliar.
En los últimos años ha habido un incremento exponencial en el número
de publicaciones que examinan una multitud de polimorfismos genéticos
(variaciones del gen IL-1, IL-10, TNF, etc.) como factores de severidad y
susceptibilidad de periodontitis (Schenkein 2002). Entre las citocinas que
regulan las reacciones inflamatorias figura la IL-1, cuya producción está
regulada por los genes IL-1A e IL-1B. Las mutaciones de un único par de bases
son bastante frecuentes; la secuencia de bases normal en el gen se denomina
alelo 1, y la modificada, alelo 2. La mutación donde la base citosina es
sustituida por la timina en la posición del nucleótido -889 (IL-1A) y en la
posición del nucleótido +3953 (IL-1B) da lugar a una propensión acentuada a la
inflamación. Se da el nombre de “genotipo IL-1 positivo” al genotipo que posee
esta mutación en los dos alelos del gen, o al menos, heterocigóticamente en
ambos genes IL (genes IL-1A e IL-1B).
El primer estudio que describió una relación entre los polimorfismos
codificantes de los genes IL-1 y la periodontitis fue presentado por Kornman y
cols en 1997b, mostrando una asociación con la severidad de la periodontitis
- 17 -
en pacientes de raza blanca no fumadores (OR 18,9 en grupos de edad
comprendidos entre 40 y 60 años). Sin embargo, la falta de asociación entre el
genotipo IL-1 compuesto también ha sido comunicada para pacientes con
periodontitis crónica y agresiva (Hodge y cols 2001, Rogers y cols 2002).
Cullinam y cols (2001) realizaron un estudio en 295 sujetos con gingivitis y
periodontitis moderada, que fueron seguidos durante 5 años y en quienes se
determinó el genotipo IL-1 compuesto. El 39% de los individuos era portador de
este genotipo. En los no fumadores mayores de 50 años, con genotipo IL-1
compuesto se observaron profundidades de sondaje mayores que en los
negativos para este genotipo. Además se encontró una interacción significativa
entre el genotipo IL-1 compuesto y la edad, el hábito de fumar y la presencia de
Porphyromonas gingivalis, hecho que sugiere que ese genotipo es un factor de
susceptibilidad contribuyente, pero no esencial para la progresión de la
enfermedad periodontal. Sin embargo, Borrell y Papapanou (2005) afirman que
no hay suficiente evidencia epidemiológica que establezca de forma
convincente ninguno de los polimorfismos genéticos estudiados como un
verdadero factor de riesgo.
A diferencia de los factores de fondo, existen otros que son adquiridos,
ambientales y de conducta/comportamiento. Así, el nivel socioeconómico o
educacional bajo se ha relacionado con mayores índices de enfermedad
periodontal; su papel puede atribuirse a diferencias en la posibilidad de acceder
a medios y oportunidades que faciliten comportamientos preventivos (Albandar
2002, Borrell y Papapanou 2005). Por otra parte, un hábito tóxico como el
tabaquismo está considerado hoy en día como un factor de riesgo verdadero
(Machuca y cols 2000); el fumador severo tiene 2,5 a 7 veces más probabilidad
de desarrollar una periodontitis crónica (Kinane y Chestnutt 2000). En un
estudio de Haber y cols (1993) encontraron que en una población joven (19 a
30 años), el 51-56% de las periodontitis se asociaban con el hábito de fumar.
Entre las enfermedades sistémicas, la diabetes mellitus es un factor de
riesgo verdadero de periodontitis, especialmente en sujetos con mal control
metabólico y larga duración de la enfermedad (Grossi y Genco 1998, Taylor y
cols 1998, Lalla y cols 2004). En un estudio longitudinal de dos años Taylor y
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cols (1998) evaluaron el riesgo de pérdida de hueso alveolar mediante
radiografías panorámicas en 14 diabéticos no-insulinodependientes mal
controlados, en 7 con diabetes mejor controlada y 338 no diabéticos, y
encontraron que la odds ratio de desarrollar pérdida ósea a lo largo del tiempo
era 2.2 en los diabéticos mejor controlados comparados con los individuos no
diabéticos, y 5.3 en los diabéticos mal controlados comparados con los mejor
diabéticos controlados. Lalla y cols (2004) estudiaron la asociación entre
diabetes mellitus y enfermedad oral en 150 adultos con diabetes y 150 sujetos
control, procedentes de una población urbana con bajo nivel socioeconómico, y
hallaron un incremento del 50% de pérdida ósea alveolar en los diabéticos
comparados con el grupo control.
Aunque numerosas publicaciones de la pasada década señalan un
incremento en la prevalencia y la severidad de la periodontitis en sujetos VIH-
seropositivos (Robinson y cols 1996, McKaig y cols 1998), otros, o no apoyan
esta idea o indican que las diferencias en el estado periodontal entre sujetos
VIH-seropositivos y VIH-seronegativos son mucho más limitadas de lo que se
creía en un principio. Lamster y cols (1997) concluyeron que la progresión de la
enfermedad periodontal en presencia de infección por HIV depende de la
competencia inmunitaria del huésped y de la respuesta inflamatoria local a la
microbiota subgingival típica y atípica. Datos de su laboratorio demuestran una
respuesta alterada de mediadores de la inflamación (beta-glucoronidasa e
interleuquina-1 beta). La alteración se manifiesta como la ausencia de la fuerte
correlación esperada entre la actividad de los leucocitos polimorfonucleares en
el surco gingival y las mediciones clínicas de la enfermedad periodontal
existente, así como niveles elevados de interleukina-1 beta en localizaciones
con profundidades de sondaje aumentadas. Hofer y cols (2002) demostraron
que sujetos HIV-positivos que cumplían cuidadosamente el tratamiento
periodontal, podían mantenerse periodontalmente, de manera similar a los
sujetos no infectados. El examen de las muestras de placa tomadas de
localizaciones con periodontitis en individuos seropositivos indicó que la
microbiota subgingival era muy similar a la observada en los sujetos con
periodontitis no infectados con el VIH, excepto que se encuentren
ocasionalmente microorganismos no frecuentes (Rams y cols 1991). Rams y
- 19 -
cols (1991) en un estudio con 14 sujetos infectados con el VIH que
presentaban periodontitis, hallaron A.actynomicetemcomitans, C.rectus,
P.micros y P.intermedia en un promedio de 7-16% de la microbiota cultivable
en pacientes positivos para esta especie. Además, los niveles de espiroquetas
fueron mayores, mientras que los de Candida albicans y de bacilos entéricos
gramnegativos resultaron bajos. Así, la microbiota de lesiones en individuos
seropositivos resultó bastante parecida a la de los sujetos seronegativos.
Recientemente se han apuntado nuevos factores como obesidad, la
osteopenia /osteoporosis (Tezal y cols 2000) y factores psicosociales,
aunque se necesitan ensayos mas amplios para confirmar estos hallazgos
(Genco 1996a, Albandar 2002, Borrell y Papapanou 2005).
3.2 Efectos sistémicos de las enfermedades periodontales:
Influencia sobre la patología cardiovascular
Repercusión durante el embarazo
Repercusión de la diabetes Mellitus
Recientemente se han observado asociaciones entre la presencia de
lesiones periodontales y procesos patológicos de naturaleza sistémica como la
patología cardiovascular, el embarazo o la diabetes mellitus. Se han
relacionado las enfermedades periodontales con un mayor riesgo de
desarrollar patologías cardiovasculares debido a bacteriemias de origen bucal
(Beck y Offenbacher 2005, Renvert y cols 2006), y a otros fenómenos
patológicos acompañantes como la hiperreactividad de los macrófagos y de
otros fagocitos, la liberación de endotoxinas, o la producción de distintas
citoquinas (Li y cols 2000). Se ha constatado mediante técnicas de
amplificación genéticas la presencia de Actinobacillus actinomycetemcomitans
en las placas de ateroma de 146 sujetos (Haraszthy y cols 2000a). En un
estudio de cohortes prospectivo DeStefano y cols (1993) encuentran un 25%
- 20 -
más de riesgo de enfermedad coronaria en pacientes con periodontitis
avanzada.
Por otra parte, se han relacionado también con la posibilidad de parto
pre-término y recién nacidos con bajo peso (Romero y cols 2002, López y cols
2002). Así, Marin y cols (2005) observan en gestantes mayores de 25 años,
que la enfermedad periodontal está asociada significativamente con los recién
nacidos de bajo peso. Asimismo se ha demostrado que estas madres tienen
niveles más elevados de prostaglandinas en el fluido crevicular que las madres
con recién nacidos de peso normal (131.4 +/- 21.8 vs. 62.6 +/- 10.3)
(Offenbacher y cols 1998). Dasanayake y cols (2001) hallaron que los casos
prematuros y de bajo peso tenían títulos más altos, con significación
estadística, contra Porphyromonas gingivalis (media 58.05, SE = 20.00
microg/ml) frente a los casos control (media 13.45, SE = 3.92 microg/ml; P=
0.004).
La periodontitis puede ser también un factor de riesgo para la diabetes.
Se ha demostrado que el tratamiento periodontal mejora el control metabólico
del diabético. Stewart y cols (2001) estudiaron 72 pacientes con diabetes tipo II,
la mitad de los cuales recibieron tratamiento periodontal mecánico durante 18
meses. Los pacientes de ambos grupos mostraron descensos estadísticamente
significativos en los niveles de HbA1c (una reducción del 17,1% en el grupo de
tratamiento y una reducción del 6,7% en el grupo control). Rodrigues y cols
(2003) asignaron de forma aleatoria 30 pacientes con diabetes tipo 2 a dos
grupos de tratamiento, un grupo recibió terapia periodontal no quirúrgica con
amoxicilina/ácido clavulánico y el otro recibió sólo terapia periodontal mecánica.
A los 3 meses los niveles de HbA1c se redujeron en ambos grupos, pero la
reducción fue estadísticamente significativa sólo en el grupo que recibió
únicamente raspado y alisado radicular.
- 21 -
4. ETIOLOGÍA
Como en otras patologías con una importante implicación de los
procesos inflamatorios, desde hace casi un siglo se están buscando causas
bacterianas que originan la aparición de la periodontitis. Mientras que antes
predominaba la “hipótesis de la placa inespecífica”, desde los años setenta se
ha ido responsabilizando a un número creciente de bacterias específicas como
causantes de la enfermedad.
4.1. Revisión histórica de las teorías sobre la etiología de la enfermedad
periodontal
1880 – 1930 Agentes etiológicos específicos
La búsqueda de los agentes etiológicos de las enfermedades
periodontales comenzó en la “era de oro de la microbiología” (1880-1920).
Entonces, la identificación de los agentes etiológicos estuvo muy influida por la
naturaleza de las técnicas disponibles, una situación parecida a la actual, y se
sugirieron cuatro grupos de microorganismos etiológicos: amebas,
espiroquetas, fusiformes y estreptococos. La importancia del papel de las
espiroquetas y de las bacterias fusiformes en la infección de Vincent (1899) o
“boca de trinchera" fue ampliamente reconocida en las dos décadas
siguientes. A principios de 1900, se pensó que la invasión bacteriana a los
tejidos periodontales era un fenómeno importante en la patogenia. Durante este
período se publicaron numerosos trabajos de investigación que sugirieron
ciertos agentes etiológicos específicos.
En la década de 1920, un grupo de microbiólogos orales y médicos,
partiendo de las observaciones realizadas por Vincent, sugirieron que la
enfermedad periodontal era el resultado de “infecciones mixtas”. A principios
de 1930, los investigadores comprobaron que las mezclas de microorganismos
tomadas de infecciones pulmonares o de la placa subgingival podían inducir la
aparición de lesiones al inyectarlas subcutáneamente en animales de
experimentación, causando infecciones mixtas transmisibles. Investigaciones
- 22 -
posteriores que utilizaron mezclas de bacilos anaerobios gramnegativos,
incluyendo Bacteroides melaninogenicus, causaron también infecciones
transmisibles (Macdonald y cols 1956).
1930 – 1940 Escepticismo, disminuye el interés por los microorganismos
Debido a la búsqueda de agentes etiológicos incorrectos, terapias
inadecuadas, la multiplicidad de enfermedades e hipótesis sobre su etiología
(“atrofia alveolar difusa”, “falta de función”, etc.), desapareció el concepto del
origen infeccioso y de una terapia causal, atribuyendo la causa a defectos
constitucionales, trauma oclusal, atrofia difusa y considerando a las bacterias
contribuyentes secundarios de la inflamación (Socransky y Haffajee 2005).
1950 – 1970 Hipótesis de la placa inespecífica
Dada la ineficacia de los tratamientos que se estaban empleando a
finales de la década de 1950 basados en el concepto de defectos
constitucionales o el trauma oclusal, un grupo de clínicos destacó la necesidad
de controlar la placa en la prevención y el tratamiento de las enfermedades
periodontales. Se partió de la idea de que había una relación directa entre la
cantidad de bacterias y la intensidad del efecto patógeno, sin tener en cuenta la
relevancia de las diferencias biológicas en la composición de la placa. Se creía
que los individuos con enfermedad periodontal avanzada eran más sensibles a
la placa bacteriana, o bien, mantenían una higiene oral deficiente. Según esta
teoría [denominada “hipótesis de la placa inespecífica” (Theilade 1986)],
toda acumulación de microorganismos en el margen gingival,
independientemente de su naturaleza, o por debajo de él produciría irritantes
que generarían inflamación, que en ocasiones, sería la responsable de la
destrucción del tejido periodontal. A mediados de los años sesenta los estudios
experimentales de Löe y cols (1965, 1967) y de Theilade y cols (1966)
demostraron que la acumulación de bacterias en los dientes provocaba una
respuesta inflamatoria reproducible en los tejidos gingivales, y que la
eliminación de la placa llevaba a la desaparición de esa sintomatología. En esa
- 23 -
línea de pensamiento, numerosos investigadores sostenían que la gingivitis era
el inicio de la enfermedad periodontal y que su evolución terminaba por destruir
los tejidos periodontales.
En la década de 1960 se reavivó el interés por la etiología microbiana
específica. Sin embargo, el énfasis durante esta década estuvo en el control
mecánico de la acumulación de placa, hecho que concordaba con el
concepto predominante de que la enfermedad periodontal se debía a una
acumulación bacteriana inespecífica. Este concepto todavía está vigente y
es la base de las técnicas preventivas en la mayoría de las clínicas dentales.
También está claro que el control no específico de la placa no puede evitar de
manera eficaz el desarrollo, avance o recaída de todas las formas de
enfermedad periodontal.
1970 – 2009 Hipótesis de la placa específica
A partir de los años 70 se desarrollaron procedimientos de cultivo
bacteriano que permitían la recuperación de un mayor número de especies
bacterianas anaerobias y, además, se diseñaron nuevas técnicas de
identificación.
El reconocimiento de diferencias en la composición de muestras de
placa subgingival tomadas de sitios afectados y sanos en el mismo individuo, y
entre individuos con diferentes formas clínicas de enfermedad periodontal a
partir de diversos estudios llevados a cabo en la década de 1970 (Slots 1976;
Tanner y cols 1979), llevó a la realización de investigaciones que intentaban
relacionar los microorganismos específicos con la etiología de diferentes
enfermedades periodontales.
Se observó que la tendencia de las áreas inflamadas a sufrir una
destrucción hística permanente era de naturaleza más específica, porque no
todas las gingivitis parecían avanzar de forma ineludible hacia la periodontitis.
Se señalaron como posibles patógenos algunos de los microorganismos
localizados habitualmente en las lesiones periodontales en concentraciones
- 24 -
superiores a las observadas en sujetos sanos. Si la enfermedad era
ocasionada por un grupo determinado de especies bacterianas, la eliminación
contínua de la placa no sería la única actitud profiláctica o terapéutica, y la
supresión o reducción concreta de las bacterias patógenas podría ser una
alternativa. Este concepto de la periodontitis causada por patógenos
específicos se conoce como “hipótesis de la placa específica” (Loesche
1979).
4.2 Microbiología de las enfermedades periodontales
Actualmente se considera que la etiología de la periodontitis es una
infección bacteriana específica (Loesche y Grossman 2001). Las
enfermedades periodontales son enfermedades infecciosas que, aunque
poseen muchas propiedades similares a las infecciones microbianas de otras
zonas del organismo, presentan rasgos en los cuales difieren. De forma similar
a lo que ocurre en otras enfermedades infecciosas, la colonización por
patógenos periodontales puede que no conduzca a una destrucción periodontal
evidente o manifiesta, considerándose un factor causal necesario, pero no
suficiente, considerando la importancia de los determinantes patogénicos
intraespecie, el tiempo de exposición y la respuesta inflamatoria del individuo.
Otro rasgo en común es que parecen estar causadas por un grupo
relativamente definido de microorganismos, que pueden actuar solos o en
combinación. Igualmente, presenta aspectos comunes a otras enfermedades
infecciosas, como la necesidad de los microorganismos de adherirse a una o
más superficies, de “reconocer” el medio, de la activación o inhibición de
factores de virulencia, y de la necesidad de superar o sortear los sistemas de
defensa del huésped. A diferencia de otras localizaciones infecciosas, en la
boca, los dientes aportan superficies rígidas no descamativas para los
depósitos bacterianos, dispuestas de tal manera que parte de ellas están
expuestas al medio externo y otra parte se encuentra en contacto con los
tejidos conjuntivos. De esta forma los microorganismos colonizan una
superficie relativamente estable, y permanecen continuamente en la proximidad
de los tejidos del periodonto, lo que supone un riesgo tanto para esos tejidos
como para el huésped.
- 25 -
Las enfermedades periodontales son, junto a la caries, las
enfermedades infecciosas más comunes que afectan al ser humano. La
característica más destacada de estas enfermedades es que están causadas
por microorganismos que residen en biocapas externas al organismo (placa
dental supra y subgingival) que se organizan/adhieren sobre los dientes o las
superficies periodontales. Estas biopelículas están formadas por microcolonias
de células bacterianas (15-20% del volumen), no distribuidas de manera
aleatoria, que se encuentran rodeadas por una densa matriz de
exopolisacáridos –sobre la cual se pueden depositar otros materiales tanto
orgánicos como inorgánicos (Socransky y Haffajee 2002). La biopelícula
promueve propiedades metabólicas que no serían posibles si las bacterias se
encontraran en estado planctónico, y proporciona un medio protector para la
colonización y multiplicación de microorganismos, aumentando la resistencia
de estos a los mecanismos defensivos del huésped y a los agentes
antimicrobianos (Socransky y Haffajee 200a).
Por lo general se desconoce el reservorio de los patógenos. En su
mayor parte las especies encontradas en los seres humanos son específicas
de ese entorno y, no suelen hallarse en el ambiente ni en la microbiota
subgingival de otras especies animales y se considera que el reservorio podría
ser el ser humano (Van Winkelhoff y Boutaga 2005). Por ello se cree que la
transmisión en las familias o entre personas no emparentadas desempeña un
papel esencial en la transmisión de estos patógenos (Petit y cols 1993ab,
Saarela y cols 1993, Preus y cols 1994).
La formación de una biocapa sobre una superficie limpia, dura y no
descamativa, como el diente, tras su inmersión en un medio líquido, como la
cavidad oral, se desarrolla en varias fases. Inmediatamente después de su
inmersión o después de la limpieza, se produce la adsorción de
macromoléculas hidrófobas [glucoproteínas salivales e inmunoglobulinas] a la
superficie formando una biopelícula (la película adquirida). La adhesión
bacteriana a esta capa supone la incorporación de los formadores primarios de
la placa: cocos y bacilos grampositivos facultativos. Este fenómeno se produce
- 26 -
en dos etapas: la primera, reversible, en la que las bacterias se adhieren
débilmente, y a continuación se alcanza un status irreversible en el que la
unión se consolida. Los colonizadores primarios se multiplicarán para
formar colonias favoreciendo el crecimiento de la matriz extracelular. Sobre
receptores de estas bacterias se producirá la adición secuencial de más
especies, entre ellas gramnegativos anaerobios estrictos, hasta formar una
biocapa más compleja y madura, cuya heterogeneidad se incrementará con el
tiempo (Marshall 1992) (Fig 1.). Estos aspectos los desarrollamos con mayor
detalle al describir los efectos sinérgicos de los periodontopatógenos (4.2.2
Bacterias periodontopatógenas).
Fig 1. Etapas de la formación de una biocapa.
La formación de esta estructura tan compleja necesita tiempo, que, en
función de las condiciones ambientales del surco gingival y las características
patogénicas de los componentes de la flora subgingival, explicarían la
asociación encontrada en los estudios epidemiológicos entre la edad y la
gravedad de las lesiones.
La composición de la flora supra e infragingival difiere, ya que se
observan diferencias de composición y de cantidad. El aporte sanguíneo local y
los componentes del líquido gingival facilitan el crecimiento de las especies
bacterianas gramnegativas con mayor potencial periodontopático. Debido a la
dificultad de obtener muetras de placa subgingival preservada en su posición
- 27 -
entre la encía y los tejidos duros del diente, sólo se dispone de algunos
estudios sobre su estructura interna (Listgarten 1976, Westergaard y cols
1978).
La estructura de la placa supra y subgingival es similar, en particular, en
casos de gingivitis sin bolsas profundas. Las bacterias incluyen cocos
gramnegativos y grampositivos, bacilos y microorganismos filamentosos. Se
observan espiroquetas y bacterias flageladas, especialmente en la zona más
apical de la placa. La capa superficial suele ser menos densa, con leucocitos
interpuestos entre la placa y la superficie epitelial del surco (Listgarten 1976).
En la bolsa periodontal, la estructura de la placa adquiere mayor
complejidad. Se distinguen cuatro nichos ecológicos subgingivales de
composición probablemente diferente: a) la superficie del diente (placa
adherida), b) el medio líquido del exudado gingival (placa laxamente adherida),
c) la pared blanda de la bolsa y d) la superficie del epitelio de unión (Listgarten
y cols 1975, 1976). Aún no se ha investigado en profundidad la composición
bacteriana de estos reservorios, desconociéndose la influencia de cada uno de
ellos en la patogenia de la enfermedad. Los estudios de Listgarten y cols (1975,
1976 y 1979) mostraron que la superficie orientada hacia el tejido blando
almacena una cantidad mayor de espiroquetas, bacterias flageladas y cocos y
bacilos gramnegativos. Estos estudios llevaron a la teoría de los complejos de
Sokransky y su disposición espacial en el surco. Estudios posteriores han
detectado la presencia de grandes cantidades de bacterias
periodontopatógenas en la biocapa que recubre la superficie epitelial (P.
gingivalis, Tr. denticola y T. forsythia) (Kigure y cols 1995, Dibart y cols 1998).
4.2.1 Características de una bacteria periodontopatógena
En la cavidad oral se ha detectado hasta ahora la presencia de más de
700 microorganismos distintos, empleando técnicas de cultivo y métodos
moleculares, y más de 400 de ellos se hallan en las bolsas periodontales
(Paster y cols 2006), los cuales normalmente se mantienen en un equilibrio
ecológico fisiológico con el organismo huésped. Lo que conocemos hasta
- 28 -
ahora es que del conjunto de bacterias orales, un subgrupo de especies
bacterianas, las denominadas especies periodontopatógenas, son capaces de
desencadenar la destrucción del periodonto. El desequilibrio que produce este
subgrupo suele corregirse espontáneamente o tras la aplicación de medidas
terapéuticas (Socransky y Haffajee 2005a).
Debido a la complejidad de la flora subgingival, fue necesario establecer
la relación causal, para lo cual Haffajee y Socransky (1994) adaptaron los
postulados de Koch para utilizarlos en la identificación de patógenos
periodontales y propusieron los siguientes criterios:
1. Asociación: elevadas odds ratios en enfermedad al compararlo con sujetos
sanos.
2. Eliminación: conversión de enfermedad a salud cuando las bacterias son
eliminadas.
3. Desarrollo de una respuesta inmunitaria específica del huésped.
4. Presencia de factores de virulencia.
5. Evidencia de estudios en animales corroborando las observaciones en
humanos: la inoculación en animales desarrolla la enfermedad.
6. Apoyo de estudios de evaluación de riesgo.
En conjunto, estos apartados señalan que la consideración de una
especie como periodontopatógena, no se basa en un solo criterio, sino en el
“peso de la evidencia” de una evaluación. No sólo es importante su asociación
con la enfermedad, sino la mejora de la enfermedad tras la “eliminación” de los
patógenos con el tratamiento, la activación de la respuesta del huésped a la
infección específica, la constatación de la presencia de factores de virulencia,
la creación de cuadros clínicos similares a la periodontitis en la
experimentación animal y el apoyo de estudios prospectivos en los que puede
evaluarse el riesgo de progresión de la enfermedad por la presencia de un
microorganismo en determinados niveles.
- 29 -
4.2.2 Bacterias periodontopatógenas
Basándose en los criterios descritos por Socransky, el Congreso Mundial
de Periodoncia (Genco y Kornman 1996b) identificó tres especies como
patógenos periodontales: Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa),
P.gingivalis (Pg) y Tannerella forsythia (Tf) (anteriormente conocida como
Bacteroides forsythus).
Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aggregatibacter
actinomycetemcomitans): Fue la primera especie reconocida en el “consenso
de patógenos periodontales”, inicialmente por su asociación con lesiones de
LJP, y más tarde por la reducción de sus niveles en sujetos tratados con éxito,
la respuesta elevada de anticuerpos para esta especie, la inducción de la
enfermedad en animales de experimentación y la presencia de numerosos
factores de virulencia (Haffajee y Socransky 1994).
Actinobacillus actinomycetemcomitans pertenece al género
Actinobacillus, de la familia Pasteurellaceae. Es un bacilo pequeño,
gramnegativo, capnofílico, no móvil, sacarolítico, de extremos redondeados,
que crece en medios de cultivo formando colonias pequeñas y convexas con
un centro en “forma de estrella” (Murray y cols 1999). El nicho ecológico
primario de Aa es el área subgingival (Slots y cols 1980), aunque se encuentra
frecuentemente en superficies dentales supragingivales, en las mucosas de la
cavidad oral y también puede aparecer en saliva (Socransky y cols 1999).
Recientemente se ha propuesto la reclasificación de este
microorganismo en función del gen que codifica la nicotinamida fosforibosil
transferasa (enzima que permite a Aa y algunos Haemophilus crecer sin factor
V). La propuesta englobaría a Aa dentro del género Aggregatibacter junto con
H. aphrophilus y H. segnis (Norskov-Lauritsen y Kilian 2006).
Numerosas líneas de investigación apoyan su papel etiológico como un
verdadero patógeno periodontal, sobre todo en relación con periodontitis
agresivas (Slots y Ting 1999, Fives-Taylor y cols 1999, Socransky y cols 1999).
- 30 -
Aa no sólo ha sido encontrado en diferentes formas de periodontitis, sino
también en sujetos periodontalmente sanos. Asikainen y cols (1991) obtuvieron
muestras de placa subgingival y de saliva estimulada de 293 sujetos, 232 con
periodontitis y 61 periodontalmente sanos, y detectaron Aa en el 62,5% de las
muestras de los sujetos sanos y en el 71,9% de las muestras de los individuos
con periodontitis.
Aa es una especie heterogénea en cuanto a su capacidad patogénica.
Se han reconocido seis serotipos de Aa (Henderson y cols 2002). El serotipo b
es el más frecuentemente asociado con periodontitis agresiva localizada, y el
considerado más virulento y patogénico (Henderson y cols 2002). Zambon y
cols (1983a) estudiaron 29 pacientes con PJL y observaron que la incidencia
del serotipo b era aproximadamente dos veces superior que los serotipos a o c,
sugiriendo un mayor potencial patógeno de este serotipo. Por otra parte,
Haraszthy y cols (2000b), empleando una técnica de PCR, detectaron este tipo
clonal virulento en 39 de 71 sujetos con LJP. Este serotipo es muy homogéneo
genéticamente, se han detectado pocos clones diseminados en grandes áreas
geográficas, a diferencia de los otros serotipos que son muy heterogéneos
(Haubek y cols 1996) El serotipo a, ha sido implicado en formas adultas de la
enfermedad periodontal destructiva, pero su papel está menos claro (Zambon
1983b).
En esta especie se han identificado varios factores de virulencia: una
leucotoxina, una toxina de distensión celular, mecanismos de adherencia como
la producción de pili y proteínas específicas y, por último los carbohidratos
extracelulares. La leucotoxina es una toxina de la familia RTX, a la que
pertenecen la alfa-hemolisina de Escherichia coli y la adenilato ciclasa de
Bordetella pertussis (Lally y cols 1999). Esta toxina interfiere con el
funcionamiento de los polimorfonucleares humanos, induce la apoptosis de los
leucocitos y, a altas concentraciones, es capaz de formar poros
transmembrana provocando la muerte celular (Baehni y cols 1979).
En estudios recientes se planteó la posibilidad de que sólo un subgrupo
de tipos clonales de Aa fuera el causante de la PJL. En un estudio, DiRienzo y
- 31 -
McKay (1994) sobre 800 aislamientos de miembros de 18 familias con al
menos un miembro con PJL activa o una historia documentada de la
enfermedad y uno o más hermanos, menores de 13 años, sin evidencia clínica
de LJP y 32 sujetos control, identificaron un genotipo específico de Aa que
parecía estar asociado con la PJL y fue asociado con la conversión de salud
periodontal a enfermedad. Identificaron también dos clones que fueron aislados
exclusivamente en sujetos periodontalmente sanos (RFLP Tipo XIII y XIV).
Brogan y cols (1994) y otros evidenciaron que el tipo clonal virulento (JP2)
mostraba una producción 10 a 20 veces aumentada de leucotoxina respecto a
una cepa de Aa mínimamente tóxica (652) y se hallaba frecuentemente en
pacientes de origen norteafricano (Haubek y cols 1996, 2002). Haubek y cols
(2001) estudiaron 217 muestras de placa de niños marroquíes con EOP, 131
(60,4%) fueron positivas en el cultivo para Aa. En los pacientes que fueron
postivos para Aa, se recuperaron 19 aislados en los que se observó una
delección de 530 bp en la zona del promotor del gen que codifica la
leucotoxina, ltx. La consecuencia de esta delección es una producción
aumentada de la toxina. Se halló una fuerte asociación entre la presencia del
clon JP2 de Aa y EOP (OR=29,4).
Además, se ha identificado la producción de uan seguna toxina, cdt,
capaz de inducir la apoptosis de linfocitos T y B, pero no afecta a los
fibroblastos (Shenker y cols 1982). Esta toxina de distensión celular es similar a
la asociada a Campylobacter jejuni, E. coli y Shigella spp (Pickett y Whitehouse
1999). El efecto más significativo de ambas toxinas es la interrupción de la
actividad leucocitaria y linfocitaria, produciéndose un mayor reclutamiento de
células inflamatorias. Como consecuencia de esta hiperreactividad, se produce
el daño tisular del tejido conectivo y óseo.
El grupo clonal JP2 tiene una capacidad de colonización persistente no
observada en otras variantes genéticas de esta especie. En un estudio
realizado en 365 niños marroquíes, Haubek y cols (2009) observaron que casi
la mitad de los pacientes estaban infectados de forma continua por este
microorganismo y que esto estaba relacionado (RR = 13.9) con una forma
agresiva de la enfermedad. En este tipo de aislados se ha identificado una “isla
- 32 -
de colonización extendida” (widespread colonization island o WCI). Esta isla,
denominada complejo WCI, es un conjunto de 14 genes que codifican proteinas
(flp-rcp-tad) responsables de la adherencia, autoagregación y formación de la
biocapa (Planet y cols 2003). Adicionalmente a este complejo, se ha detectado
en esta especie la producción de un polímero extracelular de D-glucosamina,
demnominado PGA, que actúa en la formación de la biocapa como cemento
que facilita la autoagregación (Kaplan y cols 2003).
Por último, los pacientes con periodontitis juvenil presentan niveles de
anticuerpos séricos contra Aa claramente elevados en comparación con los de
sujetos sanos (Listgarten y cols 1981, Ebersole y Taubman 1994). Listgarten y
cols (1981) determinaron los niveles de anticuerpos séricos contra cuatro cepas
de Aa utilizando una técnica de inmunofluorescencia indirecta en tres grupos
de 21 pacientes cada uno con periodontitis juvenil, periodontitis crónica y sin
periodontitis y encontraron que los niveles medios de anticuerpos contra Aa
estaban significativamente elevados (p<0.05) en el grupo de periodontitis
juvenil para tres de las cepas que contenían una leucotoxina.
Porphyromonas gingivalis: Es un miembro del género Porphyromonas, de la
familia Bacteroidaceae; pertenece al grupo de los Bacteroides de pigmentación
negra que forman colonias de color negro-amarronado. Es un coco-bacilo
gramnegativo, anaerobio estricto, no móvil, y asacarolítico, que forma
pequeñas colonias convexas (1-2mm) con una típica pigmentación marrón
oscura o negra (Murray y cols 1999). El nicho ecológico de Pg es el área
subgingival (Slots 1979, Danser y cols 1995), aunque se puede encontrar de
manera ocasional en las mucosas orales y en saliva. Van Winkelhoff y cols
(1988) encontraron Pg en seis de ocho muestras de saliva de pacientes con
periodontitis sin tratar en recuentos de 6 a 20 x 106 UFC/ml. Es considerado un
verdadero patógeno periodontal, más comúnmente asociado con la
periodontitis crónica (Slots y Ting 1999, Socransky y cols 1999, Holt y cols
1999).
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Madianos y cols (1997), en un estudio in vitro, observaron que Pg puede
inhibir la migración de los PMN a través de la barrera epitelial. Además en otro
estudio in vitro, Sandros y cols (2000) demostraron que Pg afecta a la
producción o degradación de citocinas por células de mamíferos. Esta especie
se ha encontrado en escasa cantidad en sujetos sanos o con gingivitis, y se
detecta con mayor frecuencia en las formas destructivas de la enfermedad
(Haffajee y Socransky 1994). Wolf y cols (1993) observaron que la OR de
encontrar altos niveles de Pg era de 3.9 en bolsas > 5mm. También se ha
demostrado que aumenta su número o frecuencia de detección en
localizaciones deterioradas. Así, en un estudio sobre 16 pacientes con EOP se
detectó mediante PCR la presencia de Pg en el 71,9% de las localizaciones
activas (Kamma y cols 2001). Además se ha asociado con un riesgo elevado
de gravedad y progreso de la enfermedad. Grossi y cols (1995) encontraron
que la colonización subgingival por Pg estaba asociada con una pérdida ósea
severa (OR 1,73).
El hecho de que pueda estar presente Pg en bolsas periodontales
activas y en surcos gingivales sanos sugiere que es una especie heterogénea
con subpoblaciones de elevada y baja patogenicidad (Frandsen y cols 2001).
Se han empleado diversos métodos de tipificado molecular para la
caracterización de clones patógenos. Sin embargo, el poder discriminatorio y la
reproducibilidad de estos métodos son variables. Estudios basados en la
secuenciación de varios genes esenciales, metodología denominada Multilocus
Type Sequencing o MLST, sugieren que esta especie es panmítica. En este
sentido llama la atención que el 7% del genoma de esta especie contiene
secuencias repetitivas, especialemente secuencias de inserción o IS. Estas
secuencias originan una alta frecuencia de recombinación intraespecífica,
aunque con escasa repercusión a nivel proteico, pero que produce un alto
grado de polimorfismo (Koehler y cols 2003).
En esta especie bacteriana se observa una mayor variabilidad en el
especio intergénico de los genes codificantes de ribosomas (ISR) que en el
propio gen 16S ARNr que se usa habitualmente para determinar filogenia.
(Rumpf y cols 2000). Griffen y cols (1999) analizando las secuencias IRS,
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determinaron la existencia de 11 heteroduplex o variantes genéticas mientras
que en otros estudios, com o el de Ley y cols (Leys y cols 1999), se han
encontrado hasta 22 variantes clonales. En ambos estudios se detectó Pg en el
79% de los sujetos con periodontitis y en el 25% de los individuos sanos (p<
0,0001), pero lo más interesante fue la asociación de algunas variantes
genéticas, como la HW83, la h49417 y la hHG1691, que estaban
significativamente asociadas a enfermedad. La probabilidad de encontrar hW83
y h49417 fue (para cada una de ellas) casi diez veces superior en pacientes
con periodontitis que en sujetos sanos, pero el intervalo de confianza del 95%
fue menor para la hW83. Estos datos indican que la virulencia en la
periodontitis humana varía entre las cepas de Pg, e identifican un subgrupo
muy virulento.
En un estudio de Enersen y cols (2006) se analizaron un total de
cuarenta cepas de Pg procedentes de 9 países de 4 continentes mediante
MLST (multilocus sequence typing); 38 de pacientes con periodontitis crónica y
2 de un estudio en monos Macaca fascicularis con periodontitis. Utilizando esta
metodología se identificaron un total de 33 patrones, y se hallaron clones
idénticos o relacionados en aislamientos de diferentes regiones geográficas.
Estos resultados mostraron signos de una estructura poblacional clonal,
con un nivel de recombinación no tan elevado como el que se había
sugerido previamente para esta especie. Este estudio proporciona evidencia
adicional de una alta diversidad genética de la especie, pero a pesar de la
amplia recombinación, existe algún grado de clonalidad en la subpoblación
patógena de Pg.
En esta especie se han identificado varios determinantes de
patogenicidad: el polisacárido capsular, o antígeno K, las hemaglutininas, la
fimbria y las gingipaínas. Únicamente los clones virulentos están capsulados y
poseen los genes codificantes de los enzimas responsables de la síntesis de la
cápsula (Aduse-Opoku y cols 2006). Los anticuerpos producidos por los
pacientes periodontales están dirigidos frente a esta estructura polisacárida
(O´Brien-Simpson y cols 2000) y se ha observado que es responsable de
reducir la respuesta inmune de los fibroblastos (Brunner y cols 2010) Las
- 35 -
gingipainas son cistein proteasas que están presentes en la superficie de P.
gingivalis y que poseen un alto poder proteolítico además de poseer dominios
de adhesinas. La actividad de las gingipainas está relacionada con la
destrucción tisular y la pérdida de inserción observada en la enfermedad
periodontal (Eley y Cox 1996), así como en su capacidad de adherencia
interbacteriana y a células como fibroblastos, eritrocitos, leucocitos y células
epiteliales. De forma adicional, esta especie expresa 5 hemaglutininas en la
superficie implicadas en la adhesión a receptores oligosacáridos de células
humanas (Bodet y cols 2007). Respecto al tipo de fimbria, en estudios recientes
se ha observado que los aislados virulentos se caracterizan por expresar el
alelo tipo II de la fimbria A, mientras que los que no están asociados con
patología expresan el tipo I (Kato y cols 2007). La fimbria, junto con las
gingipaínas-adhesinas y las hemaglutininas, juegan un papel decisivo en la
adeherencia bacteriana de P. gingivalis.
La adhesión constituye la etapa inicial de la invasión de tejidos
periodontales de esta especie. La adhesión desencadena una serie de señales
en la célula humana, mediante la activación de quinasas, que provocan la
formación de una invaginación de la membrana que acaba rodeando a la
bacteria e internalizándola (Houalet-Jeanne y cols 2001). Una vez en el interior
de la célula es capaz de multiplicarse dentro de la vesicula invaginada
(Houalet-Jeanne y cols 2001) y también de propagarse a células contiguas sin
pasar por el espacio extracelular (Yilmaz y cols 2006) y de esta forma
diseminarse en los tejidos y escapar a la acción de los fagocitos.
Tannerella forsythia (Bacteroides fusiformes/ forsythus): Es un bacilo
fusiforme muy pleomórfico, gramnegativo de crecimiento lento (requiere entre 7
y 14 días para la formación de colonias diminutas), anaerobio, no móvil y
asacarolítico (Murray y cols 1999). Su nicho ecológico es el área subgingival,
aunque se ha encontrado también en las amígdalas, en el dorso de la lengua y
en la saliva. Es una especie difícil de cultivar. Su crecimiento mejora con el
cocultivo con F. nucleatum y con la inclusión de ácido N-acetilmurámico en el
- 36 -
medio de cultivo, Tf tiene un requerimiento infrecuente de este factor, que es
un componente esencial de la pared celular de peptidoglicano (Wyss 1989).
Los determinantes de patogenicidad observados en esta especie han
sido su capacidad de adherencia y de inducción de la apoptosis celular. La
pared bacteriana de T. forsythia es la responsable de la adherencia a células
epiteliales (Sabet y cols 2003) y a otras especies bacterianas como P.
gingivalis y T. denticola, propiedad muy significativa para la formación de
biocapas en las bolsas periodontales. Recientemente, el fenómeno de
apoptosis, caracterizado por la activación de las caspasas, endonucleasas
eucariontas, se ha relacionado con la destrucción de tejidos periodontales
(Bantel y cols 2005). Las lipoproteínas de la membrana bacteriana de esta
especie son capaces de activar las caspasas 3 y 8 de varias líneas celulares
humanas (Hasebe y cols 2004).
Además de las tres especies descritas, se ha demostrado una
asociación moderada para otras bacterias aisladas de la microbiota subgingival
como Campylobacter rectus (Cr), Eubacterium nodatum (En),
Fusobacterium nucleatum (Fn), Peptostreptococcus micros (Pm),
Prevotella intermedia (Pi) y Prevotella nigrescens (Pn), Streptococcus
intermedius (Si) y varias espiroquetas, como Treponema denticola (Td)
(Genco y Kornman 1996b). La mayoría de estos patógenos pertenecen a la
microflora oral normal y se encuentran presentes normalmente en casos de
gingivitis y en sujetos sanos, por lo que su papel en la etiología es menos
evidente.
Estudios preliminares han sugerido a determinados grupos de especies
como iniciadores o posibles contribuyentes a la patogenia de la enfermedad
periodontal: Eikenella corrodens (Ec), bacilos entéricos, especies de
Pseudomonas y de Staphylococcus y levaduras (Genco y Kornman 1996b).
Algunas de estas especies como, especies de pseudomonas y de bacilos
entéricos, se encuentran raramente, y en relativamente poca cantidad, en la
población occidental. Su papel etiológico parece también poco claro.
- 37 -
Recientemente se ha implicado a virus, como el de Epstein-Barr, el
citomegalovirus humano, el virus del papiloma y el del herpes simple en la
etiología y evolución de las enfermedades periodontales. La infección gingival
viral podría producir un deterioro de los mecanismos del huésped a la
microflora subgingival local, lo que favorecería la colonización por patógenos
periodontales y el desarrollo de la enfermedad inflamatoria destructiva
(Contreras y Slots 2000, Ling y cols 2004). Estos genomas víricos han sido
aislados de lesiones periodontales de pacientes con periodontitis crónica
(Contreras y Slots 1996), agresiva (Michalowicz y cols 2000) y periodontitis
asociada con enfermedades sistémicas en estudios transversales (Contreras y
cols 2001).
Efectos sinérgicos de los periodontopatógenos
Hoy en día las enfermedades periodontales se consideran infecciones
bacterianas mixtas. Las bacterias no actúan como especies individuales, sino
que existen asociaciones específicas entre las especies bacterianas en las
biopelículas. Socransky y cols (1998) elaboraron una clasificación que incluía
la presencia de seis grupos microbianos dentro de la placa dental, que se
asocian al colonizar la superficie dental, a los que asignaron un código de
colores en función de su patogenicidad (Fig. 2). Examinaron más de 13.000
muestras de placa subgingival procedentes de 185 adultos y emplearon
análisis de conglomerados y técnicas de ordenación de comunidad.
- 38 -
Fig. 2. Esquema de la asociación entre especies subgingivales (Socransky y cols 1998).
Azul: Actinomyces spp
Amarillo: bacterias del género Streptococcus.
Verde: Capnocytophaga spp, A. actinomycetemcomitans serotipo a, E.
corrodens y Campylobacter concisus.
Púrpura: Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula
Naranja: Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Eubacterium
nodatum, Campylobacter showae, Fusobacterium nucleatum,
Fusobacterium periodonticum, Peptostreptococcus micros, Prevotella
intermedia, Prevotella nigrescens y Streptococcus constellatus.
Rojo: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia y Treponema
denticola.
Bacterias que no pertenecen a ningún complejo microbiano, como es el
caso de A. actinomycetemcomitans serotipo b.
ACTYNOMICES
SPECIES
STREPTOCOCUS SP. S. GORDONII
S. INTERMEDIUS
S. MITIS S. ORALIS
S. SANGUIS
E. CORRODENS C. GINGIVALIS C. SPUTIGENS C. OCHRACEA C. CONCISUS
A. ACTINO. A
V. PARVULA
A. ODONTOLYTICUS
P.INTERMEDIA P.NEGRESCENS P.MICROS F.NUC.VICENTII F.NUC.NUCLEATUM F.NUC.POLYMORPHUM
F.PERIODONTICUM
C. GRACILIS C. RECTUS
E. MODATUM
C. SHOWAE S. CONSTELLATUS
COMPLEJOS BACTERIANOS
SUBGINGIVALES
A. ACTINO. B S. NOXIA
R.GINGIVALIS T.FORSITHIA
T.DENTICOLA
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Los cuatro primeros grupos de especies son colonizadores iniciales del
surco gingival y forman parte de la flora supragingival normal, presente en
pacientes sanos y también en pacientes sin dientes. Las especies del complejo
naranja preceden a la aparición de los periodontopatógenos y favorecen la
formación de biocapas de especies más patógenas, especialemente
Fusobacterium y Prevotella. Este complejo es necesario para la estabilidad de
la biocapa. La sucesión bacteriana facilita la maduración de las poblaciones de
la placa, y se cree que el establecimiento de los agentes periodontopatógenos
depende de los cambios en la diversidad bacteriana que se producen a medida
que la biocapa se desarrolla (Socransky y cols 1998).
Las especies de Actinomyces son las que parecen dominar en la placa
supragingival y subgingival de individuos sanos y enfermos. Sin embargo, a
medida que se avanza del medio supragingival al subgingival y de la salud
a la enfermedad, hay una disminución en las especies de Actinomyces y
un predominio de los miembros del complejo rojo y naranja.
Las características más destacables que interviene en la formación de las
biocapas bacterianas y que explican la arquitectura observada en los complejos
de Sokransky son la agregación bacteriana y el comensalismo entre especies.
Dentro de la agregación bacteriana hay que distinguir la autoagregación y la
coagregación. La autoagregación es la propensión a agregarse células de la
misma especie, característica común a los colonizadores primarios y a muchos
patógenos. Específicamente, tanto Aggregatibacter como Porphyromonas son
conocidos por sus propiedades autoagregativas, que incluso definen el taxon
en el caso de A. actinomycetemcomitans. Esta propiedad confiere ventajas
frente a especies no autoagregativas, debido a que aumenta la unión en
biocapas en fases iniciales de formación (Elliot y cols 2006).
La coagregación se produce entre bacterias de distintas especies. Los
fenómenos de coagregación están mediados por componentes de la superficie
bacteriana, en muchos casos proteinas sensibles a proteasas, que reconocen y
se unen a receptores específicos de otra especie. Está comunicación
interbacteriana explica la sucesión ordenada y organizada de especies
- 40 -
bacterianas orales en la arquitectura de las biocapas subgingivales. Un
esquema representativo se muestra en la figura 3 a partir de los trabajos de
Kolebrander y cols (2002). Kolenbrander y cols (2002) demostraron relaciones
similares a las de los complejos microbianos de Socransky y Haffajee en
estudios de coagregación in vitro, en los que examinaron las interacciones
entre pares de especies bacterianas de la cavidad bucal diferentes, lo que
sugiere que la coagregación podría ser un determinante ecológico relevante en
el desarrollo de la biodiversidad de la placa supragingival y subgingival. Entre
las especies orales analizadas, Fusobacterium nucleatum, perteneciente al
complejo naranja de Sokransky, ha demostrado unas capacidades únicas,
mediando en la coagregación de los primeros colonizadores con las especies
patógenas como P. gingivalis. Se ha observado que la presencia de F.
nucleatum favorece el crecimiento de P. gingivalis incluso en ambientes
atmósferas desfavorables (Diaz y cols 2002). Por otra parte, la detección de T.
forsythia en una bolsa periodontal con frecuencia se ve acompañada con la
presencia simultánea de P. gingivalis.
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Figura 3. Esquema representativo de la coagregación bacteriana en la placa
subgingival (Kolebrander y cols 2002).
- 42 -
5. DIAGNÓSTICO
5.1 Diagnóstico de la periodontitis
En el diagnóstico debemos considerar tres aspectos: el motivo de
consulta, los cambios inflamatorios de la encía y los signos de destrucción
periodontal. Los motivos de consulta son, con frecuencia, signos y síntomas
tardíos de la enfermedad e incluyen la movilidad y migraciones dentarias,
recesiones gingivales, abscesos periodontales y halitosis. El grado de
inflamación gingival se evalúa mediante un examen visual y el sangrado al
sondaje, que detecta la presencia de inflamación subgingival. La lesión
inflamatoria destructiva del periodonto da lugar a una migración apical del
epitelio de unión y a una afectación de los tejidos periodontales profundos
(cemento radicular, ligamento periodontal y hueso alveolar). Las
manifestaciones clínicas principales de la enfermedad son la presencia de
profundidades de sondaje superior a 3 mm y la recesión gingival. La pérdida de
inserción clínica (suma de la recesión gingival más la profundidad de bolsa al
sondaje) junto con el estudio radiológico, mediante serie periapical, nos permite
valorar la pérdida de soporte óseo y realizar un diagnóstico completo de la
afectación periodontal.
Las bolsas con mayor profundidad de sondaje tienen mas riesgo de
progresión que las poco profundas, tanto en pacientes tratados como en los no
tratados; además, cuanto mayores son las profundidades de sondaje mayor es
el riesgo de progresión de la enfermedad en el futuro (Greenstein 1997a). El
sangrado al sondaje es el indicador más preciso de actividad de la lesión
(Lang y cols 1986), sin embargo, hay que tener en cuenta que los signos de
inflamación pueden estar ausentes en períodos de inactividad o ser signos
inespecíficos de inflamación gingival. Lang y cols (1990), en un estudio
prospectivo de dos años y medio de duración concluyeron que el hecho de que
el valor predictivo positivo de progresión de enfermedad fuera sólo del 6% y el
valor predictivo negativo del 98% hace que la ausencia contínua de “sangrado
al sondaje” sea un predictor fiable del mantenimiento de la salud periodontal.
- 43 -
Es necesario además, valorar otros aspectos como la edad de comienzo
y la tasa de progresión del proceso (si tenemos datos clínicos o radiológicos
anteriores del mismo paciente). La extensión del proceso indicará si un caso es
diagnosticado como localizado o generalizado, y la severidad de la destrucción
periodontal nos indicará si estamos ante un caso inicial, moderado o avanzado.
Es importante determinar la presencia de factores de susceptibilidad y de
riesgo que pueden influir negativamente en el resultado del tratamiento y en la
evolución durante el mantenimiento.
5.2 Importancia del diagnóstico microbiológico en Periodoncia
La utilidad del diagnostico microbiológico persigue varios objetivos en la
consecución final de una eficacia terapéutica. En primer lugar se trata de
distinguir tipos microbiológicos de infecciones periodontales, para
seleccionar a los pacientes que deben recibir tratamiento antibiótico
sistémico (periodontitis agresiva, refractaria, recurrente, combinadas con
enfermedades sistémicas, periodontitis crónica muy avanzada e implantología).
La elección del tratamiento óptimo pretende la eliminación de los gérmenes
y trata de evitar la aparición de resistencias.
Varios estudios han probado la utilidad de la identificación microbiológica
como ayuda en el plan de tratamiento, como el trabajo de Rosenberg y cols
(1993) que investigaron la eficacia de obtener datos basales de cultivo y datos
de sensibilidad en pacientes con periodontitis del adulto. Individuos
diagnosticados de PC, PRP o PR fueron seguidos durante un período de 6
años. Más del 95% de los pacientes con PC fueron tratados con éxito
únicamente con terapia mecánica; aproximadamente la mitad de los pacientes
con PRP fueron tratados con éxito sin antibióticos y, todos los pacientes con
PR necesitaron antibióticos sistémicos. La mayoría de los sujetos con PC
mostraban una o dos especies de microorganismos al inicio, y éstas eran
eliminadas o reducidas a niveles muy bajos mediante la terapia mecánica. Por
el contrario, los pacientes con PRP o PR presentaban múltiples especies y
- 44 -
requerían antibióticos sistémicos junto con la terapia mecánica para detectar
descensos de recuentos de bacterias en la microflora subgingival.
Asimismo el diagnóstico microbiológico ayuda a establecer cuando se
debe terminar el tratamiento periodontal activo, y contribuye a definir la
frecuencia del mantenimiento. Renvert y cols (1996) evaluaron el efecto clínico
del tratamiento dirigido a la supresión de Aa y Pg por debajo de los niveles de
detección, y Pi por debajo del 5% de la flora cultivable de la bolsa periodontal.
La presencia de Aa, Pg y Pi, solos o en combinación, se correlacionó con
cambios en el nivel de inserción a nivel individual. Chaves y cols (2000)
demostraron que la presencia de Pg tenía un valor predictivo en su progresión
y en la pérdida de hueso alveolar (valor predictivo positivo 84%, valor predictivo
negativo 85%, odds ratio 31.9, p<0.0001). En el mismo sentido, Tran y cols
(2001) comprobaron que los pacientes en los que persistía Tf tenían 5.3 veces
más probabilidades de desarrollar pérdida de inserción que aquellos que no lo
tenían. En otro estudio (Dahlen y Rosling 1998) se evaluó si la presencia de
Aa, Pg y Pi, detectados por cultivo podía discriminar entre pacientes con
enfermedad periodontal recurrente, con enfermedad periodontal tratada o
sujetos periodontalmente sanos. Aunque los tres microorganismos se
encontraban significativamente más frecuentemente en sitios enfermos, se
concluyó que una muestra positiva para los tres indicaría una falsa señal de
actividad de la enfermedad. Sin embargo, una muestra negativa para las tres
bacterias indica fuertemente ausencia de actividad de la enfermedad.
Por último, las técnicas de diagnóstico microbiológico permiten
seleccionar pacientes con necesidad de tratamiento periodontal previo a la
colocación de implantes (especialmente si tienen historia de periodontitis) (Van
WinKelhoff 2000a), y aportan información sobre la transmisión horizontal y
vertical de patógenos periodontales (Van Winkelhoff 2005a).
- 45 -
5.3 Métodos de diagnóstico microbiológico
La variabilidad que se observa en los diferentes estudios que analizan la
prevalencia de periodontopatógenos en diferentes grupos de pacientes se debe
en parte a los diferentes métodos de detección empleados. Las tres especies
cultivables, y especialmente Pg y Tf, son bacterias difíciles de obtener con
medios habituales en el laboratorio. La incorporación de métodos moleculares
específicos para estas bacterias, no dependientes del cultivo, ha permitido
incrementar la sensibilidad en la detección.
1. Tipos de pruebas microbiológicas
A. Cultivos: La obtención de cultivos bacterianos es uno de los métodos
de diagnóstico clásicos más antiguos, dirigido a caracterizar la composición de
la microflora subgingival, y continúa siendo el método de referencia (gold
standard) para determinar la utilidad de nuevas pruebas diagnósticas en
microbiología. Mediante cultivos selectivos y no selectivos obtenemos colonias
de Aa, Pg y Tf (Liébana 2002).
Las técnicas de cultivo presentan sin embargo algunas limitaciones:
Las bacterias deben mantenerse vivas durante el transporte; los
periodontopatógenos suelen ser anaerobios, y pueden causar problemas en la
toma y las condiciones de transporte al laboratorio (O2, temperatura, medio
nutritivo); el cultivo requiere tiempo, conocimientos microbiológicos y un
equipamiento adecuado de laboratorio con los costes correspondientes.
Además las bacterias anaerobias orales crecen muy lentamente, y, en
ocasiones, hay que esperar unas tres semanas para obtener un resultado
definitivo. Por otra parte algunas especies bacterianas son difíciles de cultivar
(Sakamoto y cols 2002), a lo que hay que añadir que la sensibilidad del cultivo
puede ser muy baja, especialmente en medios no selectivos, con límites de
detección entre 103 - 104 bacterias, por lo que patógenos específicos que se
encuentren en pequeñas cantidades pueden no ser detectados.
- 46 -
B. Pruebas inmunológicas:
La identificación inmunológica de las bacterias se efectúa mediante
anticuerpos monoclonales (Ac) que deben reaccionar frente a determinados
antígenos (Ag) específicos (estructuras como pili, fimbrias; mayoritariamente
hidratos de carbono y glucoproteínas). Para hacer visible la unión Ag-Ac se
emplean sustancias colorantes o fluorescentes. La inmunofluorescencia
permite observar la reacción Ag-Ac en el microscopio de fluorescencia (luz
ultravioleta). Las bacterias fijadas en el portaobjetos se ligan, mediante sus
antígenos superficiales específicos para cada tipo, a los anticuerpos
específicos añadidos, que llevan adheridas moléculas fluorescentes. En los
procedimientos con inmunofluorescencia directa el Ac está marcado con una
enzima fluorescente, y se acopla sin intermediarios al antígeno bacteriano. En
las técnicas indirectas, en un primer tiempo se forma un complejo Ag
bacteriano / Ac específico, y en un segundo tiempo se añade un segundo Ac,
esta vez marcado con un fluorocromo, que se fija sobre el primer Ac (Wolf y
cols 2005c). Zambon y cols (1985) mostraron que las técnicas de
inmunofluorescencia indirecta eran comparables con el cultivo bacteriano en su
capacidad para identificar Aa y Pg en muestras de placa subgingival. La
sensibilidad de la inmunofluorescencia indirecta comparada con el cultivo fue
del 91 al 100% mientras que la especificidad varió del 87 al 89%. Listgarten y
cols (1995) compararon la utilidad diagnóstica de las técnicas indirectas y el
cultivo para la detección de Aa, mostrando una sensibilidad más alta de las
técnicas indirectas (41,8%) y una tasa de detección significativamente más
elevada (39,4% para el cultivo frente al 81,8% para las técnicas indirectas).
Las pruebas de ELISA (enzimo-inmunoanálisis) se basan en una
reacción cromática. A diferencia de los métodos anteriores que usan el
microscopio, en este caso la lectura es automática y en un autoanalizador.
Quizás su principal ventaja reside en el examen simultáneo de numerosas
muestras, o para la valoración de titulaciones (Liébana 2002).
Las pruebas inmunológicas para bacterias orales proporcionan una
estimación cuantitativa o semicuantitativa de los microorganismos marcadores.
- 47 -
Estos métodos han mostrado una mayor sensibilidad y especificidad que el
cultivo bacteriano en la detección de Aa, Pg y Tf; sin embargo requieren el uso
de anticuerpos monoclonales para asegurar una elevada especificidad y los
límites de detección son similares o inferiores que los del cultivo (103 - 104).
Snyder y cols (1996) encontraron un límite de detección de 105 para Aa y 106
para Pg. Tienen además la ventaja de que no exigen una toma de muestras
rigurosa y un transporte metodológico para asegurar la viabilidad de las
bacterias. Sin embargo están limitadas por el número de anticuerpos que se
ponen a prueba, no sirven para estudiar la susceptibilidad a los antibióticos y
hay una falta de estudios clínicos bien controlados que los validen (Sanz y cols
2004).
C. Pruebas bacterianas enzimáticas. Test BANA
Determinadas bacterias periodontopatógenas como Tf, Pg, Td o
Capnocytophaga spp, producen una enzima similar a la tripsina capaz de
degradar el sustrato sintético N-α-benzoilo-DL-arginina-2-naftilamida o BANA.
Uno de los productos de descomposición es la β-naftilamida, que puede
hacerse visible mediante una reacción cromática y utilizarse para la
identificación de gérmenes. El test BANA (Perioscan®), aunque es
relativamente barato y rápido, no sirve para detectar Aa, y se ha visto que otros
gérmenes de la bolsa poco patógenos también pueden ser BANA positivos.
Loesche y cols (1992) propuso el empleo de esta reacción BANA en las
muestras de placa subgingival para detectar la presencia de cualquiera de
estos patógenos periodontales y así servir como un marcador de actividad de la
enfermedad, mostrando que las bolsas poco profundas tenían solo un 10% de
reacciones BANA positivas, mientras que las bolsas profundas (7mm)
mostraban un 80-90% de reacciones BANA positivas.
- 48 -
D. Técnicas de biología molecular
Son técnicas directas que permiten realizar el diagnóstico microbiológico
a partir de la muestra clínica, mediante la amplificación de un componente
bacteriano, el ácido nucleico, hasta un nivel detectable en unas pocas horas.
La metodología comprende las siguientes fases: obtención del ácido
nucleico a partir de la muestra clínica, amplificación por un procedimiento
enzimático (reacción en cadena de la polimerasa: PCR) y, por último, detección
del producto amplificado. Pueden emplearse diferentes técnicas para su
detección (sondas, checkerboard DNA-DNA, PCR), lo cual es necesario para
identificar la especie bacteriana que posee el ADN aislado.
Socransky y cols (1994) describieron una técnica de hibridación de ADN
en dámero que permitía detectar y determinar los niveles de un gran número de
especies bacterianas subgingivales simultáneamente a partir de una o varias
muestras de placa; “checkerboard DNA-DNA”. Para ello emplearon sondas de
ADN de genoma completo marcadas con digoxigenina, consiguiendo la
hibridación simultánea del ADN desnaturalizado de 43 muestras con 43 sondas
diferentes de ADN. Papapanou y cols (1997) analizaron 283 muestras de placa
subgingival y compararon este método con el cultivo para la identificación de
bacterias subgingivales (Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia/Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter
rectus, Eikenella corrodens, Bacteroides forsythus, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Streptococcus sanguis and Streptococcus mutans).
Tomando el cultivo como referencia, la sensibilidad de detección de la técnica
checkerboard oscilaba entre 0,17 y 0,86, con una especificidad de 0,17 a 1.0, y
una fiabilidad diagnóstica de 0,51 a 0,81 dependiendo de la especie
bacteriana.
El método más sensible disponible para la detección de secuencias de
ADN es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ashimoto y cols (1996)
desarrollaron un método de detección por PCR basado en las secuencias 16s
del ARNr para determinar la prevalencia de Aa, Tf, Cr, Rc, Pg, Pi, Pn, y Td. Los
- 49 -
resultados en cultivo y PCR coincidían en el 28% (Tf) y en el 71% (Aa) de las
muestras. La mayor discrepancia ocurrió en los casos de muestras PCR-
positivo, cultivo-negativo. Esto se debió al menor límite de detección de la PCR,
entre 25 y 100 células, en comparación con el cultivo (104-105 UFC/ml). Eick y
Pfister (2002) compararon una PCR comercial de la secuencia 16s del ARNr
para Aa, Pg, Pi, Tf y Td con el cultivo bacteriano. La PCR era capaz de detectar
Pg y Tf más frecuentemente que el cultivo, con una sensibilidad del 86% y una
especificidad del 76% para Pg. Aa era detectado de forma similar con ambos
métodos. De igual manera Riggio y cols (1996) estudiaron la detección de Aa y
Pg en muestras de placa subgingival de pacientes periodontales mediante PCR
y cultivo en un total de 170 muestras de placa de 43 pacientes. Aa y Pg fueron
detectados, cada uno de ellos en 40 (24%) de las muestras mediante PCR,
mientras que por cultivo se detectó Aa y Pg en 25 (15%) y 18 (11%) de las
muestras, respectivamente. Sin embargo, la PCR estándar proporciona sólo
información cualitativa sobre las bacterias estudiadas, y por tanto, su uso es
limitado.
La PCR en tiempo real con cebadores especie-específicos es un método
preciso y sensible para una cuantificación fiable de especies bacterianas
individuales (Sanz y cols 2004). Los cebadores principalmente empleados en
métodos diagnósticos basados en PCR para la detección de bacterias
periodontales son normalmente las secuencias 16s ARNr (Ashimoto y cols
1996). Lyons y cols (2000) empleando un sistema TaqMan determinaron la
cantidad de Pg en muestras de placa subgingival. Usando cebadores especie-
específicos y una sonda fluorescente, la detección de ADN de diluciones
seriadas de células de Pg fue lineal en un amplio rango de concentraciones de
ADN (coeficiente de correlación = 0,96). Shelbourne y cols (2000) usaron
también una sonda TaqMan para cuantificar Tf con cebadores basados en las
secuencias 16s del ARNr. Al comparar esta PCR cuantitativa con el test de
ELISA observaron idénticos resultados en 36 de las 54 muestras estudiadas y
obtuvieron un falso positivo y 17 falsos negativos con el test de ELISA usando
la PCR como método estándar. Sin embargo cada bacteria puede contener una
cantidad variable de secuencias 16s del ARNr, y por tanto, estos cebadores
pueden no ser adecuados para un análisis cuantitativo. Por ello, el empleo de
- 50 -
cebadores basados en una copia única de una secuencia genética es más
adecuado. Morillo y cols (2004) desarrollaron un método para la cuantificación
de Aa, Pg y Tf de muestras de placa subgingival basado en la tecnología de la
“PCR en tiempo real Taq-man”. Para ello se obtuvieron estas especies
bacterianas tras el cultivo de cepas de referencia y se llevó a cabo el recuento
microscópicamente. Los cebadores para la PCR fueron seleccionados de las
secuencias de los genes LktC (Aa), Arg-gingipain (Pg) y BspA antigen (Tf) para
la obtención de amplicones por debajo de los 100 pares de bases. La PCR en
tiempo real basada en la Taq-man se ajustó para cuantificar cada especie
separadamente. Se calcularon los valores de los umbrales de los ciclos para
cada especie de acuerdo al número inicial de copias. Se obtuvo una elevada
sensibilidad (101 copias para Aa y Tf y 102 para Pg) y especificidad para la
detección de las tres especies bacterianas (no se demostró reacción cruzada
con ninguna de las especies estudiadas). Además, la técnica demostró una
buena “repetibilidad” en los valores umbrales de ciclo obtenidos para cada
número inicial de copias, mostrando coeficientes de variación por debajo del
5% para cada bacteria.
6. TRANSMISIÓN DE LA ENFERMEDAD
6.1 Modelos de infección
Para poder entender las diferencias entre las diversas bacterias
periodontopatógenas hay que distinguir la infección oportunista de la
endógena. Microorganismos comensales, constituyentes de la flora normal de
las personas, pueden causar enfermedades infecciosas cuando se diseminan
desde sus nichos ecológicos normales a zonas del cuerpo estériles. Estos
microorganismos pueden sobrevivir en el nuevo medio si son capaces de
unirse a la superficie del huésped y de resistir su respuesta inmune. La
enfermedad se desarrolla especialmente en personas con mecanismos
defensivos alterados (p. ej., por intervenciones quirúrgicas, enfermedades
sistémicas, utilización incorrecta de antibióticos,…) y se denomina “infección
oportunista”.
- 51 -
Las patologías causadas por microorganismos comensales se
denominan “infecciones endógenas”, para las cuales la transmisión de
microorganismos de huésped a huésped no es necesaria. En la cavidad oral un
incremento de la carga bacteriana y una alteración concomitante en la
composición microbiana de la placa dental puede causar gingivitis. Estos
agentes se caracterizan a menudo por una baja patogenicidad intrínseca y
pueden causar enfermedad cuando aparecen en zonas del cuerpo inusuales o
en elevadas concentraciones en o cerca de sus hábitats normales.
Microorganismos que normalmente no se encuentran presentes en
huéspedes sanos y que pueden causar enfermedades infecciosas se
denominan “patógenos exógenos”. La mayoría de los patógenos humanos no
sólo aparecen en sujetos enfermos, si no también en portadores sanos que
pueden actuar como reservorio y servir como foco de infección.
Las enfermedades infecciosas transmisibles son capaces de
diseminarse de persona a persona. La prevención de la transmisión de un
agente infeccioso es la mejor medida de prevenir la enfermedad en una
población; sin embargo, en enfermedades multifactoriales que se asocian con
una compleja microflora, como son las enfermedades periodontales, el
problema de la transmisión es más complejo (Van Winkelhoff y Boutaga
2005b).
Es discutible si Aa y Pg forman parte de la flora oral normal, dada la
escasa frecuencia con que se identifican en sujetos periodontalmente sanos o
con gingivitis, y por el hecho de que presentan características de patógenos
exógenos más que de oportunistas (Genco y cols 1986, van Winkelhoff y cols
1994) (tabla 4). Además se encuentran más a menudo en las formas
destructivas de la enfermedad (Van Winkelhoff y cols 2002, Boutaga y cols
2003, Yang y cols 2004).
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Tabla 4. Características de los patógenos exógenos y endógenos (van Winkelhoff y cols 1994).
Patógeno Exógeno Endógeno
Flora indígena No, transitoria Sí, permanente
Prevalencia Baja Alta
Patogenicidad Alta, enfermedad Baja, oportunista
Virulencia Alta Baja
Tipos de clones Pocos Muchos
Clones presentes Uno Muchos
Eliminación Posible No, permanente
Respuesta de anticuerpos Puede ser alta Nulos a bajos
Niveles en salud Bajos o nulos Bajos a moderados
Factor predisponente No requere Cambios previos
Asociado – enfermedad A menudo Posible
Estado de portador Sí No
Período incubación Corto Indefinido
Infección subclínica Posible Posible
Nivel umbral No claro No claro
Prevención Supresión o eliminación Supresión
Van Winkelhoff y cols (2002), utilizando técnicas de cultivo, demostraron
la baja frecuencia de detección Pg en sujetos sanos (10.6%) y encontraron
una asociación significativa de este patógeno con la enfermedad periodontal
destructiva (OR = 12.3). Aa se halló sólo en el 12.8% de los individuos sin
periodontitis. Boutaga y cols (2003) aplicaron una técnica de PCR en tiempo
real para detectar Pg y Aa en individuos sanos y enfermos; Aa y Pg fueron
detectados en el 18% y 9.9%, respectivamente, de los sujetos sin periodontitis.
Yang y cols (2004) emplearon una técnica de inmunofluorescencia indirecta
para detectar Pg y Tf en sujetos sanos y con periodontitis, demostrando Pg en
el 85.7% y Tf en el 60.7% de los individuos enfermos frente al 23.1% y 39,6%,
respectivamente, en los que estaban sanos.
Algunos investigadores han sugerido que estas bacterias deben ser
consideradas patógenos exógenos (Genco y cols 1986, Van Winkelhoff y cols
2002; Boutaga y cols 2003; Yang y cols 2004; Van Winkelhoff y Boutaga
- 53 -
2005b), y por lo tanto si realmente lo fueran, evitar la exposición a ellos sería
un objetivo importante en su profilaxis; el tratamiento estaría orientado a
eliminarlos. Por tanto, su mera presencia, especialmente si se trata de clones
de elevada patogenicidad (por ejemplo el ya comentado clon hW83 de Pg),
sería indicativa de intervención terapéutica. En cambio, ante una infección
endógena el objetivo sería reducir su cuantía en las zonas subgingivales (Van
Winkelhoff y cols 1996).
La asociación entre elevados niveles de colonización por patógenos
periodontales específicos y la progresión de la enfermedad periodontal ha sido
corroborada por datos longitudinales en poblaciones no tratadas, aclarando la
importancia del concepto de carga bacteriana más que la mera presencia de
colonización. Papapanou y cols (1997), en un estudio durante un período de
diez años, mostraron que la colonización por P. gingivalis, B. forsythus,
Campylobacter rectus, y T. denticola en niveles que excedían ciertos umbrales
conllevaba una probabilidad significativamente elevada (OR >4) de tener
bolsas profundas y sitios que mostraban progresión. Hamlet y cols (2004), en
un estudio de tres años, demostraron OR de 8.16 para la pérdida de inserción
en adolescentes con una colonización persistente por Tf.
La prevalencia y el nivel de colonización por estos patógenos se ha
observado que varía significativamente entre poblaciones de diferentes
localizaciones geográficas (Sanz y cols 2000; Haffajee y cols 2004). Haffajee y
cols (2004) encontraron importantes diferencias al examinar la composición de
la microbiota subgingival en sujetos con periodontitis crónica de Brasil, Chile,
Suecia y E.E.U.U.. Vieron que Td era más frecuente en los individuos
brasileños, y Tf y Pg en los chilenos. Pg constituía el 7.5, 11.9, 1.6 y 6,6% de la
microbiota en sujetos de Brasil, Chile, Suecia y USA (p<0,001), mientras que
las proporciones de Td eran 6.7, 4.2, 0.8 y 2.3, respectivamente (p<0,001). Sin
embargo, las proporciones de Tf oscilaban entre el 6,2 y el 8,5% y no diferían
significativamente entre los países. Sin embargo no se debe descartar que las
variaciones encontradas pueden estar influenciadas por las diversas técnicas
empleadas (Van Winkelhoff y Boutaga 2005b).
- 54 -
6.2 Mecanismos de transmisión
El comportamiento de un microorganismo patógeno depende de la
interacción entre el huésped, el patógeno y el medio. Cambios en cualquiera
de estos factores afectarán a la probabilidad de transmisión. Muchas bacterias
pasan de persona a persona principalmente por contacto directo. La
transmisión indirecta ocurre a través de agentes intermedios como alimentos,
agua o aerosoles. Cuando la transmisión ocurre directamente de padres a hijos
(vía sanguínea, saliva, leche,…) se denomina vertical. En cambio cuando un
sujeto infecta a individuos no relacionados por contacto, vía respiratoria o fecal-
oral, etc., se llama horizontal. Los factores destacables en la transmisión son:
la fuente (individuos con enfermedad activa, portadores sanos), la cantidad de
microorganismos transmitidos, la frecuencia de contactos efectivos y la
supervivencia en el medio.
6.3 La periodontitis como una enfermedad transmisible
Comúnmente se piensa que las bacterias asumen una función
destacada en la patogénesis de la enfermedad periodontal destructiva. Por
tanto, conocer si la transmisión de bacterias juega un papel en la periodontitis
es de gran relevancia. Sin embargo, el significado clásico de transmisión de un
patógeno no puede ser aplicado en la periodontitis dada la complejidad del
componente bacteriano en esta enfermedad.
Estudios recientes permiten afirmar que las periodontitis severas se
agrupan en familias. Van der Velden y cols (1993) estudiaron clínica y
microbiológicamente 23 familias, con más de 3 hermanos con miembros que
tenían periodontitis para ver el efecto sobre el estado periodontal de la relación
entre hermanos. Los resultados muestran un efecto significativo de la relación
entre hermanos sobre: la placa bacteriana, el cálculo, la pérdida de inserción, la
presencia de espiroquetas en la lengua y en las bolsas periodontales, P.
gingivalis en la encía y en la saliva y P.intermedia en la saliva. Estos resultados
apoyan la hipótesis de que las periodontitis se agrupan en familias. Basándose
- 55 -
en las investigaciones de estos autores, Van Winkelhoff y Boutaga (2005b)
señalan que habría que considerar factores genéticos, de comportamiento y
ambientales, incluyendo la transmisión de posibles patógenos periodontales.
Las especies subgingivales no suelen aparecer en el ambiente (suelo,
aire, agua) ni tampoco en la microflora de otras especies animales. Su hábitat
natural es la cavidad oral. Existen excepciones, como la detección de la
misma cepa de Aa en un paciente con PJL y en el perro de la familia mediante
análisis de la endonucleasa de restricción (Preus y Olsen 1988). Las especies
aisladas en animales son fenotípica y genotípicamente diferentes a las aisladas
en humanos (Karjalainen y cols 1993, Menard y Mouton 1995)
La mayoría de los estudios sobre transmisión bacteriana en periodontitis
se han centrado en Aa y Pg. Estas bacterias han sido seleccionadas por su
frecuente asociación con diferentes formas de enfermedad periodontal
destructiva (Slots y Ting 1999) y su potencial patógeno (Haffajee y Socransky
1994; Holt y cols 1999, Fives-Taylor y cols 1999). No existen datos de
comparación de aislamientos de Tf entre individuos.
En la actualidad, los llamados “métodos de tipificado de
periodontopatógenos” se emplean para comparar las bacterias. Hay que tener
en cuenta que la detección de las mismas especies bacterianas en miembros
de una misma familia no prueba su transmisión (van Winkelhoff y Boutaga
2005b). Es necesario tipificar (comparar los aislados) las bacterias aisladas y
para ello se dispone de dos estrategias diferentes, el estudio de las
características fenotípicas y genotípicas.
Métodos de fenotipado: Se basan en las características fenotípicas de las
especies bacterianas. Los más usados son:
Biotyping (biotipado): Utiliza los resultados de pruebas bioquímicas para
determinar caracteres fisiológicos y asignar miembros de la misma especie a
diferentes grupos
Test de sensibilidad antibiótica
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Serotipia (Serological typing): Emplea una serie de anticuerpos, obtenidos a
partir de animales, para identificar diferentes determinantes antigénicos de la
superficie bacteriana
Fagotipia (Phage typing): Diferentes cepas de una especie presentan distinta
sensibilidad para la actividad lítica de bacteriófagos.
Estudios moleculares: Permiten distinguir entre aislamientos
epidemiológicamente no relacionados por la variación genética del ADN
cromosómico de una especie bacteriana.
Análisis de la endonucleasa de restricción (Restriction Enzyme Análisis -REA-):
Mediante estas enzimas, de corte o restricción, se fracciona el ADN en
secuencias. Los fragmentos se separan por su tamaño mediante electroforesis
en gel de agarosa. Diferentes cepas de la misma especie bacteriana tienen
distintos patrones de restricción en sus secuencias de ADN. Van Steenbergen
y cols (1993) emplearon esta técnica para tipificar Pg y encontraron que, con
una excepción, cada individuo estaba colonizado por un sólo tipo clonal de Pg.
Observaron que los patrones de ADN de todos los aislamientos de Pg de
individuos no relacionados eran distintos. Este hecho también se encontró para
Aa empleando este mismo método (Petit y cols 1993a,b).
Análisis del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción
(Restriction Fragment Length Polymorphism -RFLP-): El ADN cromosómico es
cortado con enzimas de restricción, y los fragmentos son separados en un gel
de agarosa. Posteriormente se transfieren a una membrana-soporte donde se
hibridan con sondas específicas marcadas. Éstas se unen los fragmentos que
tienen secuencias de nucleótidos complementarias. Las variaciones en el
número y tamaño de los fragmentos detectados por hibridación se denominan
RFLPs. DiRienzo y McKay (1994) empleando este método, identificaron un
genotipo específico de Aa (grupo RFLP II) que parecía estar relacionado con la
periodontitis juvenil y que mostró la mayor correlación con la conversión de
salud periodontal a enfermedad (p < 0,002).
Ribotipia (Ribotyping): Este método usa ADN cromosómico, y una sonda de
ARN ribosómico (ARNr) que proporciona diferentes perfiles. Dado que todos
los aislamientos bacterianos tienen uno o más operones de ARNr distribuidos
en el cromosoma, y ya que estas secuencias son altamente conservadas,
- 57 -
todos los aislamientos bacterianos pueden ser tipificados usando sondas
dirigidas a las secuencias de ADN con lugares de ARNr. Alaluusua y cols
(1993) estudiaron 54 aislamientos de Aa obtenidos a partir de 9 familias (12
niños y 11 padres). En 5, los aislamientos pertenecientes a la misma familia
tenían idénticos patrones de hibridación. En otras 3 familias, cada miembro
albergaba sólo un ribotipo de Aa. Sólo en un grupo familiar la madre tenía dos
ribotipos, uno común con la hija y uno diferente. Este estudio confirma
resultados previos sobre la transmisión intrafamiliar de Aa.
Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE): El genoma bacteriano es digerido con
una enzima de restricción que tiene relativamente pocos sitios de
reconocimiento, y así genera aproximadamente 10-30 fragmentos que son
separados por electroforesis de campo pulsante para producir un patrón de
bandas. Valcarcel y cols (1997) aplicaron este método para el tipificado de 19
cepas de Aa y obtuvieron un alto grado de polimorfismo con 13 perfiles
distintos.
Reacción en cadena de la polimerasa con cebadores (primers) arbitrarios
(Arbitrarily primed [AP-PCR]): Este tipo de técnica de PCR usa un cebador
corto que no está dirigido a amplificar ninguna secuencia específica del ADN
bacteriano. Los productos resultantes representarán una variedad de
fragmentos de ADN de diferente tamaño según las bases. Asikainen y cols
(1996) emplearon esta técnica para tipificar aislamientos de Aa de miembros
de las mismas familias. En 11 de 12 grupos familiares encontraron idénticos
genotipos de Aa, sugiriendo la transmisión de este microorganismo.
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP): Es una PCR de una
secuencia común, seguida de una restricción que proporciona fragmentos
diferentes. Van Winkelhoff y cols (2000b), empleando esta técnica demostraron
que los aislamientos de Aa de un padre y su hijo que padecía periodontitis eran
indistinguibles, sugiriendo la transmisión del microorganismo.
Los marcadores fenotípicos o genéticos únicos entre aislamientos
bacterianos independientes son un prerrequisito para estudiar la distribución de
distintas cepas bacterianas entre individuos. Las cepas de una misma especie
pueden mostrar una virulencia variable, y tipificar estas cepas puede ayudar a
distinguir entre representantes patogénicos y menos patogénicos de una
especie.
- 58 -
Estudios de transmisión: La información referida a la transmisión de
periodontopatógenos por contactos humanos puede ser relevante para
determinar factores de riesgo de la enfermedad y desarrollar estrategias
preventivas. Se ha señalado que los dos patógenos periodontales principales,
Aa y Pg, se agrupan en familias (Zambon y cols 1983b, Gunsolley y cols
1990, van der Velden y cols 1993, Petit y cols 1994), sin embargo las
casuísticas que apoyan estos datos son cortas y las metodologías no han sido
uniformes.
Mediante la utilización de métodos de tipificación molecular, se ha
podido evidenciar que padres e hijos pueden compartir clones idénticos de Aa y
Pg o bien estar infectados por cepas diferentes. Se encontraron patrones
distintos para las cepas aisladas de familias diferentes (DiRienzo y Slots 1990,
Alaluusua y cols 1993, Petit y cols 1993a, b). Petit y cols (1993a, b) observaron
que Aa podía transmitirse entre miembros de una misma familia, pero con una
baja frecuencia, un 15% para los niños y un 8% entre parejas. Preus y cols
(1994) al comparar las cepas de Aa mediante AP-PCR, detectaron en seis de
siete familias diferentes genotipos de Aa en ambos conyugues. En cambio en
los hijos se aisló un genotipo idéntico al de uno de sus padres.
Se ha descrito también que ambos miembros de la pareja comparten los
mismos clones, lo que indica que estas especies pueden ser transmitidas entre
parejas. Van Steenbergen y cols (1993) demostraron que, en seis de ocho
parejas, los pacientes periodontales y sus cónyuges compartían los mismos
clones aislados de Pg, ya que mostraban patrones de restricción
indiferenciables. Saarela y cols (1993) encontraron en dos de cuatro parejas los
mismos serotipos y ribotipos de Aa, y dos de cuatro parejas que compartían los
mismos ribotipos de Pg.
Tuite-McDonnell y cols (1997) en un estudio sobre transmisión de Pg en
104 familias, empleando una técnica de detección por PCR, demostraron que
el contacto con un miembro familiar infectado incrementa sustancialmente el
riesgo relativo de colonización de los cónyuges (4), de los niños y sus padres
- 59 -
(3), los niños y sus madres (4.7), adultos y sus madres (2.4), y hermanos (2.4).
Los cónyuges de individuos infectados tenían casi cuatro veces más
probabilidad de ser colonizados que los cónyuges de sujetos no colonizados.
Esto sugiere la posibilidad de transmisión entre parejas. Sin embargo, no
observaron ninguna relación entre la transmisión y el tiempo de casados, lo que
indica que la transmisión probablemente ocurre en los primeros años de
matrimonio.
Asikainen y cols (1996) estudiaron la frecuencia de transmisión entre
parejas casadas, y de padres a hijos de Aa (47 familias) y Pg (31 familias)
comparando mediante AP-PCR. La transmisión entre las parejas de Aa se
produjo en el 36% de las mismas y de Pg en el 20%. La transmisión de padres
a hijos de Aa tuvo lugar en el 32% de las familias. Pg no se transmitió de
padres a hijos en ninguna de las familias estudiadas.
Aunque disponemos de pocos estudios, no sólo se ha podido evidenciar
la transmisión, sino que además se ha observado que los clones compartidos
entre las parejas poseen factores de patogenicidad implicados en una
colonización más eficaz. Asano y cols (2003) demostraron que el gen que
codifica las fimbrias de las cepas de Pg pertenece al tipo II, más eficaz en la
unión a células epiteliales, en 5 de seis parejas cuyos patrones de PFGE eran
idénticos. Esto sugiere que sólo aquellos clones con determinados factores de
virulencia tienen capacidad de colonización y y transmisión entre individuos con
una relación estrecha.
Van Winkelhoff y Boutaga (2005b), en una revisión de la literatura que
incluye ocho estudios de transmisión, señalan que la frecuencia de
transmisión vertical de Aa oscila entre el 30% y el 60%, mientras que la
transmisión vertical de Pg sólo se observa ocasionalmente. La frecuencia de
transmisión horizontal entre parejas de Aa varía entre el 14% y el 60%, y entre
el 30% y el 75% para Pg.
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6.4 Posibles vías de transmisión de bacterias periodontales
Aa y Pg pueden encontrarse en el área subgingival, en la saliva, en la
placa supragingival y en la mucosa de la cavidad oral de pacientes con
periodontitis (Van Winkelhoff y cols 1988, Socransky y cols 1999). En pacientes
con periodontitis la placa supragingival normalmente contiene una mayor
proporción de Pg que en sujetos sanos. Socransky y cols (1999) encontraron
recuentos de 0,6 x 105 y 0,1 x 105 UFC/ml en la placa supragingival de sujetos
enfermos y sanos respectivamente; e igualmente de 1,4 x 105 y de 0,1 x 105
UFC/ml en la subgingival. Ambas especies se diseminan intraoralmente a
través de saliva contaminada, y colonizan la placa supragingival antes de
afectar el área subgingival (Socransky y cols 1999). La infección subgingival
ocurre en sitios con y sin pérdida de inserción periodontal. Se ha especulado
que las bolsas profundas de sujetos con la enfermedad actúan como
reservorios para diseminar la infección a zonas sanas (Riviere y cols 1996).
No hay evidencia de que las bacterias periodontales puedan ser
transmitidas a través de aerosoles, pero sí parece probable que la saliva y el
contacto mucoso directo sean vías de transmisión de estas bacterias. Los
objetos inanimados (instrumentos odontológicos, cepillos dentales) también
pueden servir como vehículo de transmisión (Christersson y cols 1985, Glass y
Lare 1986).
Aa y Pg pueden ser cultivados a partir de la saliva de pacientes con
periodontitis (Van Winkelhoff y cols 1988). La transmisión de bacterias orales
de un individuo a otro depende de la cantidad de bacterias transmitidas, de su
virulencia y capacidad intrínseca de colonización y del número de veces que
son transmitidas. El contacto mucoso a través de los besos puede ser por tanto
una vía posible de inoculación directa de estos patógenos en otra persona. La
supervivencia de patógenos periodontales en la saliva fuera de la cavidad oral
no se conoce. La inoculación indirecta puede ocurrir cuando un cepillo de
dientes contaminado se utiliza durante las siguientes horas a su uso. Müller y
cols (1989), empleando técnicas de cultivo, examinaron los cepillos de dientes
de 21 pacientes con enfermedad periodontal destructiva, todos tenían Aa en
- 61 -
cuantía moderada a elevada en la placa subgingival. El 29% de los cepillos
contenían cantidades detectables de Aa. Inmediatamente después del cepillado
esta cifra se elevaba al 62%, pero disminuía al 50% después de una hora.
Quirynen y cols (2001), investigaron el índice de supervivencia de especies
periodontopatógenas y cariogénicas en cepillos dentales, con y sin pasta de
dientes, y en cepillos interdentales de 12 pacientes con periodontitis, y
demostraron que los detergentes de la pasta de dientes disminuían el índice de
supervivencia de especies patógenas en los cepillos (2 logaritmos a nivel basal,
otros 2 logaritmos a las 4 horas y un logaritmo adicional a las 8 horas para las
especies aerobias y anaerobias), pudiendo así limitar el riesgo de traslado de
las bacterias.
La dosis mínima de infección y el número de exposiciones requeridas
para la transmisión de Aa o Pg de una persona a otra se desconoce, pero
parece probable que ambos parámetros influyan en la odds ratio de
transmisión.
6.5 Consecuencias de la transmisión
Las consecuencias clínicas de la transmisión de Aa o Pg de una persona
enferma a otra no se conocen. En ocasiones, a pesar de poseer el agente
infectante, las parejas de los pacientes con periodontitis no desarrollan la
enfermedad. Esto puede ser atribuido a la respuesta del huésped, a sus
mecanismos de defensa frente a las bacterias, a un antagonismo entre
bacterias, aunque también cabe la posibilidad de que se deba a una menor
patogenicidad de las bacterias infectantes (Greenstein 1997b). Por ejemplo,
Christersson y cols (1985) demostraron que las sondas periodontales eran
capaces de distribuir patógenos desde localizaciones enfermas a sanas en
pacientes con PJL. Sin embargo, la monitorización de 16 localizaciones
mediante cultivo que fueron contaminadas por Aa tras la inserción de una
sonda, reveló que Aa persistió en sólo 8 localizaciones tras una semana, 2
localizaciones después de 2 semanas, y no se halló en ninguna localización
transcurridas 3 semanas. Por tanto, a pesar de la transmisión microbiológica,
- 62 -
los pacientes fueron capaces de resistir al desarrollo de nuevas localizaciones
colonizadaspor Aa. Los autores sugirieron que esto se puede haber debido al
efecto de limpieza de las bolsas por el fluido crevicular gingival, a un
antagonismo bacteriano, o, con más probabilidad, a la respuesta inmune del
paciente.
Numerosos trabajos indican que Aa y Pg pueden ser encontradas en
sujetos sin destrucción periodontal manifiesta (Petit y cols 1993a,b, Van
Steenbergen 1993, Van Winkelhoff 2002). Estas especies probablemente
pueden persistir en equilibrio con el huésped y la microflora residente durante
años, sin embargo, no está claro qué factores microbiológicos o del huésped
determinan el inicio de la destrucción periodontal a partir de la infección por
estos patógenos.
Hay estudios que sugieren que la cohabitación con una persona con
periodontitis puede influenciar el estado periodontal de la pareja (Petit y cols
1994, Von Troil-Linden y cols 1995; Van Winkelhoff y Boutaga 2005b). Aunque
no se pueden descartar factores causales ambientales comunes, los resultados
de varios estudios sugieren que la transmisión de microorganismos virulentos
es un factor importante (Tuite-McDonnell y cols 1997; Asano y cols 2003) sin
embargo, son necesarios más estudios para probar esta hipótesis.
Petit y cols (1994) investigaron la prevalencia de microorganismos
periodontopatógenos y la destrucción periodontal en las parejas y los hijos de
pacientes adultos con periodontitis, en un grupo de 24 familias, con 49 niños.
Por debajo de los 5 años, ninguno de los niños tenía CAL, mientras que entre
los 5-15 años, el 26,5% tenían 1-5 sitios con 1-3 mm de CAL. Un total de 16
parejas tenían una forma leve a moderada de periodontitis, con al menos un
sitio con 1 a 4 mm de CAL y 5 parejas tenían destrucción periodontal severa
con sitios que mostraban al menos 8 mm de CAL. En 18 de 24 pacientes los
resultados confirmaron Pg. Este microorganismo se encontró en un niño de 5
años y en 11 de las parejas. Por otra parte, Aa se detectó en 13 pacientes, 5
niños y 5 de las parejas. Si un niño albergaba uno de los periodontopatógenos,
al menos uno de los padres era también positivo para esa bacteria.
- 63 -
Von Troil-Linden y cols (1995), llevaron a cabo un examen clínico,
radiológico y microbiológico de las condiciones periodontales en dos grupos de
parejas casadas para valorar similitudes entre marido y mujer. Los sujetos
enfermos (n=10) tenían una periodontitis avanzada y los sanos (n=10)
presentaban un estado periodontal normal. Las muestras fueron cultivadas
para Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis,
Prevotella intermedia, Campylobacter rectus and Peptostreptococcus micros.
La media de frecuencia de detección de bolsas moderadamente profundas (4-5
mm) y profundas (≥6 mm) fue significativamente mayor en las parejas de los
sujetos enfermos que en las parejas de los sanos. Se hallaron bolsas
profundas en seis parejas de los individuos enfermos y sólo en dos parejas de
los sujetos sanos. Los enfermos y sus cónyuges tenían Aa, Pg, P. intermedia,
C. rectus and P. micros en 4, 6, 9, 9 y 4 parejas respectivamente. Los sanos y
sus parejas tenían estos patógenos en 0, 1, 9, 5 y 3 parejas, respectivamente.
Pg se encontró en 7 parejas de los individuos enfermos y sólo en 2 de los
sujetos sanos.
Aunque se ha demostrado la transmisión intrafamiliar (Petit y cols
1994, Von Troil-Linden y cols 1995; Asikainen y cols 1996), parece probable
que también se produzca entre individuos no relacionados, hasta por un
contacto casual. Cabe destacar que ya a principios de 1900 algunos autores
sugirieron que los brotes severos de GUNA después de la primera guerra
mundial se debieron a la transmisión de bacterias virulentas, lo que respalda la
idea de que los patógenos periodontales pueden transmitirse con facilidad de
una persona a otra, especialmente cuando se trata de clones muy virulentos de
Aa y Pg. Así, parece probable que nuevas especies o diferentes cepas de la
misma especie pueden ser adquiridas con relativa frecuencia por un individuo
en diferentes etapas de su vida. La posibilidad de que halla una recidiva o una
nueva infección podría repercutir en el enfoque terapéutico (Von Troil-Lindén
y cols 1996).
- 64 -
7. PREVENCIÓN
La eficacia de la actuación odontológica sobre la enfermedad y su
prevención requiere la colaboración del paciente, que debe ser formado e
informado en el mantenimiento de su salud. El odontólogo, no sólo necesita
unos conocimientos actualizados en el diagnóstico periodontal y en su
terapéutica, sino también capacidad de comunicación con el paciente.
La prevención primaria trata de la información, instrucción en higiene
oral y de medidas profilácticas (oral y antibiótica si procede). El principal agente
desencadenante de la gingivitis y de la periodontitis es la placa bacteriana, sin
la cual no se desarrolla la inflamación marginal. Por lo tanto, la prioridad recae
sobre la prevención y la eliminación de la placa y el tártaro dental, y en la
motivación del paciente para mantener una higiene oral adecuada. Además se
debe actuar sobre los elementos locales que favorecen el depósito de placa:
factores iatrogénicos (restauraciones, prótesis inadecuadas), apiñamientos, etc.
Eliminar el 100% de placa es prácticamente imposible, por lo que hay que
procurar obtener un grado óptimo de higiene oral (índice de placa), para
impedir sus efectos patológicos, y mantenerlo en el tiempo.
Tradicionalmente, el abordaje terapéutico de las periodontitis se hacía
desde la visión del paciente de forma aislada, sin considerar el entorno de
relación personal. En la actualidad debemos incluir el criterio de riesgo de la
transmisión derivado de la convivencia con personas afectadas. Por ello,
estaría justificada la revisión rutinaria de las parejas de pacientes
periodontales, y la recomendación de tener especial precaución con sus hijos.
- 65 -
Para cortar estas vías de transmisión se deben adoptar diversas
medidas como la revisión odontológica de los individuos y su tratamiento
cuando proceda, y uso higiénico individual de los utensilios, tanto para la
limpieza bucodental como los de la alimentación.
Basándonos en los conocimientos actuales, la realización de técnicas
microbiológicas de screening (despistaje) y la prevención de la transmisión de
clones específicos virulentos de Aa puede ser viable y efectivo para prevenir
algunas formas de enfermedad periodontal.
Pg es recuperada frecuentemente de sujetos adultos enfermos, y la
transmisión de este patógeno parece estar restringida a individuos en ese
grupo de edad. La transmisión horizontal de Pg puede ser controlada mediante
el tratamiento periodontal, que engloba la eliminación o supresión significativa
del patógeno en individuos enfermos, y con un alto nivel de higiene oral (Van
Winkelhoff y Boutaga 2005b).
La respuesta del huésped a la infección es determinante en la aparición
y evolución de una periodontitis, La actuación sobre factores de riesgo
modificables que a su vez influyen en la susceptibilidad y en la microflora
subgingival, tales como el tabaco, el estrés o enfermedades sistémicas que
MADRE
HIJO
PADRE
HIJO
TRANSMISIÓN
HORIZONTAL
TRANSMISIÓN
HORIZONTAL
TRANSMISIÓN
VERTICAL
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favorecen o contribuyen a causar una periodontitis es también una parte
destacada de la prevención (Albandar 2002).
La prevención secundaria trata del diagnóstico precoz de la
enfermedad y del tratamiento antiinfeccioso, mientras que la prevención
terciaria incluye la detección y prevención de la reaparición de la enfermedad
tratada (necesidad de un mantenimiento periodontal).
- 67 -
II. OBJETIVOS
1. Evaluar en muestras de placa subgingival y de saliva la presencia de A.
actinomycetemcomitans y P. gingivalis, y su desaparición o disminución al
mes y a los 6 meses de finalizar el tratamiento periodontal (cultivo y PCR en
tiempo real).
2. Determinar si disminuyen o modifican su cuantía en las parejas debido al
tratamiento del paciente.
3. Evaluar la evolución clínica después del tratamiento y a los 6 meses de su
finalización, y compararla con la evolución microbiológica.
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III. HIPÓTESIS
1. Entre parejas se transmiten bacterias periodontopatógenas y se comparten
los mismos clones, aunque sólo uno de los miembros muestre o desarrolle
patología periodontal.
2. La flora oral de la pareja asintomática puede servir de reservorio y transmitir
microorganismos al paciente que ya ha finalizado el tratamiento.
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IV. PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO
El objeto de nuestro trabajo es investigar la transmisión de la
periodontitis crónica entre parejas, enfermedad que destruye los tejidos que
circundan a los dientes. Los datos publicados son escasos, y se apoyan en
series cortas de individuos, dificultad que hemos tratado de resolver.
La trascendencia de la transmisión de bacterias periodontopatógenas
entre parejas es un tema controvertido. La dificultad de los estudios reside
tanto en la disponibilidad de un número suficiente de casos, como en su
seguimiento y en la utilización de técnicas diagnósticas altamente sensibles y
específicas. Precisamente el objetivo de esta Tesis es desarrollar una base
sólida de investigación para analizar la transmisión de dichas bacterias,
comparando su presencia y su cuantía en pacientes periodontales y en sus
parejas, antes y después de efectuar un tratamiento periodontal correcto. Una
de las cuestiones que trataremos de dilucidar es la posibilidad de
recolonización o reinfección por periodontopatógenos una vez que un individuo
ha sido tratado con éxito. Para estructurar la investigación hemos diseñado un
árbol de decisiones para la obtención de muestras, pruebas de diagnóstico
microbiológico (incluyendo recientes procedimientos de biología molecular) y
tratamiento.
- 70 -
V. METODOLOGÍA Y PLAN DE TRABAJO
1. SELECCIÓN DE PACIENTES: Se efectuó entre individuos estudiados en la
Facultad de Odontología de la Universidad de Sevilla, 16 sujetos con sus
respectivas parejas, en total 32 casos. Todos fueron informados sobre el
estudio y dieron su consentimiento por escrito (ver apartado 7).
Previamente, el Comité de Ética de la Facultad dio su aprobación al trabajo.
1.1 CRITERIOS DE SELECCIÓN: Cada individuo debía reunir los siguientes
requisitos:
- Periodontitis crónica
- Edad superior a 35 años
- Con al menos 20 dientes
- Sin enfermedades sistémicas (diabetes, HTA, procesos inflamatorios
crónicos, cáncer, etc)
- Sin tratamiento periodontal, al menos durante el año precedente
- Sin tratamiento antibiótico en los 3 meses previos
- Con relación heterosexual de al menos 2 años de cohabitación
La Periodontitis fue definida, según los criterios de Machteii y cols
(1992), por:
la presencia de pérdida de inserción clínica 6 mm en 2 o más
dientes,
y uno o más sitios con profundidad de bolsa al sondaje 5 mm.
1.2 CRONOGRAMA: Se aplica a los pacientes y a las parejas
1.2.1 Primera visita: Exploración clínica, radiológica y elección de
zonas de estudio microbiológico.
1.2.2 Segunda visita: Toma de muestras para estudios
microbiológicos.
1.2.3 Tratamiento: Se cita el paciente una semana después para
tratamiento.
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1.2.4 Tercera visita: Evaluación clínica al mes, y toma de muestras.
1.2.5 Cuarta visita: A los 6 meses, última valoración clínica y toma de
muestras.
Las parejas sanas se excluyen evidentemente del tratamiento.
2. EXPLORACIÓN DE LOS PACIENTES
2.1. Exploración Clínica (Periodontograma): Todas las medidas fueron
tomadas por un mismo examinador empleando una sonda periodontal
manual milimetrada (Michigan N-11, OMS) en seis superficies de cada
diente (mesio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, lingual y
disto-lingual). La exploración periodontal se recogió en un diagrama
específico, donde se anotaron las siguientes medidas:
1. Profundidad de sondaje: Distancia medida desde el margen gingival
hasta el nivel de penetración de la sonda cuando se aplica una
fuerza moderada (25Nw/cm2).
2. Nivel del margen gingival libre: Medida de la relación del margen
gingival libre (porción más coronal de la encía libre) con respecto a la
línea amelocementaria (o margen de la preparación). Puede ser “0”
(a nivel de la LAC), “+” (por encima de la LAC), o ”– “ (por debajo de
la LAC).
3. Nivel de inserción cínico: Es la distancia del LAC al fondo de la bolsa.
Representa la suma de la recesión más la profundidad de sondaje
(cuando el margen gingival se encuentra apical al LAC). El NIC es
igual a la PS si el margen gingival está a nivel del LAC y es inferior a
la PS cuando el margen gingival se situa en una posición coronal al
LAC.
- 72 -
4. Sangrado gingival al sondaje: Sangrado que se produce durante los
primeros 20-30” tras realizar el sondaje. Se toma en los puntos de
sondaje como presencia o ausencia.
5. Índice de placa (Silness y Löe 1964): Califica los depósitos de placa
en una escala de 0 a 3: “0” ausencia de placa; “1” al pasar la sonda
periodontal a lo largo del margen gingival se extrae placa; “2”
acúmulo moderado de placa en el surco gingival, sobre el margen
gingival y/o el diente visible; “3”, placa abundante en estos mismos
sitios.
2.2. Estudio radiológico: Se llevó a cabo mediante una serie periapical
completa (14 radiografías) para evaluar la pérdida ósea radiológica:
distribución y localización de la pérdida ósea (si afecta a toda la dentición o
es localizada); tipo de pérdida ósea (horizontal, vertical o angular y del lecho
alveolar); importancia de la pérdida ósea (distancia de la cresta marginal a la
LAC, afectación de furcas, bolsas infraóseas, inserción residual) y causa de
la pérdida del soporte periodontal (irritantes yatrógenos, presencia de
cálculo, factores anatómicos radiculares, posición dental, problemas
endodónticos o endoperiodontales).
[Toma de muestra (ver apartado 4)]
2.3. Tratamiento periodontal
Todos los pacientes recibieron información e instrucción en medidas de
higiene oral en la primera sesión de tratamiento mecánico, y el nivel de higiene
se reforzó en citas posteriores. El tratamiento mecánico incluyó raspado y
alisado radicular por cuadrantes, en sesiones semanales; cuatro en total,
durante un período de un mes.
- 73 -
Al mes de finalizar el tratamiento se reevaluó a los pacientes con una
nueva exploración periodontal con especial atención al sangrado. En esta
evaluación se decidió si el paciente era dado de alta para pasar a controles
periódicos, o si debía volver a tratar alguna zona, e incluso plantear la
indicación de cirugía periodontal en sitios que sangraban al sondaje y con
profundidades de bolsa ≥5 mm (Kaldahl y cols 1993). Seis meses después del
tratamiento se exploraron los mismos parámetros clínicos.
3. EXPLORACIÓN DE LAS PAREJAS
3.1 Exploración clínica: Idéntica a la del paciente
3.2 Estudio radiológico: Se realizó una serie periapical completa sólo en
las parejas que padecían periodontitis (según el punto 2).
[Toma de muestra (ver apartado 4)]
3.3 Tratamiento periodontal: Los cónyuges que presentaban periodontitis
recibieron el mismo tratamiento que los pacientes, y a los sujetos
periodontalmente sanos se les hizo una tartrectomía con cureta y pulido. Al
mes de completar el tratamiento en las parejas con periodontitis, se llevó a
cabo una reevaluación, decidiendo darles de alta para pasar a controles
periódicos, tratar nuevamente alguna zona o bien someterlos a cirugía
periodontal. Seis meses después del tratamiento se exploraron los mismos
parámetros clínicos.
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4. TOMA DE MUESTRAS
Muestras periodontales:
1) El procedimiento seguido consistió en aislar la zona con rollos de
algodón, retirar la placa supragingival con una cureta y secar el exceso
de saliva con una gasa (sin usar chorro de aire).
2) Se introducía una punta de papel absorbente estéril del nº 50
(Maillefer®) hasta el fondo de la bolsa durante 30 segundos y se
extraía evitando que entrara en contacto con saliva o con la mucosa
oral.
3) Se incluía en 2 ml de VMGA-III que se destinaba a procesamiento por
cultivo.
4) Se tomaba otra muestra de la misma bolsa para efectuar los métodos
moleculares, durante el mismo periodo de tiempo, y se introducía en
un tubo Eppendorf estéril.
Muestras de saliva:
1) El paciente segregaba saliva durante 5 minutos y se recogía en un
recipiente estéril.
2) Se tomaban 2 mililitros de saliva con una pipeta estéril, añadiendo uno
en un tubo Eppendorf estéril y otro en el medio VMGA-III.
4.1 Toma de muestras microbiológicas en la primera visita de los
pacientes
En cada enfermo se obtuvieron:
Cuatro muestras de placa subgingival de 2 bolsas con una
profundidad de sondaje 5mm
Dos muestras de un punto con una profundidad de sondaje 3 mm,
2 ml de saliva
4.2 Toma de muestras microbiológicas al mes y a los seis meses de los
pacientes
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El procedimiento se repitió al mes y a los seis meses de finalizar el
tratamiento.
4.3 Toma de muestras microbiológicas en la primera visita de las
parejas
En la pareja, si padecía periodontitis se seguía una metodología igual
que el enfermo, y si era periodontalmente sana se obtenían cuatro muestras
de dos dientes que hubiesen sido sondados y 2 ml de saliva.
4.4 Toma de muestras microbiológicas a los seis meses de las parejas
El procedimiento se repitió a los seis meses de finalizar el tratamiento.
5. PROCESADO DE LAS MUESTRAS
5.1 Procedimiento para cultivo microbiológico
5.1.1 Composición de los medios
Medio VMGA-III (Möller 1966)
Objetivo: Permitir la viabilidad de la muestra durante el tiempo de
traslado al laboratorio.
El medio contiene Bacto gelatina (5 %), Thiona peptona (0,05 %), Bacto
agar (0,002 %), L-cisteína-HCL (0,05 %), azul de metileno (0,003 %),
CaCl2.6H2O (0,024 %), KCl (0,042 %), NaCl (0,1 %), Ácido tioglicólico
(0,05 %), Na glicerofosfato (1 %), Acetato fenilmercúrico (0,0005 %),
MgSO4.7H2O (0,01 %).
Medio VMG-1 (Murray y cols 1999)
Objetivo: Medio para diluir las muestras.
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Contenido: triptosa (0,25 %), thiona E peptona (0,25 %) y ClNa 0,5 %).
Agar Brucella selectivo (Murray y cols 1999)
Objetivo: Crecimiento de anaerobios.
Contenido: Agar Brucella (4,5 %), Bacto agar (0,3 %), vitamina K (0,005
%), sangre desfibrinada al 5%, hemina (0,005 %), vancomicina (0,002
%) y gentamicina (0,02 %).
Agar Brucella (Murray y cols 1999)
Objetivo: Cultivo de anaerobios.
Contenido: Agar Brucella (4,5 %), Bacto agar (0,3 %), vitamina K (0,005
%), sangre desfibrinada al 5%, hemina (0,005 %).
Medio TSBV (Tryptic soy-serum-bacitracin-vancomycin) (Slots 1982)
Objetivo: Cultivo de A. actinomicetemcomitans
Contenido: Tryticase Soy Agar (4 %), extracto de levadura (0,1 %), suero
de caballo (10 %), bacitracina (0,075 %), y vancomicina (0,005 %).
Medio Dentaid-1 (Alsina y cols 2001)
Objetivo: Cultivo de A. actinomicetemcomitans
Contenido: Brain heart infusion agar (BHIA), extracto de levadura (0,5
%), fumarato sódico (0,15 %), formato sódico (0,1 %) y vancomicina
(0,009 %).
- 77 -
5.1.2 Inoculación en los medios de cultivo
Las muestras se inoculaban en los medios de cultivo en un plazo máximo
de 2 horas.
1. Los tubos que contienen las puntas de papel incluidas en el medio de
transporte se agitan durante 30” en un vórtex para liberar los
microorganismos de las puntas de papel al medio.
2. Se efectúan diluciones seriadas 1/10, 1/100, 1/1.000 y 1/10.000 y se
siembran en TSBV, Dentaid-1, Agar Brucella y Agar Brucella selectivo.
5.1.3 Incubación
Las placas sembradas en medios específicos para anaerobios (Agar-
Brucella y Agar Gentamicina-Vancomicina) se introducen y se reincuban en
condiciones de anaerobiosis utilizando jarras OXOID de 2,5 l con el sistema
AnaeroGenTM (OXOID Ltd.). Las jarras se incuban en una estufa a 35ºC +/-
2ºC.
Los medios específicos para Aa (TSBV y Dentaid-1) se incuban en una
atmósfera de 10% de CO2 a 37ºC.
5.1.4 Lectura
- Para determinar si existe crecimiento de anaerobios se examinan las
placas a los 7 y 14 días empleando una lupa estereoscópica.
- Para efectuar el recuento se selecciona la dilución en la que se
visualiza crecimiento de 5-100 colonias.
- Las colonias con morfología compatible con Pg, Aa y Tf se
subcultivan en medio sin antibiótico y se conservan congeladas a -
80ºC
- 78 -
5.2 MUESTRAS PARA PCR
5.2.1. Extracción y purificación del ácido nucleico
Durante la primera fase el objetivo principal es conseguir romper o lisar
la célula bacteriana, sin destruir o deteriorar los ácidos nucleicos, bien el ácido
desoxirribonucleico (ADN) o bien el ácido ribonucleico (ARN). Se han utilizado
diferentes métodos químicos, enzimáticos y físicos para obtener ADN en
suficiente cantidad y calidad para su análisis con sondas de ADN o PCR que
permiten detectar y en algunos casos cuantificar las bacterias marcadoras
periodontopatógenas.
Para el empleo de técnicas de diagnóstico molecular es necesario
extraer y purificar el ADN bacteriano de las muestras, liberándolo de otras
sustancias, principalmente proteínas, que puedan interferir en las siguientes
fases.
La extracción del ADN se llevó a cabo con el kit QIAamp DNA
(Qiagen®) según las indicaciones del fabricante. Procedimiento:
1. Preparar dos baños de agua caliente, uno a 70 ºC y otro a 95 ºC.
2. Centrifugar las muestras de saliva a 13.000 rpm durante 15min a 4ºC. y
desechar el sobrenadante, dejando el “pellet”.
3. Añadir a la muestra 200 µl de tampón de lisis ATL para romper las
membranas y 20 µl de proteinasa K para destruir los componentes proteicos
de las células. Agitar en el vórtex 30” para asegurar una lisis eficaz. Incubar
a 70ºC durante 10 minutos para activar la proteinasa K. Centrifugar
brevemente para eliminar las gotas de la parte interna de la tapa.
4. Añadir 200 µl de tampón de lisis AL y mezclar de nuevo en el vórtex 15”.
Incubar 5 minutos a 95ºC (se inactiva la proteinasa K) y centrifugar
brevemente.
- 79 -
5. Añadir 200 µl de etanol y agitar en el vórtex 15”. Incubar 5 minutos a 95ºC y
centrifugar brevemente.
6. Transferir los 620 µl del tubo eppendorff a la columna QIAmp Spin en un
tubo colector de 2 ml sin mojar el borde, cerrar la tapa para evitar la
formación de aerosoles y centrifugar 1min a 8.000 rpm.
7. Colocar la columna QIAmp Spin en un tubo colector de 2 ml limpio y
desechar el colector que contiene el fluido filtrado.
8. Añadir 500 µl de tampón AW1 sin mojar el borde. Cerrar la tapa y
centrifugar dos minuto a 8.000 rpm.
9. Colocar un tubo colector nuevo y desechar el que contiene el fluido filtrado.
10. Añadir 500 µl de tampón AW2 sin mojar el borde, cerrar la tapa y centrifugar
3 minutos a 13.000 rpm
11. Colocar la columna QIAmp spin en un tubo eppendorff de 1,5 ml y desechar
el colector con el fluido filtrado.
12. Añadir 250 µl de tampón de elución AE y centrifugar 2 minutos a 8.000rpm.
13. El ADN purificado se almacena a -80ºC.
5.2.2 PCR cuantitativa
Se llevará a cabo mediante PCR en tiempo real
Amplificación de fragmentos específicos
- 80 -
Cebadores
A. actinomycetemcomitans: cebadores específicos del gen lktC
(leucotoxina) previamente descritos (Morillo y cols 2003) que
amplifica un fragmento de 77 pb entre la posición 736 a 812.
Aa-forward 5´-ACGCAGACGATTGACTGAATT-TAA-3´
Aa-reverse 5´-GATCTTCACAGCTATA-TGGCAGCTA-3´
P. gingivalis: cebadores específicos del gen ARg-gingipaina
previamente descritos (Morillo y cols 2003) que amplifica un
fragmento de 71 pb de la posición 1308 a 1379
Pg-forward 5´CCTACGTG-TACGGACAGAGCTATA-3´
Pg-reverse 5´-AGGATCGCTCAGCGTAGCATT-3´
Amplificación
Se utilizará la Taq polimerasa de Invitrogen siguiendo las instrucciones del
fabricante en un volumen final de reacción de 25 ml conteniendo 3 ml de ADN
molde y buffer y nucleótidos ajustados al volumen.
La reacción se llevará a cabo de cada microorganismo por separado
utilizando un ABI Prism 7700 con el siguiente programa:
2 minutos a 50º C
10 min a 95º C
40 ciclos de 15 segundos a 95º C y 1 minuto a 60º C
Cuantificación
Se realizará por comparación de las curvas de disociación de las
muestras respecto a cantidades conocidas de los fragmentos amplificados
clonados en un vector.
- 81 -
6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
En este estudio estadístico, para cada una de las tablas que aparecen, fue
necesario realizar contrastes del tipo
H0: μA = μB
H1: μA ≠ μB
o la generalización del mismo con n variables/muestras en lugar de 2; salvo
para la tabla “9B”, para la que se realizó un contraste del tipo
H0: πA = πB
H1: πA ≠ πB,
Se utilizó, para ambos tipos de contrastes, el programa estadístico SPSS.
Contraste (1)
El primer paso para realizar el contraste (1) fue comprobar la normalidad de las
variables/muestras cuyas medias se comparaban. Para verificar dicha
propiedad se usó el Test de Normalidad de Shapiro-Wilk, asumiendo
normalidad si tanto para la variable/muestra A como para la variable/muestra B
(o para todas las variables/muestras, en su versión general), se obtenía un p >
0’05.
A partir del resultado de dicho test, se continuó de dos formas:
Si p ≤ 0’05, se usaron técnicas no paramétricas.
Si p > 0’05, se usaron técnicas paramétricas.
Tanto a la hora de realizar contrastes paramétricos como no paramétricos, se
tuvo en cuenta si las variables/muestras a comparar eran independientes o
relacionadas. Así, se obtuvieron realmente cuatro formas de proceder a partir
de la comprobación de normalidad:
(1)
(2)
- 82 -
No paramétricas:
o Muestras independientes: Test U de Mann-Whitney (H de Kruskal-
Wallis en la versión general del contraste)
o Muestras relacionadas: Test de Wilcoxon (Friedman en la versión
general del contraste)
Paramétricas:
o Muestras independientes: Prueba T para muestras
independientes (ANOVA de un factor en la versión general del
contraste)
o Muestras relacionadas: Prueba T para muestras relacionadas
Asímismo, cuando se realizaron las comprobaciones paramétricas anteriores,
se debió observar, antes de tomar el p-valor correspondiente al contraste que
interesaba desde un principio (1), el valor de p resultante del Test de Levene
para igualdad de varianzas, para saber si se debía tomar el p-valor
correspondiente a la suposición de varianzas iguales o varianzas desiguales.
Hecho esto, se pudieron recopilar los distintos p-valores resultantes.
Contraste (2)
Por su parte, para el contraste (2), el primer paso a seguir fue construir una
Tabla de Contingencia (tabla 2x2) para cada contraste, y tras ello, realizar la
prueba Chi cuadrado, recogiendo el p-valor correspondiente para el contraste
deseado.
- 83 -
7. ANEXO
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PACIENTES
ESTUDIO: Estudio de transmisión de periodontopatógenos entre parejas
pre y postratamiento periodontal
El paciente:
Con DNI:
Mayor de edad, fecha de nacimiento:
Ha sido informado de:
“Se le invita a participar en un estudio sobre la posibilidad de transmisión de
bacterias orales de unos individuos a otros. Para ello se le tomarán unas
muestras de los dientes con puntas de papel absorbente antes de empezar
el tratamiento periodontal, y al transcurrir un mes y a los seis meses de
finalizar el tratamiento. La toma de estas muestras no interfiere con el
tratamiento que le ha recomendado su dentista, ya que el mismo y el control
de la evolución se llevarán a cabo según las indicaciones habituales. El
tratamiento que se le va a realizar es el mismo que se le hace a cualquier
otra persona con su mismo problema.”
Usted puede abandonar la participación en el estudio cuando lo desee,
sin que ello suponga una interrupción en el tratamiento o una modificación del
mismo”.
Sevilla, de de 200
Firma
- 84 -
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PAREJAS
ESTUDIO: Estudio de transmisión de periodontopatógenos entre parejas
pre y postratamiento periodontal
El paciente:
Con DNI:
Mayor de edad, fecha de nacimiento:
Ha sido informado de:
“Se le invita a participar en un estudio sobre la posibilidad de transmisión de
bacterias orales de unos individuos a otros. Para ello se le tomarán unas
muestras de los dientes con puntas de papel absorbente antes de empezar
el tratamiento periodontal de su pareja y seis meses después de finalizar el
tratamiento. La toma de estas muestras no interfiere con el tratamiento que
le ha sido recomendado a su pareja por su dentista, ya que el mismo y el
control de la evolución se llevará a cabo según las indicaciones habituales.
El tratamiento que se le va a realizar es el mismo que se le hace a cualquier
otra persona con su mismo problema.”
Usted puede abandonar la participación en el estudio cuando lo desee,
sin que ello suponga una interrupción en el tratamiento de su pareja o una
modificación del mismo”.
Sevilla, de de 200
Firma
- 85 -
VI. RESULTADOS
1. CASUÍSTICA
Se seleccionaron 16 pacientes periodontales que acudieron a la Facultad
de Odontología de la Universidad de Sevilla, y se solicitó la colaboración de
sus parejas. En total 32 sujetos con un tiempo de relación medio de 20,5
años (rango: 6 a 40).
El grupo de pacientes incluía más varones que mujeres (12 varones y 4
mujeres) y sus parejas eran 12 mujeres y 4 varones. La edad media era similar
entre los pacientes y sus parejas; 45,6 años (rango: 37 y 63) y 42,9 años
(rango: 26 y 60) respectivamente. El porcentaje de pacientes y parejas
ocupadas, no ocupadas y amas de casa fue similar también entre ambos
grupos. Igualmente el porcentaje de fumadores también se equiparaba entre
los pacientes y sus respectivas parejas. De las parejas, 6 (37,5%) tenían
cónyuges enfermos con periodontitis, y los 10 restantes estaban sanos (tablas
1, 2).
De las 16 parejas que comenzaron el estudio 12 lo completaron. Dos
parejas (una sin periodontitis crónica “sana” y una con periodontitis crónica
“enferma”) abandonaron el estudio antes de la segunda toma de muestras y
otras dos parejas (una sana y una enferma) antes de la tercera toma de
muestras.
- 86 -
Tabla 1. Características demográficas de los 16 pacientes y sus 16 parejas.
Pacientes (n=16) Parejas (n=16)
Media Media
Edad 45,6 42,9
Tiempo de relación 20,4 20,4
%
Sexo (varones/mujeres)
Varones 75,0 25,0
Mujeres 25,0 75,0
Fumadores
Sí 31,3 31,3
No 62,5 68,8
Ex-fumadores 6,3 0,0
Ocupación
Ocupados 62,5 62,5
No ocupados 25,0 12,5
Amas de casa 12,5 25,0
Tabla 2. Características demográficas de los 16 pacientes y sus 16 parejas (sanas y enfermas).
Pacientes
(n=16)
Parejas sanas
(n=10)
Parejas enfermas
(n=6)
Media Media Media
Edad 45,6 39,2 49,0
Tiempo de relación 20,4 19,5 22,0
%
Sexo (varones/mujeres)
Varones 75,0 20,0 33,3
Mujeres 25,0 80,0 66,7
Fumadores
Sí 31,3 20,0 50,0
No 62,5 80,0 50,0
Ex-fumadores 6,3 0,0 0,0
Ocupación
Ocupados 62,5 60,0 66,7
No ocupados 25,0 0,0 33,3
Amas de casa 12,5 40,0 0,0
- 87 -
2. SITUACIÓN CLÍNICA PERIODONTAL INICIAL Y RESPUESTA AL
TRATAMIENTO.
Se realizó una exploración clínica completa (periodontograma) a los 32
individuos que comenzaron el estudio. De los 32 casos, 22 fueron
diagnosticados de Periodontitis Crónica.
Al comparar los hallazgos clínicos de los pacientes y los cónyuges
enfermos, se observó que los pacientes enfermos tenían proporciones medias
superiores de localizaciones con PS 4-5mm y ≥ 6mm, y de localizaciones con
pérdida de nivel de inserción clínico avanzado (≥ 5mm). Así mismo, al
comparar las características clínicas de todos los sujetos enfermos con las de
los cónyuges sanos, se comprobó que los enfermos tenían proporciones
medias muy superiores de localizaciones con PS 4-5mm y ≥ 6mm, y de
localizaciones con pérdida de nivel de inserción clínico moderado y avanzado.
De igual forma, la proporción media de localizaciones que mostraban
sangrado al sondaje eran superiores en los pacientes periodontales respecto a
los cónyuges, enfermos o sanos. Sin embargo, el índice de placa bacteriana
era similar entre pacientes y cónyuges enfermos, y superior en los sujetos
enfermos respecto a los cónyuges sanos. Las características clínicas de los
pacientes y las parejas se exponen en las tablas 3 y 4.
- 88 -
Tabla 3. Características clínicas de los 16 pacientes (antes del tratamiento).
Media (% Localizaciones)
(Exploración Inicial)
Pacientes (n=16)
Profundidad de Sondaje
≤ 3 mm 55,95
4-5mm 35,39
≥ 6 mm 8,65
Nivel de pérdida de inserción clínico
Leve PIC=1-2mm 23,58
Moderada PIC=3-4mm 41,12
Avanzada PIC≥5mm 35,30
Sangrado al sondaje
Positivo 50,69
Negativo 49,31
Índice de placa
0 34,75
1 22,25
2 22,94
3 20,05
- 89 -
Tabla 4. Características clínicas de las 16 parejas (antes del tratamiento).
Media (% Localizaciones) (Exploración Inicial)
Parejas Enfermas
(n=6)
Parejas Sanas
(n=10)
Profundidad de
Sondaje
≤ 3 mm 80,86 93,22
4-5mm 17,90 6,78
≥ 6 mm 1,23 0,00
Nivel de inserción
clínico
Leve PIC=1-2mm 37,04 65,08
Moderada PIC=3-
4mm 46,30 34,05
Avanzada PIC≥5mm 16,67 0,87
Sangrado al sondaje
Positivo 39,04 23,38
Negativo 60,96 76,62
Índice de placa
0 30,25 59,02
1 19,91 25,40
2 24,54 13,71
3 25,31 1,88
Al mes de finalizar el tratamiento mecánico mediante raspado y alisado
radicular se reevaluó a los pacientes con una nueva exploración periodontal.
De los 22 pacientes, 10 recibieron cirugía periodontal y tratamiento antibiótico
con Amoxicilina 875 mg/8h, 7 días durante el período postoperatorio.Seis
meses después del tratamiento se exploraron los mismos parámetros clínicos.
La tabla 5 muestra la respuesta clínica al tratamiento periodontal, al mes
y a los 6 meses, de los 12 pacientes que completaron el estudio, y la tabla 6
expone la evolución clínica de los 4 cónyuges enfermos (los 8 restantes
estaban sanos y no recibieron tratamiento periodontal). Los parámetros clínicos
muestran una disminución progresiva del pocentaje de localizaciones con
profundidad de sondaje de 4-5 mm y ≥ 6mm, un descenso de las localizaciones
con pérdida de inserción clínica moderada y avanzada, así como de los índices
de sangrado al sondaje y placa bacteriana.
- 90 -
Tabla 5. Evolución clínica de los pacientes (n=12)
Media (% Localizaciones)
Pacientes (n=12)
Exploración
Inicial
Exploración 2
(1 mes)
Exploración 3
(6 meses)
Profundidad de Sondaje
≤ 3 mm 55,38 77,70 87,92
4-5mm 35,48 19,52 11,59
≥ 6 mm 9,14 2,79 0,50
Nivel de inserción clínico
Leve PIC=1-2mm 23,66 36,18 32,53
Moderada PIC=3-4mm 40,74 33,94 35,38
Avanzada PIC≥5mm 35,60 29,88 32,09
Sangrado al sondaje
Positivo 45,70 29,88 20,94
Negativo 54,30 70,12 79,06
Índice de placa
0 36,74 58,18 48,39
1 21,74 19,39 25,46
2 22,52 14,61 16,05
3 19,00 7,82 10,10
Tabla 6. Evolución clínica de las parejas enfermas (n=4)
Media (% Localizaciones)
Parejas (n=4)
Exploración
Inicial
Exploración 2
(1 mes)
Exploración 3
(6 meses)
Profundidad de Sondaje
≤ 3 mm 26,64 27,33 29,68
4-5mm 3,29 2,42 1,43
≥ 6 mm 0,18 0,06 0,12
Nivel de inserción clínico
Leve PIC=1-2mm 13,44 15,33 15,43
Moderada PIC=3-4mm 13,20 12,00 11,71
Avanzada PIC≥5mm 3,46 2,48 4,09
Sangrado al sondaje
Positivo 9,98 8,73 7,99
Negativo 20,13 21,09 23,23
Índice de placa
0 10,63 13,33 13,38
1 6,33 7,15 4,96
2 7,47 5,58 6,63
3 5,68 3,76 6,26
- 91 -
3. RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS
3.1. Resultados de cultivo bacteriano
3.1.1. Cuantificación de recuentos bacterianos en los pacientes y
las parejas, antes y después del tratamiento periodontal
En la comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios
de cultivo empleados, según el tipo de sujeto estudiado (paciente y pareja),
antes del tratamiento (muestras 1), se observan recuentos bacterianos totales
superiores en los pacientes al compararlos con las parejas, siendo estas
diferencias significativas en el recuento de anaerobios pigmentados. Esto
puede ser debido a que la mayoría de las parejas estaban sanas (el 62,5% no
padecían peridontitis crónica) (tabla 7).
Tabla 7. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados, según el tipo de sujeto estudiado (paciente y pareja), antes del tratamiento (muestras 1)
*diferencias significativas (p<0.05)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1)
Medios Paciente (n=64) Pareja (n=55) p
TSBV 2,0 1,6 0,199
Dentaid 2,1 2,0 0,63
Medio no selectivo para
anaerobios totales 4,3 3,9 0,118
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,6 1,5 0,81
Medio selectivo para
anaerobios totales 3,4 2,8 0,089
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 2,1 1,3 0,01*
- 92 -
Al estimar los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo
empleados según la profundidad de bolsa de los dientes (< / ≥ 4mm) antes del
tratamiento (muestras 1), se demuestran valores significativamente mayores de
anaerobios pigmentados en las muestras subgingivales profundas (tabla 8).
Tabla 8. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados según la profundidad de bolsa de los dientes (< / ≥ 4mm) antes del tratamiento (muestras 1)
**diferencias muy significativas (p<0.01)
Media de Log10 UFC/ml
(Muestras 1)
< 4mm ≥ 4mm
Medios (n = 70) (n=49) P
TSBV 2,2 1,3 0,064
Dentaid 2,4 1,5 0,038
Medio no selectivo para
anaerobios totales 4,1 4,1 0,838
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,1 2,1 0,002**
Medio selectivo para
anaerobios totales 2,7 3,7 0,073
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 1,4 2,3 0,07
- 93 -
En las tablas 9, 10 y 11 se obtuvieron recuentos de anaerobios
significativamente mayores, tanto de cifras totales como de colonias
pigmentadas, al aumentar el índice de placa y si existía sangrado. En la
muestra examinada el hábito tabáquico no afectaba significativamente al
recuento de anaerobios.
Tabla 9. Comparación de los recuentos bacterianos de anaerobios totales y pigmentados en relación con la posibilidad de tabaquismo (fumador, no fumador y ex-fumador) antes del tratamiento (muestras 1)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1)
Fumar
Medios
Sí
(n=38)
No
(n=77)
Ex Fumadores
(n=4) P
Medio no selectivo para
anaerobios totales 4,1 4,1 3,9 0,928
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,9 1,4 1,9 0,314
Medio selectivo para
anaerobios totales 3,0 3,2 2,8 0,629
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 1,4 1,9 0,7 0,208
Tabla 10. Comparación de los recuentos bacterianos de anaerobios totales y pigmentados según las características clínicas de la localización de la toma de muestra (sangrado al sondaje) antes del tratamiento (muestras 1)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1)
Sangrado al sondaje
Medios Positivo (n=38) Negativo (n=49) P
Medio no selectivo para
anaerobios totales 3,5 3,6 0,687
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,6 1,6 0,826
Medio selectivo para
anaerobios totales 3,1 2,3 0,063
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 1,9 1,3 0,057
- 94 -
Tabla 11. Comparación de los recuentos bacterianos de anaerobios totales y pigmentados según las características clínicas de la localización de la toma de muestra (índice de placa bacteriana) antes del tratamiento (muestras 1)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1)
Placa Bacteriana
Medios 0 (n=37) 1 (n=20) 2 (n=17) 3 (n=13) P
Medio no selectivo para
anaerobios totales 3,3 3,6 3,5 4,2 0,041*
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,6 1,5 1,7 1,8 0,946
Medio selectivo para
anaerobios totales 2,0 2,6 3,2 3,6 0,041*
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 1,1 1,3 2,3 2,4 0,021*
*diferencias significativas (p<0.05)
Se miden valores superiores de recuentos bacterianos en individuos
enfermos respecto a sujetos sanos, en los diferentes medios de cultivo
estudiados en las muestras tomadas antes del tratamiento periodontal, siendo
estas diferencias estadísticamente significativas para los anaerobios totales y
pigmentados (muestras 1) (tabla 12)
Tabla 12. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados en sujetos sanos y enfermos antes del tratamiento (muestras1)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1)
Medios Sanos (n=32) Enfermos (n=87) P
TSBV 1,4 2,0 0,08
Dentaid 1,9 2,1 0,487
Medio no selectivo para
anaerobios totales 3,7 4,2 0,07
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,5 1,6 0,699
Medio selectivo para
anaerobios totales 2,4 3,4 0,008**
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 1,1 2,0 0,026*
*diferencias significativas (p<0.05); **diferencias muy significativas (p<0.01)
- 95 -
En la tabla 13 se observa que se esquiparan los valores de los recuentos
bacterianos de los sujetos enfermos a los valores de los individuos sanos 6
meses después del tratamiento.
Tabla 13. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados en sujetos sanos y enfermos postratamiento (muestras 3)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 3)
Medios Sanos (n=26) Enfermos (n=64) P
TSBV 1,5 1,1 0,366
Dentaid 1,8 1,3 0,246
Medio no selectivo para
anaerobios totales 3,4 3,5 0,596
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,9 2,5 0,177
Medio selectivo para
anaerobios totales 2,0 2,3 0,378
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 0,7 0,7 0,735
- 96 -
El seguimiento de los sujetos sanos y enfermos, entre la evaluación
inicial y 6 meses tras el tratamiento, demostró que había diferencias muy
significativas en los recuentos bacterianos de los enfermos, que disminuían con
el tratamiento. En los sujetos sanos estas diferencias eran casi significativas en
el recuento de anaerobios totales, que se reducía por el tratamiento en los
enfermos (tabla 14).
Tabla 14. Comparación de los recuentos bacterianos en los diferentes medios de cultivo empleados en sujetos sanos y enfermos, antes y después (6 meses) del tratamiento (muestras 1 y muestras 3)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3)
Antes (M1) Después (M3) p(sanos)
p(enfermos)
Medios
Sanos
(n=26)
Enfermos
(n=64)
Sanos
(n=26)
Enfermos
(n=64)
TSBV 1,5 2,0 1,5 1,1 0,758 0,001**
Dentaid 2,0 2,1 1,8 1,3 0,476 0,001** Medio no selectivo
para anaerobios totales 3,8 4,2 3,4 3,5 0,096 0,001** Medio no selectivo para anaerobios pigmentados 1,4 1,6 1,9 2,5 0,538 0,004** Medio selectivo para
anaerobios totales 2,8 3,5 2,0 2,3 0,055 0,001** Medio selectivo para anaerobios pigmentados 1,2 2,1 0,7 0,7 0,246 0,001**
**diferencias muy significativas (p<0.01)
- 97 -
Como se puede ver hay una disminución muy significativa en los
recuentos de anaerobios totales al comparar las muestras tomadas antes del
tratamiento periodontal (muestras1) y 6 meses después (muestras3) tanto en
los pacientes como en las parejas (tabla 15, gráfico 1).
Tabla 15. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios totales a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3)
Tipo de sujeto Medio no selectivo para anaerobios
Totales - M1 (n=90) Totales - M3 (n=90) P
Pacientes 4,2 (n=48) 3,6 (n=48) 0,008**
Parejas 3,9 (n=42) 3,4 (n=42) 0,007**
**diferencias muy significativas (p<0.01)
Gráfico 1. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios totales a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3)
- 98 -
Los recuentos de anaerobios pigmentados se incrementan despues del
tratamiento periodontal (muestras 3) únicamente en los pacientes y no en las
parejas (tabla 16, gráfico 2).
Tabla 16. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios pigmentados a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3)
Tipo de
sujeto Medio no selectivo para anaerobios
Pigmentados - M1
(n=90)
Pigmentados - M3
(n=90) P
Pacientes 1,5 (=48) 2,4 (n=48) 0,014*
Parejas 1,5 (n=42) 2,2 (n=42) 0,161
*diferencias significativas (p<0.05)
Gráfico 2. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios pigmentados a lo largo del tiempo en Medio no selectivo (muestras 1 y muestras 3)
- 99 -
Se observa una reducción estadísticamente muy significativa de los
recuentos de anaerobios totales tras la terapéutica tanto en los pacientes como
en las parejas (muestras 3) (tabla 17, gráfico 3).
Tabla 17. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios totales a lo largo del tiempo en Medio selectivo (muestras 1 y muestras 3).
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3)
Tipo de sujeto Medio selectivo para anaerobios
Totales - M1 (n=90) Totales - M3 (n=90) P
Pacientes 3,5 (n=48) 2,2 (n=48) 0,001**
Parejas 3,1 (n=42) 2,2 (n=42) 0,002**
**diferencias muy significativas (p<0.01)
Gráfico 3. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios totales a lo largo del tiempo en Medio selectivo (muestras 1 y muestras 3)
- 100 -
Como en la tabla anterior se comprueba una disminución en la
cuantificación de colonias pigmentadas 6 meses después del tratamiento
siendo esta diferencia muy significativa en los pacientes y casi significativa en
las parejas (tabla 18, gráfico 4).
Tabla 18. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios pigmentados a lo largo del tiempo en Medio selectivo (muestras 1 y muestras 3)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3)
Tipo de sujeto Medio selectivo para anaerobios
Pigmentados - M1 (n=90) Pigmentados - M3 (n=90) P
Pacientes 2,2 (n=48) 0,6 (n=48) 0,001**
Parejas 1,5 (n=42) 0,8 (n=42) 0,076
*diferencias significativas (p<0.05); **diferencias muy significativas (p<0.01)
Gráfico 4. Seguimiento evolutivo de los recuentos de anerobios pigmentados a lo largo del tiempo en Medio selectivo (muestras 1 y muestras 3)
- 101 -
Las mediciones reflejan valores muy superiores en las muestras de
saliva en comparación a las obtenidas de localizaciones periodontales, siendo
estas diferencias estadísticamente muy significativas para los medios TSBV,
Dentaid, y medio no selectivo y selectivo para anaerobios totales (tabla 19).
Tabla 19. Comparación de los recuentos totales en saliva y diente antes del tratamiento periodontal (muestras1)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1)
Medios Saliva (n=32) Diente (n=87) P
TSBV 3,9 1,0 0,001**
Dentaid 4,4 1,2 0,001**
Medio no selectivo para
anaerobios totales 5,5 3,6 0,001**
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 1,4 1,6 0,399
Medio selectivo para
anaerobios totales 4,4 2,6 0,001**
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 2,1 1,6 0,199
**diferencias muy significativas (p<0.01)
Los recuentos totales son superiores en las muestras de saliva al
compararlas con las muestras periodontales de igual forma que las muestras 1
(tabla 20).
Tabla 20. Comparación de los recuentos totales en saliva y diente después del tratamiento (muestras3)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 3)
Medios Saliva (n=24) Diente (n=66) P
TSBV 3,4 0,5 0,001**
Dentaid 3,6 0,7 0,001**
Medio no selectivo para
anaerobios totales 5,4 2,8 0,001**
Medio no selectivo para
anaerobios pigmentados 4,0 1,7 0,001**
Medio selectivo para
anaerobios totales 4,0 1,6 0,001**
Medio selectivo para
anaerobios pigmentados 1,2 0,5 0,076
**diferencias muy significativas (p<0.01)
- 102 -
Se objetiva una disminución significativa de los valores tanto en las
muestras de saliva como en las muestras periodontales, aunque los valores
continuaron siendo superiores en las muestras de saliva respecto a las
periodontales 6 meses después del tratamiento periodontal (tabla 21).
Tabla 21. Comparación de los recuentos totales en saliva y diente antes y después del tratamiento (muestras 1 y muestras 3)
Media de Log10 UFC/ml (Muestras 1 vs Muestras 3)
Antes (M1) Después (M3)
Medios
Saliva
(n=24)
Diente
(n=66)
Saliva
(n=24)
Diente
(n=66) p(saliva) p(diente)
TSBV 3,9 1,1 3,4 0,5 0,259 0,003**
Dentaid 4,5 1,2 3,6 0,7 0,041* 0,017*
Medio no
selectivo para
anaerobios
totales 5,5 3,6 5,4 2,8 0,92 0,001**
Medio no
selectivo para
anaerobios
pigmentados 1,1 1,7 4,0 1,7 0,001** 0,806
Medio selectivo
para anaerobios
totales 4,9 2,7 4,0 1,6 0,003** 0,001**
Medio selectivo
para anaerobios
pigmentados 2,3 1,7 1,2 0,5 0,041* 0,001**
*diferencias significativas (p<0.05); **diferencias muy significativas (p<0.01)
- 103 -
3.2. PCR Cuantitativa
3.2.1. Detección y cuantificación de Aa Y Pg en los pacientes y las
parejas antes y después del tratamiento
La media de Log de PCR Pg y PCR Aa es superior en los pacientes al
compararla con las parejas, siendo las diferencias muy significativas en la
media de recuento por PCR Pg (tabla 22).
Tabla 22. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en pacientes y parejas antes del tratamiento (muestras 1 PCR)
Pacientes Parejas p
Media de PCRPG-LOG (M1) 3,2 (n=30) 2,0 (n=30) 0.002**
Media de PCRAA-LOG (M1) 0,8 (n=30) 0,7 (n=30) 0.624
**diferencias muy significativas (p<0.01)
Se constatan unos valores superiores en la media de Log de PCR Pg
respecto a la media de Log de PCR Aa, tanto en las muestras de saliva como
en las de dientes. Sin embargo, no se aprecian diferencias significativas al
comparar la media de Log de PCR Pg y de PCR Aa en las muestras de saliva y
periodontales (tabla 23).
Tabla 23. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en saliva y dientes antes del tratamiento (muestras 1 PCR)
Saliva Dientes P
Media de PCRPG-LOG (M1) 2,5 (n=30) 2,7 (n=30) 0,458
Media de PCRAA-LOG (M1) 0,9 (n=30) 0,6 (n=30) 0,502
- 104 -
Los datos de la tabla 24 reflejan medias de Log de PCR Pg superiores
en sujetos enfermos, siendo la diferencia muy significativa, sin embargo no se
observan discrepancias significativas entre las medias de Log de PCR Aa de
individuos sanos y enfermos.
Tabla 24. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en sujetos sanos y enfermos antes del tratamiento (Muestras 1 PCR)
Sanos Enfermos P
Media de PCRPG-LOG (M1) 1,6 (n=18) 3,0 (n=42) 0,002**
Media de PCRAA-LOG (M1) 0,8 (n=18) 0,7 (n=42) 0,891
**diferencias muy significativas (p<0.01)
En la exploración al mes del tratamiento la media de Log de PCR Pg fue
inferior en los pacientes al enfrentarla con las parejas, sin embargo la media de
Log Aa fue superior en los pacientes, obteniéndose un resultado de PCR
negativo en las parejas (tabla 25).
Tabla 25. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en pacientes y parejas 1 mes después del tratamiento (muestras 2 PCR)
Pacientes Parejas p
Media de PCRPG-LOG (M2) 1,8 (n=28) 3,2 (n=6) 0.081
Media de PCRAA-LOG (M2) 0,5 (n=28) 0,0 (n=6) 0.333
- 105 -
La tabla 26 contrasta la media de Log de PCR Pg y PCR Aa en muestras
de saliva y muestras periodontales 1 mes después de la terapéutica. Se
observan unos valores similares en la media de Log de PCR Pg y en la media
de Log de PCR Aa, en las muestras de saliva y en las muestras periodontales,
no observándose diferencias significativas (tabla 26).
Tabla 26. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en saliva y dientes 1 mes después del tratamiento (muestras 2 PCR)
Saliva Dientes
P
Media de PCRPG-LOG (M2) 2,2 (n=17) 2,0 (n=17) 0,726
Media de PCRAA-LOG (M2) 0,5 (n=17) 0,3 (n=17) 0,902
En la valoración a los 6 meses del tratamiento se observó que la media
de Log de PCR Pg continuó siendo inferior en los pacientes al compararla con
la de las parejas. La media de Log de Aa fue similar en ambos grupos (tabla
27).
Tabla 27. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en pacientes y parejas 6 meses después del tratamiento (muestras 3 PCR)
Pacientes Parejas p
Media de PCRPG-LOG (M3) 1,3 (n=22) 1,8 (n=22) 0.248
Media de PCRAA-LOG (M3) 0,4 (n=22) 0,4 (n=22) 0.953
- 106 -
Al comparar la media de Log de PCR Pg y de PCR Aa en las muestras
de saliva y muestras periodontales tomadas 6 meses después del tratamiento,
no se observaron diferencias significativas en ambos tipos de muestras (tabla
28).
Tabla 28. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en saliva y dientes 6 meses después del tratamiento (muestras 3 PCR)
Saliva Dientes
P
Media de PCRPG-LOG (M3) 1,7 (n=22) 1,5 (n=22) 0,697
Media de PCRAA-LOG (M3) 0,5 (n=22) 0,3 (n=22) 0,89
Al cotejar los datos de los sujetos sanos y enfermos 6 meses después
del tratamiento se pudo comprobar que los valores de la media de Log Pg y de
la media de Log Aa eran similares en individuos sanos y enfermos (tabla 29).
Tabla 29. Media de Log de PCR Pg y PCR Aa en sujetos sanos y enfermos 6 meses después del tratamiento (Muestras 3 PCR)
Sanos Enfermos P
Media de PCRPG-LOG (M3) 2,0 (n=14) 1,4 (n=30) 0,192
Media de PCRAA-LOG (M3) 0,7 (n=14) 0,3 (n=30) 0,281
- 107 -
En la tabla 30 el seguimiento reveló una disminución de la media de Log
de Pg y de Aa en los pacientes. Esta disminución fue estadísticamente
significativa para la media de Log de Pg de las muestras periodontales de los
pacientes.
Tabla 30. Seguimiento cuantitativo por PCR antes y después del tratamiento (1 mes y 6 meses) (muestras 1, 2 y 3 PCR).
Log PCR
Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3 p p
Saliva Diente Saliva Diente Saliva Dientes Saliva Dientes
Paciente
PG 2,7 3,4 1,8 1,8 1,4 1,4 0,103 0,026*
AA 0,8 1,0 0,4 0,0 0,6 0,2 0,926 0,368
Pareja
PG 3,0 2,4 3,6 2,7 2,0 2,0 0,148 0.717
AA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 - -
*diferencias significativas (p<0.05)
Número de
muestras en cada
caso
Log PCR
Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3
Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente
Paciente
PG 10 10 10 10 10 10
AA 10 10 10 10 10 10
Pareja
PG 3 3 3 3 3 3
AA 3 3 3 3 3 3
- 108 -
El seguimiento cualitativo mostró que no había diferencias significativas en
el porcentaje de positivos de Pg y Aa en los pacientes y las parejas al evaluar
las tres muestras a la vez (tabla 31). No se aisló Aa inicialmente en las
muestras de ningún sujeto, paciente o pareja, por cultivo, pero se evidenció por
PCR en 2 enfermos, persistiendo en ellos tras el tratamiento. Se observa como
Pg se detecta al diagnóstico por PCR en 87.5% de los pacientes, y en 81.25%
de las parejas (43,75% “portadoras” sanas, 37.5% parejas enfermas).
Tabla 31. Seguimiento cualitativo por PCR: porcentaje de positivos antes y después del tratamiento (1 mes y 6 meses): Muestras 1, frente a 2 y 3 PCR
% PCR
Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3 p p
Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente
Paciente
PG 80,0% 90,0% 60,0% 60,0% 50,0% 60,0% 0,366 0,240
AA 20,0% 20,0% 10,0% 0,0% 20,0% 10,0% 0,787 0,329
Pareja
PG 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 66,7% 100,0% 0,325 -
AA 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% - -
% PCR
Número de muestras
POSITIVAS en cada
caso
Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3
Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente
Paciente
PG 8 9 6 6 5 6
AA 2 2 1 0 2 1
Pareja
PG 3 3 3 3 2 3
AA 0 0 0 0 0 0
% PCR
Número de muestras
NEGATIVAS en cada
caso
Muestras 1 Muestras 2 Muestras 3
Saliva Diente Saliva Diente Saliva Diente
Paciente
PG 2 1 4 4 5 4
AA 8 8 9 10 8 9
Pareja
PG 0 0 0 0 1 0
AA 3 3 3 3 3 3
- 109 -
3.3. Comparación de los resultados de cultivo bacteriano y PCR
cuantitativa
Al examinar los resultados del cultivo frente a los de PCR en los pacientes y
las parejas antes del tratamiento, constatamos unos recuentos superiores de
Pg en los pacientes respecto a las parejas, tanto en cultivo como en PCR,
siendo estas diferencias estadísticamente significativas. Los valores de Aa son
similares (tabla 32).
Tabla 32. Cultivo frente a PCR respecto a pacientes y parejas antes del tratamiento (Muestras 1 PCR)
Log (Muestras 1)
Paciente Pareja P
Recuento de Pg
Cultivo Medio Selectivo
Pigmentados (Log) 2,1 (n=64) 1,3 (n=55) 0,01*
PCR (Log) 3,2 (n=30) 2,0 (n=30) 0,002**
Recuento Aa
Cultivo TSBV (Log) 2,0 (n=64) 1,6 (n=55) 0,199
Dentaid (Log) 2,1 (n=64) 2,0 (n=55) 0,63
PCR (Log) 0,8 (n=30) 0,7 (n=30) 0,624
*diferencias significativas (p<0.05); **diferencias muy significativas (p<0.01)
- 110 -
El análisis de regresión mostró que los recuentos obtenidos por PCR
fueron superiores a los del cultivo (gráfico 5).
Gráfico 5. Análisis de regresión de recuento de anaerobios pigmentados en medio selectivo frente a PCR Pg en los pacientes (muestras 1)
Los resultados del cultivo frente a los de PCR en fumadores y no
fumadores antes del tratamiento, no presentan diferencias significativas ni en
los recuentos de Pg ni en los de Aa (tabla 33).
Tabla 33. Cultivo frente a PCR respecto a fumadores y no fumadores antes del tratamiento (Muestras 1 PCR)
Log (Muestras 1)
Fumadores No fumadores P
Recuento de Pg
Cultivo Medio Selectivo
Pigmentados (Log) 1,4 (n=38) 1,9 (n=77) 0,176
PCR (Log) 2,1 (n=20) 2,8 (n=40) 0,188
Recuento Aa
Cultivo TSBV (Log) 1,8 (n=38) 1,9 (n=77) 0,973
Dentaid (Log) 1,7 (n=38) 2,3 (n=77) 0,14
PCR (Log) 0,7 (n=20) 0,7 (n=40) 0,875
- 111 -
Los datos de cultivo frente a los de PCR en muestras de saliva y
periodontales antes del tratamiento, muestran que por cultivo se obtienen
valores muy superiores de anaerobios totales y pigmentados en las muestras
de saliva al compararlas con las de localizaciones periodontales. Sin embargo
las cuantificaciones por PCR de Pg no reflejan diferencias entre las muestras
de saliva y las periodontales. La media de recuento por PCR Pg fue inferior
(diferencia muy significativa) a la media de recuento de anaerobios totales en
muestras de saliva y fue superior a la media de recuento de anaerobios
pigmentados en muestras periodontales (diferencia muy significativa) (tabla
34).
Tabla 34. Cultivo (anaerobios totales y pigmentados) frente a PCR Pg respecto a saliva y dientes antes del tratamiento (Muestras 1 PCR)
Cultivo PCR (Muestras 1) p P
Log
MST
Log
MSP PCRPG-LOG
Saliva 4,4 2,1 2,5 0.001** 0.806
Dientes 2,6 1,6 2,7 0.625 0.001**
MNST: medio no selectivo anaerobios totales; MNSP: medio no selectivo anaerobios pigmentados; MST: medio selectivo anaerobios totales; MSP: medio selectivo anaerobios pigmentados.
**diferencias muy significativas (p<0.01)
- 112 -
El seguimiento evolutivo en las medias de cultivo y en las medias y
porcentajes de positivos de PCR antes del tratamiento y 6 meses después del
mismo, pone de manifiesto un descenso de los recuentos bacterianos y del
porcentaje de positivos a Pg y Aa transcurridos 6 meses del tratamiento
periodontal (tabla 35).
Tabla 35. Comparación de medias de cultivo y medias y porcentaje de positivos de PCR antes y después del tratamiento (Muestras 1 y Muestras 3)
Cultivo PCR
Log
TSBV
Log
Dent
Log
MST
Log
MNSP
Log
MST
Log
MSP
PCR PG-
LOG
PCRAA-
LOG %+Pg %+Aa
M 1 1,9 2,1 4,1 1,5 3,3 1,9 2,5 0,8 78,57% 16,67%
M 3 1,2 1,4 3,5 2,3 2,2 0,7 1,6 0,4 61,90% 14,29%
Número de muestras en cada caso
Cultivo PCR
Log
TSBV
Log
Dent
Log
MST
Log
MNSP
Log
MST
Log
MSP
PCR PG-
LOG
PCRAA-
LOG %+Pg %+Aa
M 1 90 90 90 90 90 90 42 42 42 42
M 3 90 90 90 90 90 90 42 42 42 42
MNST: medio no selectivo anaerobios totales; MNSP: medio no selectivo anaerobios pigmentados; MST: medio selectivo anaerobios totales; MSP: medio selectivo anaerobios pigmentados.
- 113 -
VII. DISCUSIÓN
A continuación pasamos a discutir los hallazgos más relevantes
encontrados en la tesis. La discusión se ha estructurado en función de los
datos clínicos y microbiológicos.
1. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS Y ESTADO CLÍNICO DE LAS
PAREJAS SELECCIONADAS.
1.1 Características demográficas
La selección de las parejas que se incluyeron en el estudio se basó en la
situación clínica periodontal de los pacientes. Los pacientes periodontales
fueron 16 individuos con periodontitis crónica no tratada, al menos durante el
año precedente, sin enfermedades sistémicas, con una edad superior a 35
años, un mínimo de 20 dientes, y que no habían recibido tratamiento antibiótico
en los 3 meses previos. El único criterio que debían cumplir los cónyuges era
que hubiesen mantenido una relación de al menos 2 años de cohabitación con
los pacientes periodontales para asegurar que hubiese transcurrido un tiempo
suficiente para la transmisión horizontal de las bacterias, y para el desarrollo de
la periodontitis en los cónyuges. Finalmente el tiempo de relación de las
parejas fue muy superior al mínimo que se estableció, entre 6 años y 40 años.
Por tanto en el momento de la selección se desconocían las características
demográficas y el estado periodontal de los cónyuges.
Se utilizaron criterios de selección muy estrictos para conseguir que el
estudio se llevase a cabo sobre un grupo homogéneo, y se consiguió que
pacientes y parejas acudiesen a sus citas en los plazos establecidos. Una de
las mayores dificultades del estudio fue la fidelización de pacientes y parejas,
y lograr su asistencia permanente a citas y controles clínicos, terapéuticos y
tomas de muestras. Por este motivo, de 16 parejas completaron el estudio 12.
- 114 -
La media de edad de los pacientes y las parejas era muy similar, 45,6
(rango: 37 a 63) y 42,9 años (rango: 26 a 60) respectivamente, y el porcentaje
de fumadores era el mismo en ambos grupos (31,3%), así como el porcentaje
de individuos ocupados (62,5%).
1.2 Estado clínico de las parejas seleccionadas
Cuando se comparó el estado clínico de los pacientes periodontales y sus
cónyuges, se observó que de las 16 parejas, 6 padecían periodontitis crónica, y
10 estaban sanas periodontalmente.
Cuando se compararon los hallazgos clínicos de los pacientes y los
cónyuges enfermos, se observó que los pacientes enfermos tenían
proporciones medias superiores de localizaciones con PS 4-5mm y ≥ 6mm, y
de localizaciones con pérdida de nivel de inserción clínico avanzado (≥ 5mm).
Así mismo, al comparar las características clínicas de todos los sujetos
enfermos con las de los cónyuges sanos, se comprobó que los enfermos
tenían proporciones medias muy superiores de localizaciones con PS 4-5mm y
≥ 6mm, y de localizaciones con pérdida de nivel de inserción clínico moderado
y avanzado. De igual forma, la proporción media de localizaciones que
mostraban sangrado al sondaje eran superiores en los pacientes periodontales
respecto a los cónyuges, enfermos o sanos. Sin embargo, el índice de placa
bacteriana era similar entre pacientes y cónyuges enfermos, y superior en los
sujetos enfermos respecto a los cónyuges sanos. Las diferencias en hábitos de
higiene personales pueden explicar en parte los resultados clínicos, puesto que
los sujetos sanos mostraban índices de placa bacteriana y sangrado muy
inferiores a los de los enfermos.
En nuestro trabajo, a diferencia de otros publicados, sólo el 37,5% de las
parejas padecía periodontitis. Petit y cols (1994) investigaron la prevalencia de
destrucción periodontal en 24 parejas que habían permanecido unidas durante
al menos 8 años. Un total de 16 parejas tenían una forma leve a moderada de
periodontitis, con al menos una localización con pérdida de inserción clínica de
- 115 -
1 a 4 mm, y 5 parejas tenían destrucción periodontal severa con localizaciones
que mostraban al menos 8 mm de pérdida de inserción clínica. Von Troil-
Linden y cols (1995), en el examen clínico de 20 parejas que habían estado
casadas un mínimo de 10 años, encontraron que el 80% de los cónyuges
mostraban al menos periodontitis inicial. La diferencia en la prevalencia de
cónyuges sanos y enfermos puede explicarse por el criterio utilizado al definir la
periodontitis crónica. En nuestro estudio, la Periodontitis fue definida por la
presencia de pérdida de inserción clínica ≥6 mm en 2 o más dientes, y una o
más localizaciones con profundidad de sondaje ≥ 5mm.
Estos y otros estudios sugieren por tanto una asociación entre las
condiciones clínicas periodontales entre cónyuges. Debe señalarse también
que, debido al número limitado de parejas en las distintas publicaciones, las
conclusiones a cerca de la prevalencia de enfermedad en los cónyuges de
sujetos con periodontitis crónica deberían ser interpretadas con cautela.
2. TÉCNICAS DE ESTUDIO EMPLEADAS: CULTIVO Y PCR CUANTITATIVA
En nuestro estudio se emplearon dos tipos distintos de muestras (saliva y
exudado de muestra subgingival) y dos métodos de diagnóstico microbiológico,
el cultivo y la PCR en tiempo real. En primer lugar se llevó a cabo el cultivo en
medios tanto enriquecidos como medios selectivos específicos para Aa y Pg de
muestras periodontales y de saliva de pacientes y de sus parejas, antes y
después del tratamiento. En segundo lugar se efectuó la detección y
cuantificación de estas mismas bacterias mediante un método molecular de
amplificación (PCR cuantitativa en tiempo real). La amplificación se realizó con
cebadores específicos y la cuantificación se realizó mediante una comparación
con una recta obtenida de las dianas clonadas en diferentes diluciones.
Como cabía esperar, los resultados obtenidos con los dos métodos
empleados fueron muy distintos. Coinciden con los de otros estudios que han
analizado la prevalencia de periodontopatógenos en diversos grupos de
pacientes con diferentes métodos de detección, mostrando una gran
- 116 -
variabilidad de los resultados al utilizar distintos procedimientos. Ashimoto y
cols (1996) desarrollaron un método de detección por PCR basado en las
secuencias 16s del ARNr para determinar la prevalencia de Aa, Tf, Cr, Rc, Pg,
Pi, Pn, y Td. Los resultados en cultivo y PCR coincidían en el 28% (Tf) y en el
71% (Aa) de las muestras. En el análisis de Ashimoto y col. la mayor
discrepancia ocurrió en los casos de muestras PCR-positivo, cultivo-negativo.
Esto se debió al menor límite de detección de la PCR, entre 25 y 100 células,
en comparación con el cultivo (104-105 UFC/ml). De igual forma Riggio y cols
(1996) estudiaron la detección de Aa y Pg en muestras de placa subgingival de
pacientes periodontales mediante PCR y cultivo en un total de 170 muestras de
placa de 43 pacientes. Aa y Pg fueron detectados, cada uno de ellos en 40
(24%) de las muestras mediante PCR, mientras que por cultivo se detectó Aa y
Pg en 25 (15%) y 18 (11%) de las muestras, respectivamente.
Las técnicas de cultivo presentan sin embargo algunas limitaciones: las
bacterias deben mantenerse vivas durante el transporte. Los
periodontopatógenos suelen ser anaerobios, y pueden causar problemas en la
toma y las condiciones de transporte al laboratorio (O2, temperatura, medio
nutritivo); el cultivo requiere tiempo, conocimientos microbiológicos y un
equipamiento adecuado de laboratorio, con los costes correspondientes.
Además las bacterias anaerobias orales crecen muy lentamente, y, en
ocasiones, hay que esperar unas tres semanas para obtener un resultado
definitivo. Por otra parte algunas especies bacterianas son difíciles de cultivar
(Sakamoto y cols 2002).
Conociendo las limitaciones de las técnicas de cultivo para la obtención de
colonias de bacterias orales, se llevó a cabo un procesado de las muestras
muy riguroso. Las muestras se procesaron en un tiempo inferior a 1 hora desde
que fueron tomadas y el medio de transporte elegido permite la viabilidad de
anaerobios como Pg. En nuestro trabajo se empleó el método de cultivo, dado
que la obtención de cultivos bacterianos continúa siendo el método de
referencia (gold standard) en microbiología. Mediante cultivos selectivos y no
selectivos obtenemos colonias de anaerobios totales y pigmentados, así como
de capnófilos (Liébana 2002). En cuanto al recuento efectuado mediante
- 117 -
cultivo, utilizamos un recuento total de anaerobios pigmentados en vez de la
identificación individual de cada colonia, obteniendo un marcador indirecto de la
presencia de Prevotella y Porphyromonas spp.
Dado que la sensibilidad del cultivo puede ser muy baja, especialmente
en medios no selectivos, con límites de detección entre 103 - 104 bacterias por
lo que patógenos específicos que se encuentren en pequeñas cantidades
pueden no ser detectados, se utilizó una técnica de biología molecular: la PCR
cuantitativa en tiempo real. El procesado de las muestras mediante dicha
técnica permitió no sólo la detección de los dos patógenos sino también su
cuantificación, pudiendo compararse posteriormente los resultados con el
cultivo.
La PCR en tiempo real con cebadores especie-específicos es un método
preciso y sensible para una cuantificación fiable de especies bacterianas
individuales (Sanz y cols 2004). Los cebadores más empleados para la
detección de bacterias periodontales son normalmente las secuencias 16s
ARNr (Ashimoto y cols 1996). Esta estrategia obliga a la utilización posterior de
sondas para las secuencias intra-diana específicas de cada especie, lo que
dificulta desde el punto de vista técnico y económico la detección cuantitativa
de estos patógenos.
Otros investigadores han explorado diseños de diana que d eentrada ya
son específicos de cada especie, con lo cual la detección no requiere de
sondas específicas. Morillo y cols (2004) desarrollaron un método para la
cuantificación de Aa, Pg y Tf de muestras de placa subgingival basado en la
tecnología de la “PCR en tiempo real” no basada en este tipo de dianas, que
requieren del uso posterior de. Para ello se obtuvieron estas especies
bacterianas tras el cultivo de cepas de referencia, y se llevó a cabo el recuento
microscópicamente. Los cebadores para la PCR fueron seleccionados de las
secuencias de los genes LktC (Aa), Arg-gingipain (Pg) y el antígeno BspA
antigen (Tf) para la obtención de amplicones por debajo de los 100 pares de
bases. Se calcularon los valores de los umbrales de los ciclos para cada
- 118 -
especie de acuerdo al número inicial de copias. Se obtuvo una elevada
sensibilidad (101 copias para Aa y Tf y 102 para Pg) y especificidad para la
detección de las tres especies bacterianas (no se demostró reacción cruzada
con ninguna de las especies estudiadas). Además, la técnica demostró una
buena repetitividad en los valores umbrales de ciclo obtenidos para cada
número inicial de copias, mostrando coeficientes de variación por debajo del
5% para cada bacteria. Debido a los excelentes resultados obtenidos con estos
cebadores en cuanto a especificidad, se eligieron para este trabajo este tipo de
dianas.
3. PRESENCIA DE PERIODONTOPATÓGENOS EN EL ÁREA
SUBGINGIVAL Y EN LA SALIVA.
En nuestro trabajo se efectuaron los recuentos bacterianos en medios de
cultivo específicos para Aa (TSBV y Dentaid) y para anaerobios (medio
selectivo y no selectivo) a partir de muestras de localizaciones periodontales y
de saliva de los pacientes y las parejas, antes y después del tratamiento. Así
mismo se realizó la detección y cuantificación de Aa y Pg mediante PCR
cuantitativa en tiempo real en los pacientes y las parejas en muestras de
saliva y periodontales, antes y después del tratamiento.
Los recuentos bacterianos totales en los distintos medios de cultivo
empleados, según el origen de la muestra (saliva o diente) antes del
tratamiento periodontal, reflejaron valores muy superiores en las muestras de
saliva al compararlas con las obtenidas de localizaciones periodontales, siendo
estas diferencias estadísticamente muy significativas para los medios TSBV,
Dentaid, y medio no selectivo y selectivo para anaerobios totales. Esto es
debido a que los recuentos mediante cultivo son totales de la población de
Prevotella y Porphyromonas, todos los anaerobios pigmentados. En cambio,
mediante PCR estamos cuantificando de forma específica Pg. Lo mismo ocurre
con los medios TSBV y Dentaid, en lo sque no se ha llevado a cabo una
identificación individual de las colonias, sino que se ha realizado un recuento
total de capnófilos, mientras que la PCR estaba dirigida frente a Aa.
- 119 -
En cualquier caso, tanto los recuentos totales mediante cultivo como los
recuentos específicos mediante PCR reflejan una disminución por efecto del
tratamiento. Al comparar los recuentos bacterianos totales en muestras de
saliva y muestras periodontales antes y después del tratamiento, observamos
una disminución significativa de los recuentos en ambos tipos de muestras,
aunque los valores continuaron siendo superiores en las muestras de saliva 6
meses después del tratamiento. Esto refleja que el tratamiento tiene un impacto
sobre al menos toda la flora anaerobia de especies de Gram negativso
pigmentados y que estos, de forma indirecta, podrían ser indicadores de la
disminución de Pg, pero no en todos los casos, ya que no encontramos una
buena correlación entre los recuentos de anaerobios pigmentados y los
recuentos por PCR.
En el estudio microbiológico mediante PCR en tiempo real no se
apreciaron diferencias significativas al comparar los recuentos de Pg y de Aa
entre las muestras de saliva y muestras periodontales tanto las tomadas antes
del tratamiento y como las tomadas 6 meses después. Este es un hecho
remarcable, que muestra que la flora bucal forma una población homogénea
en toda la boca.
Coincidiendo con nuestros resultados, otros estudios han demostrado
que Aa y Pg pueden encontrarse en el área subgingival, en la saliva, en la
placa supragingival y en la mucosa de la cavidad oral de pacientes con
periodontitis (Van Winkelhoff y cols 1988, Socransky y cols 1999). Van
Winkelhoff y cols 1988 demostraron que Aa y Pg pueden ser cultivados a partir
de la saliva de pacientes con periodontitis. Socransky y cols (1999)
encontraron recuentos de 0,6 x 105 y 0,1 x 105 UFC/ml en la placa
supragingival de sujetos enfermos y sanos respectivamente; e igualmente de
1,4 x 105 y de 0,1 x 105 UFC/ml en la subgingival. Ambas especies se
diseminan intraoralmente a través de saliva contaminada, y colonizan la
placa supragingival antes de afectar el área subgingival (Socransky y cols
1999). La infección subgingival ocurre en sitios con y sin pérdida de
inserción periodontal.
- 120 -
El seguimiento cuantitativo por PCR pre-tratamiento, 1 mes y 6 meses
después, reveló una disminución de la media del únicamente en el recuento de
Pg en las muestras de saliva y en las muestras periodontales en los pacientes.
No se apreciaron disminuciones estadísticamente significativas en el caso de
Aa ya que el número de pacinetes positivos fue muy bajo (2).
En nuestro estudio al comparar los recuentos bacterianos obtenidos en
los diferentes medios, se encontraron valores significativamente superiores de
anaerobios pigmentados en las muestras subgingivales profundas, respecto a
las que tenían PS < 4mm. Se ha especulado que las bolsas profundas de
sujetos con la enfermedad actúan como reservorios para diseminar la
infección a zonas sanas (Riviere y cols 1996).
No hay evidencia de que las bacterias periodontales puedan ser
transmitidas a través de aerosoles, pero sí parece probable que la saliva y el
contacto mucoso directo sean vías de transmisión. Los objetos inertes
(instrumentos odontológicos, cepillos dentales) también pueden servir como
vehículo de transmisión (Christersson y cols 1985, Glass y Lare 1986).
Christersson y cols 1985 demostraron que las sondas periodontales podían
distribuir patógenos desde localizaciones enfermas a sanas en pacientes con
PJL. Glass y Lare 1986.
4. COMPARACIÓN DE HALLAZGOS CLÍNICOS Y MICROBIOLÓGICOS EN
ENFERMOS PERIODONTALES Y SUS CÓNYUGES.
Al comparar los recuentos bacterianos en los diferentes medios de
cultivo empleados en los pacientes y las parejas antes del tratamiento
periodontal, se observaron recuentos bacterianos totales superiores en los
pacientes al compararlos con las parejas, siendo estas diferencias significativas
en el recuento de anaerobios pigmentados. Esto puede ser debido a que la
mayoría de las parejas estaban sanas (el 62,5% no padecían peridontitis
- 121 -
crónica). El seguimiento evolutivo de los recuentos de anaerobios totales y
pigmentados a lo largo del tiempo (antes del tratamiento y 6 meses después)
demostró un descenso significativo de los recuentos, tanto en los pacientes
como en las parejas, transcurridos 6 meses del tratamiento periodontal.
Al agrupar los pacientes y las parejas según su estado periodontal en la
evaluación inicial (enfermos y sanos), se pudo comprobar que los individuos
enfermos mostraban valores superiores de recuentos bacterianos en todos los
medios de cultivo empleados, siendo estas diferencias estadísticamente
significativas para los anaerobios totales y pigmentados. Transcurridos 6
meses del tratamiento periodontal se observa que se equiparan los
valores de los recuentos bacterianos de los sujetos enfermos a los
valores de los individuos sanos.
Cabe resaltar que en el seguimiento evolutivo de las parejas sanas,
entre la evaluación inicial y 6 meses tras el tratamiento del enfermo, se
demostró que había diferencias muy significativas en los recuentos
bacterianos, y casi significativas en el recuento de anaerobios totales, que se
reducía por el tratamiento en los enfermos.
Por otro lado, el estudio microbiológico mediante PCR cuantitativa en los
pacientes y las parejas en el examen inicial mostró recuentos de Pg y Aa
superiores en los pacientes. Al agrupar a estos y a las parejas en sujetos
sanos y enfermos la media del recuento por PCR de Pg fue muy superior en
sujetos enfermos (diferencia muy significativa), sin embargo el recuento de Aa
fue similar en ambos grupos. En la evaluación a los 6 meses del tratamiento se
observó que la media de recuento por Pg fue inferior en los pacientes al
compararla con la de las parejas. También en esta ocasión, el recuento de Aa
fue similar en ambos grupos. Al comparar los sujetos sanos y los enfermos 6
meses después del tratamiento se pudo comprobar que los valores de los
recuentos por PCR de Pg y de Aa eran similares en sanos y enfermos.
Estos hallazgos microbiológicos concuerdan con la respuesta clínica al
tratamiento de los pacientes periodontales, en los que se pudo apreciar una
- 122 -
disminución progresiva del pocentaje de localizaciones con profundidad de
sondaje de 4-5 mm y ≥ 6mm, un descenso de las localizaciones con pérdida de
inserción clínica moderada y avanzada, así como de los índices de sangrado al
sondaje y placa bacteriana.
Numerosos trabajos indican que Aa y Pg pueden ser encontradas en
sujetos sin destrucción periodontal manifiesta (Petit y cols 1993a,b, Van
Steenbergen 1993, Van Winkelhoff 2002). Estas especies probablemente
pueden persistir en equilibrio con el huésped y la microflora residente durante
años, sin embargo, no está claro qué factores microbiológicos o del huésped
determinan el inicio de la destrucción periodontal a partir de la infección por
estos patógenos.
El hecho de que se sigan detectando recuentos de Pg tanto en las parejas
como en los pacientes tras el tratamiento también puede deberse al tipo de
clones que están colonizando a estos individuos y a la variable patogenicidad
de cada uno de los clones. Desde 2006, se dispone de un sistema de
clasificación de clones mediante Multi Locus Type Sequence (MLST) para Pg.
Este esquema, vigente hoy en día, fue definido por el grupo de Enersen y col.
en la Universidad de Oslo (Enersen y cols 2006). El esquema propuesto por
Enersen reducía el número de genes conservados a analizar de 10 que
proponía Koehler y cols (Koehler y cols 2003) a 8 debido a que dos de los
genes que se incluyen en el esquema de Koehler creaban problemas de
amplificación (EFE-Tu y dnaK). Finalmente el esquema que ha prevalecido es
el siguiente: ftsQ, hagB, gdpxJ, pepO, mcmA, recA, and pga. Al estudiar 40
aislados de diferente origen y obtenidos tanto de seres humanos como de
animales, se constató que las especies de animales correspondían a otra
especie (P. gulae) y que Pg coloniza exclusivamente al hombre.
Utilizando el método MLST para estudiar la distribución de la población de
Pg, se observó que la población bacteriana de esta especie en parte tiene una
estructura panmítica, con alto nivel de recombinación, y en parte clonal
(Enersen y cols 2006, Enersen 2011). Los tres tipos de poblaciones se
muestran en la figura 1. Por el momento hay descritos hasta 183
- 123 -
secuenciotipos (STs) en la base de Pg. Los dendogramas realizados con estos
STs muestran agrupamientos o clusters entre aislados detectados en áreas
geográficas muy distantes y en diferentes periodos temporales, demostrando
con esto la existencia de una parte de la población con un comportamiento
clonal. Cuando se han analizado factores de patogenicidad como la fimbria
mayor o FimA, responsable de la adhesión y activación de la endocitosis en el
interior de las células endoteliales humanas, se ha distinguido 6 secuencias
distintas (I-VI) (Fujiwara y cols 1993). En los casos con peridontitis crónica, los
aislados más frecuentes son aquellos con fimA del tipo II, IV y Ib. En cambio,
en los pacientes sanos periodontalmente predominan los del tipo I, III y V
(Amano 2003). Algunos clones se encuentran más asociados a enfermedad,
determinados por la secuencia de fimA y por la agrupación de secuenciotipos.
Esto demuestra la existencia de clones virulentos que no se encuentran en
pacientes sanos.
Dentro del mismo individuo se han encontrado varios clones, aunque no
suele ser un fenómeno muy frecuente y parece está circusncrito a pacientes
con periodontitis crónica. En un estudio llevado a cabo en 15 pacientes con
periodontitis crónica, se detectaron entre 1 y 8 secuenciotipos diferentes por
bolsa (Enersen y cols 2008). Esto puede ser debido al intercambio genético
dentro de la misma bolsa a lo largo del tiempo, considerandose más una
“deriva genética” que una colonización múltiple. Esta deriva iría conducida tanto
por el estrés de supervivencia en las bolsas como por el estrés producido por el
sistema inmunitario del huésped.
- 124 -
Figura 1. Modificada de Enersen M. (47).
A=clonal; B=panmítica; C=panmítica con diseminación clonal
Hay estudios que sugieren que la cohabitación con una persona con
periodontitis puede influenciar el estado periodontal de la pareja (Petit y cols
1994, Von Troil-Linden y cols 1995). Aunque no se pueden descartar factores
causales ambientales comunes, los resultados de varios estudios sugieren que
la transmisión de microorganismos virulentos es un factor importante (Tuite-
McDonnell y cols 1997; Asano y cols 2003) sin embargo, son necesarios más
estudios para probar esta hipótesis.
Petit y cols (1994) investigaron la prevalencia de microorganismos
periodontopatógenos y la destrucción periodontal en las parejas y los hijos de
pacientes adultos con periodontitis, en un grupo de 24 familias, con 49 niños.
Por debajo de los 5 años, ninguno de los niños tenía CAL, mientras que entre
los 5-15 años, el 26,5% mostraban 1-5 sitios con 1-3 mm de CAL. Un total de
16 parejas presentaban una forma leve a moderada de periodontitis, con al
menos un sitio con 1 a 4 mm de CAL, y 5 parejas evidenciaban destrucción
periodontal severa con sitios que poseían al menos 8 mm de CAL. En 18 de 24
pacientes los resultados confirmaron Pg. Este microorganismo se encontró en
un niño de 5 años, y en 11 de las parejas. Por otra parte, Aa se detectó en 13
pacientes, 5 niños y 5 de las parejas. Si un niño albergaba uno de los
- 125 -
periodontopatógenos, al menos uno de los padres era también positivo para
esa bacteria.
Von Troil-Linden y cols (1995), llevaron a cabo un examen clínico,
radiológico y microbiológico de las condiciones periodontales en dos grupos de
parejas casadas para valorar similitudes entre marido y mujer. Los sujetos
enfermos (n=10) tenían una periodontitis avanzada, y los sanos (n=10)
presentaban un estado periodontal normal. Las muestras fueron cultivadas
para Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis,
Prevotella intermedia, Campylobacter rectus and Peptostreptococcus micros.
La media de frecuencia de detección de bolsas moderadamente profundas (4-5
mm) y profundas (≥6 mm) fue significativamente mayor en las parejas de los
sujetos enfermos que en las parejas de los sanos. Se hallaron bolsas
profundas en seis parejas de los individuos enfermos, y sólo en dos parejas de
los sujetos sanos. Los enfermos y sus cónyuges poseían Aa, Pg, P. intermedia,
C. rectus and P. micros en 4, 6, 9, 9 y 4 parejas respectivamente. Los sanos y
sus parejas tenían estos patógenos en 0, 1, 9, 5 y 3 parejas, respectivamente.
Pg se encontró en 7 parejas de los individuos enfermos, y sólo en 2 de los
sujetos sanos.
Tuite-McDonnell y cols (1997) en un estudio sobre transmisión de Pg en
104 familias, empleando una técnica de detección por PCR, demostraron que
el contacto con un miembro familiar infectado incrementa sustancialmente el
riesgo relativo de colonización de los cónyuges (4), de los niños y sus padres
(3), los niños y sus madres (4.7), adultos y sus madres (2.4), y hermanos (2.4).
Los cónyuges de individuos infectados tenían casi cuatro veces más
probabilidad de ser colonizados que los cónyuges de sujetos no colonizados.
Esto sugiere la posibilidad de transmisión entre parejas. Sin embargo, no
observaron ninguna relación entre la transmisión y el tiempo de casados, lo que
indica que la transmisión probablemente ocurre en los primeros años de
matrimonio.
Asano y cols (2003) demostraron que el gen que codifica las fimbrias de las
cepas de Pg pertenece al tipo II, más eficaz en la unión a células epiteliales, en
- 126 -
5 de seis parejas cuyos patrones de PFGE eran idénticos. Esto sugiere que
sólo aquellos clones con determinados factores de virulencia tienen capacidad
de colonización y y transmisión entre individuos con una relación estrecha.
Aunque se ha demostrado la transmisión intrafamiliar (Petit y cols
1994, Von Troil-Linden y cols 1995; Asikainen y cols 1996), parece probable
que también se produzca entre individuos no relacionados, hasta por un
contacto casual. Asikainen y cols (1996) estudiaron la frecuencia de
transmisión entre parejas casadas, y de padres a hijos de Aa (47 familias) y Pg
(31 familias) comparando mediante AP-PCR. La transmisión entre las parejas
de Aa se produjo en el 36% de las mismas y de Pg en el 20%. La transmisión
de padres a hijos de Aa tuvo lugar en el 32% de las familias. Pg no se
transmitió de padres a hijos en ninguna de las familias estudiadas.
Por otra parte, cabe destacar que ya a principios de 1900 algunos
autores sugirieron que los brotes severos de GUNA después de la primera
guerra mundial se debieron a la transmisión de bacterias virulentas, lo que
respalda la idea de que los patógenos periodontales pueden transmitirse con
facilidad de una persona a otra, especialmente cuando se trata de clones muy
virulentos de Aa y Pg. Así, parece probable que nuevas especies o diferentes
cepas de la misma especie pueden ser adquiridas con relativa frecuencia por
un individuo en diferentes etapas de su vida. La posibilidad de que halla una
recidiva o una nueva infección podría repercutir en el enfoque terapéutico
(Von Troil-Lindén y cols 1996).
Existen varios aspectos en el desarrollo de este trabajo que deberían ser
el inicio de estudios posteriores. El número de parejas captadas, con las
características de cohabitación que requeríamos para este estudio, es limitado.
Por este motivo, teniendo en cuenta que la prevalencia de infección por Aa es
muy baja en nuestro país en individuos de esta edad, no hemos podido analizar
el efecto de transmisión ni del tratamiento sobre pacientes con Aa. Sería
necesario aumentar el número de parejas estudiadas o seleccionarlas
previamente en función de la detección previa de Aa. Por otra parte, existen
pocos trabajos que analicen de forma cuantitativa el efecto del tratamiento
- 127 -
periodontal entre parejas y que además comparen mediante tipado molecular la
existencia de la misma cepa en ambos miembros de la pareja. Otra línea que
debería ser explorada es el impacto de la presencia de clones clasificados
como virulentos y la evolución que presentan a lo largo del tratamiento y la
repercusión que tiene sobre la pareja. Todos estos aspectos permitirían
mejorar el diseño de los tratamientos periodontales.
De los datos obtenidos en esta Tesis se desprende que, dado que la
terapéutica periodontal reduce las cifras de periodontopatógenos en los sujetos
enfermos, y que en las parejas sanas estas cifras también se reducen de
manera correlativa, en la práctica clínica el tratamiento de los pacientes
ayudaría a prevenir el desarrollo de periodontitis en los cónyuges sanos.
Asi mismo, al tratar a un paciente con periodontitis crónica será necesaria
la revisión odontológica del cónyuge, y su tratamiento cuando proceda.
- 128 -
VIII. CONCLUSIONES
1. Los resultados obtenidos en saliva demuestran que este tipo de muestra,
mucho menos invasiva y fácil de obtener, es válida para la monitorización
mediante técnicas moleculares.
2. Existe una buena correlación del recuento de anaerobios pigmentados y
del recuento específico de Pg con la mejoría obtenida durante el
tratamiento.
3. Podemos determinar un nivel de recuento de periodontopatógenos, tanto
por cultivo como por PCR, indicador de enfermedad o de salud periodontal.
Esto puede servir como herramienta adicional para la monitorización del
tratamiento.
4. Los recuentos de Pg en saliva indican la colonización homogénea general
de la boca y la posibilidad de transmisión a través del contacto con saliva.
5. La terapéutica periodontal reduce las cifras de periodontopatógenos en los
sujetos enfermos con mejoría de los parámetros clínicos, y globalmente se
reducen las tasas bacterianas en sus parejas, tanto por PCR cuantitativa
como en los cultivos microbiológicos.
- 129 -
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