UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL - UGrepositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/24223/1/Tesis blaZ Carlos...
Transcript of UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL - UGrepositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/24223/1/Tesis blaZ Carlos...
I
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUILUNIDAD DE POSGRADO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR
TESIS PRESENTADA PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICODE MAGÍSTER EN BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR
IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUSRESISTENTE A Β-LACTÁMICOS EN QUIRÓFANOS YSALAS DE CUIDADOS INTENSIVOS DEL HOSPITAL
UNIVERSITARIO CATÓLICO DE CUENCA, MEDIANTEPCR
AUTOR: Q.F. CARLOS FERNANDO ANDRADE TACURI
TUTORA: DRA. PAOLA PATRICIA ORELLANA BRAVO MSc.
GUAYAQUIL – ECUADOROCTUBRE-2016
II
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍAFICHA DE REGISTRO DE TESIS
TÍTULO Y SUBTÍTULO:IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A Β-LACTÁMICOS EN QUIRÓFANOS
Y SALAS DE CUIDADOS INTENSIVOS DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO CATÓLICO DE CUENCA,MEDIANTE PCR
AUTOR:Q.F. Carlos Fernando Andrade Tacuri
TUTOR:Dra. Paola Patricia Orellana Bravo Ms. C.
REVISORES:Ing. Sisiana Chávez Chica, Mg.
INSTITUCIÓN:UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD:Unidad de Posgrado, Investigación y Desarrollo
CARRERA:MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR
FECHA DE PUBLICACIÓN: No. DE PÁGS:
TÍTULO OBTENIDO:QUÍMICO FARMACEUTA
ÁREAS TEMÁTICAS:Ciencias de la vida, Microbiología, Genética y ciencias afines
PALABRAS CLAVE: Staphylococcus aureus, nuc, blaZ, mecA, SARM, PCR.RESUMEN: Introducción: El rápido avance de la resistencia a los antibióticos y su diseminación,hacen de Staphylococcus aureus un microorganismo sumamente peligroso para el ser humano.Objetivo: Identificar S. aureus portadores de los genes blaZ y mecA, en los quirófanos y salasde cuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca mediante PCR paraprevenir las infecciones intrahospitalarias. Materiales y métodos: Se replica los procedimientosya publicados para identificación de los genes blaZ, mecA y nuc, con las cepas ATCC de S.aureus 11632 y 43300, y se prueban varios protocolos de PCR hasta encontrar uno queamplifique todos los genes para validar los procedimientos. Se toman 50 muestras enquirófanos y sala de cuidados intensivos del Hospital Docente Universitario Católico a las quese realizan PCR y pruebas bioquímicas. Resultados: Del total de cincuenta muestras, tresresultaron positivas para S. aureus, dos de las cuales fueron resistentes a los β-Lactámicos,según se pudo verificar mediante amplificación de los genes nuc, blaZ y mecA, además delantibiograma. Conclusiones: la PCR es un método sensible y efectivo para identificaciónpreventiva de S. aureus en superficies.No. DE REGISTRO (en base de datos): No. DE CLASIFICACIÓN:
DIRECCIÓN URL (tesis en la web):ADJUNTO PDF: SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES Teléfono:0992910299
E-mail:[email protected]
CONTACTO EN LA INSTITUCIÓN: Nombre:Unidad de Posgrado Investigación y Desarrollo
Teléfono: 2325530-38 Ext. 114E-mail: [email protected]
X
III
IV
V
VI
DEDICATORIA
La presente tesis dedico a mis hijos Jan Carlos y Carlos Eduardo, que son
mi razón de vivir, el impulso y la fuerza para salir adelante en los desafíos
y dificultades diarias.
VII
AGRADECIMIENTO
Quiero agradecer en primer lugar a Dios por todas las bendiciones
recibidas, a mis padres por su enorme apoyo, a mi esposa por su
confianza; y a la directora de tesis Dra. Paola Orellana Bravo por su
colaboración invaluable.
VIII
ÌNDICE
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA.................................................... IICERTIFICADO DEL TUTOR............................................................................................... IIICERTIFICADO DE REDACCIÓN Y ESTILO.......................................................................... IVDECLARACIÓN JURADA DEL AUTOR................................................................................ VDEDICATORIA ................................................................................................................. VIAGRADECIMIENTO ........................................................................................................ VIIÍNDICE .......................................................................................................................... VIII
CAPITULO I
1. Agente Etiológico...................................................................................................... 1
CAPÍTULO II
2. Factores de Virulencia .............................................................................................. 42.1 Proteina A ........................................................................................................ 42.2 Péptidoglucano ................................................................................................ 52.3 Ácido Teicoico .................................................................................................. 52.4 Cápsula............................................................................................................. 62.5 Proteinas de Adherencia.................................................................................. 62.6 Toxinas ............................................................................................................ 7
2.6.1 Toxinas citolíticas.................................................................................... 72.6.2 Toxinas exfoliativas................................................................................ 82.6.3 Enterotoxinas.......................................................................................... 82.6.4 TSST-1 ....................................................................................................... 8
2.7 Enzimas ............................................................................................................ 92.7.1 Coagulasa.................................................................................................. 92.7.2 Catalasa .................................................................................................. 102.7.3 Otras enzimas ......................................................................................... 10
2.8 Quorum-sensing............................................................................................. 10
CAPÍTULO III
3. Resistencia a los antibióticos.................................................................................. 123.1 Mecanismos de resistencia antimicrobiana ................................................... 123.2 Genes involucrados en la resistencia de S. aureus a los β-Lactámicos........... 143.2.1 gen blaZ ....................................................................................................... 153.2.2 Gen mecA .................................................................................................... 16
IX
CAPÍTULO IV
4. Patogénesis............................................................................................................. 214.1 Inicio del proceso infeccioso y desarrollo de signos y síntomas .................... 214.2 Principales patologías causadas por S. aureus ................................................ 22
4.2.1 Infecciones mediadas por las toxinas ..................................................... 224.2.2 Infecciones supurativas (presencia de bacterias) .................................... 24
4.3. Infecciones Intrahospitalarias ........................................................................ 294.4. Factores predisponentes del huésped ........................................................... 31
CAPÍTULO V
5. Diagnóstico de Laboratorio .................................................................................... 325.1 Frotis y tinción .................................................................................................. 325.2 Cultivo............................................................................................................... 34
5.2.1 Agar Baird-Parker...................................................................................... 355.2.2 Agar Manitol Salado.................................................................................. 385.2.3 Agar Estafilococos N° 110 ........................................................................ 405.2.4 Agar Azul de O-Toluidina-DNA o Agar DNAsa........................................... 42
5.3 Pruebas químicas ............................................................................................. 445.3.1 Prueba de la Catalasa................................................................................ 445.3.2 Prueba de la coagulasa ............................................................................. 45
5.4 Sensibilidad a los antimicrobianos ................................................................... 475.5 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) .................................................... 49
CAPÍTULO VI
6. Tratamiento: recomendaciones generales ............................................................ 526.1 Infecciones de Piel y partes blandas .................................................................. 536.2 Osteomielitis aguda, Artritis e infecciones de protésis osteoarticular .............. 556.3 Bacteriemia primaria o asociada a infección del catéter vascular..................... 566.4 Endocarditis ....................................................................................................... 576.5 Neumonía........................................................................................................... 586.6 Infección del sistema nervioso central .............................................................. 59
CAPÍTULO VII
7. Diseño Metodológico ............................................................................................. 607.1 Tipo de Investigación........................................................................................ 607.2 Criterios de inclusión ........................................................................................ 607.3 Criterios de exclusión ....................................................................................... 617.4 Equipos ............................................................................................................. 617.5 Materiales y Reactivos...................................................................................... 61
X
7.6 Criterios de validez y confiabilidad del procedimiento .................................... 627.6.1 Trabajo con cepa ATCC 11632 .................................................................. 637.6.2 Trabajo con cepa ATCC 43300 .................................................................. 657.6.3 Trabajo simultaneo con las dos cepas ATCC............................................. 677.6.4 Otras pruebas............................................................................................ 67
7.7 Análisis del manipulador .................................................................................. 707.8 Procedimiento técnico de campo..................................................................... 71
7.8.1 Toma de muestras .................................................................................... 727.8.2 Extracción de ADN .................................................................................... 757.8.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................. 767.8.4 Electroforesis horizontal ........................................................................... 767.8.5 Flujograma de toma de muestras y extracción de ADN ........................... 777.8.6 Flujograma de PCR .................................................................................... 78
CAPÍTULO VIII
8. RESULTADOS Y CONCLUSIONES ............................................................................. 798.1 Resultados del Diseño Metodológico............................................................... 798.2 Resultados de la centrifugación ....................................................................... 818.3 Resultados de siembra en agar Manitol Salado ............................................... 828.4 Resultados de antibiograma y pruebas bioquímicas........................................ 838.5 Resultados de la electroforesis horizontal ....................................................... 848.6 Conclusiones..................................................................................................... 88
BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................... 90ANEXOS ............................................................................................................................. 94
ÍNDICE FIGURAS.............................................................................................................. XFig. 1: Factores de virulencia de Staphylococcus aureus. ...................................... 4Fig. 2: síntesis de β-lactamasa estafilocócica....................................................... 16Fig. 3: Esquema de Cassette SCCmec tipo III ....................................................... 18Fig. 4: Diagrama esquemático de resistencia a la meticilina de S. aureus........... 18Fig. 5: Síndrome de Piel Escaldada....................................................................... 23Fig. 6: Síndrome de Shock Tóxico......................................................................... 24Fig. 7: Impetigo bulloso y no bulloso ................................................................... 25Fig. 8: Foliculitis y Forunculosis ........................................................................... 26Fig. 9: Conjuntivitis............................................................................................... 27Fig. 10: Celulitis infecciosa ................................................................................... 28Fig. 11: Diferencias estructurales entre bacterias Gram positivas y negativas ... 32Fig. 12: Cocos gram positivos y Gram negativos.................................................. 33Fig. 13: S. aureus en agar manitol salado............................................................. 40Fig. 14: S. aureus en Agar DNAsa ......................................................................... 44Fig. 15: Protocolo de PCR para amplificar el gen blaZ ......................................... 65
XI
Fig. 16: Protocolo de PCR para amplificar el gen mecA....................................... 66Fig. 17: DNAsa con cepas ATCC ........................................................................... 68Fig. 18: Antibiograma cepa ATTC 11632 .............................................................. 68Fig. 19: Antibiograma cepa ATTC 43300 .............................................................. 68Fig. 20: Siembra en manitol cepas ATCC 11632 y 43300 ..................................... 69Fig. 21: Prueba de la catalasa cepas ATCC 11632 y 43300 .................................. 69Fig. 22: Prueba de la coagulasa cepas ATCC 11632 y 43300................................ 69Fig. 23: Manipulador: siembra en manitol .......................................................... 70Fig. 24: Antibiograma del manipulador ............................................................... 70Fig. 25: Pruebas de la coagulasa y catalasa del manipulador .............................. 71Fig. 26: Staphylococcus aureus cepa ATCC 11632 en agar sangre....................... 79Fig. 27: Resultado de electroforesis con el amplicón del gen blaZ ...................... 79Fig. 28: Staphylococcus aureus cepa ATCC 43300 en agar sangre....................... 80Fig. 29: Resultado de electroforesis con el amplicón del gen mecA.................... 80Fig. 30: Electroforesis con el amplicones de los genes blaZ y mecA.................... 80Fig. 31: Electroforesis de controles positivos y negativos con cepas ATCC ......... 81Fig. 32: Tubos Eppendorf con pellet resultado de centrifugación de muestras .. 81Fig. 33: Resultados de siembra en agar Manitol Salado (24H00) ........................ 82Fig. 34: Resultados de siembra en agar Manitol Salado (48H00) ........................ 83Fig. 35: Antibiograma de muestras 2, 31 y 39 (positivas para S. aureus) ............ 83Fig. 36: Superficies que dieron positivo para S. aureus. ...................................... 84Fig. 37: Electroforesis de identificacion del gen nuc en muestras....................... 85Fig. 38 Electroforesis de amplicones de gen blaZ y mecA en muestras .............. 85
ÍNDICE CUADROS........................................................................................................... XICuadro 1: Factores de virulencia de Staphylococcus aureus ............................... 11Cuadro 2: Principales antibióticos a los que S. aureus es resistente ................... 13Cuadro 3: Mecanismos de resistencia identificados en S. aureus ....................... 20Cuadro 4: Infecciones nosocomiales en tres hospitales ...................................... 30Cuadro 5: Distribución de las infecciones intrahospitalarias por S. aureus......... 31Cuadro 6: Volúmenes de trabajo para la amplificación inicial del gen blaZ ........ 64Cuadro 7: Volúmenes utilizados para la amplificación inicial del gen mecA....... 66Cuadro 8: Comparación de resultados entre PCR y microbiología...................... 87
ÍNDICE GRÁFICOS .......................................................................................................... XIGráfico 1: Muestras positivas y negativas para S. aureus ................................... 86Gráfico 2: Identificación de genes blaZ y mecA................................................... 88
RESUMEN..................................................................................................................... XIIIABSTRACT..................................................................................................................... XIVINTRODUCCIÓN............................................................................................................. XVHIPÓTESIS..................................................................................................................... XVIOBJETIVOS................................................................................................................... XVII
XII
Objetivo general.................................................................................................. XVIObjetivos específicos .......................................................................................... XVI
METODOLOGÍA ........................................................................................................... XVII
XIII
RESUMEN
Introducción: El rápido avance de la resistencia a los antibióticos y sudiseminación, hacen de Staphylococcus aureus un microorganismosumamente peligroso para el ser humano. Objetivo: Identificar S. aureusportadores de los genes blaZ y mecA, en los quirófanos y salas decuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuencamediante PCR para prevenir las infecciones intrahospitalarias. Materialesy métodos: Se replica los procedimientos ya publicados paraidentificación de los genes blaZ, mecA y nuc, con las cepas ATCC de S.aureus 11632 y 43300, y se prueban varios protocolos de PCR hastaencontrar uno que amplifique todos los genes para validar losprocedimientos. Se toman 50 muestras en quirófanos y sala de cuidadosintensivos del Hospital Docente Universitario Católico a las que serealizan PCR y pruebas bioquímicas. Resultados: Del total de cincuentamuestras, tres resultaron positivas para S. aureus, dos de las cualesfueron resistentes a los β-Lactámicos, según se pudo verificar medianteamplificación de los genes nuc, blaZ y mecA, además del antibiograma.Conclusiones: la PCR es un método sensible y efectivo paraidentificación preventiva de S. aureus en superficies.
PALABRAS CLAVE: Staphylococcus aureus, nuc, blaZ, mecA, SARM,PCR.
XIV
ABSTRACT
Introduction: The quick advance of antibiotic resistance anddissemination, make of Staphylococcus aureus an extremely dangerousmicroorganism for humans. Objective: Identify S. aureus for blaZ andmecA carrier, in operating rooms and intensive care wards of the CatholicUniversity Hospital from Cuenca by PCR to prevent nosocomial infections.Materials and methods: already published procedures was replicated foridentify Blaz, mecA and nuc genes, with S. aureus ATCC strains 11632and 43300 was replicated, and several PCR protocols are tested to findone that amplify all genes to validate the procedures. 50 samples fromoperating rooms and intensive care unit of the Catholic UniversityTeaching Hospital were taken, to which biochemical tests and PCR areperformed. Results: Of the total of fifty samples, three were positive for S.aureus, two of which were resistant to β-lactams, as was verified byamplification of nuc, blaZ and mecA genes, furthermore antimicrobialsusceptibility. Conclusions: PCR is a sensitive and effective method forpreventive identification of S. aureus on surfaces.
KEYWORDS: Staphylococcus aureus, nuc, blaz, mecA, SARM, PCR.
XV
INTRODUCCIÓN
Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo,productor de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulado. Las cepasmás comunes de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilinapues tienen la capacidad de generar una penicilinasa que rompe en anillobetalactámico y las inactiva.
S. aureus es uno de los patógenos más prevalentes y clínicamentesignificativo en todo el mundo, causando una variedad de enfermedadesque van desde erupciones cutáneas superficiales benignas a lasinfecciones que amenazan la vida como bacteriemia, endocarditis,neumonía y síndrome de shock tóxico. (Jimei Du, 2011).
Desde que S. aureus resistente a la Meticilina (MRSA) fue identificado porprimera vez en 1961, se ha convertido en la causa más común deinfecciones intrahospitalarias y comunitarias en todo el mundo(Deresinski, 2005).
Según el estudio realizado en España (Francisco Álvarez Lerma, 2006)Staphylococcus aureus es uno de los principales microorganismoscausantes de infecciones adquiridas en los servicios o unidades decuidados intensivos (UCI), ya que forma parte de la flora endógenaprimaria de los pacientes hospitalizados y es causante de infeccionesintrahospitalarias precoces. Su protagonismo se ha visto incrementado enlas últimas décadas con el desarrollo de cepas resistentes a la Meticilina(SARM), que forman parte del ecosistema de muchos hospitales, dondepermanece en pacientes crónicos formando parte de su flora endógenasecundaria. Recientemente se ha podido comprobar un incremento de lacolonización o infecciones por SARM en pacientes procedentes deinstituciones cerradas, como asilos, geriátricos o centros de cuidadospaliativos.
Según la OMS (Salud, 2003) las bacterias Gram positivas: comoStaphylococcus aureus causan una gran variedad de infeccionespulmonares, óseas, cardíacas y sanguíneas y a menudo son resistentes alos antibióticos, principalmente las penicilinas.
El desarrollo de un método económico y específico para la detección deéste patógeno en sus diferentes áreas de atención, es de gran ayuda parael Hospital Universitario Católico en su lucha contra las infeccionesintrahospitalarias, especialmente por Staphylococcus aureus productor deβ-Lactamasas.
XVI
HIPÓTESIS
Mediante PCR podemos detectar en Staphylococcus aureus el gen blaZ ymecA que codifican para betalactamasas y PBP2a (Penicillin BindingProtein 2a) respectivamente, y crear un sistema molecular de controlpredictivo que podría ser usado en quirófanos y salas de cuidadosintensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca.
XVII
OBJETIVOS
Objetivo General
Identificar Staphylococcus aureus portadores de los genes blaZ y mecA,en los quirófanos y salas de cuidados intensivos del Hospital UniversitarioCatólico de Cuenca mediante PCR para evitar las infeccionesintrahospitalarias.
Objetivos Específicos
1.- Implementar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa para ladetección de los genes blaZ y mecA en S. aureus productores de βLactamasas y PBP2a.
2.- Identificar Staphylococcus aureus productores de β-Lactamasas yPBP2a en los quirófanos y salas de cuidados intensivos del HospitalUniversitario Católico de Cuenca mediante PCR.
3.- Establecer el área más afectada por la presencia de Staphylococcusaureus productores de β-Lactamasas y PBP2a en quirófanos y sala decuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca.
XVIII
METODOLOGÍA
La investigación que se desarrolló fue de tipo analítico descriptivo yexperimental de laboratorio.
XIX
MARCO TEÓRICO
Staphylococcus aureus resistentes a β-lactámicos.
- 1 -
CAPÍTULO I
AGENTE ETIOLÓGICO
Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, anaerobios
facultativos, su diámetro oscila entre 0.5 a 1.5 µm. Son bacterias
inmóviles, no esporulados, sin cápsula (aunque algunas cepas pueden
desarrollar una delicada cápsula de limo), se los encuentra dispuestos
como: células únicas, en pares, tétradas o formando racimos irregulares y
a diferencia de los otros integrantes del género son Coagulasa positivos.
(Geo. F. Brooks, 2011) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).
S. aureus es un patógeno oportunista, que se lo puede encontrar
frecuentemente colonizando la piel y mucosas del ser humano en forma
asintomática, formando parte de su microflora normal. Cuando se torna
patógeno suele producir infecciones importantes mediante su capacidad
para generar hemólisis, coagular el plasma, y producir diversas toxinas y
enzimas que son parte de su arsenal toxigénico. Actualmente esta
bacteria es una de las principales causas de infecciones en la comunidad
y adquiridas a nivel hospitalario en donde es un residente habitual. En
pacientes hospitalizados puede ocasionar muchas afecciones como
meningitis, bacteriemias y neumonías entre otras, pues el sistema
inmunológico de éstos generalmente está deprimido. Los factores
considerados más importantes para la diseminación de S. aureus en los
centros hospitalarios tienen que ver con la adaptabilidad bacteriana a
diferentes ambientes, la aglomeración de pacientes en espacios físicos
reducidos, el hecho de no cumplir con las normas básicas de asepsia,
- 2 -
pero principalmente con el hecho de no identificar tempranamente a los
portadores del patógeno y proceder a su aislamiento y tratamiento
inmediato. S. aureus posee una gran facilidad para generar resistencia
bacteriana como un efecto directo de su adaptabilidad y del
incumplimiento de tratamiento, ya sea en relación a las dosis o los
tiempos establecidos para cada antibiótico. (Estrella Cervantes-García R.
G.-G.-S., 2014) (Sandra Rincon, 2012) (IOWA STATE UNIVERSITY,
2011) (Castañón-Sánchez, 2012) (Geo. F. Brooks, 2011) (Francisco
Álvarez Lerma, 2006).
La resistencia generada por S. aureus a las penicilinas como penicilina G,
ampicilina, carboxipenicilinas y otras afines; está mediada por la
presencia del gen blaZ que codifica para una enzima llamada β-
lactamasa, la cual destruye el anillo β-lactámico de estos antibióticos
mediante hidrólisis, dejándolos sin actividad antibacteriana. Se conocen
cuatro variantes de estas β-lactamasas, para las variantes de A, C y D el
gen blaZ se localiza típicamente en los plásmidos mientras que para el
tipo B usualmente se encuentra incorporado en el cromosoma bacteriano
como parte de una sección transponible (transposón 552 o Tn552). Un
segundo gen que codifica resistencia para β-Lactámicos es el gen mecA
que se localiza en una zona móvil llamada cassett cromosómico mec o
SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec), este gen codifica
para la proteína PBP2a que tiene una afinidad disminuida por los
antibióticos como: meticilina, nafcilina, y oxacilina, por lo que a las cepas
que presentan esta característica se les conoce como MRSA (Methicillin-
resistant Staphylococcus aureus) (DEBORAH J. ZYGMUNT, 1992) (John
Elmerdahl Olsen, 2006) (Patrick R. Murray, 2014).
Se conocen siete variantes de SCCmec (I a VII) de los cuales I, IV, V y VII
generan resistencia solo para los β-lactámicos, mientras que las otras
variedades, traen incluidos además otros elementos genéticos que
- 3 -
codifican proteínas de resistencia para antibióticos como aminoglucósidos
y tetraciclinas. (Estrella Cervantes-García, 2014).
En condiciones ambientales regulares esta bacteria puede sobrevivir por
mucho tiempo. “En el medio ambiente puede encontrarse S. aureus
durante un máximo de 42 días en carcasas y órganos; y de 60 días en
productos cárnicos. Permanece viable durante 46 horas en vidrio, 17
horas bajo luz solar y menos de 7 días en pisos. Las enterotoxinas de S.
aureus son estables a temperatura de ebullición.” (IOWA STATE
UNIVERSITY, 2011).
S. aureus y MRSA pueden ser eliminados de las superficies e
instrumentales mediante desinfectantes como: hipoclorito de sodio,
alcoholes, compuestos de amoníaco cuaternario, fenoles, formaldehído y
una combinación de yodo y alcohol; o mediante autoclave (121 °C durante
un mínimo de 15 minutos) o en estufa (160-170 °C durante al menos 1
hora). (IOWA STATE UNIVERSITY, 2011).
Staphylococcus aureus produce una nucleasa termoestable de 17.000 Kd
que es una endonucleasa que degrada ADN y ARN, y está codificada por
el gen nuc, el cual es utilizado para la identificación de este patógeno.
(ODD G. BRAKSTAD, 1992).
- 4 -
CAPÍTULO II
FACTORES DE VIRULENCIA
Fig.1. Factores de virulencia de Staphylococcus aureus. (EstrellaCervantes-García R. G.-G.-S., 2014).
2.1 Proteína A (Staphylococcus aureus protein A: Spa).
La Proteína A de S. aureus es una proteína componente de la pared
celular que se ha clasificado en el grupo de adhesinas denominadas
componentes de superficie microbianas que reconocen las moléculas de
matriz adhesiva (MSCRAMMS, microbial surface components recognizing
adhesive matrix molecules), ésta ayuda a la bacteria a alterar la función
- 5 -
ciliar del hospedero, estimular respuesta inflamatoria, mediar en el daño
tisular con producción de radicales tóxicos de oxígeno, pero su función
principal es evadir la respuesta inmune del organismo huésped, mediante
su capacidad para fijarse al extremo Fc de las inmunoglobulinas: IgG1,
IgG2 e IgG4, evitando de esta manera la opsonización (al no entrar en
contacto con el extremo Fab) y por ende la fagocitosis. (Patrick R. Murray,
2014) (Geo. F. Brooks, 2011) (Castañón-Sánchez, 2012) (Estrella
Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (Antonina A Votintseva, 2014).
2.2 Péptidoglucano.
El péptidoglucano es el componente más abundante de la pared, en las
bacterias Gram positivas representa aproximadamente el 50% de su peso
y cumple algunas funciones como: brindar estabilidad estructural y
osmótica, activa el complemento y atrae químicamente a los leucocitos
polimorfonucleares. La construcción de la pared de péptidoglucano está
catalizada por unas enzimas llamadas “Proteínas Ligadoras de Penicilina”
que son las moléculas blanco de los antibióticos β-lactámicos. (Geo. F.
Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Guadalupe Zendejas-Manzo,
2014) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).
2.3 Ácido Teicoico.
Es un polímero de ribitol fosfato con sustituyentes D-alanina y N-acetil
glucosamina, es característico de los Staphylococcus, se lo puede
encontrar en la pared celular y ligados a los lípidos de la membrana
citoplasmática. Su función es mediar la unión de Estafilococos a las
superficies de las mucosas mediante uniones específicas a la
- 6 -
fibronectina, tiene poco poder inmunogénico, pero es capaz de activar los
mecanismos de la inflamación y desencadenar una respuesta humoral
específica. (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (Geo. F. Brooks,
2011) (Patrick R. Murray, 2014).
2.4 Cápsula.
Algunas cepas de S. aureus (se han identificado 11) poseen una cápsula
que les sirve principalmente para no ser reconocidos por el sistema
inmunológico del hospedero y evitar la fagocitosis. Además muchas cepas
poseen una delgada capa extracelular de limo constituida básicamente
por monosacáridos, proteínas y pequeños péptidos la cual colabora en la
adhesión de la bacteria a tejidos del hospedero y cuerpos extraños,
además de cubrir los antígenos bacterianos y constituirse en otro
mecanismo de inhibición de la fagocitosis. (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick
R. Murray, 2014) (Castañón-Sánchez, 2012).
2.5 Proteínas de adherencia.
Las MSCRAMMS (microbial surface components recognizing adhesive
matrix molecules) son un grupo de proteínas de superficie, que facilitan la
adherencia de S. aureus a los tejidos del hospedero cuando se ha perdido
la continuidad del tejido epitelial y se inicia la colonización.
Entre las principales adhesinas tenemos:
Las proteínas A y B de unión a fibronectina (FnbpA y FnbpB).
La proteína de adhesión al colágeno de la matriz extracelular (proteína
Cna).
- 7 -
Las proteínas de adhesión al fibrinógeno, conocidas también como factor
aglutinante A y B (ClfA y ClfB).
Además, tenemos proteínas de unión a elastina, osteopontina,
sialoproteína ósea, y una adhesina de amplia especificidad (complejo
mayor de histocompatibilidad análogo de proteína de clase II). S. aureus
tiene también gran facilidad para adherirse a superficies de catéteres y
prótesis para luego formar biofilms que protegen a la bacteria de los
antibióticos y de la acción inmunológica del huésped. (Michael C. Hudson,
1999) (Castañón-Sánchez, 2012) (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick R.
Murray, 2014) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).
2.6 Toxinas
S. aureus tiene una importante producción de toxinas exógenas, entre las
cuales encontramos toxinas citolíticas, toxinas exfoliativas, enterotoxinas
y toxina-1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1).
2.6.1 Toxinas citolíticas. Las toxinas citolíticas conocidas como
hemolisinas (α, β, δ, γ, y la Leucocidina de Panton-Valentine), al
integrarse a las regiones hidrofóbicas de la membrana celular del
hospedero abren poros β-barril de alrededor de 2nm de diámetro los
cuales ocasionan perdida de la estabilidad osmótica de una gran variedad
de células del hospedero, como leucocitos, eritrocitos, macrófagos,
plaquetas, fibroblastos, y hepatocitos entre otras, las cuales se
descompensan y lisan. Las enzimas lisosomales liberadas en la
destrucción de los neutrófilos provocan el daño tisular en los tejidos
circundantes. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Geo. F. Brooks, 2011)
(Patrick R. Murray, 2014) (Castañón-Sánchez, 2012).
- 8 -
2.6.2 Toxinas exfoliativas. Las toxinas epidermolíticas o exfoliativas son
dos, Toxina Exfoliativa A (ETA) y Toxina Exfoliativa B (ETB), son unas
proteasas de serina que lisan las uniones intercelulares al romper la
desmogleína 1, que es un miembro de la familia de las estructuras de
adhesión celular (desmosomas) y disuelven la matriz de mucopolisacárido
del estrato granuloso de la epidermis, merced a lo cual generan su efecto
descamativo. A pesar de tener pesos similares, mientras ETA está
codificada por un gen cromosómico y es termoestable (20 minutos a
100oC), ETB tiene su origen en un plásmido y es termolábil. (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014) (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014).
2.6.3 Enterotoxinas. Se han identificado 18 enterotoxinas (A-E, G-R y
U, V), las cuales causan diarrea, son termoestables (hasta 30 minutos a
100°C) y resisten la hidrólisis de las enzimas digestivas, por lo que su
efectividad no se ve afectada durante su tránsito por el aparato digestivo.
Un 30 a 50% de cepas de S. aureus son productoras de una o más de
estas potentes toxinas y a pesar de no conocerse claramente su
mecanismo de acción, se sabe que estas toxinas son superantígenos
cuya función principal es debilitar el sistema inmune del hospedero para la
progresión de la enfermedad. La ingestión de apenas 25 μg de
enterotoxina B es suficiente para producir vómitos y diarrea. Las toxinas
exfoliativas, TSST-1 y los genes de las enterotoxinas se encuentran en un
elemento cromosómico denominado Isla de Patogenicidad. (Castañón-
Sánchez, 2012) (Geo. F. Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014)
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
2.6.4 TSST-1. La TSST-1 (toxic shock syndrome toxin-1) o enterotoxina
F, es una exotoxina termoestable y resistente a la proteólisis, codificada
por el gen tstH que se localiza en un elemento genético móvil y se la
puede encontrar en casi el 20 % de las cepas de S. aureus. Es un
superantígeno, se une a moléculas MHC clase II, suprime la quimiotaxis
de neutrófilos, bloquea el sistema reticuloendotelial, estimula la función
- 9 -
supresora de los linfocitos T y la liberación de citocinas, produciendo la
extravasación o destrucción de las células endoteliales.
La sintomatología típica del síndrome del shock tóxico incluye: malestar
general, fiebre alta, dolor de cabeza, vómito, diarrea, presión sanguínea
baja, mialgias y rash eritematoso. Los pacientes pueden presentar
también dificultad respiratoria, coagulación intravascular, meningitis,
faringitis, conjuntivitis, vaginitis, edema, artralgia, irritabilidad. Si la
condición no se ha revertido, al final suelen presentarse convulsiones,
falla de varios órganos a causa de un shock hipovolémico y la muerte del
paciente. (Jaime A. Bustos-Martínez, 2006) (Ana C. Blanco, 2005) (Geo.
F. Brooks, 2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Guadalupe Zendejas-Manzo,
2014).
2.7 Enzimas
Entre las enzimas más importantes con las que cuenta S. aureus
podemos enumerar:
2.7.1 Coagulasa. Produce coagulación del plasma y forma una capa de
fibrina que rodea el absceso estafilocócico, con lo que evita la fagocitosis
de la bacteria y facilita el desarrollo de sepsis. Es un importante factor de
virulencia que a menudo es usado como marcador para diferenciar a las
cepas positivas de las negativas. Se conoce dos tipos de coagulasa, la
coagulasa libre y la coagulasa ligada o cumpling factor. La coagulasa
ligada no requiere de los factores plasmáticos para convertir el fibrinógeno
en fibrina, mientras que la coagulasa libre requiere de una globulina
conocida como factor de reacción con la coagulasa. (Geo. F. Brooks,
2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S.,
2014).
- 10 -
2.7.2 Catalasa. Cuando los macrófagos fagocitan a Staphylococcus
aureus lo destruyen con el peróxido de hidrogeno, pero la bacteria se
defiende mediante la producción de la enzima catalasa que convierte el
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno protegiéndola de la fagocitosis.
La prueba de catalasa diferencia a los Estafilococos en positivos y
negativos. (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (Geo. F. Brooks,
2011).
2.7.3 Otras enzimas. Los miembros del género Staphylococcus en
general producen varias enzimas que hidrolizan la matriz extracelular de
los hospedadores para facilitar la diseminación del agente infeccioso. La
hialuronidasa por ejemplo hidroliza el ácido hialurónico del tejido
conjuntivo, la fibrinolisina disuelve coágulos de fibrina, las lipasas
hidrolizan los lípidos y la nucleasa termoestable es la encargada de
hidrolizar el ADN. Estas enzimas tienen como objetivo principal facilitar la
diseminación de la bacteria en el nuevo huésped. Actualmente además
casi todas las cepas de Staphylococcus aureus son productores de la
penicilinasa, una β-Lactamasas con actividad hidrolítica capaz de
hidrolizar los anillos β-Lactámicos de las penicilinas. (Geo. F. Brooks,
2011) (Patrick R. Murray, 2014) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014)
(Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).
2.8 Quorum-sensing (QS).
S. aureus tiene la capacidad de comportarse de diferentes maneras de
acuerdo a las condiciones de su entorno y su densidad poblacional, de
esta manera reconoce el momento adecuado para activar algunos
procesos como la liberación de los factores de virulencia, formación de
biopelículas, etc, a este sistema en S. aureus se le conoce como Quorum-
sensing (QS) o agr (gene accesorio regulador). Este gen agr “utiliza una
- 11 -
péptido feromona (péptido autoinductor AIP) cuando la concentración de
inicio es alcanzada a cierta densidad celular uniéndose a la membrana
donde se localiza una cinasa de histidina (AgrC), la cual activa una
proteína reguladora AgrA involucrada en la transcripción del operón Agr”
(Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).
Todos estos factores de virulencia están codificados por sus respectivos
genes como se muestra en el cuadro a continuación:
Cuadro 1. Factores de virulencia de Staphylococcus aureus. (Estrella
Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014).
- 12 -
CAPÍTULO III
RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS
Hasta hace poco tiempo, todas las bacterias, incluido S. aureus eran
susceptibles a gran cantidad de antibióticos diferentes; sin embargo,
aparentemente la incorrecta utilización de estos fármacos ha llevado a
que la resistencia a ellos esté en aumento, y aparezcan cepas poco
sensibles o resistentes a la mayoría de estos fármacos, como se muestra
en el cuadro 2.
3.1 Mecanismos de resistencia antimicrobiana.
Los principales mecanismos de resistencia a antibióticos utilizados por las
bacterias se pueden resumir en:
a. La inactivación enzimática del antibiótico como en el caso de la
resistencia a los β-lactámicos mediante las β-lactamasas y a los
aminoglucócidos mediada por las acetiltransferasas, adeniltransferasas o
la alteración ribosomal de las fosfotransferasas.
b. La alteración de la molécula diana, esto permite que la afinidad por el
antibiótico disminuya como es en el caso de la resistencia a la meticilina
mediante la producción de la proteína PBP2a.
c. El atrapamiento del antibiótico como en el caso de la vancomicina en la
cual la resistencia está mediada por un engrosamiento de la pared, lo que
afecta la llegada del antibiótico al blanco en la membrana plasmática.
- 13 -
d. Las bombas de excreción o sistemas efflux que eliminan los fármacos
antes que lleguen a su blanco intracelular.
Cuadro 2: Principales antibióticos a los que se ha encontrado resistenciaen cepas de S. aureus (Jaime A. Bustos-Martínez, 2006).
- 14 -
Todos estos mecanismos que no son únicamente de S. aureus se
adquieren mediante diferentes vías como: transferencia horizontal de
genes, integración cromosómica de elementos transponibles, a través de
mutaciones espontáneas y/o selección positiva entre otras, que están
regulados por varios grupos de genes como el operón bla, SCCmec, etc.
(Velázquez-Meza, 2005) (Gerardo Becerra, 2009) (Carlos Andrés
Rodríguez, 2005 ).
La resistencia bacteriana a los antibióticos se inicia con la inclusión de un
gen en el ADN bacteriano, el que produce una proteína con actividad
específica contra cierto grupo de antibióticos, la mayoría de ellas son
enzimas especializadas en modificar el núcleo funcional del antibiótico
para inactivarlo, mientras que otras modifican el blanco de los antibióticos
dentro de la bacteria. (Velázquez-Meza, 2005) (Gerardo Becerra, 2009)
(Carlos Andrés Rodríguez, 2005 ).
3.2 Genes involucrados en la resistencia de S. aureus a los β-Lactámicos.
En S. aureus se han descrito dos genes centrales en la resistencia a este
tipo de antibioticos, el gen blaZ que codifica para unas enzimas llamadas
β-lactamasas que hidrolizan el anillo β-Lactámicos de la penicilina, y; el
gen mecA que codifica para PBP2a, una variante de las PBPs originales,
pero que es proteína de muy baja afinidad por la Meticilina y todos los β-
Lactámicos. Cada uno de estos genes tiene genes reguladores que están
muy cercanos, formando arreglos como el SCCmec (Staphylococcal
Cassette Chromosome mec) para el gen mecA y el operon bla para el
caso del gen blaZ. (GIL, 2000) (John Elmerdahl Olsen, 2006).
- 15 -
3.2.1 Gen blaZ. En S. aureus resistente a las penicilinas, se generan las
enzimas β-Lactamasas que destruyen el anillo β-Lactámicos de dichos
antibióticos. Se conocen 4 tipos de estas enzimas (A, B, C y D) que están
codificadas por el gen blaZ que puede ubicarse tanto en un plásmido, y en
el cromosoma como parte del elemento transponible. “Para los tipos A, C
y D usualmente se ubican en plásmidos, mientras que el tipo B
normalmente reside en el cromosoma”. (John Elmerdahl Olsen, 2006).
En el Operón β-lactamasa de Staphylococcus aureus, el gen blaZ como
puede observarse en la figura 2, forma un arreglo con los genes
reguladores: blaR1 que produce la proteína BlaR1 (un sensor-transductor)
que va a localizarse en la membrana de la bacteria y el gen blaI que
produce la proteína BlaI (un represor de la transcripción) se ubica en la
zona promotora de estos genes. (Simon R. Clarke, 2001).
La producción de β-Lactamasa en ausencia de penicilina se mantiene en
niveles bajos por la presencia de la proteína BlaI unida al ADN en la
región promotora, pero cuando la proteína BlaR1 detecta la presencia de
este antibiótico, sufre autoclivaje y por si sola o mediante la proteína
BlaR2 cliva a BlaI, desencadenando la transcripción a gran escala del
ARNm que se traducirá en β-lactamasa que inactivará a la penicilina.
Cuando se ha producido β-Lactamasas en exceso, S. aureus puede
volverse resistente incluso a la Oxacilina aún en ausencia del gen mecA,
y a estos microorganismos se los conoce como cepas con resistencia
borderline (Bordeline resistant Staphylococcus aureus-BORSA). “Las
cepas hiperproductoras de β–Lactamasas poseen un plásmido común de
β-lactamasa de 17,2 kb que codifica a la β-lactamasa estafilocócica del
tipo A”. (Castellano González Maribel, 2010).
El transposón Tn552, transporta la codificación para la β-lactamasa
estafilocócica además de los genes reguladores de la transcripción y
genes necesarios para su transposición a los diferentes elementos
- 16 -
genéticos como el plásmido estafilocócico p19789, que contiene un
derivado del sistema de resolución de Tn552 ('resR-binR') que actúa
como un "hotspot" para la transposición de Tn552. La inserción del
transposón crea segmentos de ADN flanqueado por sitios de resolución
repetidas inversamente, una (resR) en pI9789 y el otro (resL) en Tn552
que se delimitan por los dinucleótidos terminales 5'TG......CA 3’. La
translocación parecería ser replicativa ya que los genes b-lactamasa no
se pierdan en el cromosoma. La región β-lactamasa del plásmido p1524,
que comprende el gen estructural de la β-lactamasa (blaZ), genes para el
control de, la producción lactamasa (blaI, blaRI) y un segmento de forma
reversiblemente invertible de ADN, es idéntico al 'Tn552'. (S.J.Rowland,
1989).
Fig.2. Introducción a la síntesis de β-lactamasa estafilocócica en
presencia de penicilina (Castellano González Maribel, 2010).
3.2.2 Gen mecA. Este gen codifica para una variante de PBP, la proteína
PBP2a (Penicillin Binding Protein 2a), de 78KDa, de muy baja afinidad a
la penicilina y a todos los β-lactámicos, incluidas las penicilinas sintéticas,
- 17 -
por lo que la presencia de este gen brinda resistencia a todo este grupo
de antibióticos, a estos microorganismos se los conoce como resistentes
a la Meticilina. La proteína PBP2a no se encuentra en las cepas sensibles
a la Meticilina. (Estrella Cervantes-García R. G.-G.-S., 2014) (IOWA
STATE UNIVERSITY, 2011) (Foster, 2004) (Velázquez-Meza, 2005).
“El gen mecA se caracteriza por tener una longitud de 2.1 kb, localizado
en un elemento genético móvil, llamado cassette cromosomal
estafilococal (SCCmec). Hasta el momento se conocen siete tipos de
SCCmec (tipo I a VII), reconocidos por su tamaño que va de 20.9 a
66.9kb.” (Estrella Cervantes-García, 2014).
Se conocen varios tipos de SCCme (I-XI) muy móviles, pero algo lentos,
pues la aparición de PBP2a se demora varias horas, mientras que las β-
lactamasas aparecen en apenas minutos luego del contacto de la
penicilina con la bacteria. (José Mensa, 2013).
“El SCCmec tipo I de 34.3 kb, tipo IV de 20.9-24.3kb, el tipo V de 28 kb, y
el tipo VII de 35.9 kb propician resistencia sólo a los antibióticos β-
lactámicos, mientras que el SCCmec tipo II de 53 de kb y el tipo III de
66.9 kb causan resistencia a múltiples antibióticos debido a la integración
adicional de genes en SCCmec; ejemplo de esto son los plásmidos
pUB110 que lleva el gen ant4’ que codifica la resistencia a varios
aminoglucósidos como kanamicina, tobramicina y bleomicina”. (Estrella
Cervantes-García, 2014).
“El elemento SCCmec contiene varias secuencias de inserción como
IS431 e ISI272, así como genes responsables de la regulación y
transcripción del gen mecA. Los genes que codifican el cassette
cromosomal son recombinasas ccr tipo invertasas localizadas en el
elemento SCCmec. Estos genes son designados como ccrA1 y ccrB1 en
el tipo I de SCCmec, ccrA2 y ccrB2 en el SCCmec tipo II y tipo IV, ccrA3 y
- 18 -
ccrB3 en el SCCmec tipo III, ccrA4 y ccrB4 en SCCmec tipo IV de MRSA
cepa HDE288, y ccrC en SCCmec tipo V. La región del borde de mec y el
complejo ccr son denominados como regiones J (junkyard)” (Estrella
Cervantes-García, 2014).
Fig. 3 Esquema de Cassette SCCmec tipo III presente en hospitales.(Estrella Cervantes-García, 2014)
Fig.4. Diagrama esquemático que ilustra cómo S. aureus adquiereresistencia a la meticilina y su capacidad para expresar diferentes factoresde virulencia. (Foster, 2004).
- 19 -
“Todos los elementos SCCmec están divididos en tres regiones. La región
J1 del cromosoma derecho de la unión a los genes ccr, la región J2 que
va desde los genes ccr al complejo mec, la región J3 está localizada entre
el complejo mec y la extrema izquierda del elemento SCCmec. Se
descubrió que S. aureus presenta variantes SCCmec tipo I y tipo IV los
cuales difieren en las regiones J” (Estrella Cervantes-García, 2014).
La transcripción de blaZ y mecA es reprimida, respectivamente por los
represores BlaI y MecI, pero además BlaI y MecI pueden reprimir
intercambiablemente la transcripción de cualquiera de los dos genes
diana. (Martin K. Safo, 2005).
Los elementos reguladores y el gen mecA constituyen el denominado
complejo mec.
El sistema de regulación de la expresión del gen mecA es muy similar al
sistema de regulación de la expresión del gen blaZ, el sistema de
señalización incluye un gen mecI represor de la transcripción que codifica
para la proteína MecI que al encontrarse unida al ADN mantiene la
transcripción del gen mecA en limites muy bajos. (José Mensa, 2013).
El gen mecR1 codifica una proteína transmembrana denominada MecR1
la cual tiene dos dominios, uno extracelular y otro citoplasmático, esta
proteína actúa como sensor que reconoce la presencia del β-lactámico en
el medio mediante su dominio extracelular y cliva su dominio
citoplasmático, para mediante éste generar proteólisis en la proteína
represora MecI y de esta manera, al desaparecer el efecto inhibidor de
MecI, se libera la transcripción de PBP2a. (José Mensa, 2013).
Se ha identificado además resistencia a varios otros antibióticos como se
puede apreciar en el siguiente cuadro.
- 20 -
AntimicrobianoBlancocelular
Genes deresistencia
Mecanismo de resistencia
Aminoglucósido RNAr 30S
aacA-aphD,
aadA, aadD,
aadD, aphA,
aphC, spc, strA
Modificación por acetiltransferasas,
adeniltransferasas o alteración ribosomal de
las fosfotransferasas.
Cloranfenicol rRNA50s cat Modificación por acetiltransferasa
Fluoroquinolonas DNA girasa
gyrA / gyrB
norA
grlA
Mutaciones en los genes de la DNA girasa,
Bombas de expulsión, Mutaciones en el gen
de la DNA topoisomerasaIV
Fosfomicina
Síntesis del
ácido N-acetíl
murámico
fosBModificación por una glutatione-S-
transferasa
Ácido fusídicoFactor de
elongación GfusA/fusB
Alteración en el factor de elongación
G/disminución de la
Permeabilidad
GlicopéptidosComplejos D-
Ala-D-AlaSecuestro por la pared celular
Macrólidos,lincosamidas
RNAr 50sermA, ermB,
ermC, msrAMutilación del RNAr, Bombas de expulsión
MupirocinaIsoleucil-RNAt-
sintetasamupA
Producción de una isoleucil-RNAt-sintetasa
modificada
Rifampicina
Subunidad β de
la RNA
polimerasa
rif Alteraciones en la RNA polimerasa
SulfunamidasSíntesis de ácido
tetrahidrofólicosulA Sobreproducción de ácido p-aminobenzoico
Tetraciclinas RNAr 30s
tetA(K)/
tetA(L)
tetA(M)
Bombas de expulsión
Protección ribosomal
Trimetoprim
Síntesis del
ácido
tetrahidrofólico
drfA Bypass por una dehidrofolato reductasa
Cuadro 3. Mecanismos de resistencia identificados en S. aureus.(Velázquez-Meza, 2005).
- 21 -
CAPÍTULO IV
PATOGÉNESIS
Los integrantes del género Staphylococcus desde el punto de vista clínico
se pueden dividir en patógenos y no patógenos. Los no patógenos
generalmente forman parte de la microflora normal de la piel, del sistema
respiratorio y del sistema digestivo, son coagulasa-negativos y tienden a
ser no hemolíticos, mientras que los patógenos como S. aureus son
invasivos, coagulasa-positivos y tienden a ser hemolíticos.
“La capacidad patógena de una determinada cepa de S. aureus es el
efecto combinado de factores extracelulares y toxinas junto con las
propiedades invasivas de la cepa. En un extremo de la gama de la
enfermedad está la intoxicación alimentaria estafilocócica, que se atribuye
únicamente a la ingestión de la enterotoxina preelaborada; en el otro
extremo están la bacteriemia estafilocócica y los abscesos diseminados
en todos los órganos” (Geo. F. Brooks, 2011).
4.1 Inicio del proceso infeccioso y desarrollo de signos y síntomas.
El desarrollo de los signos y síntomas ocasionados por Staphylococcus
está condicionado principalmente con la forma de inicio del proceso
infeccioso que puede ser de dos maneras:
- 22 -
a. Mientras que cuando el proceso infeccioso se da por la acción de sus
toxinas, generalmente en lugares distantes de la localización inicial de la
bacteria como el caso de las infecciones alimentarias, el período de
incubación se reduce a horas (30 minutos a 8 horas).
b. Mediante la acción directa de la bacteria que implica colonización,
invasión del huésped y expresión de los determinantes de patogenicidad
en cuyo caso el período de incubación puede variar mucho, generalmente
de 4 a 10 días. (Seija, 2006). (IOWA STATE UNIVERSITY, 2011).
4.2 Principales patologías causadas por S. aureus.
4.2.1 Infecciones mediadas por las toxinas. Las tres principales
enfermedades que produce Staphylococcus aureus mediante sus toxinas
tenemos: Síndrome de piel escaldada, Intoxicación alimentaria y el
Síndrome del shock tóxico.
4.2.1.1 Síndrome de piel escaldada estafilocócica. (SSSS del inglés
Staphylococcal scalded skin syndrome), se caracteriza por descamación
dolorosa de la piel por acción de las toxinas exfoliativas estafilocócicas
(Toxina Exfoliativa A o ETA y Toxina Exfoliativa B o ETB) en la capa
granulomatosa de la epidermis. Las toxinas se producen en un foco de
infección inicial, pasan al torrente sanguíneo, y se diseminan en regiones
alejadas, por lo que en las zonas descamadas y sus alrededores no
encontramos ningún germen. El síndrome abarca desde afecciones
ampollosas localizadas hasta la descamación generalizada de la piel, que
afectan principalmente, pero no exclusivamente a recién nacidos y niños
menores de 5 años. Su tasa de mortalidad se ubica alrededor del 5% en
niños, pudiendo llegar hasta el 60% en adultos, debido a complicaciones
como sepsis, superinfecciones, y los desequilibrios electrolíticos.
- 23 -
(GUERRER-FERNANDEZ J. , 2002) (Inbal Braunstein, 2014) (Seija,
2006) (Jesus Saavedra, 2011).
Fig. 5. Síndrome de Piel Escaldada. (Patrick R. Murray, 2014).
4.2.1.2 Intoxicación Alimentaria. Los alimentos suelen ser un medio de
transporte de las enterotoxinas de muchos microorganismos, que cuando
ingresan al organismo producen efectos de distinta intensidad en el
huésped. Las enterotoxinas termoestables de S. aureus (A-E,G-I) son
superantígenos que aceleran el peristaltismo y generan manifestaciones
clínicas como: náuseas, dolor abdominal, vómito, diarrea (de hasta 2
días), en general sin fiebre y en los casos más graves se pueden
presentar cefalea y choque. Estos síntomas suelen aparecer de 1 a 6
horas después de la ingesta de los alimentos contaminados, que
principalmente suelen ser aquellos alimentos de elevado contenido en
proteínas e hidratos de carbono como: cárnicos (principalmente pollo,
chorizo y jamón), pasteles, helados y salsas. La recuperación suele ser
rápida mediante rehidratación y sin necesidad de tratamiento antibiótico.
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).
4.2.1.3 Síndrome de shock tóxico. El síndrome de shock tóxico (SST) es
una enfermedad sistémica multiorgánica provocada por la toxina 1 del
síndrome del shock tóxico (TSST-1) de S. aureus que restringe la
- 24 -
quimiotaxis de neutrófilos, induce la función supresora de los linfocitos T y
bloquea el sistema reticuloendotelial. Predomina en mujeres en edad fértil
y se relaciona con el uso de tampones superabsorbentes, y son pocos los
casos no menstruales (10-15%). Los síntomas son: dolor de cabeza,
fiebre alta, hipotensión, mialgias, rash eritematoso en pies y manos,
vómito y diarrea. Si no se controla a tiempo puede avanzar a shock grave
en 48 horas (síndrome de dificultad respiratoria, coagulación intravascular
y falla renal) y la muerte. La tasa de mortalidad es alta. (Jaime A. Bustos-
Martínez, 2006) (Ana C. Blanco, 2005) (Seija, 2006) (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014).
Fig. 6 Síndrome de Shock Tóxico. (Patrick R. Murray, 2014).
4.2.2 Infecciones supurativas (presencia de bacterias). En cuanto a las
afecciones supurativas que incluyen presencia de la bacteria como tal,
podemos mencionar que S. aureus está involucrado en una amplia gama
de enfermedades, que van desde infecciones superficiales relativamente
benignas (impétigo, foliculitis, forunculosis o conjuntivitis), hasta
enfermedades sistémicas que ponen en riesgo la vida, como abscesos
profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía.
- 25 -
4.2.2.1 Impétigo. Se define como infección de la epidermis,
caracterizada por presencia de vesículas y/o pústulas, localizadas
principalmente en cara y extremidades. Afecta principalmente a niños
entre 2 a 5 años, se disemina rápidamente y está asociada a problemas
de higiene y hacinamiento.
Se distinguen dos formas clínicas de Impétigo:
No ampolloso que es el más frecuente, necesita de perdida de
continuidad de la piel para el contagio inicial, es contagioso, se
caracteriza por lesiones indoloras, a veces pruriginosas, con moderada
sensibilidad a la palpación, sin eritema alrededor y generalmente sin
fiebre.
Ampolloso se caracteriza por presencia de ampollas muy frágiles
(causadas por acción de las toxinas exfoliativas lejos de la ubicación de la
infección) que al romperse dejan una zona eritematosa.
(Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de
Medicina Interna (SEMI), 2006) (Jesus Saavedra, 2011) (Leonardo
Sánchez–Saldaña, 2006).
Fig. 7. Impétigo Bulloso. Recuperado de:(Leonardo Sánchez–Saldaña, 2006) .
Fig. 7A. Impétigo no Bulloso.Recuperado de: (LeonardoSánchez–Saldaña, 2006).
- 26 -
4.2.2.2 Foliculitis y Forunculosis. Son procesos inflamatorios secundarios
a la infección bacteriana que afectan al folículo pilosebáceo superficial
(foliculitis) y profundo (forunculosis) en las zonas con mayor presencia de
pelo como la cabeza, el mentón, la región superior del tronco, axilas,
nalgas, región inguinal y muslos. Se presentan en forma de pápulas y/o
pústulas a nivel del orificio folicular. Las forunculosis consisten en la
aparición repetida durante largos períodos de tiempo de forúnculos únicos
o múltiples en localizaciones variables que puede ser ocasionado por una
foliculitis previa. La coalescencia de los forúnculos con extensión de la
supuración al tejido celular subcutáneo se conoce como Ántrax. (García,
2014) (VILA MAS, 2003) (Leonardo Sánchez–Saldaña, 2006).
4.2.2.3 Conjuntivitis. Es la inflamación de la conjuntiva ocular,
generalmente a causa de bacterias o virus. S. aureus puede causar esta
enfermedad pues se encuentra en nuestra piel o en vías respiratorias. La
infección puede iniciar en los dos ojos, o primero en uno y en un día pasar
el otro. (ESTEVA, 2006).
Fig. 8. Foliculitis. Recuperado de:(VILA MAS, 2003).
Fig. 8A. Forunculosis. Recuperado de:(VILA MAS, 2003).
- 27 -
Fig. 9 Conjuntivitis. Recuperado de:http://es.slideshare.net/mediconauta/oftalmologa-ojo-rojo
4.2.2.4 Celulitis. Inflamación aguda de la piel que a diferencia de la
erisipela, se extiende hasta el tejido celular subcutáneo, caracterizada por
edema, eritema con bordes mal definidos (debido a la profundidad de la
infección) y dolor de la zona afectada, con frecuencia se observa
adenopatías regionales y los signos y síntomas generales de fiebre,
escalofríos y malestar general. La causa más común suelen ser S.
pyogenes y S. aureus (aunque pueden ser otras bacterias) con
antecedentes de lesiones cutáneas previas y afecta generalmente las
mejillas (unilateral) y extremidades. Es de mucho cuidado la ubicación en
la zona cercana al ojo debido a las serias complicaciones que podrían
presentarse con la visión y el sistema nervioso central. Las
complicaciones más serias de la celulitis son: abscesos subcutáneos,
osteomielitis, artritis séptica, tromboflebitis, bacteriemia y fascitis
necrotizante. (Jesus Saavedra, 2011) (Leonardo Sánchez–Saldaña, 2006)
(Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de
Medicina Interna (SEMI), 2006).
- 28 -
Fig. 10 Celulitis infecciosa. Recuperado de:http://www.enciclopediasalud.com/categorias/dermatologia-piel-y-
belleza/articulos/la-celulitis-infeccion-de-la-piel.
4.2.2.5 Sepsis. La sepsis estafilocócica es una entidad clínica
caracterizada por el paso de Estafilococo desde un punto inicial de
infección hacia la sangre y su metástasis a diferentes sitios,
principalmente pulmón, corazón, articulaciones, huesos, músculos, riñón y
cerebro, comprometiendo seriamente la vida del paciente.
Lamentablemente produce síntomas muy generales (Ricardo Arteaga
Bonilla, 2005) (Lismay González Reynosa, 2001).
4.2.2.6 Piomiositis. Es un tipo de infección que necrosa el tejido
muscular, se caracteriza principalmente por la presencia de abscesos en
los músculos y es más frecuente en zonas tropicales. Generalmente es
causada por S. aureus cuando ha logrado llegar a la sangre y se ha
transportado a los músculos. (Sociedad Española de Quimioterapia
(SEQ), Sociedad Española de Medicina Interna (SEMI), 2006).
- 29 -
4.2.2.7 Neumonía. A pesar de que S. aureus es un habitante frecuente
del aparato respiratorio pues un alto porcentaje de seres humanos a nivel
mundial son portadores de este microorganismo, la incidencia de
infecciones a este nivel es relativamente baja, y ocasionalmente puede
llegar a los pulmones y desarrollar neumonía necrosante con múltiples
complicaciones como: empiema, neumatoceles, pioneumotórax y fístulas
broncopleurales.
4.3. Infecciones Intrahospitalarias.
En tres hospitales de Quito-Ecuador: "Enrique Garcés" (dependiente del
Ministerio de Salud Pública), "Carlos Andrade Marín" (Instituto
Ecuatoriano de Seguridad Social) y Quito Número 1, de la Policía
Nacional (Ministerio de Gobierno), cada uno de los cuales tenía más de
60 camas se realizó un estudio en un mismo momento temporal, en las
Unidades de Cuidados Intensivos, fueron estudiados 16 pacientes, “de los
cuales 9 presentaban una infección intrahospitalaria (prevalencia 56,25 %,
IC 95 %: 29,8-80,2) localizada en vías respiratorias bajas (neumonía 6);
sistema nervioso central 1; piel y tejidos blandos 1 y osteoarticular 1”.
(César Ignacio Ruano, 2004).
Como se puede apreciar en los resultados del estudio que se exponen en
el cuadro 4, el patógeno más frecuente a nivel intrahospitalario fue
Staphylococcus aureus, el cual estuvo presente en 4 de los nueve
pacientes que presentaban infección intrahospitalaria.
- 30 -
Cuadro 4. Infecciones nosocomiales en tres hospitales de Quito Ecuador.DH: días de hospitalización. FR: factor de riesgo (el principal identificado).VM: ventilación mecánica. NE: nutrición enteral.VRB: vías respiratoriasbajas. SNC: sistema nervioso central. Bacterias coexistentes en elpaciente: pseudomona aeuroginosa y klebsiella pneumoniae,pseudomona aeuroginosa, serratia spp y proteus vulgaris.
En España también se llevó a cabo un estudio en la Unidad de Cuidados
Intensivos de los hospitales de algunas ciudades como Barcelona,
Malaga, Vizcaya, Madrid, etc, en el que (Francisco Álvarez Lerma, 2006)
evidenció que “S. aureus está presente en el 19,8% de los pacientes con
infecciones adquiridas en las UCI, principalmente en neumonías
relacionadas con ventilación mecánica. La mortalidad de los pacientes
con infecciones por S. aureus ha sido superior a la de los pacientes con
infecciones por otros microorganismos y a la de pacientes sin infecciones.
Por el contrario, no se han identificado diferencias en la evolución de los
pacientes con infecciones por S. aureus sensible o resistente a meticilina”.
- 31 -
Cuadro 5. Distribución de las infecciones intrahospitalarias en el área decuidados intensivos en función del aislamiento de Staphylococcus aureus.(Francisco Álvarez Lerma, 2006).
4.4. Factores predisponentes del huésped.
Según (Seija, 2006) dentro de los principales factores predisponentes del
huésped para adquirir la infección y desarrollar la enfermedad tenemos:
• Defectos de quimiotaxis leucocitaria congénitos o adquiridos.
• Defectos de opsonización por anticuerpos.
• Defectos en la muerte intracelular luego de la fagocitosis (enfermedad
granulomatosa crónica).
• Heridas de piel (quemaduras, incisiones quirúrgicas, eczema).
• Presencia de cuerpos extraños (suturas, vías venosas, prótesis).
• Infecciones por otros agentes, particularmente virus (influenza).
• Enfermedades crónicas como alcoholismo, falla renal crónica,
enfermedades malignas, etc.
- 32 -
CAPÌTULO V
DIAGNÓSTICO EN EL LABORATORIO
5.1 Frotis y tinción.
La extensión de las muestras sobre una lámina portaobjetos y su posterior
tinción es un procedimiento básico y de gran ayuda en microbiología
cuando de identificar agentes patógenos se trata, por lo que tenemos a
disposición una amplia variedad de tinciones entre las que podemos
encontrar a la tinción de Gram.
Tinción de Gram. La tinción de Gram es una prueba muy utilizada en los
laboratorios, por ser económica, rápida y eficaz, además de ser una
tinción diferencial pues clasifica a las bacterias en positivas (aquellas que
fijan la tinción) y en negativas (las que no la fijan) y esto depende de la
estructura de la pared celular de las bacterias. S. aureus es una bacteria
que está en el grupo de las Gram positivas. (Geo. F. Brooks, 2011) (Luis
Esaú López-Jácome, 2014) (Patrick R. Murray, 2014).
Figura 11. Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gramnegativas y Gram positivas. (Luis Esaú López-Jácome, 2014).
- 33 -
La tinción de Gram utiliza dos colorantes: el violeta de cristal y la
safranina. El violeta de cristal tiene afinidad con el péptidoglucano que se
encuentra en gran cantidad en la pared celular de las Gram positivas por
lo que se tornan azuladas, mientras que las Gram negativas lo sueltan
pero fijan la safranina y se tornan rojizas. (Geo. F. Brooks, 2011) (Luis
Esaú López-Jácome, 2014) (Patrick R. Murray, 2014).
Fig. 12. Cocos Gram positivos y Gram negativos, recuperado de:
https://microbitos.files.wordpress.com/2011/08/staphylococcus-sp-fig6.jpg
y http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/ayuda/cocosgneg.GIF.
Procedimiento. Según indica (Geo. F. Brooks, 2011), se realiza el frotis o
extensión de la muestra sobre una lámina portaobjetos, se deja secar a
temperatura ambiente y se fija usando calor o metanol para evitar
desprendimiento de la muestra durante el procedimiento de tinción y
lavado de los colorantes que se han de utilizar.
A continuación se cubre la muestra con el colorante violeta de
cristal y dejamos reposar alrededor de un minuto para que el
colorante penetre en las bacterias, luego de lo cual lavamos
cuidadosamente con agua corriente.
Sin secar, aplicamos lugol (que forma un complejo con el violeta de
cristal impidiendo que escape durante la decoloración)
cuidadosamente y dejamos actuar por un minuto, luego de lo cual
- 34 -
lavamos nuevamente con agua, teniendo mucho cuidado que no se
desprenda la muestra.
Sin secar, se aclara la tinción agregando sobre la muestra, gota a
gota, una preparación de acetona (30 ml) con alcohol (70 ml), y
agitando durante 10 a 30 segundos, teniendo cuidado de no
decolorar demasiado, luego de lo cual retiramos mediante
enjuague con agua, la solución decolorante.
Posteriormente se cubre la muestra con una solución de safranina
al 2.5% en alcohol al 95%, durante 10 a 30 segundos, lavamos con
agua y dejamos secar. (Geo. F. Brooks, 2011) (Luis Esaú López-
Jácome, 2014) (Patrick R. Murray, 2014).
5.2 Cultivo.
Análisis microbiológico. Para la identificación de S. aureus es necesario
utilizar algunas pruebas bioquímicas y medios de cultivo especiales que
permitan su fácil determinación. Esta identificación se basa en las
enzimas y las toxinas que produce el microorganismo. Aprovechando
estas características en el mercado se pueden encontrar una gran
variedad de medios de cultivo sólidos y líquidos que se han diseñado
para aislar e identificar esta bacteria, entre los cuales los más importantes
son: Agar Baird-Parker, Agar Manitol Salado, Agar azul de O-toluidina-
DNA, Agar Estafilococos N° 110. (INSTITUTO ECUATORIANO DE
NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo,
2014).
- 35 -
5.2.1 Base de agar Baird-Parker.
5.2.1.1 Fórmula (por litro):
Triptona…………………………………..…. 10, 0 g
Extracto de Carne...................................... 5, 0 g
Extracto de Levadura................................. 1,0 g
Glicina........................................................ 12,0 g
Cloruro de Litio............................................. 5,0 g
Agar.......................... .................................. 20, 0 g
Sulfametacina sódica (cuando sea necesario).
Agua destilada ……………………………….1,0 L
Piruvato de sodio al 20%
Telurito de potasio al 1%
Emulsión de yema de huevo
5.2.1.2 Fundamento: Es una base a la que se deben añadir Emulsión de
Yema de Huevo y Potasio Telurito. También se puede añadir
Sulfametazina para inhibir el crecimiento de Proteus. Por la presencia del
Cloruro de Litio y Telurito de Potasio se inhibe el crecimiento de
microorganismos no deseados convirtiendose en un medio medianamente
selectivo. Por la presencia del Sodio Piruvato y la Glicina se favorece el
crecimiento de los Estafilococos recuperando incluso a aquellos que han
sufrido daño no letal. A su vez el Potasio Telurito combinado con la acción
de la yema de huevo permite diferenciar los Estafilococos.
Staphylococcus aureus da colonias negras, por la reducción del potasio
telurito a teluro, rodeadas de un halo de transparencia debido la
destrucción de los lípidos de la yema de huevo. Existe un paralelismo
importante entre los coagulasa-positivos y la reacción descrita con la
yema de huevo y el telurito; es por lo que estas características se utilizan
como indicativo de esta actividad. (INSTITUTO ECUATORIANO DE
NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo,
2014).
- 36 -
5.2.1.3 Uso. En las muestras biológicas, y diferentes productos
cosméticos, farmacéuticos, e incluso alimentos en los que se necesita
aislar selectivamente Estafilococos. El medio de cultivo completo es
opaco y no puede almacenarse por lo que debemos utilizarlo
inmediatamente sembrando homogéneamente en su superficie. Incubar a
37ºC durante 24-48 horas. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija,
2006) (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013).
5.2.1.4 Preparación. Primero se prepara el medio base disolviendo los
componentes en un litro de agua destilada, se agrega el agar y se deja en
reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente y ajustamos el pH a
6,8 ± 0,2. Manteniendo agitación continua llevar a ebullición hasta que se
disuelven completamente los componentes, se distribuye en frascos (90
cc en cada frasco) y se esteriliza en el autoclave a 121ºC durante 15
minutos. Este agar base puede conservarse en refrigeración (4 °C ±1°C)
más de un mes. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN,
2013) (Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
A continuación se prepara las soluciones de telurito de potasio al 1%,
Sulfametacina sódica, piruravo sódico 20% y la emulsión de yema de
huevo como se detalla a continuación:
Telurito de potasio al 1%.
Disolver 10 g de telurito de potasio en 100 cc de agua destilada tibia y
esterilizar por filtración.
Piruvato de sodio al 20%.
Disolver 20 g de piruvato de sodio en 50cc de agua destilada, una vez
disuelto agregar 50cc más de agua y esterilizar también por filtración.
Sulfametacina sódica.
Disolver 0,2 g de sulfametacina sódica en 10 cc de hidróxido de sodio
0,1N y agregar agua destilada hasta 100cc. Si la sulfametacina fuera
- 37 -
necesaria, se agrega 27,5 cc por cada litro del medio base antes de
esterilizarlo. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013)
(Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
Emulsión yema de huevo.
Lavar con jabón, un cepillo y agua tibia suficientes huevos frescos como
para obtener 50cc de yema, sumergirlos en etanol al 70% v/v y dejarlos
en reposo por unas horas. Flamearlos y con una pipeta estéril retirar la
clara de cada uno de ellos, en una probeta estéril colocamos 50cc de
yemas a las que añadimos 50cc de suero fisiológico estéril y mesclamos
en una licuadora a baja velocidad para que no se forme espuma. Esta
emulsión de yema de huevo se puede conseguir preparada. (INSTITUTO
ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014).
Finalmente se prepara el medio completo mezclando 90 cc del medio
base, 1 cc de solución de telurito de potasio al 1%, 5 cc de piruvato de
sodio al 20 % y 5 cc de emulsión de yema huevo. Se distribuye en las
placas y se deja enfriar. (INSTITUTO ECUATORIANO DE
NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo,
2014).
Las placas preparadas deben ser utilizadas dentro de las siguientes 24h y
los resultados positivos deben ser confirmados con frotis y tinción de
Gram. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija,
2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
5.2.1.5 Interpretación de resultados:
Colonias MicroorganismosNegras, lustrosas, convexas 1 a 5mm de diámetro, con bordeestrecho blanquecino, rodeado porun halo claro de 2 a 5 mm deanchura. Dentro del halo claropresencia de anillos opacos novisibles antes de las 48 horas
Staphylococcusaureus
- 38 -
Negras, lustrosas, pero en formairregular. Al cabo de 24 horas,presencia de zonas opacasalrededor de las colonias.
Staphylococcusepidermitis
(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006)
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
5.2.2 Agar Manitol Salado.
5.2.2.1 Fórmula (g/L):
Peptona…………………………. 10,0
Extracto de carne……………….. 1,0
Cloruro sódico………………… 75,0
D (-) manitol……………………. 10,0
Rojo de fenol…………………… 0.025
Agar-agar……………………….. 12,0
pH 7,4 ± 0,1
5.2.2.2 Fundamento:
El agar manitol salado fue formulado para lograr el aislamiento de
Estafilococos, inhibiendo el crecimiento de otras bacterias al utilizar una
alta concentración de cloruro de sodio (7.5%). En este medio, las
peptonas y el extracto de carne proporcionan la fuente de carbono,
nitrógeno, vitaminas y minerales. Con la fermentación del D-Manitol se
genera ácido que ocasiona el viraje del rojo de fenol a amarillo,
permitiendo así una mayor claridad en el momento de establecer el
diagnóstico, ya que la mayoría de Estafilococos patógenos fermentan este
azúcar. El agar es adicionado como agente solidificante. . (INSTITUTO
ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006) (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014).
- 39 -
5.2.2.3 Uso:
El Agar Sal y Manitol se emplea para el aislamiento selectivo y recuento
de Staphylococcus patógenos en productos cárnicos, lácteos, marinos y
otros productos alimenticios. También se emplea con el mismo fin en
productos farmacéuticos y cosméticos. La siembra se realiza en
superficie, por estría. Debido al potente efecto inhibidor de este medio,
debe sembrarse masivamente. Incubar a 37º C 24-48 horas. .
(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006)
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
5.2.2.4 Preparación:
Suspender 108 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con
agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto.
Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. Dejar enfriar a una
temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.
(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija, 2006)
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
5.2.2.5 Interpretación de resultados:
Los Estafilococos coagulasa (+) (Staphylococcus aureus) producen
colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo,
mientras que los Estafilococos negativos a la coagulasa producen
colonias de color rojo y no provocan cambios en el color del indicador rojo
fenol. (INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Seija,
2006) (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
- 40 -
Fig. 13. Crecimiento de diferentes cepas de S. aureus en agar manitol
salado.
5.2.3 Agar Estafilococos N° 110.
5.2.3.1 Fórmula (g/L):
Extracto de levadura………... 2.5
Tripteína…........................... 10.0
Gelatina……………………... 30.0
Lactosa……………………...... 2.0
D-Manitol……………………. 10.0
Cloruro de Sodio................... 75.0
Fosfato dipotásico.................. .5.0
Agar....................................... 15.0
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/estafilococomedio110.htm.
5.2.3.2 Fundamento. Este medio es selectivo para Estafilococos gracias a
la producción de color debido a la hidrolisis de la gelatina y fermentación
del manitol. Los nutrientes de este medio ideal para diferenciación de
Estafilococos, son aportados por la tripteína y el extracto de levadura
mientras que la gelatina nos sirve la verificar la producción de la enzima
gelatinasa. La alta concentración de cloruro de sodio con el objetivo de
inhibir el crecimiento de microorganismos diferentes a los Estafilococos lo
- 41 -
que lo hace un medio selectivo para esta bacteria. La fuente de carbón
fermentable está constituida por el manitol y la lactosa. (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014).
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/estafilococomedio110.htm.
5.2.3.3 Uso. Se lo utiliza con el fin de aislar selectivamente Estafilococos
en muestras clínicas y no clínicas. La siembra es en placa directamente
por estriado o por extensión y se incuba de 24 a 48 horas en la estufa a
35-37°C. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014)
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/estafilococomedio110.htm.
5.2.3.4 Preparación. Suspender 149 g del medio en un litro de agua
destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1
o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Verter
en placas y mezclar para dispersar el precipitado. (Guadalupe Zendejas-
Manzo, 2014).
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/estafilococomedio110.htm.
5.2.3.5 Interpretación de resultados. Los Estafilococos coagulasa
positivos forman colonias amarillas y doradas, pero sin embargo es
necesario realizar dos pruebas para la identificación de estos
microorganismos:
Primero buscamos averiguar si hay o no fermentación del manitol
para lo cual es necesario colocar unas gotas de purpura de
bromocresol en la zona de crecimiento bacteriano y en la zona
donde no hay crecimiento, esto con el fin de observar si se
obtienen coloraciones diferentes entre las dos zonas. Se considera
prueba positiva cuando se encuentras colonias con un halo
amarillento alrededor en la zona donde hay crecimiento bacteriano,
mientras que en la zona donde únicamente hay medio de cultivo
sin inocular, el indicador permanece intacto.
- 42 -
A continuación se evalúa si existe o no hidrolisis de gelatina para lo
cual se agrega sobre la placa 5ml de solución saturada de sulfato
de amonio y se incuba durante 10 minutos en la estufa a 35-37ºC.
Se considera prueba positiva si se forma un halo transparente
alrededor de las colonias, esto indica digestión de la gelatina por la
enzima gelatinasa.
Nota: por la alta concentración de cloruro de sodio en este medio, no es
recomendable utilizar las colonias crecidas en el para realizar la prueba
de la coagulasa, por lo que se recomienda previamente realizar un
subcultivo de estas colonias en medios no selectivos. (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014)
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/estafilococomedio110.htm.
5.2.4 Agar Azul de O-Toluidina-DNA o Agar DNAsa.
5.2.4.1 Fórmula en g/L
Peptona de Caseína………………….. 15.00
Acido Desoxirribonucleico……………... 2.00
Peptona de Soja………………………… 5.00
Cloruro Sódico………………………….. 5.00
Agar Bacteriológico……….…………… 15.00
Final pH 7.3 ± 0.2 a25ºC
http://www.condalab.com/uploads/media/1028_PARA_PRUEBA_DNASA_
REv_0_mayo_2010.pdf.
5.2.4.2 Fundamento. Las cepas patógenas de S. aureus producen
nucleasas que descomponen el ADN del medio debido a que la ADNas
tiene la capacidad de romper sus enlaces fosfodiester, lo cual se
evidencia al formar un halo alrededor de la zona inoculada del agar. Las
Peptonas de Caseína y Soja aportan nitrógeno, vitaminas, minerales y
aminoácidos, necesarios para el crecimiento de las colonias bacterianas,
- 43 -
mientras que el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).
http://www.condalab.com/uploads/media/1028_PARA_PRUEBA_DNASA_
REv_0_mayo_2010.pdf.
5.2.4.3 Usos. Aunque ha sido diseñado para identificar Estafilococos
patógenos que producen la desoxirribonucleasa debido a que esta enzima
es un indicador de su potencial patogénico, también se lo utiliza para
identificar otros microorganismos con actividad DNAsa. Para la siembra,
con un asa con una buena cantidad del cultivo realizamos una estría recta
de alrededor de 2 centímetros de longitud en el centro de la placa y
dejamos incubar en la estufa a 35-37 ºC durante 18-24 horas antes de
realizar la prueba del ácido clorhídrico. (Guadalupe Zendejas-Manzo,
2014) (Seija, 2006) http://www.condalab.com/uploads/media/1028_
PARA_PRUEBA_DNASA_REv_0_mayo_2010.pdf.
5.2.4.4 Preparación. Pesar 42 gramos del medio y diluir en un litro de
agua destilada agitando continuamente y con calor. Una vez disuelto
llevar a ebullición durante un minuto hasta conseguir una completa
disolución. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Dejare
enfriar hasta 45-50ºC y verter en placas de Petri estériles. Las placas
preparadas deben almacenarse entre 8-15 ºC.
5.2.4.5 Interpretación. El color del medio preparado es ámbar ligeramente
opalescente pero al cubrir con ácido clorhídrico 1N se torna más opaco y
en la zona que rodea a la zona inoculada, si se forma un halo
transparente indica que la prueba ha sido positiva. En lugar del ácido
clorhídrico se puede utilizar azul de toluidina en cuyo caso el medio se
torna azul y alrededor de la zona de crecimiento se forma un halo rosado.
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014).
http://www.condalab.com/uploads/media/1028_PARA_PRUEBA_DNASA_
REv_0_mayo_2010.pdf.
- 44 -
Fig. 14. S. aureus en Agar DNAsa
5.3 Pruebas bioquímicas
Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas reacciones que ponen
en evidencia la existencia de una enzima o pasos metabólicos
determinados, y que muchas veces nos permiten llegar a la identificación
a nivel de especie. Para el caso de Estafilococo aureus las pruebas más
importantes son las que identifican la producción de dos enzimas
principalmente, la Catalasa y la Coagulasa.
5.3.1 Prueba de la Catalasa.
5.3.1.1 Fundamento. Algunas bacterias como Staphylococcus y
Micrococcus poseen la capacidad de producir la enzima catalasa
(catalasa positivas) que tiene la propiedad de descomponer el peróxido de
hidrógeno o agua oxigenada en agua y oxígeno, logrando de esta manera
sobrevivir a los efectos tóxicos del sistema mieloperoxidasa de los
fagocitos.
2 H2O2 2 H2O + O2Catalasa
- 45 -
Esta prueba es útil para diferenciar las bacterias catalasa positivas de los
organismos catalasa negativos como Streptococcus y Enterococcus.
(Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006) (Geo. F. Brooks, 2011).
5.3.1.2 Procedimiento. Colocar una o dos gotas de H2O2 sobre un
portaobjetos y luego agregar una pequeña cantidad de colonias del
cultivo. Para esta prueba no se puede obtener las colonias desde un agar
que contenga sangre, ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y
pueden dar falsos positivos. Esta prueba también puede realizarse a partir
de un cultivo en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro
del mismo. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006) (Geo. F.
Brooks, 2011).
5.3.1.3 Interpretación. Se considera prueba positiva cuando existe la
formación de burbujas debido a la descomposición de peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno. (Guadalupe Zendejas-Manzo, 2014) (Seija,
2006) (Geo. F. Brooks, 2011).
5.3.2 Prueba de la coagulasa.
5.3.2.1 Fundamento. Estafilococo aureus posee la característica de
producir una proteína llamada coagulasa, lo que le diferencia de otras
especies de Estafilococos a los que no producen dicha proteína y se les
conoce como coagulasa negativos. Estafilococo dorado presenta dos
tipos de coagulasa, una endocoagulasa y una exocoagulasa:
La endocoagulasa está en la pared bacteriana y actúa directamente
sobre el fibrinógeno del plasma con EDTA o Citrato de sodio
generando coágulos o grumos.
La exocoagulasa o coagulasa libre requiere de una activación
previa mediante la unión a un factor sérico (CRF) para formar un
- 46 -
complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno y
genera el coágulo de fibrina.
La coagulasa es un factor de agregación que representa un importante
factor de virulencia, pues esta proteína convierte el fibrinógeno en fibrina
insoluble, la cual forma cúmulos que los Estafilococos utilizan para
adherirse y agruparse. Esta prueba sirve para diferenciar cepas de S.
aureus así como comprobar su presencia en la muestra analizada.
(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).
5.3.2.2 Procedimiento. Existen dos formas de realizar esta prueba, en
placa portaobjetos y/o en tubo para ambos casos podemos utilizar cultivos
en Caldo Infusión Cerebro Corazón (ICC).
Para la prueba en lámina portaobjetos es necesario preparar una
disolución de las colonias sospechosas con una gota de agua
destilada hasta que adopte un tono lechoso, luego se agrega una
gota de plasma de conejo y mezclamos.
Para la prueba en tubo de ensayo utilizaremos tubos de 75 mm x 7 mm
que contengan 0,5 ml de plasma de conejo, los cuales se inoculan con
colonias de los presuntos cultivos de S. aureus y, en el tubo control,
pipetear 0,1 ml de ICC sin colonias y 0,5 ml de plasma. Inmediatamente
se procede a incubar los tubos en baño maría a 35-37ºC de 4 a 6 horas
controlando a cada hora si existe o no coagulación del plasma.
(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).
5.3.2.3 Interpretación de resultados. Para la prueba en lámina, se
considera positiva la formación de grumos dentro de los primeros 10
segundos, por lo que se le considera una prueba rápida y económica;
pero en caso de resultar negativa (aproximadamente entre el 10 y 15% de
S. aureus dan resultados negativos a la prueba en placa) es necesario
- 47 -
corroborar el resultado con la prueba en tubo cuyos resultados se
interpretan de la siguiente manera:
Si al inclinar el tubo casi horizontalmente, sobresale un coagulo
pequeño, se considera que la prueba es positiva 2 +.
La formación de un coagulo que ocupe más de los ¾ del volumen
inicial del líquido, se considerará una prueba de la coagulasa
positiva 3 +.
Si se logra una coagulación total del plasma y éste no se
desprende del tubo sino con una ligera agitación, se tiene una
prueba de la coagulasa positiva 4+.
Si el resultado a las 4 horas es negativo es necesario regresar los
tubos al baño María y dejar en incubación toda la noche y se revisa
los resultados a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es muy
importante porque ocasionalmente puede presentarse lisis del
coagulo por las fibrinolisinas de Staphylococcus aureus.
Según la norma NTE INEN 1529-14:2013 se debe considerar S.
aureus cogulasa positivos a aquellos que han producido una
coagulación de 3 + o 4 +, además es necesario diferenciar los
coágulos verdaderos de los falsos, agitando suavemente el tubo
para que los pseudocoágulos se deshagan.
En el tubo control, el plasma debe permanecer inalterado.
(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013) (Guadalupe
Zendejas-Manzo, 2014) (Seija, 2006).
5.4 Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos es una de las más
importantes dentro del combate contra las infecciones bacterianas, pues
ayuda a los médicos en la elección del antibiótico más efectivo para
contrarrestarlas.
- 48 -
Para este se utiliza el Agar Mueller-Hinton como se detalla a
continuación.
5.4.1. Formula g/L
Infusión de carne………………. 300.0
Caseína ácida hidrolizada……… 17,5
Almidón…………………………….1,5
Agar………………………………..15,0
Agua purificada……………….. 1000 ml
pH final a 25ºC……………….. 7.3 ± 0.1
http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.
5.4.2 Fundamento. La infusión de carne y la caseína ácida hidrolizada
proporcionan nitrógeno, carbono, azufre y otros nutrientes esenciales para
el crecimiento de los organismos en estudio, mientras que el almidón
actúa como un coloide protector contra sustancias tóxicas presentes en el
medio. El agar permite el crecimiento satisfactorio de la mayoría de los
microorganismos. http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.
5.4.3 Usos. Agar Mueller-Hinton es el medio de cultivo recomendado
universalmente para realizar el antibiograma por la reproducibilidad de los
resultados. http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.
5.4.4 Preparación.
Suspender 38 gramos en 1000 ml de agua destilada.
Calentar hasta ebullición para disolver el medio completamente.
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión (121 ° C) durante 15
minutos.
Mezclar bien antes de verter en las cajas Petri estériles.
Inocular las placas con el microorganismo e incubar a 37ºC por 18
a 24 horas. http://himedialabs.com/TD/M173.pdf.
- 49 -
5.4.5 Interpretación. Halos de inhibición de crecimiento de 16mm o
mayores se considera que el microorganismo es susceptible al antibiótico.
5.5 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
Los métodos biotecnológicos de identificación de los organismos vivos
basados en el análisis de su ADN han evolucionado aceleradamente
durante la última década, por lo que se han producido una gran cantidad
de equipos, materiales y reactivos que si bien no es muy fácil obtenerlos
tampoco es tan difícil, pero brindan muchas ventajas sobre los métodos
tradicionales (el cultivo y pruebas bioquímicas) como su gran
especificidad, reproducibilidad de resultados y rapidez, lo que hace de
estos métodos los más propicios para la identificación de los
microorganismos. Entre los métodos biotecnológicos más utilizados en la
actualidad para este fin podemos mencionar la Real Time PCR (qPCR),
RT-PCR (Reverse Transcription PCR) y la PCR convencional que se
complementa con la electroforesis.
Mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa, con el correcto diseño
de “primers o cebadores” se logra limitar y amplificar correctamente un
segmento deseado de la cadena de ADN (siempre y cuando se encuentre
en la muestra de ADN previamente purificada), de esta manera se puede
identificar diferentes tipos de organismos como bacterias y virus, y
además se logra distinguir diferentes cepas de acuerdo a si poseen o no
determinados genes que produzcan proteínas de patogenicidad.
La PCR basa su función en la creación de nuevas cadenas por
complementariedad de bases con una cadena molde (extraída desde el
organismo en estudio), lo cual requiere de varios reactivos en
concentraciones exactas para lograr la polimerización de los nucleótidos.
- 50 -
Entre los elementos necesarios para la PCR tenemos:
El Termociclador es el equipo que brinda los cambios de
temperatura necesarios para las diferentes etapas de la PCR.
ADN, que sirva de plantilla sobre la cual se llevará a cabo la
construcción de las primeras copias que se formarán por
complementariedad de bases con dicha plantilla, dicha
complementariedad está dada por puentes de Hidrógeno que se
forman entre las bases complementarias: A-T y G-C.
ADN Polimerasa, conocida como Taq Polimerasa por su origen
(bacteria Thermus aquaticus) la cual posee una gran estabilidad
térmica, cualidad muy útil para soportar los cambios de
temperatura durante los diferentes ciclos de la PCR.
Primers o Cebadores oligonucleótidos que generalmente fluctúan
entre 15 a 25 nucleótidos de longitud, que reconocen una
secuencia de la cadena molde, se fijan a ella y dan el soporte para
que la polimerasa inicie su trabajo de generación de la nueva
cadena. Como mínimo se necesitan un primer Forward y uno
Reverse
dNTPs libres, que son los monómeros necesarios para la
elaboración de las nuevas cadenas.
Iones divalentes, buffer y agua, en las concentraciones adecuadas
facilitan las reacciones. (Tamay de Dios L, 2013) (John Elmerdahl
Olsen, 2006)
Cada ciclo de PCR involucra tres etapas principales: desnaturalización,
hibridación y elongación, y estos ciclos se repiten por tantas veces como
sean necesarios, generalmente 25-30.
Desnaturalización, que consiste en romper los puentes de
Hidrógeno generados entre las bases complementarias de las dos
cadenas con el objetivo de separarlas, para que sea posible el
siguiente paso que es la Hibridación. Esto se logra elevando la
- 51 -
temperatura generalmente a 94-95˚C, por un lapso de tiempo
determinado por la necesidad (20 segundos a 1 minuto). Al inicio
del proceso antes de entrar en la serie de ciclos, se realiza una
desnaturalización inicial que puede variar en el tiempo de duración
entre 5-10 minutos. (Tamay de Dios L, 2013) (John Elmerdahl
Olsen, 2006)
Hibridación, es en la unión de los primers por complementariedad
de secuencias en los extremos 3’ de la cadena de ADN que sirve
como templado o molde, para esto se requiere una temperatura
que fluctúa entre 50-60˚C. El correcto diseño de los cebadores es
la clave en el éxito o fracaso de la amplificación. (Tamay de Dios
L, 2013) (John Elmerdahl Olsen, 2006)
Elongación, consiste en el trabajo de la polimerasa, es decir en la
colocación de los nucleótidos en la cadena que se está elaborando,
se le conoce también como extensión. (Tamay de Dios L, 2013)
(John Elmerdahl Olsen, 2006)
Algunos años atrás dichos reactivos llegaban individualmente, tanto cada
uno de los nucleótidos, ADN polimerasa, iones divalentes, etc., con los
cuales había que realizar los cálculos y diluciones necesarias para
preparar las masters mix y lograr las reacciones. En la actualidad se
dispone de una variedad de kits preparados con todos los componentes
incluidos en un solo vial para facilitar el trabajo del laboratorista.
Algunos kits de amplificación, como el que se usó en este estudio (GoTaq
Green 2X de Promega) incluso traen incluido en su mezcla un tampón de
depósito, de manera que cuando termina la PCR, el amplicón se coloca
directamente en el gel de agarosa (para la electroforesis) sin necesidad
de realizar ninguna otra preparación lo que representa una ventaja en
ahorro de tiempo y trabajo.
- 52 -
CAPÍTULO VI
TRATAMIENTO: RECOMENDACIONES GENERALES
Un elevado porcentaje de cepas de S. aureus (más del 90%) tienen la
capacidad de producir β- lactamasas que inactivan a las penicilinas por lo
que para el tratamiento de las infecciones ocasionadas por este patógeno
se recurre con frecuencia a:
- Asociaciones de Penicilina con un inhibidor de Betalactamasas.
- Cefalosporinas (especialmente las de primera generación).
- Carbapenems.
- Penicilinas resistentes a la penicilinasa.
En el tratamiento de las infecciones en las que se sospecha la presencia
de S. aureus, sin duda alguna hay que tomar en cuenta, que puede no ser
el único patógeno presente en la lesión, pues a menudo en los focos
infecciosos pueden presentarse más de un microorganismo por lo que el
adecuado diagnóstico clínico cumple un rol fundamental para la elección
del tratamiento antibiótico empírico que debe iniciarse con premura,
pudiéndose modificar posteriormente con los resultados de sensibilidad
de la cepa aislada.
Debido a la falta de consenso para el tratamiento de estas infecciones se
tomará como base la “Guía de tratamiento antimicrobiano de la infección
por Staphylococcus aureus” y la “Guía de tratamiento de la infección
producida por Staphylococcus aureus resistente a meticilina” de la
Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de
Medicina Interna (SEMI) y la GTIPO-Sociedad Española de
- 53 -
Anestesiología y Reanimación, elaboradas en el 2008 y 2013 por un
grupo de médicos representantes de las entidades antes mencionadas.
Dentro de las consideraciones más importantes al momento de la elección
del antibiótico en las diferentes infecciones, está el hecho de indagar
sobre la utilización de estos fármacos durante el último mes, pues pueden
existir residuos de los mismos que condicionan su uso, debido a que los
efectos terapéuticos no son los mejores cuando se encuentran
Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) presentes ya en los
pacientes. Por ejemplo en el caso de SARM, si se trata con vancomicina,
solo se la utiliza si las CMI preexistente es menor de 1 mg/l, pues hay
varios estudios que indican que con CMI de 1,5 mg/l o superiores el
pronóstico de recuperación es muy bajo, incluso si se llega a una
concentración mayor de 15 mg/l, razón por la cual ha sido desplazada a
segundo plano en el tratamiento de infecciones por S. aureus. (Josep
Mensa, 2008).
6.1 Infecciones de Piel y partes blandas.
En el procedimiento diagnóstico de cualquier infección de la piel y los
tejidos blandos lo más importante es determinar la existencia o no de
necrosis y la profundidad de la afección.
Luego de realizada la valoración clínica basada en los antecedentes
personales y las manifestaciones clínicas, se puede realizar análisis
complementarios de laboratorio como: bioquímica sérica, biopsia, cultivo y
antibiograma, etc., lo cual no debería retrasar de ninguna manera el inicio
del tratamiento antibiótico, pues basado inicialmente en el diagnóstico
clínico debe iniciarse en forma precoz, por vía intravenosa con antibióticos
de amplio espectro debido a que en la mayoría de estas infecciones se
pueden encontrar varias bacterias y es difícil diferenciar unos cuadros de
- 54 -
otros. (Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española
de Medicina Interna (SEMI), 2006).
Una vez aislado el agente patógeno y comprobado que estamos en
presencia de S. aureus se puede iniciar el tratamiento específico
diferencial, si se trata de SASM o SARM, con las siguientes opciones:
6.1.1 Infección leve por SASM o SARM. Se puede atacar con
Amoxicilina/Clavulánico, Cefalexina, Clindamicina, Minociclina o
Doxiciclina, pero si el patógeno fuera SARM se prefiere Cotrimoxazol,
Clindamicina, Linezolid, Minociclina o Doxiciclina, aunque por ser una
afección leve en ocasiones el drenaje completo del forúnculo o absceso
cutáneo puede ser suficiente, pero se acompaña de antibiótico si el
paciente es de edad avanzada, si no se logra el drenaje completo, si hay
evidencia de celulitis, flebitis, fiebre, inmunodepresión o presencia de un
dispositivo o material protésico endovascular o endocardíaco. Puede
utilizarse Clindamicina 300 mg/8 h, Cotrimoxazol 800/160 mg/12 h o
Doxiciclina 100 mg/12 h, por vía oral. Para estos casos no hay un
medicamento que demuestre superioridad terapéutica sobre los otros.
(Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.1.2 Infección de gravedad moderada o alta por SASM. Se opta por
utilizar como primera elección Cloxacilina + Clindamicina o Linezolid vía
endovenosa (EV) cada 4 horas o preferiblemente en infusión continua,
para mantener una mejor concentración sérica, y como segunda opción
monoterapia con Linezolid o Daptomicina. (Josep Mensa, 2008) (José
Mensa, 2013).
6.1.3 Infección de gravedad moderada o alta por SARM. Si el patógeno
fuera SARM como primera opción tenemos Linezolid o Daptomicina y
como segunda opción Vancomicina o Teicoplanina con las siguientes
dosis: Linezolid 600 mg/12 h oral o EV, Vancomicina 2 g/dia (500 mg/6h),
- 55 -
o Daptomicina 6 mg/kg 1 vez/24 h. En caso de infección grave o de
fascitis necrosante es aconsejable asociar Clindamicina 600-900 mg/6-8 h
EV con Vancomicina o Daptomicina. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa,
2013).
6.2 Osteomielitis aguda, Artritis e infecciones de material protésicoosteoarticular.
En las infecciones del material protésico articular, como primer paso es
recomendable efectuar el retiro del mismo y luego se puede iniciar el
tratamiento antibiótico aunque, “La asociación de Rifampicina con Ácido
Fusídico se ha empleado en el tratamiento de 20 casos de infección
aguda sobre material protésico producida por S. aureus (en 11 casos se
trataba de SARM). Se realizó desbridamiento quirúrgico, sin retirar la
prótesis y se obtuvo la curación en un 90% de pacientes” (Josep Mensa,
2008).
6.2.1 Osteomielitis o Artritis por SASM. El medicamento de primera
elección es la Cloxacilina vía EV en la fase aguda, dejando como
segunda elección Clindamicina, Linezolid o Clotrimoxazol, pero si se trata
de infección del material protésico osteoarticular es necesario iniciar con
Cloxacilina EV por 5 a 7 días y continuarlo con Levofloxacino +/o
Rifampicina y como segunda opción tenemos Linezolid + Rifampicina,
Cotrimoxazol o Clindamicina + Rifampicina. (José Mensa, 2013) (Josep
Mensa, 2008).
6.2.2 Osteomielitis o Artritis por SARM. Tenemos como primera elección
Linezolid o Daptomicina dejando como alternativa Clindamicina,
Vancomicina y Teicoplanina. Tras el tratamiento por vía EV de la fase
aguda, puede continuarse por vía oral, con Linezolid, Cotrimoxazol o
Clindamicina, o asociaciones de Rifampicina con Cotrimoxazol,
Clindamicina o Ácido Fusídico, pues se ha observado clínicamente el
- 56 -
fracaso de cerca del 50% de los casos en el tratamiento de osteomielitis
por SARM con Vancomicina mientras que con Linezolid se alcanzó el
80% de efectividad. (José Mensa, 2013) (Josep Mensa, 2008).
Para las infecciones moderadas o graves de material protésico articular
por SARM se aconseja iniciar con Daptomicina + Rifampicina vía EV por 5
a 7 días y continuar con la asociación de Linezolid ± Rifampicina dejando
como alternativa la utilización de Cotrimoxazol o Clindamicina +
Rifampicina. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.3 Bacteriemia primaria o asociada a infección del catéter vascular.
En este caso, lo primero es retirar el catéter y a continuación iniciar con el
tratamiento antibiótico.
6.3.1 Bacteriemia producida por SASM. Luego de retirar el catéter
vascular, el antibiótico de elección es la Cloxacilina vía EV, también
puede emplearse Amoxicilina-Ácido Clavulánico, Clindamicina, o
Minociclina en monoterapia o una Fluoroquinolona (Levofloxacino o
Moxifloxacino) asociada a Rifampicina, siempre teniendo en cuenta la
función renal. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.3.2 Infección es producida por SARM. Tomando en cuenta que la
Vancomicina que hasta hace pocos años fuera considerada la primera
elección y de a poco ha sido desplazada, se recomienda el uso de
Daptomicina vía EV como antibiótico de primera elección, dejándola como
segunda opción junto a Linezolid, Clotrimoxasol, Minociclina y
Teicoplanina. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
- 57 -
Dentro de las consideraciones especiales que deben ser tomadas en
cuenta al momento de la terapia antibiótica de la bacteriemia, se puede
agregar elementos que guían la decisión de suspender o continuar el
tratamiento EV, entre las que se puede mencionar que si se obtienen
hemocultivos negativos en las primeras 24-48 horas de tratamiento por
vía EV, el paciente se encuentra sin fiebre, estable y sin evidencia clínica
de metástasis, se puede completar el tratamiento por vía oral. (Josep
Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.4 Endocarditis.
En este caso hay que diferenciar también si la válvula afectada es natural
o prótesis.
6.4.1 Endocarditis de válvula nativa por SASM. La primera elección es la
terapia mixta con Cloxacilina ± Gentamicina vía EV de 3 a 5 días, pero en
este caso debido la presencia del Aminoglucósido, se hace indispensable
vigilar la función renal, y en caso de que el paciente además reciba otra
medicación potencialmente nefrotóxica o que el filtrado glomerular sea
menor de 40 mL/min, la Gentamicina debe ser sustituida por Daptomicina.
(Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.4.2 Endocarditis de válvula nativa por SARM. Daptomicina +
Fosfomicina y/o Gentamicina EV de 3 a 5 días es el tratamiento de
elección, dejando la Vancomicina como segunda opción bajo la condición
de que la CMI previa se menor a 1mg/L. También hay que tomar en
consideración la vigilancia de la función renal como en el caso anterior.
(Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
- 58 -
6.4.3 Endocarditis de válvula protésica por SASM. Se recomienda en este
caso Cloxacilina + Gentamicina por 15 días y continuar con Rifampicina,
tomando en cuenta siempre la función renal para ver la conveniencia de
cambiar la Gentamicina con por una Quinolona si la cepa es sensible. El
tratamiento con Rifampicina se puede iniciar a partir del tercer o quinto
día. (Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.4.4 Endocarditis de válvula protésica por SARM. La primera elección de
antibioticoterapia es Daptomicina + Rifampicina + Fosfomicina y/o
Gentamicina, teniendo en cuenta la toxicidad renal por la Gentamicina y la
sensibilidad de la cepa a la Fosfomicina que de ser resistente, se debe
considerar la sustitución con Cloxacilina o Cotrimoxazol. Como segunda
elección tenemos Vancomicina + Gentamicina por 15 días + Rifampicina.
Otra alternativa es la Daptomicina sola o asociada a Gentamicina. (Josep
Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.5 Neumonía.
6.5.1 Neumonía por SASM. Está recomendado el tratamiento con
Cloxacilina, pero si la cepa fuera productora de PVL (Leucocidina de
Panton-Valentine) se aconseja la asociación con Linezolid o Clindamicina.
(Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
6.5.2 Neumonía por SARM. Linezolid es la primera opción para el
tratamiento de neumonía por SARM, pero si el proceso cursa con
bacteriemia debe considerarse su asociación con Daptomicina. Como
tratamiento alternativo se puede aplicar Vancomicina ± Rifampicina. La
Daptomicina pierde parcialmente su efecto en contacto con el surfactante
pulmonar por lo que no se recomienda su uso en este caso.
(Josep Mensa, 2008) (José Mensa, 2013).
- 59 -
“En dos estudios aleatorizados, realizados a doble ciego en pacientes
adultos con neumonía comunitaria, Daptomicina administrada a dosis de
4 mg/kg/día fue significativamente inferior a Ceftriaxona 2 g/día” (Josep
Mensa, 2008).
6.6 Infección del sistema nervioso central. (Meningitis, Abscesocerebral o epidural, Empiema subdural, Trombosis séptica de lossenos venosos).
6.6.1 Infección del sistema nervioso central por SASM. Como en los
casos anteriores la principal opción es Cloxacilina.
6.6.2 Infección del sistema nervioso central por SARM. Linezolid es la
primera opción, considerando la posibilidad de adicionar al tratamiento
Vancomicina (vía intratecal en dosis de 10 mg) o Fosfomicina. Tomar en
cuenta que los corticoides pueden reducir la difusión de Vancomicina en
las meninges.
En los pacientes con alergia a los betalactámicos se puede emplear
Aztreonam, Amikacina o una Fluoroquinolona (Ciprofloxacino o
Levofloxacino) asociada con Metronidazol y Linezolid o un Glucopéptido.
La Tigeciclina, por su amplio espectro que incluye SARM, enterobacterias
productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y
microorganismos anaerobios, puede ser una opción en monoterapia para
los pacientes alérgicos a los betalactámicos. (Sociedad Española de
Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de Medicina Interna (SEMI),
2006).
- 60 -
CAPÍTULO VII
DISEÑO METODOLÓGICO
7.1 Tipo de Investigación.
La investigación que se desarrolló fue de tipo analítico descriptivo y
experimental de laboratorio.
7.1.1 Universo. El universo está constituido por los equipos, instrumentos
y superficies que permanecen en las dos salas de quirófano y la sala de
cuidados intensivos con dos camas, existentes en el Hospital Docente
Universitario Católico.
7.1.2 Muestra. Se tomaron aleatoriamente 50 muestras de los equipos,
instrumentos y superficies que cumplen con los criterios de inclusión.
7.2 Criterios de inclusión.
Muestras de instrumental, equipos y superficies de las áreas de
quirófano y sala de cuidados intensivos (con mayor frecuencia de
uso y/o mayor dificultad para limpieza y esterilización).
- 61 -
7.3 Criterios de exclusión.
Muestras de instrumental, equipos y superficies del área de
consulta externa.
7.4 Equipos.
Cámara de flujo laminar con luz UV.
Estufa de incubación
Congelador
Centrifuga
Termociclador Piko (Finnzymes).
Cámara de electroforesis y fuente de poder.
Transiluminador UV.
7.5 Materiales y Reactivos.
Cepa ATCC 11632 S. aureus productora de betalactamasa
Cepa ATCC 43300 S. aureus resistente a la meticilina
Cepa ATCC 12344 Streptococcus pyogenes (control negativo)
Primer blaZ 1: 5’-GTTGCGAACTCTTGAATAGG-3’
Primer blaZ 2: 5’-GGAGAATAAGCAACTATATCATC-3’
Primer mecA F: 5’-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATGA-3’
Primer mecA R: 5’-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3’
Primer Tn1: 5’-GACTATTATTGGTTGATCCACCTG-3’ (gen nuc)
Primer Tn2: 5’-GCCTTGACGAACTAAAGCTTCG-3' (gen nuc)
SDS 1% en NaOH 2,5N (solución de lisis)
Mastermix GoTaq Green 2X de Promega
- 62 -
Ladder
Blue Juice 10X
Agar sangre
Agar manitol salado
Agar DNAsa
HCl 1% Agar Mueller Hinton
Agarosa
Caldo Tripticasa Soya
TAE 40X
Agua ultrapura libre de DNAsa
Bromuro de etidio
Discos de sensibilidad (9 antibióticos)
Cajas Petri
Tubos Eppendorf
Tubos de PCR (0,2 ml)
Lámpara de alcohol
Asa bacteriológica
7.6 Criterios de validez y confiabilidad del procedimiento.
El obtener un sistema de identificación preventiva de una de las bacterias
más frecuentes como lo es Estafilococo dorado resistente a la Penicilina y
la Meticilina (antibióticos del grupo de los β-Lactámicos), el cual brinde
algunas ventajas como rapidez, bajo costo y alta sensibilidad, es sin duda
de gran ayuda para el personal de salud que labora en los hospitales y
para los pacientes que necesitan utilizar los quirófanos y salas de
cuidados intensivos.
Por este motivo, nuestro propósito ha sido desarrollar un método basado
en las bondades de la biología molecular como la PCR y la electroforesis,
con el cual se pueda identificar cepas de Estafilococos dorados
- 63 -
productora de β-Lactamasas (resistentes a Penicilina) y simultaneamente
cepas productoras de PBP2a (resistentes a Meticilina).
Para garantizar la efectividad del procedimiento se trabajó con cepas
ATCC de Staphylococcus aureus: la cepa 11632 productora de β-
lactamasa para detectar la presencia del gen blaZ y la cepa 43300
resistente a la Meticilina, para la detección del gen mecA.
Como primer paso se trabajó por separado con estas dos cepas,
siguiendo los pasos establecidos en investigaciones anteriores como las
descritas por John Elmerdahl Olsen, 2006 quien trabajó con el gen blaZ, y
Mogahid M. Elhassan, 2015 y Ewan M. Harrison, 2014 quienes trabajaron
con el gen mecA.
7.6.1 Trabajo con cepa ATCC 11632. Se realizaron varias tareas que se
detallan a continuación:
7.6.1.1 Siembra en Agar Sangre. Esta cepa ATCC de S. aureus, fue la
primera con la cual se trabajó sembrándola en agar sangre, e incubándola
a 37ºC por 24 horas.
7.6.1.2 Extracción de ADN. Para este procedimiento se utilizó la solución
de lisis formada por SDS (dodecilsulfato sódico) al 1% en NaOH 0,25N y
ebullición como se detalla a continuación:
a. Se tomó con un asa bacteriológica en anillo colonias de la
siembra en agar sangre y se suspendió en tubos eppendorf con1
ml de agua destilada estéril.
b. A continuación se centrifugó 10 minutos a 3000rpm y se
descartó el sobrenadante.
c. Agregamos 50 µl de solución de lisis, dimos vortex y llevamos
los tubos al calor, introduciéndolos en agua en ebullición por 15
minutos.
- 64 -
d. Agregamos 450 µl de agua libre de nucleasas y centrifugamos
por 20 seg.
7.6.1.3 PCR. Posteriormente se desarrolló la PCR en un termociclador
PIKO con capacidad para volumen final de 20µL, para lo cual se empleó
la mastermix GoTaq Green 2X de Promega la que suministra la
polimerasa en un tampón de reacción con pH 8,5, 400μM dATP, 400μM
dGTP, 400μM dCTP, 400μM dTTP y 3 mM MgCl2, un tampón verde que
aumenta la densidad de la muestra y los tintes amarillo y azul que
funcionan como colorantes de carga cuando los productos de la reacción
se analizar por electroforesis. Se aplicó el siguiente protocolo:
a. Desnaturalización inicial 5 min X 94 ºC,
b. 34 ciclos de:
i. 1 min X 94ºC para desnaturalización,
ii. 1 min X 54ºC para alineamiento,
iii. 1 min X 72ºC para elongación,
c. Elongación final de 72ºC X 10 minutos.
Los “primers” o cebadores utilizados fueron 5’-
GTTGCGAACTCTTGAATAGG-3’ y 5’-GGAGAATAAGCAACTATATCATC-3’
que generan un amplicón de 674 pb, tanto los primers (par 486-488)
como el protocolo de amplificación fueron descritos por (John Elmerdahl
Olsen, 2006). Se probó diferentes mezclas para identificar la cantidad
óptima de ADN con la que se trabajará las siguientes PCR con el objeto
de amplificar el gen blaZ, las cuales se detallan en el cuadro a
continuación:
Master mix µl 10 10 10 10 10 10 10 10Primer 1 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5Primer 2 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
ADN µl 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5Agua µl 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5
Volumen final µl 20 20 20 20 20 20 20 20Cuadro 6. Volúmenes con los que se trabajó para la amplificacióninicial del gen blaZ.
- 65 -
Fig. 15 Protocolo de PCR para amplificar el gen blaZdescrita por John Elmerdahl Olsen, 2006.
7.6.1.4 Electroforesis horizontal. Finalmente se realizó la electroforesis en
gel de Agarosa al 1,5% con los amplicones obtenidos en la PCR antes
mencionada y se pudo apreciar que el mejor resultado de amplificación se
obtuvo con 1,5 µl de ADN.
7.6.2 Trabajo con cepa ATCC 43300. Se trabajó con la cepa ATCC S.
aureus 43300 portadora del gen mecA, repitiendo los protocolos de
extracción de ADN y de Electroforesis llevados a cabo con la cepa ATCC
11632 y variando únicamente en la PCR.
7.6.2.1 PCR. El protocolo de PCR aplicado fue:
a. Desnaturalización inicial 5 min X 94 ºC,
b. 30 ciclos de:
i. 1 min X 94ºC para desnaturalización,
ii. 30 seg X 62ºC para alineamiento,
iii. 35 seg X 72ºC para elongación,
c. Elongación final de 72ºC X 10 minutos.
Los cebadores específicos utilizados son F: 5’-
GTAGAAATGACTGAACGTCCGATGA-3’ y R: 5’-
- 66 -
CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3’ que generan un amplicón de 310
pb. Los primers y protocolos de PCR fueron descritos por (Mogahid M.
Elhassan, 2015) y (Ewan M. Harrison, 2014).
Fig. 16 Protocolo de PCR para amplificar el gen mecA.
Los volúmenes de reactivos utilizados para la amplificación del gen
mecA, en la cual se buscaba la cantidad óptima de ADN se indican en
el cuadro 7.
Master mix µl 10 10 10 10 10 10 10
Primer 1 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Primer 2 µl 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
ADN µl 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Agua µl 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3
Volumen final µl 20 20 20 20 20 20 20Cuadro 7. Volúmenes utilizados para la amplificación inicial del
gen mecA.
- 67 -
7.6.2.2 Electroforesis horizontal. Se procedió con la electroforesis con
diferentes concentraciones de ADN para evaluar cuál es el volumen
óptimo de ADN para el trabajo.
7.6.3 Trabajo simultaneo con las dos cepas ATCC. Probados los
reactivos, primers y la cantidad optima de ADN de las dos cepas
individualmente al obtener los respectivos amplicones, se procedió a
buscar un protocolo con el que se logre amplificar tanto el gen blaZ como
el mecA, para lo cual tuvimos que probar inicialmente con el protocolo con
el que se amplificó el gen blaZ, una variedad de éste con 30 ciclos en
lugar de los 34 llevados a cabo en la PCR inicial, y finalmente un
protocolo con temperatura de hibridación intermedia que se describe a
continuación:
a. Desnaturalización inicial 5 min X 94 ºC,
b. 34 ciclos de:
i. 1 min X 94ºC para desnaturalización,
ii. 1 min X 58ºC para alineamiento,
iii. 1 min X 72ºC para elongación,
c. Elongación final de 72ºC X 10 minutos.
Se pudo apreciar que el mejor resultado se obtuvo con el protocolo 2 que
consiste en: 5 minutos a 94°C para la desnaturalización inicial, seguido de
30 ciclos de 1 minuto a 94 °C para desnaturalización, 1 minuto a 54 °C
para alineamiento y 1 minuto a 72 °C para elongación. La elongación final
fue de 10 minutos a 72 °C.
7.6.4 Otras pruebas. Además a las cepas ATCC se realizó las pruebas
de:
ADNasa
- 68 -
Fig. 17: prueba de ADNasa positiva para las dos cepas ATCC.
Antibiograma en agar Mueller Hinton con discos de sensibilidad
de: Penicilina (P 10U), Amoxicilina (AX 25mcg), Netilmicina (NET
30 mcg), Cefuroxima (CXM 30 mcg), Ceftriaxone (CRO 30 mcg),
Meticilina (ME 5mcg), Vancomicina (VA 30mcg), Oxacilina (OX
1mcg), y Cloxacilina (CX 1mcg).
Fig. 18: Antibiograma cepa sensible a Cefuroxime, Meticilina y
Ceftriaxone.
Fig. 19: Antibiograma, cepa sensible únicamente a Cefuroxime.
- 69 -
Siembra en manitol.
Fig. 20: Las dos cepas ATCC viran el agar manitol salado.
Prueba de la catalasa.
Prueba de la Coagulasa.
Fig. 22 Cepa ATCC 11632 y cepa ATCC 43300 son Coagulasa positivas.
Fig. 21: Cepa ATCC 11632 y la cepa ATCC 43300positivas a prueba de la catalasa.
- 70 -
7.7 Análisis del Manipulador.
Para un trabajo completo también se realizó análisis del manipulador
como se muestra a continuación:
7.7.1. Toma de muestra de las fosas nasales. Se realiza con hisopo estéril
y se siembra en agar manitol salado. A las 24 horas se obtiene
crecimiento de colonias y viraje del medio del que se toman algunas
colonias para realizar extracción de ADN, PCR (con los 3 pares de
primers) y electroforesis horizontal.
Fig. 23. Prueba de Manitol del manipulador.
7.7.2. Antibiograma. Se realizó el antibiograma (se observa sensibilidad
únicamente para Cefuroxima), y se siembra en agar sangre del que se
realiza las pruebas de la coagulasa y catalasa que dan resultado positivo.
Fig. 24. Antibiograma de muestra del Manipulador.
- 71 -
7.7.3. Prueba de la coagulasa. Las colonias del manipulador dan
resultado positivo para la prueba de la coagulasa.
Fig. 25 Coagulasa y catalasa positivas del manipulador.
7.7.3. Extracción de ADN, PCR y electroforesis horizontal. Luego de la
extracción de ADN con el protocolo enunciado en el punto 7.6.1.2, se
realiza la reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis horizontal,
donde se encuentra el gen nuc (este gen está presente en todas las
cepas de Staphylococcus aureus) en las dos cepas control, y; en el
manipulador se identifican los genes nuc, blaZ (codifica para
Betalactamasa) y mecA (codifica para PBP2a). Además en la cepa ATCC
12344 de Streptococcus pyogenes que se utilizó como control negativo no
se encontró amplicón de ninguno de los tres genes.
Para la amplificación del gen nuc en las cepas control y del manipulador
de S. aureus se trabaja con 1,5 µl de ADN y se utilizaron los cebadores
Tn1 5’-GACTATTATTGGTTGATCCACCTG-3’ y Tn2 5’-
GCCTTGACGAACTAAAGCTTCG-3’ que generan un amplicón de 218pb.
(Florence Depardieu, 2004 ).
7.8 Procedimiento técnico de campo.
Debido a que el manipulador es portador asintomático, se enfatiza en las
medidas de seguridad para evitar contaminación de las muestras.
- 72 -
7.8.1 Toma de muestras. La correcta toma de muestras es crucial para el
éxito de todo el procedimiento, pues podría obtenerse falsos negativos. La
toma de muestras en el Hospital Docente Universitario Católico se realizó
en instrumental, equipos y superficies de las áreas de quirófano y sala de
cuidados intensivos (con mayor frecuencia de uso y/o mayor dificultad
para limpieza y esterilización) y se trasladó las mismas hasta el
laboratorio en tubos eppendorf con 1 ml de caldo Tripticasa Soya o TSB
(Tryptic Soy Broth), en el cual se obtiene un buen crecimiento de S.
aureus y contiene por cada 1000 ml:
Triptona 17,0 g
Fitona(peptona de soya) 3,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
D(+) glucosa 2,5 g
Fosfato dipotásico 2,5 g
Agua destilada 1,0 L.
(INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN, 2013).
Se preparó 100 ml de Caldo Tripticasa Soya, para lo cual se pesó 3
gramos de medio deshidratado y se diluyó en 100 ml de agua destilada,
calentando suavemente se agitó hasta disolución total y se colocó en
autoclave a 121ºC por 15 minutos. Se dispensó 1 ml del preparado en
tubos eppendorf previamente enumerados (del 1 al 50 por duplicado) y
esterilizados por 15 minutos en luz UV de la cámara de flujo laminar,
ayudándonos con una pipeta micrométrica de 1000µl y puntas con filtro.
Ayudándonos de hisopos estériles humedecidos en Caldo Tripticasa Soya
al momento de la toma de muestras y luego de la toma se retira los
excedentes del medio de cultivo líquido con swabs comerciales con
alcohol isopropílico al 70%. Se tomó un total de 50 muestras en los
quirófanos y sala de cuidados intensivos del Hospital Docente
Universitario Católico como se detalla a continuación:
- 73 -
- EN EL QUIRÓFANO 1
1. Mascarilla de anestesia general (verde)
2. Mascarilla de anestesia general (azul)
3. Mascarilla de anestesia general infantil (blanca)
4. Filtro bacteriano
5. Tubo para anestesia
6. Conector 1 de mascarilla
7. Conector 2 de mascarilla
8. Cánula grande
9. Cánula mediana
10.Cánula pequeña
11.Piso (esquina)
12.Lámpara
13.Mesa para instrumental
14.Mesa de materiales
15.Semiluna para instrumental
- EN EL QUIRÓFANO 2
16.Mascarilla para anestesia general (azul)
17.Ambo (insuflador) para oxigeno (grande)
18.Conector de mascarillas
19.Conector de salida de oxígeno
20.Filtro bacteriano
21.Salida de aire de la máquina de anestesia
22.Cánula grande
23.Cánula pequeña
24.Ambo (insuflador) para oxígeno (pequeño)
25.Mesa para materiales
26.Mesa para instrumental
27.Semiluna para instrumental
- 74 -
28.Piso (esquina)
29.Lámpara
30. Interruptores para la luz
- EN LA SALA DE CUIDADOS INTENSIVOS, CAMA 1
31.Equipo de intubación
32.Soporte para sueros
33.Superficie de la ventana
34.Superficie metálica de la cama
35.Coche de paro
36.Mesa del coche de paro
37.Manija de mesa de materiales
38.Superficie de lámpara para radiografías
39.Equipo de succión
40.Conector del equipo de succión
- EN LA SALA DE CUIDADOS INTENSIVOS, CAMA 2
41.Filtro de manguera de succión
42.Equipo de succión tapa interna
43.Equipo de succión tapa externa
44.Equipo de succión superficie
45.Monitor signos vitales
46.Bomba para sueros (superior)
47.Bomba para sueros (inferior)
48.Piso esquina 1
49.Piso esquina 2
50.Manija de cortina separadora de camas.
Se decide tomar las muestras en diferentes puntos de cada una de las
áreas, debido a la realidad diferente de cada una de ellas.
- 75 -
La toma de muestras se realizó cumpliendo las condiciones de asepsia
para evitar contaminación, fueron debidamente documentadas y la
descripción gráfica de las mismas se encuentra en la sección de anexos.
Se transporta las muestras al laboratorio y se colocan en incubación a
37°C durante 4 horas para obtener una mayor cantidad de bacterias en
caso de estar presentes en las muestras tomadas.
Una vez se ha cumplido el tiempo de incubación (4h), se siembra en Agar
Manitol Sal para ser incubados por 24 horas a 37°C y los hisopos se
vuelven a sembrar en nuevos eppendorf con Caldo Tripticasa Soya por 18
horas para realizar pruebas comprobatorias, mientras que el producto de
los tubos incubados por cuatro horas se lleva para el proceso de
extracción de ADN. Después de las 24 horas de incubación en Manitol no
se encuentran crecimiento por lo que se deja incubar por 24 horas más.
Con estas colonias se realiza una siembra en agar sangre del que se
toma unas muestras para realizar el antibiograma con discos de
sensibilidad de: Penicilina (P 10U), Amoxicilina (AX 25mcg), Netilmicina
(NET 30 mcg), Cefuroxima (CXM 30 mcg), Ceftriaxone (CRO 30 mcg),
Meticilina (ME 5mcg), Vancomicina (VA 30mcg), Oxacilina (OX 1mcg), y
Cloxacilina (CX 1mcg); y las pruebas de catalasa, coagulasa y DNAsa.
7.8.2 Extracción de ADN. En el laboratorio se realiza la extracción del
ADN mediante el protocolo que se describe a continuación:
Los 50 tubos Eppendorf se coloca en centrifugación por 10 minutos
a 2500 rpm, para precipitar las bacterias (si existieran) en los tubos
incubados por cuatro horas.
Se descarta el sobrenadante y al pellet se agrega 50 µl de solución
de lisis y se lleva a ebullición por 15 minutos.
Se agrega 450 µl de agua destilada libre de nucleasas.
- 76 -
Se centrifuga 20 segundos a 3000 rpm.
Se colocan en congelación hasta el momento de la PCR.
Se repite el mismo procedimiento con los tubos incubados por 18
horas.
7.8.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se realizó la PCR de
las extracciones de ADN del paso 7.7.1, siguiendo el protocolo que se
validó en el literal 7.6.3 (Trabajo simultáneo con las dos cepas ATCC) y
que se describe a continuación:
a. Desnaturalización inicial 5 min X 94 ºC,
b. 30 ciclos de:
iv. 1 min X 94ºC para desnaturalización,
v. 1 min X 54ºC para alineamiento,
vi. 1 min X 72ºC para elongación,
c. Elongación final de 72ºC X 10 minutos.
Se realiza primero la PCR para amplificar el gen nuc (el que nos permitirá
conocer si las muestras poseen o no S. aureus) desde el ADN extraído
desde las muestras incubadas en Caldo Tripticasa Soya, utilizando 1,5 µl
de ADN pero no se consigue amplicones para el gen nuc por lo que se
intenta con volúmenes de 3µl y 4µl para encontrar la cantidad adecuada
de ADN con el cual se trabajaran las muestras, así se obtuvo que 4µl es
el volumen óptimo para este fin.
7.8.4 Electroforesis horizontal. Se trabaja con el mismo protocolo de
electroforesis validado en los trabajos con la cepa ATCC 11632 y la cepa
ATCC 43300, es decir 70V, 70A y 50 W por 2 horas para lograr una
buena separación de los amplicones y la escalera alélica.
- 77 -
7.8.5 Flujograma de toma de muestras y extracciónde ADN
1 mlCaldo
TripticasaSoya
Tomar lamuestra
conhisopoestéril
Incubarpor 4
horas a37°C
Colocarel hisopo
en eltubo
Centrifugarpor 10
minutos a2500 rpm
Descartar elsobrenadante
Colocar50 µl desoluciónde lisis
Vortex,luegoebulliciónpor 15 min
Colocar450 µl de
aguaultrapura
Centrifugar 20 seg. a3000 rpm y congelar
hasta la PCR
Incubar enManitol por 24
horas a 37°C
Incubar enManitol por 24
horas más a 37°C
Antibiograma
Incubar en CTSpor 18 horas a
37°C
- 78 -
7.8.6 Flujograma de PCR
Preparación de master mixColocar 10µl demaster mixpor cadareacción
Agregar1,5 µldeprimerF y R
Añadir 5,5µl de agualibre deDNAsas
DarVortex
Dispensar18,5 µl demezcla encadapocillo
Adicionar1.5 µl deADN
Sellar yetiquetarLlevar al
termociclador
Revelar conelectroforesis
- 79 -
CAPÌTULO VIII
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
8.1 Resultados del Diseño Metodológico
Fig. 26. Staphylococcus aureus cepa ATCC 11632 en agar sangre.
Fig. 27 Resultado de PCR y electroforesis con el amplicón obtenido de la
cepa ATCC 11632.
- 80 -
Fig. 28. Staphylococcus aureus cepa ATCC 43300 en agar sangre.
Fig. 29. Resultado de PCR y electroforesis de la cepa ATCC 43300. Para
un volumen final de PCR de 20 µL se probó con volúmenes diferentes de
ADN (1 a 4 µL), obteniendo buena amplificación con todos los volúmenes.
Fig. 30. Resultado de la prueba de diferentes protocolos de amplificación.
- 81 -
Fig. 31. Electroforesis muestra presencia de los genes blaZ y nuc en lacepa ATCC 11632, amplicones del gen mecA y nuc en la cepa ATCC43300, amplicones de los genes blaZ, mecA y nuc en la muestra delmanipulador y ausencia de amplicones para los genes blaZ, mecA y nucen la cepa ATCC 12344 de Streptococcus pyogenes (control negativo).
8.2 Resultados de la Centrifugación.
Tras la centrifugación de las muestras incubadas por cuatro horas se
encontró pellet en 7 tubos y al realizar la centrifugación de los Eppendorf
de las mismas muestras incubados por 18 horas tenemos mayor
crecimiento.
Fig. 32 Tubos eppendorf con pellet que corresponden a las muestras 2,31, 33, 37, 39, 41 y 48.
- 82 -
Estos tubos son llevados para la extracción de ADN, posterior PCR y
finalmente Electroforesis horizontal.
8.3 Resultados de siembra en agar Manitol Salado.
Después de 24 horas de incubación a 37ºC, no hubo crecimiento en
ninguna de las 50 muestras sembradas en agar manitol.
Fig. 33. No se encuentra crecimiento en manitol salado tras 24 horas deincubación.
Se dejó incubar por 24 horas más y se revisó a las 48 horas de
incubación, encontrando crecimiento en las cajas correspondientes a las
muestras un número 2, 31 y 39, y que coinciden con las muestras que
presentaron pellet en el Caldo Tripticasa Soya.
- 83 -
8.4 Resultados de antibiograma, prueba de coagulasa y catalasa, delas muestras positivas para S. Aureus:
2 31 39
Fig. 35. Antibiograma de muestras positivas para Staphylococcus aureusse trabajó con los siguientes antibióticos: 1. Penicilina (P 10U), 2.Ceftriaxone (CRO 30 mcg), 3. Amoxicilina (AX 25mcg), 4. Netilmicina
Fig. 34 Tras 48 horas de incubación se aprecia poco crecimiento en 3muestras (número: 2, 31 y 39), lo que indica pocas colonias en lassuperficies donde se tomó las muestras.
- 84 -
(NET 30 mcg), 5. Cefuroxima (CXM 30 mcg), 6. Oxacilina (OX 1mcg), 7.Cloxacilina (CX 1mcg), 8. Meticilina (ME 5mcg), y 9. Vancomicina (VA30mcg). Se revela sensibilidad de la muestra #2 a: Penicilina, Amoxicilina,Netilmicina, Meticilina y Vancomicina; y resistencia a Cefuroxima,mientras que las Muestras # 31 y 39 presentan resistencia prácticamentea todos los antibióticos probados, apenas se aprecia un pequeño halo deinhibición alrededor de Netilmicina.
8.5 Resultados de electroforesis horizontal de muestras 2, 31 y 39.
Las muestras que resultaron positivas para Staphylococcus aureus tanto
en los métodos tradicionales como con PCR, fueron:
a) La muestra número 2 tomada de la Mascarilla de anestesia general
(azul) en el quirófano 1
b) La muestra número 31, tomada en el Equipo de intubación de la cama
1 de la sala de cuidados intensivos
c) La muestra número 39 tomada en el Equipo de succión de la cama 1
de la sala de cuidados intensivos
2 31 39
Fig. 36 Superficies que dieron positivo para S. aureus, en las muestras
tomadas
- 85 -
Fig.37. Electroforesis de amplicones del gen nuc, resultado de PCRcon 3µl y 4 µl de ADN extraído desde las muestras incubadas enCaldo Tripticasa Soya, se busca identificar la cantidad óptima de ADNpara amplificación. Se opta por trabajar con 4µl por que se obtieneresultados homogéneos.
Fig.38. Resultado de la Electroforesis en la que se puede identificaramplicones para los genes blaZ y mecA en las cepas control y lasmuestras 2, 31 y 39:
1.-El gen blaZ presente en la cepa ATCC 11632 (control positivo),muestra 31 y muestra 39 y ausente en la cepa ATCC 12344 deStreptococcus pyogenes (control negativo) y muestra 2.
2.- El gen mecA presente en la cepa ATCC 43300 (control positivo),muestra 31 y muestra 39; y ausente en la cepa ATCC 12344 deStreptococcus pyogenes (control negativo) y muestra 2.
- 86 -
Grafico 1: Muestras positivas para S. aureus de las muestras tomadas enel Hospital Docente Universitario Católico.
- 87 -
GEN nuc PRUEBASMICROBIOLÓGICAS
MUESTRAS POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO1 X X2 X X3 X X4 X X5 X X6 X X7 X X8 X X9 X X
10 X X11 X X12 X X13 X X14 X X15 X X16 X X17 X X18 X X19 X X20 X X21 X X22 X X23 X X24 X X25 X X26 X X27 X X28 X X29 X X30 X X31 X X32 X X33 X X34 X X35 X X36 X X37 X X38 X X39 X X40 X X41 X X42 X X43 X X44 X X45 X X46 X X47 X X48 X X49 X X50 X X
Cuadro 8: Concordancia 100% de los resultados por PCR y métodos
tradicionales en la identificación de S. aureus
- 88 -
Grafico 2: se aprecia presencia de los genes blaZ y mecA en los controlespositivos y las muestras # 31 y 39, y ausencia en la muestra 2 y controlnegativo.
8.6 Conclusiones.
1.- Utilizando como control positivo las cepas ATCC 11632 y 43300 de
Staphylococcus aureus y como control negativo la Cepa ATCC 12344 de
Streptococcus pyogenes, se implementó la técnica de Reacción en
Cadena de la Polimerasa para la detección de los genes blaZ y mecA en
S. aureus productores de β Lactamasa y PBP2a, encontrando que el
protocolo que logra la amplificación simultanea de los genes antes
mencionados más el gen “nuc” es el siguiente: 5 minutos a 94°C para la
desnaturalización inicial, seguido de 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C para
desnaturalización, 1 minuto a 54 °C para alineamiento y 1 minuto a 72 °C
para elongación. La elongación final fue de 10 minutos a 72 °C.
2.- De un total de cincuenta muestras tomadas en los quirófanos y salas
de cuidados intensivos del Hospital Universitario Católico de Cuenca,
mediante PCR se identificó en dos muestras los genes nuc, blaZ y mecA
ATCC11632
ATCC12344
Muestra2
Muestra31
Muestra39
IDENTIFICACION DEL GENblaZ
PRESENCIA AUSENCIA
ATCC43300
ATCC12344
Muestra2
Muestra31
Muestra39
IDENTIFICACION DEL GENmecA
PRESENCIA AUSENCIA
- 89 -
lo que indica que son cepas de Staphylococcus aureus productoras de β-
Lactamasas y PBP2a. Se encontró también una muestra positiva de S.
aureus sensible a los β Lactámicos, en la que se amplifica ni únicamente
el gen nuc, lo cual fue comprobado mediante los métodos tradicionales
como siembra en manitol y el antibiograma, así pues, se observó que la
PCR es un método 100% sensible y específico para detección de este
patógeno.
3.- Se estableció que el área más afectada por la presencia de
Staphylococcus aureus productores de β-Lactamasas y PBP2a en el
Hospital Universitario Católico de Cuenca, es la sala de cuidados
intensivos en donde se encontraron dos (muestras # 31 y 39) de las tres
muestras positivas del total de 50 muestras tomadas y la tercera muestra
positiva (muestra# 2) se encontró en una de las mascarillas de anestesia
general del quirófano # 1.
- 90 -
BibliografíaAna C. Blanco, M. S. (2005). Shock tóxico no menstrual por Staphylococcus aureus.
Arch.argent.pediatr, 426-429.
Antonina A Votintseva, R. F. (2014). Prevalence of Staphylococcus aureus protein A(spa)mutants in the community and hospitals in Oxfordshire. BMC Microbiology, 1-11.
Carlos Andrés Rodríguez, O. V. (2005 ). Staphylococcus aureus resistente a vancomicina.Biomédica , 575-587.
Castañón-Sánchez, C. A. (2012). Patogenia molecular de Staphylococcus aureus.Evidencia Médica e Investigación en Salud, 79-84.
Castellano González Maribel, P.-M. A. (2010). Mecanismos de resistencia a antibióticosb-lactámicos en Staphylococcus aureus. Kasmera, 18-35.
César Ignacio Ruano, J. C. ( de enero de 2004). Frecuencia de infección nosocomial enterapia intensiva: datos del proyecto PIN-FCM. Quito, Pichincha, Ecuador.
DEBORAH J. ZYGMUNT, C. W. (1992). Characterization of Four B-Lactamases Producedby Staphylococcus aureus. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,, 440-445.
ESTEVA, E. (2006). Infecciones oculares. OFFARM, 58-62.
Estrella Cervantes-García. (2014). Importancia de Staphylococcus aureus meticilinaresistente intrahospitalario y adquirido en la comunidad. Rev Latinoam PatolClin Med Lab, 196-204.
Estrella Cervantes-García, R. G.-G.-S. (2014). Características generales delStaphylococcus aureus. Revista Latinoamericana de Patología Clínica, 28-40.
Ewan M. Harrison, G. K. (2014). A novel hybrid SCCmec-mecC region in Staphylococcussciuri. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 911 –918.
Florence Depardieu, B. P. (2004 ). Detection of the van Alphabet and Identification ofEnterococci and Staphylococci at the Species Level by Multiplex PCR. Journal ofclinical microbiology, 5857–5860.
Foster, T. J. (2004). The Staphylococcus aureus “superbug”. The Journal of ClinicalInvestigation, 1693-1696.
Francisco Álvarez Lerma, M. P. (2006). Infecciones nosocomiales por Staphylococcusaureus en pacientes críticos en unidades de cuidados intensivos. MedicinaClínica, 641-646.
- 91 -
García, C. A. (2014). Foliculitis infecciosas. (Parte I). Rev Cent Dermatol Pascua, 90-98.
Geo. F. Brooks, K. C. (2011). Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg.México, D.F.: McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A.
Gerardo Becerra, A. P. (2009). Mecanismo de resistencia a antibacterianos en bacterias.Enfermedades Infecciosas y Microbiología, 70-76.
GIL, M. (2000). Staphylococcus aureus: microbiología y aspectos moleculares de laresistencia a la Meticilina. Rev Chil infect, 145-152.
Guadalupe Zendejas-Manzo, H. A.-F.-P. (2014). Microbiología general de Staphylococcusaureus: Generalidades, patogenicidad y métodos de identificacion. Rev Biomed,129-143.
GUERRER-FERNANDEZ, J. (2002). Síndrome de la Escaldadura Estafilocócica. Revista WebPediatrica.com, 1-3.
GUERRER-FERNANDEZ, J. i. (01 de abril de 2002). Revista Web PEDiatrica.com.Recuperado el 21 de mayo de 2016, de Revista Web PEDiatrica.com:http://www.webpediatrica.com/casosped/pdf/10_ssss.pdf
Inbal Braunstein, K. W. (2014). Antibiotic Sensitivity and Resistance Patterns in Pediatric.Pediatr Dermatol, 305-308.
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN. (1 de SEPTIEMBRE de 2013). NTE INEN1529-1. QUITO, PICHINCHA, ECUADOR.
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN. (1 de SEPTIEMBRE de 2013). NTE INEN1529-14. QUITO, PICHINCHA, ECUADOR.
IOWA STATE UNIVERSITY. (2011). Staphylococcus aureus resistente a la meticilina MRSA.THE CENTER FOR FOOD SECURITY & PUBLIC HEALTH, 1-27.
Jaime A. Bustos-Martínez, A. H.-P.-C. (2006). Staphylococcus aureus: la reemergencia deun patógeno en la comunidad. Rev Biomed, 287-305.
Jesus Saavedra, M. S. (2011). Infecciones bacterianas de la piel y tejidos blandos.Procolos Diagnostico-Terapeuticos de la AEP: Infectología Pediátrica, 159-175.
Jimei Du, C. C. (2011). Molecular Characterization and Antimicrobial Susceptibility ofNasal Staphylococcus aureus Isolates from a Chinese Medical College Campus .PLOS one, 1-5.
John Elmerdahl Olsen, H. C. (2006). Diversity and evolution of blaZ from Staphylococcusaureus and coagulase-negative staphylococci. Journal of AntimicrobialChemotherapy, 450-460.
- 92 -
José Mensa, A. S. (2013). Guía de tratamiento antimicrobiano de la infección porStaphylococcus aureus. Rev Esp Quimioter , 1-84.
Josep Mensa, J. B. (2008). Guía de tratamiento de la infección producida porStaphylococcus aureus resistente a meticilina. Revista Española deQuimioterapia, 234-258.
Leonardo Sánchez–Saldaña, E. S.-A. (2006). INFECCIONES CUTÁNEAS BACTERIANAS.Dermatología Peruana , 7-31.
Lismay González Reynosa, O. U. (2001). SEPSIS ESTAFILOCÓCICA. Revista Cubana deEnfermería, 95-100.
Luis Esaú López-Jácome, M. H.-D.-C. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio demicrobiología. Investigación en Discapacidad, 10-18.
Martin K. Safo, Q. Z. (2005). Crystal structures of the BlaI Repressor from Staphylococcusaureus and its complex with DNA: insights into transciptional regulation of thebla and mec operons. Journal of Bacteriology, 1833-1844.
Michael C. Hudson, W. K. (1999). Staphylococcus aureus adhesion to bone matrix andbone-associated biomaterials. FEMS Microbiology Letters, 279-284.
Mogahid M. Elhassan, H. A. (2015). Absence of the mecA Gene in Methicillin ResistantStaphylococcus aureus Isolated from Different Clinical Specimens in Shendi City,Sudan. BioMed Research International, 1-5.
ODD G. BRAKSTAD, K. A. (1992). Detection of Staphylococcus aureus by PolymeraseChain Reaction Amplification of the nuc Gene. JOURNAL OF CLINICALMICROBIOLOGY, 1654-1660 .
Patrick R. Murray, K. S. (2014). Microbiología Médica. Barcelona: ELSEVIER.
Ricardo Arteaga Bonilla, R. A. (2005). Infecciones estafilocócicas. Revista de la SociedadBoliviana de Pediatría, 177-180.
S.J.Rowland, K. (1989). Characterization of the staphylococcal B-lactamase transposonTn552. The EMBO Journal, 2761-2773.
Salud, O. M. (2003). Prevención de las infecciones nosocomiales, Guía Práctica.Organización Mundial de la Salud, 71.
Sandra Rincon, J. R. (2012). Cefazolin high-inoculum effect in methicillin-susceptibleStaphylococcus aureus from South American hospitals. Journal of AntimicrobialChemotherapy, 2773-2778.
Seija, V. (2006). Género Staphylococcus. Temas de Bacteriología y Virología médica, 257-271.
- 93 -
Simon R. Clarke, K. G. (2001). The signal transducer (BlaRI) and the repressor (BlaI) of theStaphylococcus aureus b-lactamase operon are inducible. Microbiology, 803–810.
Sociedad Española de Quimioterapia (SEQ), Sociedad Española de Medicina Interna(SEMI). (2006). Guía de tratamiento de las infecciones de piel y tejidos blandos.Rev Esp Quimioterap, 378-394.
Tamay de Dios L, I. C. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa(PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en Discapacidad, 70-78.
Velázquez-Meza, M. E. ( 2005). Surgimiento y diseminación de Staphylococcus aureusmeticilinorresistente. Salud Publica de México, 381-387.
VILA MAS, A. (2003). Foliculitis y forunculosis. Clínica y tratamiento. FARMACIAPROFESIONAL, 78-80.
- 94 -
Anexos.QUIRÓFANO 1
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15
- 95 -
QUIRÓFANO 2
16 17 18 19
20 21 22 23
24 25 26 27
28 29 30
- 96 -
CAMAS 1 Y 2 DE LA SALA DE CUIDADOS INTENSIVOS
31 32 33 34
35 36 37 38
39 40 41 42
43 44 45 46
- 97 -
47 48 49 50