UNIVERSIDAD DE COLIMA Tesis para obtener el grado de ...

Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus

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UNIVERSIDAD DE COLIMA

Tesis para obtener el grado de:

Presenta:

Asesores:

Colima, Col., a 30 de Julio del 2002

U de C U de C

U de C U de C

U de C U de C

U de C U de C


2

Guadalajara, Jalisco a 10 de Julio del 2002.

C. Dr. Benjamín Trujillo

Coordinador de Posgrado

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas Universidad de Colima

Por medio de la presente, le informo que el médico especialista José Manuel

Ornelas Aguirre, alumno del programa de posgrado de la Maestría en Ciencias Médicas de la

generación 2000-2002 ha concluido la escritura de su tesis y otorgo mi autorización para su

presentación y de defensa de la misma.

Sin otro asunto por el momento, me despido de usted y quedo a sus órdenes para

cualquier aclaración al respecto.

Atentamente

Investigador asociado "D"

Unidad de Investigación en Epidemiología Clínica.IMSS


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"ALTERACIONES MORFOLÓGICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS EN HIPERTENSIÓN ARTERIAL PULMONAR EN AUTOPSIAS DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO"

Tesis para obtener el grado de:

Maestro en Ciencias Médicas

Presenta:

Médico Patólogo José Manuel Ornelas Aguirre. Asesores:

M. en C. Jorge Iván Gamez Nava (Clínico) D. en C. José Clemente Vázquez Jiménez (Básico)

Co-asesores: Médico Patólogo Gonzalo Vázquez Camacho.

Médico Patólogo Teresita Plasencia. M. en C. Laura del Carmen González López

Colima, Col. A 30 de Julio del 2002.


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AGRADECIMIENTOS:

Con todo respeto a mis profesores y asesores a quien agradezco su apoyo incondicional e

invaluables enseñanzas en los muchas veces difíciles caminos de la investigación

M. en C. Jorge Iván Gamez Nava D. en C. José Clemente Vásquez Jiménez

Muy especialmente a quienes viven entregados a la investigación científica en el Instituto

Mexicano del Seguro Social

Dr. Jesús García Pérez, Dra. Ana María Contreras y M. en C. Mario Salazar Páramo

De manera muy especial a mis profesores en el departamento de Patología del Hospital de Especialidades en el Centro Médico de Occidente (HECMNO) del IMSS:

Médicos Patólogos Dr. Gonzalo Vázquez Camacho, Dra. Teresita J. Plasencia y Dra.

Claudia Velásquez García

Con mucho agradecimiento a quien apoyó en el Hospital General Regional #110 del IMSS y colaboró con sus importantes consejos y observaciones estadísticas en la realización de esta

tesis:

M. en C. Laura del Carmen González López

Respetuosamente a mis profesores en el Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Colima:

D. en C. Benjamín Trujillo Hernández, M. en C. Cuauhtémoc Acoltzin Vidal, M. en C.

Oscar Uribarren Berrueta y al médico Hematólogo Dr. Ernesto Reynoso Zuñiga

Un agradecimiento muy especial a quienes colaboraron de forma importante en la técnica de inmunohistoquímica en el laboratorio del departamento de Patología del HECMNO:

Tec. Hist. Gabriela Blancas

Tec. Hist. Juan Manuel Álvarez Pérez

Tec. Hist. Brenda Eunice Martínez Romero

Por último, la realización de éste trabajo hubiera sido imposible sin el apoyo económico

proporcionado por el Fondo de Fomento a la Investigación Científica (FOFOI) del IMSS, en el programa de apoyo a Maestrías y Doctorados (FP-0038-240)


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ÍNDICE Índice de cuadros y figuras……………………………………………………………………………………6

Abreviaturas ……………………………………………………………………………………………..8

Resumen / Abstract………………………………………………………………………………9-10

Introducción....................................................................................................................................................11

Antecedentes..................................................................................................................................................12

Justificación................................................................................................................................................... 22

Pregunta de Investigación e hipótesis.......................................................................................................23

Objetivo general y particulares .................................................................................................................. 23

Material y métodos ......................................................................................................................................24

Resultados................................................................................................................................................ 3 0

Discusión....................................................................................................................................................... 48

Conclusiones .................................................................................................................................................54

Anexos..................................................................................................................................................... 55

Bibliografía................................................................................................................................................... 6 7


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ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS: Cuadro 1. Constituyentes de la matriz extracelular del parénquima pulmonar…………………...13 Cuadro 2. Principales causas del desarrollo de la Hipertensión Arterial Pulmonar…………………..14

Figuras 1-4. Diversos grados de Hipertensión Arterial Pulmonar……………………………….15

Cuadro 3. Principales Características Histopatológicas en la HAP………………………………….17

Figura 5. Representación de la técnica inmunohistoquímica para la avidina-biotina…………….19

Tabla 1. Características de los pacientes estudiado……………………………………………30

Figura 6. Principales síntomas encontrados en los casos con LES estudiados………………………31

Tabla 2. Principales características pulmonares en los pacientes estudiados……………………...32

Figura 7. Principales características pulmonares en los casos de LES/HAP estudiados…………….. 33

Tabla 3. Grado de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) en los pacientes con LES……………….34 Figura 8. Grado de Hipertensión Arterial Pulmonar según Heat-Edwards………………………….34 Tabla 4. Características de la inmunohistoquímica en el intersticio del tejido pulmonar de los casos con y sin HAP…………………………………………………………………….35 Figura 9. Positividad intersticial para los reactivos estudiado…………………………………...36 Tabla 5. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP……………………………………………………37 Figura 10. Grados de positividad intersticial en la inmunohistoquímica (a/b)……………………38 Tabla 6. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP……………………………………39 Figura 11. Grados de positividad intersticial en la inmunohistoquímica. (a/b)…………………...40 Tabla 7. Características de la inmunohistoquímica en las arterias del tejido pulmonar de los casos con y sin HAP…………………………………………………………………………………… 41 Figura 12. Positividad arterial para los reactivos estudiados…………………………………….42 Tabla 8. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP…………………………………43


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Figura 13. Grados de positividad arterial en la inmunohistoquímica(a/b)…………………………44 Tabla 9. Comparación del nivel de tinción en el intersticio del tejido pulmonar de los pacientes con LES estudiados en relación al desarrollo de HAP ………………………………………………...45 Figura 14. Grados de positividad arterial en la inmunohistoquímica.(a/b) ……………………46 Tabla 10. Correlación entre el grado de Hipertensión Arterial Pulmonar según la gradificación de Heat-Edwards y el grado de la tinción intersticial de los diferentes reactivos entre los casos con LES estudiados………………………………………………………………………………………… 47 Anexo I. Criterios revisados para la clasificación de Lupus Eritematoso Sistémico……………...55 Anexo II. Clasificación de Heat-Edwards para la arteriopatía pulmonar plexogénica……………..56 Anexo III. Hoja de recolección de datos………………………………………………………57 Anexo IV. Fotografías microscópicas………………………………………............................63


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ABREVIATURAS: APP; Arteriopatía plexogénica pulmonar FCVE: Factor de Crecimiento Vascular Endotelial HAP; Hipertensión arterial sistémica HPP; Hipertensión arterial primaria gr.; Peso en gr. IgG; Inmunoglobulina-G IgM; Inmunoglobulina-M LES; Lupus eritematoso sistémico OR: Odds ratio (razón de momios) (r); Prueba de correlación de Sperman (rho) X2; prueba de Ji cuadrada


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RESUMEN:

INTRODUCCIÓN: Pocos estudios han evaluado las características inmunohistoquímicas de la

Hipertensión Arterial Pulmonar en el Lupus Eritematoso Sistémico (HAP-LES).

OBJETIVO: Evaluar las características inmunohistoquímicas de la HAP-LES.

MÉTODOS: En un estudio de casos y controles, seleccionamos de las autopsies de 1984 al

2001, 11 casos con HAP-LES, 7 controles con LES sin HAP y 9 controles sin enfermedad

pulmonar. Se realizó un análisis morfológico e inmunohistoquímico para Tenascina-C, Laminina,

Fibronectina, Inmunoglobulinas, Serotonina y CD-34.

RESULTADOS: Los casos con LES-HAP se diferenciaron de los controles sin LES en la

frecuencia e intensidad para la Tenascina-C (p=0.003) y Serotonina (p=0.035). La tinción para

Tenascina-C se incrementó en pacientes con HAP-LES en comparación con casos de

LES sin HAP (p=0.025). Una correlación positiva se observó entre el grado de HAP (Heat-

Edwards) con la intensidad para la Tenascina-C (rho=0.43, p=0.03) y Colágena IV (rho--0.47,

p=0.02) en la inmunohistoquímica arterial.

DISCUSIÓN: La Tenascina-C puede jugar un papel importante en la patogénesis de la HAP

en LES. Se requieren otros estudios, para evaluar la consistencia de nuestros hallazgos.

PALABRAS CLAVE:

Hipertensión Arterial Pulmonar, Lupus Eritematoso Sistémico, Inmunohistoquímica, Tenascina-C.


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ABSTRACT:

INTRODUCTION: Few studies have evaluated the immunohistochemical characteristics of the

Pulmonary Hypertension secondary to Systemic Lupus Erythematosus (PH-SLE).

OBJECTIVE: To evaluate the immunohistochemical characteristics of PH- SLE.

METHODS: In a case-control study, we selected from the autopsies of 1984 to 2001, 11 cases

with PH-SLE, 7 controls with SLE non-PH, and 9 controls without pulmonary disease.

Morphological and immunohistochemical studies were performed. We compared presence and

intensity of Tenascin-C, Colagen IV, Laminin, Fibronectin, Immunoglobulins, Serotonin, and

CD-34, among cases and controls.

RESULTS: PH-SLE differed from controls without SLE in the frequency and intensity of

Tenascin-C (p=0.003) and Serotonin (p=0.035). The stain for Tenascin-C was increased in

patients with PH associated to SLE in comparison with non-PH SLE (p=0.025). A positive

correlation was observed between the grade of PH in the Heat-Edwards scale with the grade of

Tenascin-C (rho=0.43, p=0.03) and Collagen IV (rho=0.47, p=0.02) in the arterial

immunohistochemical stain.

DISCUSSION: Tenascin-C and Collagen IV may play an important role in the pathogenesis of

PH-SLE. Further studies are required to evaluate the consistency of our findings.

KEY WORDS:

Arterial Pulmonary Hypertension, Systemic Lupus Erythematosus, Immunohistochemical stain,

Tenascin-C.


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INTRODUCCIÓN:

El Lupus Eritematoso Sistémico (LES) es una enfermedad multisistémica del tejido

conectivo que en sus complicaciones frecuentemente engloba diversos sistemas y órganos

blanco1. A este respecto, la afección del sistema cardiovascular se asocia a desenlaces más

graves y provoca una mayor morbi-mortalidad. Una de las complicaciones en estos pacientes es el

desarrollo de Hipertensión Arterial Pulmonar con desenlaces fatales a corto plazo.

La inquietud por la realización de esta tesis se dirigió a dilucidar las características

morfológicas e inmunohistoquímicas relacionadas al desarrollo de la Hipertensión Arterial

Pulmonar en estos pacientes.

El presente estudio se realizó en tejidos procedentes de autopsias con diagnóstico de

LES. Diversos fueron los factores en contra que tuvimos que afrontar en la realización de este

trabajo, siendo principalmente: 1) el trabajar con tejidos fijados en parafina por largo tiempo

que podía haber causado una pérdida en la respuesta a los anticuerpos ensayados, y 2) pérdida de

información en expedientes clínicos.

El primer factor se logró vencer con la búsqueda sistematizada de los casos, tratando

de contar con tejidos en el mejor estado de conservación y lo más reciente posible; además

de una adecuada estandarización en la técnica de inmunohistoquímica y el desenmascaramiento

por calor a presión que devolviera la antigenicidad perdida a los tejidos analizados, por último, el

segundo factor en contra se solucionó creando una hoja de recolección adecuada que nos

permitiera capturar de una manera sistemática y eficiente la información requerida.

Es por lo tanto, la presente tesis el producto del esfuerzo conjunto del investigador

principal y colaboradores que contribuyeron en gran medida para el éxito en su realización.


12

ANTECEDENTES:

1. Generalidades del Lupus Eritematoso Sistémico:

Dentro de las enfermedades difusas del tejido conectivo, el Lupus Eritematoso

Sistémico (LES) es el prototipo clásico de una enfermedad multisistémica de origen

autoinmunitario y crónica, de causa desconocida y que en su desarrollo involucra a

cualquier órgano vinculado a fenómenos de autoinmunidad 1.

El comienzo puede ser agudo, siendo generalmente una enfermedad crónica,

recidivante y a menudo febril. Se caracteriza principalmente por lesiones cutáneas, articulares,

renales y serosas2. La expresión clínica de la enfermedad tiene un amplio rango de severidad

y una alta mortalidad, en esta última las infecciones oportunistas y la afección a órgano

mayor son los principales factores implicados3. Alrededor del 50-70% de los casos con

LES desarrollan manifestaciones pleuropulmonares durante el curso de su enfermedad las

cuales incluyen: pleuritis con o sin derrame, neumonitis intersticial y alveolitis fibrosante 4.

2. Hipertensión Arterial Pulmonar en Lupus Eritematoso Sistémico

Diversos estudios demuestran que la presencia de afección del sistema

cardiovascular y respiratorio en estos pacientes, juega un impacto negativo en la

sobrevida y se acompaña de forma frecuente de complicaciones severas a los pocos años

de padecer la enfermedad dentro de las cuales, se encuentra el desarrollo de la Hipertensión

Arterial Pulmonar (HAP) cuya principal característica es la resistencia al flujo de la

circulación en el lecho pulmonar.

La HAP asociada a enfermedades autoinmunes ha sido más frecuentemente descrita en

la enfermedad mixta del tejido conectivo y esclerodermia (CREST). Sin embargo; su

relación con el LES ha sido considerada como rara 5. Algunos estudios transversales y de

cohorte han mostrado que la HAP se presenta del 9 al 25% de los pacientes con LES 5-7.

Alguna vez fue considerada como una entidad raramente diagnosticada en vida, debido a

que en fases iniciales los pacientes se muestran asintomáticos y no es sospechada esta entidad

hasta que se presentan grados mayores de severidad durante el curso de su enfermedad 8-10.


13

Actualmente, la prevalencia de HAP se ha obtenido en estudios más amplios usando

ecocardiograma Doppler como método no invasivo, se considera que está en personas que sufren

la enfermedad, va desde el 9 al 43% 5,11.

2. El Pulmón en la Hipertensión Arterial Pulmonar:

El pulmón es un órgano clave en la génesis de la hipertensión pulmonar de origen

secundario. El pulmón normal microscópicamente tiene una estructura característica. Tanto el

intersticio, el epitelio bronquial, el endotelio vascular y la pleura tienen su principal función en

servir como medio de separación y sustentación de la estructura del pulmón, su principal

constituyente es el tejido conectivo. Los componentes normales del pulmón y las substancias que

son liberadas del mismo pueden verse modificadas durante los procesos inflamatorios. Estos

componentes y sustancias son mencionadas en el Cuadro 1: un desequilibrio de estos

componentes puede modificar algunos aspectos de la función normal pulmonar.


14

4. Etiología de la Hipertensión Arterial Pulmonar:

Para entender la Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) en lupus eritematoso

sistémico, es primero necesario revisar los conceptos generales de la HAP y sus causas. La

HAP es un síndrome cuya característica es el incremento sostenido de presión en las

arterias pulmonares que lleva a una resistencia al flujo de la circulación del lecho

pulmonar 5 y que puede ocurrir como resultado de diversas enfermedades, las principales se

encuentran referidas en el cuadro 2. Resulta de una gran variedad de estímulos iniciadores,

histológicamente se encuentra (1) muscularización de arteria periféricas, normalmente no

musculares y debido a la diferenciación de pericitos, (2) hipertrófia de la túnica media y

formación una neoíntima en arteria musculares, como consecuencia de la hipertrófia,

proliferación y migración de células musculares lisas residentes con un incremento en la

producción de los componentes de la matriz extracelular (colágena, elastina, fibronectina y

tenascina-C) 12-13,. Todo lo anterior, conlleva a un incremento de los componentes normales

del vaso sanguíneo, con una disminución en su luz, así como lesiones plexiformes

(rugosidades y tortuosidades del vaso sanguíneo con cambios angiomatoides-

neovascularización) las cuales están constituidas primariamente por células endoteliales. (Ver

figuras 1-4).


15

En el caso de lupus eritematoso sistémico, la causa de la hipertensión arterial

pulmonar aún no ha sido totalmente dilucidada. Son 4 las principales teorías acerca

de su patogénesis: 1)La teoría del fenómeno de inmunocomplejos, en la cual la

presencia de autoanticuerpos inicia una reacción inflamatoria al depositarse en la luz

arterial; 2)La teoría de la enfermedad trombótica arterial, en la cual anticuerpos como

el anticardiolipina y el anticoagulante lúpico desarrollan fenómenos de microtrombos

que ocluyen la luz de arteriolas pulmonares, generando mayor resistencia al flujo.

3)La teoría de la liberación de substancias vasoconstrictoras y proliferativas del endotelio


16

vascular y la túnica media, que desencadena una respuesta proliferativa que gradualmente

ocluye las arteriolas y arterias pulmonares con fenómenos de neoformación vascular e

incremento de la presión pulmonar. Por último, 4)La teoría de la respuesta proliferativa vascular

en respuesta a un aumento de la resistencia a nivel alveolar, en esta teoría la fibrosis pulmonar

que desarrollan algunos pacientes lleva a un aumento en la resistencia al flujo vascular y al

desarrollo de hipertensión pulmonar secundaria. Más que una sola teoría estos aspectos

pueden ser complementarios y todos ellos constituyen una hipótesis de un proceso

autoinmune desconocido aún, que lleva al desarrollo de la hipertensión.

5. Detección de Hipertensión Arterial Pulmonar en Clínica

Las manifestaciones clínicas de los pacientes con HAP en LES son similares a las

de los de otros tipos de Hipertensión Pulmonar, inicialmente pueden ser asintomáticos, ser

detectados por estudios de gabinete especiales o de forma tardía por medio de la realización

de cateterismo cardíaco, cuando ya se han desarrollado síntomas de una insuficiencia

cardiaca derecha(ICD)5,9,11. Entre los síntomas que sugieren HAP se encuentran la disnea,

ortopnea, síncope de esfuerzo, dolor torácico y de manera menos frecuente aparece tos,

hemoptisis y muerte súbita, que se pueden presentar sobre todo en aquellos pacientes con

HAP muy grave12. Uno de los graves problemas relacionados a la HAP en LES, es su

asociación con una mayor mortalidad a corto plazo; sugiriéndose en la actualidad que, una

vez establecido el diagnóstico de HAP el promedio de vida es de 2 años 12-14.

6. Características Microscópicas de la HAP:

En estudios de microscopia de luz, la HAP de los pacientes con lupus eritematoso

sistémico es muy similar a la forma primaria de la HAP. La forma primaria ha sido clasificada en

3 tipos los cuales son descritos en el Cuadro número 3:


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Dentro de las características microscópicas observadas en la HAP primaria se

incluye el daño vascular a pequeñas y medianas arteriolas manifestada por una

Arteriopatía Plexogénica Pulmonar caracterizada por la presencia de necrosis fibrinoide

en la pared arterial 15-17. La Hipertensión Pulmonar Primaria (HPP) puede presentar una

elevada frecuencia de anticuerpos antinucleares y dirigidos a las colágenas tipos I, III y

IV 18-19 . Las teorías actuales en relación a la patogénesis de la HPP han sido

enfocadas a las anormalidades de la interacción entre las células endoteliales y

musculares de los vasos sanguíneos pulmonares, con un desequilibrio de los mediadores

inflamatorios, favoreciendo la vasoconstricción y otras alteraciones 20-22.

A este respecto, los estudios inmunohistoquímicos que han sido realizados a

nivel vascular pulmonar en la HPP sugieren, que tanto la expresión de la síntesis del óxido

nítrico y la excreción de metabolitos activos de la prostaciclina, se encuentra disminuida en

las arterias pulmonares de pacientes con HPP.


18

Otros estudios en cambio señalan, un incremento en la expresión de otras

substancias como la endotelina-1 23, la cual puede producir un incremento en el tono

arterial, con el desarrollo de vasoconstricción y proliferación de células musculares lisas,

lo que ya ha sido demostrado por la presencia de endotelina-1 en células alveolares de

pacientes con fibrosis pulmonar. Otras sustancias como Serotonina, Fenfluramina,

Dexfenfluramina, Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (FCVE), Mitógeno

Endotelial Celular Específico, Citocinas y diversos factores de crecimiento celular han

sido también asociadas al desarrollo de HPP, debido a que pueden provocar

estimulación en la emigración y multiplicación y elaboración de la matriz extracelular de

las células musculares lisas en los vasos sanguíneos1,14,24.

7. El diagnóstico inmunohistoquímico:

Desde los inicios de la patología, se ha reconocido la necesidad de una adecuada

validación de los juicios morfológicos, para lo cual diversos métodos especiales han sido

desarrollados para facilitar el reconocimiento celular y establecer mejores diagnósticos.

Inicialmente se desarrolla la inmunofluorescencia por Conos y cols. (1941),

posteriormente fue utilizada por Fagraeus en 1948 y otros investigadores, cimentaron las

bases para el desarrollo de la inmunopatología. En un principio, la inmunofluorescencia no

tuvo gran difusión debido a su baja resolución morfológica y a la imposibilidad de aplicarse

como método de rutina en el estudio de tejidos fijados en parafina (Taylor y cols, 1983). Lo

anterior, obligó a la búsqueda de nuevas técnicas que pudieran evitar los problemas

antes referidos y fue hasta el año de 1974 cuando fue realizada la técnica de

inmunohistoquímica por Taylor y Burns, que podía ser utilizada en tejidos fijados en

parafina 25. Estos métodos inmunoenzimáticos se basan en la unión entre una enzima

activa a un anticuerpo específico (avidina), que posteriormente y mediante la utilización

de otra enzima (biotina) producen una reacción colorimétrica visible en el substrato y en

los sitios de localización del complejo enzima-anticuerpo dentro del tejido de estudio. Las

enzimas más utilizadas para este fin son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la glucosa-

oxidasa 26.

Las ventajas que ofrece la inmunohistoquímica son una sensibilidad y

especificidad de más del 75% a pruebas de material de rutina y su compatibilidad con la

mayoría de las sustancias de fijación de tejidos26-27 .En teoría, cualquier sustancia que sea

antigénica y que dicha antigenicidad sea al menos parcialmente retenida en los cortes


19

de tejido puede ser determinada por inmunohistoquímica. Para la tinción de

inmunohistoquímica varios procedimientos son disponibles actualmente, los dos más

comúnmente utilizados son: 1)peroxidasa-antiperoxidasa y 2)avidina-biotina (Fig. 5).

La avidina es una glucoproteína básica con un peso molecular de 68,000

daltons y cuatro sitios de alta afinidad para la biotina (vitamina de un peso molecular de

244,000), éstas al unirse a la peroxidasa le confieren una reacción de tinción más intensa

debido a la actividad de la peroxidasa.

Figura 5. Representación de la técnica inmunohistoquímica para la avidina-biotina.

Modificado de: Shan-Rong S, Richard JC, Clive RT. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry

1997;45: 327-344.

Un problema común en la realización de estas técnicas lo constituyen la

desnaturalización, la naturaleza y estructura tridimensional de los receptores antigénicos

por los métodos comunes de fijación, procesamiento y conservación del tejido en

parafina 27. En general, los antígenos que se encuentran presentes en una alta

concentración dentro del citoplasma son mejor preservados durante la fijación con

formol, en cambio los de superficie son más comúnmente enmascarados o

desnaturalizados y esto puede ir aumentando en relación directamente proporcional al

tiempo de fijación y de almacenamiento utilizados. Sumado a lo anterior, en los tejidos

de autopsia, la presencia de la anoxia terminal al momento de la muerte con disminución

del pH intracelular provoca la desnaturalización de algunas proteínas estructurales.


20

No todos los antígenos son susceptibles de esta desnaturalización por anoxia, lo

cual depende principalmente de: l) una adecuada difusión del fijador (4-6hrs) dentro del

tejido (a este respecto el pulmón tiene una adecuada capacidad de fijación) y 2) el tipo

y tamaño del tejido (mejores resultados se obtienen con fragmentos pequeños).

Para tratar de disminuir los efectos deletéreos en los antígenos, se utilizan en

la actualidad diferentes métodos para lograr una recuperación antigénica

(desenmascaramiento o restauración) con un aumento de su expresión inmunológica

mediante la incubación con enzimas proteo-líticas (Tripsina), tratamiento con álcalis

fuertes (solución de Hidróxido de sodio-NaOH y metanol) o la elevación de la

temperatura de los tejidos mediante calor a presión (el método más efectivo) 28-29.

8. Inmunohistoquímica en la Hipertensión Arterial Pulmonar y Lupus eritematoso

Sistémico:

Poca información existe acerca de las características inmunohistoquímicas de los

pulmones y arterias pulmonares de pacientes con lupus eritematoso sistémico, menos

información existe acerca de estas características en pacientes con hipertensión pulmonar

en esta patología. Esta falta de información se debe a que fue considerada una entidad

rara y pocos esfuerzos se han realizado para su estudio.

Los estudios de autopsias pulmonares hacen énfasis principalmente en

características histomorfológicas y no en las características inmunohistoquímicas.

Quismorio y sus colaboradores reportaron en 3 pacientes con lupus e hipertensión arterial

pulmonar, el depósito de inmunocomplejos en el endotelio arterial pulmonar, lo que

constituye un apoyo a la hipótesis de autoinmunidad. Otros autores han encontrado el

inmunocomplejo DNA-antiDNA en estas paredes, en autopsias de pacientes con

hipertensión arterial pulmonar y lupus eritematoso sistémico. Aun en otras

enfermedades con hipertensión pulmonar, solo poca información existe de sus

características inmunohistoquímicas.


21

La substancia más estudiada ha sido la endotelina-1, donde algunos datos sugieren

un incremento de la endotelina-1 en las células endoteliales de las arterias pulmonares de

pacientes con engrosamiento de la media y fibrosis de la íntima. Sin embargo, otras

substancias como la Tenascina-C, la cual es una glicoproteína de la matriz

extracelular que predomina en tejidos embriónicos y adultos en constante

remodelación (Chiquet-Ehrismann et al, 1995), han sido relacionada a proliferación,

diferenciación, migración celular y apoptósis 30, así como participación en la

neoformación vascular en tumores y otros procesos 31-32 no ha sido estudiada por

inmunohistoquímica en la hipertensión pulmonar.


22

JUSTIFICACIÓN

El LES puede cursar con afectación vascular pulmonar durante su evolución, los

pacientes suelen cursar con diferentes manifestaciones clínicas que hacen diferente el

pronóstico, destacando por su severidad la HAP, considerada de mal pronóstico, con un

promedio de vida de 2 años posterior al diagnóstico. Recientes estudios denotan que

algunos pacientes pueden tener un pronóstico medianamente más favorable, si son

detectados en etapas tempranas de la enfermedad 11,14. Sin embargo, a pesar de que

cada vez se diagnostica con mayor frecuencia, no es conocido porque en algunos

pacientes con LES se encuentra el desarrollo de HAP mientras que en otros no 5.

Se han postulado diversas teorías para el desarrollo de HAP en lupus eritematoso

sistémico, dentro de los que se ha sugerido la intervención de diferentes mecanismos

productores de la lesión vascular. Desde el punto de vista inmunohistoquímico

y morfológico la comparación entre pacientes que habían desarrollado HAP y los que no

la desarrollaron no se ha establecido claramente 33.

Este trabajo evalúa las características morfológicas e inmunohistoquímicas en

tejido vascular y del parénquima pulmonar proveniente de autopsias de pacientes con lupus

eritematoso sistémico con HAP y las compara con pacientes con LES sin HAP y con controles sin

patología autoinmune. El hallazgo de las diferencias inmunohistoquímicas en algunas

substancias potencialmente implicadas en la teoría de formación neovascular y

proliferación de células endoteliales tales como; Tenascina-C y Endotelina-1, pueden

llevar a un mejor entendimiento de la patogénesis de la hipertensión pulmonar y la lesión

parenquimatosa pulmonar en LES, que a futuro pueda brindar un soporte a tratamientos

más tempranos, que puedan detener la progresión de la hipertensión pulmonar en estos

pacientes.


23

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN:

¿Cuáles son las características inmunohistoquímicas intersticiales y vasculares

del parénquima pulmonar que distinguen a pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico

con Hipertensión Arterial Pulmonar de pacientes sin hipertensión arterial pulmonar?

HIPÓTESIS:

Existen alteraciones inmunohistoquímicas distintivas en los pacientes con lupus

eritematoso sistémico que tienen hipertensión arterial pulmonar de pacientes que no

presentaron esta entidad.

OBJETIVO GENERAL:

Comparar características morfológicas e inmunohistoquímicas del parénquima y

tejido vascular pulmonar en pacientes con lupus eritematoso sistémico con hipertensión

pulmonar comparado a pacientes sin hipertensión pulmonar.

OBJETIVOS PARTICULARES:

1.- Evaluar las características morfológicas del daño vascular pulmonar en

pacientes con LES asociados a HAP y compararlas con las encontradas en pulmones sanos.

2.- Evaluar las características inmunohistoquímicas del daño vascular pulmonar

en pacientes con LES, su asociación al desarrollo de HAP y en comparación con pulmones sanos.

3.- Analizar los cambios morfológicos e inmunohistoquímicos en el parénquima pulmonar

(Neumonitis, Infecciones oportunistas, poliserosítis, etc.) en LES asociado al desarrollo de

HAP y en comparación con pulmones sanos.


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MATERIAL Y MÉTODOS:

1. Tipo de estudio y selección de los sujetos de estudio:

En un estudio de casos y controles se seleccionaron para el grupo a estudiar a todas las

autopsias realizadas en un periodo de 17 años (1984-2001) con diagnóstico de LES con o

sin diagnóstico previo de HAP según los criterios del Colegio Americano de Reumatología

de 1982 34. Lo anterior, debido a que la presencia del desarrollo de HAP en enfermos

con Lupus Eritematoso Sistémico es de alrededor del 1% y en la población sana (HAP de origen

no autoinmune) es de alrededor del 0.0002%.

Para el grupo control sin enfermedad autoinmune se seleccionaron autopsias de

pacientes sin diagnóstico de enfermedad autoinmune en el expediente clínico, donde la

causa de muerte hubiera sido algún proceso que no hubiera comprometido a pulmones o

algún proceso infeccioso agudo y cuyos tejidos se encontrarán en el archivo del servicio de

Anatomía Patológica del Centro Médico Nacional de Occidente del IMSS.

Requisitos fundamentales para su inclusión fueron que todos los estudios de autopsia

estuvieran debidamente concluidos y existiera la presencia de tejido pulmonar viable y

debidamente conservado en parafina para estudio morfológico e inmunohistoquímico (no

fragmentado y con tamaño suficiente para realizar varios cortes a 5µ de espesor). Se

excluyeron aquellos estudios de autopsia no concluidos, con datos en expediente clínico

incompletos o no legibles y con existencia de tejido pulmonar no viable para estudio

morfológico e inmunohistoquímico.

Definición de Caso:

Se consideró como caso, aquellos pacientes con lupus eritematoso sistémico con datos

histopatológicos de HAP definidas según los criterios de la clasificación de Heat-Edwards

incluyendo los estadios 1 al VI (ver cuadro de clasificación en la sección de Anexos).


25

Definición de Controles:

Para aumentar la validez del estudio, se seleccionaron 2 tipos de controles:

a) Control -1: Aquellas autopsias de pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico

con ausencia de datos histopatológicos para Hipertensión Arterial Pulmonar según la

clasificación de Heat-Edwards. Solo aquellos con estadio 0 (normal: ausencia de

neoformaciones vasculares, ausencia de lesiones plexiformes sin hipertrofia o hiperplasia

de la íntima y media de las arterias pulmonares) fueron incluidos como el primer grupo de

controles.

b) Control-2: Para el segundo grupo de comparación, se seleccionaron autopsias

de pacientes que no fueran portadores de enfermedad de origen autoinmune (ausencia de

criterios diagnósticos para lupus eritematoso sistémico u otra colagenopatía) y que en la

autopsia no se observó la presencia de hipertensión arterial pulmonar. En este grupo se

incluyeron también solamente aquellos pacientes con un grado de Heat-Edwards = 0

(normal).

2. Procedimiento:

Se formaron tres grupos de estudio:

a) El primer grupo constituido por 11 casos de autopsia con LES con alteraciones

histológicas de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP).

b) El segundo grupo (control número 1) lo constituyeron 7 autopsias de pacientes

con LES con ausencia de alteraciones histológicas de HAP.

c) El tercer grupo (control número 2) constituido por 9 casos de pacientes sin

enfermedad autoinmune con ausencia de alteraciones histológicas de HAP.

Las variables independientes investigadas fueron los resultados de la tinción de

inmunohistoquímica para las siguientes substancias en el tejido pulmonar y en los vasos


26

arteriales pulmonares analizados: Colágena tipo IV, Laminina, Fibronectina, CD-34, IgG, IgM, Tenascina-C y Serotonina. Se detectó grado de tinción para cada una de los antígenos, el grado fue categorizado de forma arbitraria en cruces siendo (-) = negativo, (+) positividad leve, (++) positividad moderada, (+++) positividad alta.

Se revisó también los cambios morfológicos del parénquima pulmonar y las arterias

pulmonares utilizando la lectura en cortes de tejido pulmonar a 5µ de espesor y teñidos en

Hematoxilina y eosina, solo en caso necesario se solicitaron tinciones especiales de Masson,

Fibras elásticas y Acido Peryódico de Schiff. Así como la búsqueda de cambios agregados,

tales como el desarrollo de procesos infecciosos, trombosis, hemorragia pulmonar, infartos

pulmonares, etc.

La información obtenida se registró mediante un formato previamente estructurado

que incluía datos morfológicos (hiperplasia e hipertrofia de los vasos sanguíneos para la

gradificación de Heat-Edwards, presencia de trombos vasculares, neumonitis, pleuritis e

infecciones oportunistas agregadas), así como la presencia de cambios plexogénicos

pulmonares.

Revisión de expedientes clínicos

Se evaluaron los expedientes clínicos en busca de variables clínicas y demográficas

que fueron registradas en un formato estructurado. Entre estas características se

identificaron la edad, sexo del paciente, diagnóstico de enfermedad de base,

enfermedades asociadas, causa de la muerte, factores contribuyentes a la muerte. En caso

de sintomatología cardiovascular, se consignó la disnea, ortopnea, tos, hemoptisis, ataques

de angor, arritmias, edema y hepatomegalia, así como otros datos de insuficiencia cardiaca

derecha e izquierda.

Procedimiento para la detección de reactividad en Inmunohistoquímica:

Por último, se evaluó la reactividad a diversos anticuerpos presentes en el

parénquima pulmonar y las arterias pulmonares (Colágena tipo IV, Laminina,

Fibronectina, CD-34 IgG, IgM, Tenascina-C y Serotonina), por medio de la técnica estándar de

inmunohistoquímica para peroxidasa anti-peroxidasa niveles 1 y 2 Dako® utilizada, previo al

desenmascaramiento de la antigenicidad tisular de los anticuerpos mediante la siguiente técnica:


27

1.-Realización de corte histológico de tejido fijado e incluido en parafina a 3-5µ de

espesor y colocación en laminilla de cristal con adhesivo para tejidos de poli-L-lisina.

Posteriormente se dejó secar por un periodo de 2-16 horas,

2.- Se procedió a la desparafinización del tejido mediante xilol y alcohol a diversas

ncentraciones (100, 96 y 75%),

3.- Se colocaron las laminillas en solución buffer (Conteniendo 8.5 gr. de Cloruro de

sodio, 0.266 gr. de fosfato de potasio monobásico y 1.14 gr. de fosfato de sodio

dibásico en 1000 ml de agua bidestilada),

4.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del reactivo de peróxido de

hidrógeno al 3% (Blocking reagent), dejando reposar por 20 minutos,

5.- lavado con solución buffer,

6.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del reactivo de Suero normal

por 20 minutos,

7.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del anticuerpo primario durante

toda la noche en cámara húmeda obscura, prosiguiendo al día siguiente con un

lavado inicial en solución buffer,

8.- Incubación en cámara húmeda agregando 2 gotas del reactivo de tinción (Linking

reagent) por 20 minutos,

9.- Posterior a un nuevo lavado con solución buffer, se colocó la laminilla nuevamente

en cámara húmeda agregando 2 gotas del revelador (Labelling reagent) dejando

reposar por 20 minutos más y tiñendo finalmente por hematoxilina de Harris durante 5

minutos.


28

La observación al microscopio de la reacción colorimétrica se calificó por

dos patólogos observadores de acuerdo a negativo si no existía tinción alguna de color

magenta en el tejido analizado y/o positivo, si existía tinción presente en el tejido,

realizándose una subcategorización de acuerdo al porcentaje de intensidad de la

tinción: negativo (-), leve (+), moderado (++) y alto (+++).

Todas las laminillas fueron revisadas por el mismo investigador. El investigador

fue cegado al grupo del cual procedían las laminillas. Un segundo evaluador revisó los

resultados de las observaciones de las laminillas. En caso de discrepancia en las

observaciones entre los dos evaluadores, se llegó a un acuerdo posterior a un análisis de

las laminillas y de los criterios utilizados para calificar los cambios.

De la información obtenida se calificó como variable dependiente a los cambios

morfológicos de HAP (hiperplasia e hipertrofia de vasos sanguíneos y cambios

plexogénicos pulmonares) según la gradificación de Heat-Edwards y como variable

independiente al resultado de la tinción de inmunohistoquímica para el tejido pulmonar

y vasos arteriales pulmonares (Colágena tipo IV, Laminina, Fibronectina, CD-34 IgG,

IgM, Tenascina-C y Serotonina). Otras variables evaluadas fueron: cambios

morfológicos agregados en el parénquima pulmonar, desarrollo de procesos infecciosos,

trombosis, hemorragia pulmonar, infartos pulmonares del parénquima y arterias

pulmonares.

3. Análisis estadístico:

El análisis de los resultados fue realizado mediante el programa SPSS® 8.0

para Windows (SPSS Inc, 1997), las gráficas se realizaron mediante el programa Harvard

Graphics ® 4.0.1 para Windows (Software Publishing Corporation 1991-1995).

Para la comparación de las diferencias entre proporciones de los grupos se utilizó

la X2 y prueba exacta de Fisher cuando fue necesario. La comparación entre las

diferencias de los porcentajes de positividad para la inmunohistoquímica entre pacientes

con HAP los grupos de comparación se realizó mediante la prueba de U de Mann-

Whitney. Se realizó un cálculo de las prevalencias entre los diferentes auto-anticuerpos

determinados por la inmunohistoquímica. Un valor de p≤ 0.05 fue considerado como

significativo para las diferencias observadas entre los grupos.


29

Se utilizó un coeficiente de correlación de Spearman (rho) de una cola para

evaluar la correlación entre el grado de Heat-Edwards y el grado de positividad para

inmunohistoquímica de cada uno de los antígenos evaluados. Una correlación perfecta

es igual 1, excelente entre .8 a.99, buena de 0.7 a 0.79, regular 0.5 a 0.69, pobre 0.3 a 0.49 y

mala 0.0 a 0.29. Estos mismos valores fueron usados en su forma negativa para el

caso de correlación negativa.


30

RESULTADOS:

En la tabla 1 y figura 7, se puede apreciar que del total de pacientes con LES

(n=18) predominó el sexo femenino 5:1, la edad promedio fue de 36±14 años (DE). Se

realizó el diagnóstico de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) por el clínico previo a la

muerte del paciente solo en 2 casos (18%), dentro de la sintomatología referida en el

expediente clínico se encontró que las cuatro principales manifestaciones clínicas fueron

disnea en 9 casos (50%), seguido de la ortopnea, tos e insuficiencia cardiaca en 6 casos

(34%), respectivamente.

Por otra parte, el desarrollo de neumonía se sospechó por el clínico en el

50% de los casos con LES, donde se encontraron 4 procesos neumónicos por hongos

(22%). Los casos con LES + HAP fueron 11, de ellos los síntomas más frecuentemente

encontrados fueron la disnea en 8 casos (73%), seguidos de la ortopnea e insuficiencia

cardiaca en 6 casos cada uno (55%).

Tabla 1.Características de los pacientes estudiados


31

En la Tabla 2 y figura 7, se aprecian las principales características del

tejido de autopsia en los casos analizados, donde se puede observar que los pulmones

de los casos con LES que desarrollaron HAP fueron relativamente más ligeros (805 ±

257 gr.) en comparación de los casos con LES que no desarrollaron HAP (1026 ±

592 gr.), pero no existió una diferencia estadísticamente significativa a este respecto.


32

En cuanto a las características macroscópicas de los pulmones, en los casos con

LES que desarrollaron HAP se encontró que la mayoría eran rojizos (6 casos, 55%) y de

consistencia blanda (7 casos, 64%), microscópicamente se corroboró la presencia de algún

proceso infeccioso neumónico en 11 casos de 18 con LES, de los cuales 7 casos (64%)

correspondían a aquellos que desarrollaron HAP.

Tabla 2. Principales características pulmonares en los pacientes estudiados


33

En la Tabla 3 y figura 8, se aprecian los casos con LES que desarrollaron HAP,

según la gradificación de Heat-Edwards. De 11 casos con datos histológicos de

HAP, 3 casos (27%) correspondían al grado I constituido por cambios mínimos de

hipertrofia media de las arterias y muscularización de arteriolas, 2 casos (18%) con

cambios de proliferación de la íntima de arterias pulmonares (grado II), 3 casos (27%)

tenían cambios de proliferación concéntrica de la íntima de arterias y fibrosis laminar en

"hojas de cebolla" (grado III) y 3 casos (27%) tenían dilatación de pequeñas arterias con

lesiones plexiformes (grado IV), no hubo casos con lesiones angiomatoides o arteritis

Necrotizante (grados V-VI).


34


35

En la tabla 4 y figura 9, se aprecia el resultado de la aplicación de la

inmunohistoquímica para el tejido pulmonar estudiado, donde se aprecia una mayor

positividad para colágena IV en aquellos casos de LES + HAP (11 casos, 100% ) y al

comparar los casos con HAP con los pulmones de los controles sin LES se encontró una

diferencia estadísticamente significativa (p=0.008), para el caso de la laminina no hubo

diferencias para la positividad entre los casos de LES con HAP y sin HAP, sin embargo; al

comparar los casos con LES + HAP contra pulmones de los controles sin LES se

encontró una diferencia estadísticamente significativa (p=0.012) y con un valor de razón

de momios (OR) protector de 0.06; por último, aunque para los casos con LES + HAP se

encontró una alta positividad para Tenascina-C en 9 casos (82%), no existió una

diferencias estadísticamente significativa con los casos de LES sin HAP, sin embargo; al

comparar éstos casos con los controles sin LES, se encontró una diferencia estadísticamente

significativa (p=0. 012) y con un valor de razón de momios (OR) no protector de 15.75.

Hipertensión Arterial Pulmona en Lupus

36

En la tabla 5 y figuras 10a/10b, se aprecia la comparación en la reactividad

intersticial entre los casos de LES estudiados comparando los casos con HAP y aquellos que

no la desarrollaron, donde observamos que hubo una mayor positividad leve (+) y moderada

en los casos con HAP para Tenascina-C, Colágena IV, Fibronectina, CD-34, IgG e IgM.

Sin embargo, no existió una diferencia estadísticamente significativa en todos ellos.


37


38


39

En la tabla 6 y figuras 11a/11b, se aprecia la comparación en la

reactividad intersticial entre los casos de LES con HAP y los controles sin LES, donde

observamos que para la Tenascina-C hubo una mayor positividad moderada (++)

y alta (+++) en los casos con HAP en comparación con los controles sin LES

(p=0.001), para la Fibronectina hubo una mayor positividad leve (+) en los casos con

HAP en comparación con los controles sanos (p=0.001), para la Colágena IV hubo una

mayor positividad moderada (++) y alta (+++) en los casos con HAP en comparación

con los controles sanos (p=0.002), para la Serotonina hubo una mayor positividad leve

(+) en los casos con HAP en comparación con los controles sin LES (p=0.038) y para la

Laminina de forma contraria existió una mayor positividad leve (+) y moderada (+) en los

controles sin LES (p=0. 042).


40


41

En la tabla 7 y figura 12, se aprecia el resultado de la aplicación de la

inmunohistoquímica en las arterias del tejido pulmonar estudiado, donde se aprecia una

positividad en 1 caso para la Laminina en aquellos casos de LES con HAP (9%) y al

comparar los casos con los controles sin LES donde hubo una mayor positividad

(78%) se encontró una significancia estadística (p=0.003) con un valor de razón de

momios (OR) protector de 0.03, para la Tenascina-C se encontró una positividad en 9

(82%) casos con HAP en comparación de 1 caso ( 11% ) de los controles sin LES (p=0.003)

y con un valor de razón de momios (OR) no protector de 36.00 y para la Serotonina se

encontró una positividad en 8 casos (73%) con HAP en comparación de 2 (22%) casos

de los controles sin LES (p=0.035) con valor de razón de momios (OR) no protector de 9.33.


42

Figura 12. Positividad arterial para los reactivos estudiados

(LES CON HAP, LES sin HAP y controles sin LES)

En la tabla 8 y figuras 13a/13b, se aprecia la comparación en la reactividad en las

arterias pulmonares entre los casos de LES con HAP y los controles sanos, donde

observamos que para la Tenascina-C hubo una mayor positividad moderada (++) y alta

(+++) en los casos con HAP en comparación con los controles sin LES (p=0.025). En el

resto de los reactantes no se encontró una diferencia estadísticamente significativa.


43


44


45

En la tabla 9 y figuras 14a/14b, se aprecia la comparación en la reactividad

intersticial entre los casos de LES con HAP y los controles sin LES, donde observamos que

para la Tenascina-C hubo una mayor positividad moderada (++) y alta (+++) en los

casos con HAP en comparación con los controles sin LES (p=0.001), para la Fibronectina

hubo una mayor positividad leve (+) y moderada (++) en los casos con HAP en

comparación con los controles sin LES (p=0. 001), para la Colágena IV hubo una mayor

positividad leve (+) en los controles sin LES (p=0.002), para la Serotonina hubo una

mayor positividad leve (+) y moderada (++) en los casos con HAP en comparación a los

controles sin LES (p=0.038) y para la Laminina de forma contraria existió una mayor

positividad leve (+), moderada (++) y alta (+++) en los controles sin LES en

comparación de los casos de LES con HAP (p=0. 042).


46


47

En la tabla 10 se observa el índice de correlación de Spearman (rho) entre los

casos con LES, la positividad a los inmunoreactantes y el grado de Heat-Edwrads para los

casos que tenían HAP. Podemos observar como para la positividad de la colágena IV a nivel

arterial se encontró una significancia estadística (p=0.02), así como a nivel intersticial donde

esta significancia fue limítrofe (p=0.06).Por otra parte, la Tenascina-C demostró también

una significancia estadística (p=0. 03).

Tabla 10.- Correlación entre el grado de Hipertensión Arterial Pulmonar según la gradificación de Heat-Edwards y el grado de la tinción intersticial de los diferentes

reactivos entre los casos con Lupus Eritematoso Estudiado.


48

DISCUSIÓN:

En nuestro estudio, se observó que un 62% de las autopsias de pacientes con

Lupus Eritematoso Sistémico, presentaron datos histológicos de Hipertensión Arterial

Pulmonar, los cuales eran de leves a moderados (grados I-IV de Heat-Edwards) (Anexo IV

Fig. 15). Lo anterior, contrasta con estudios previos donde la presencia de HAP en LES se

sugiere como rara. Así por ejemplo, Quismorio 35, encontró sólo 2 casos (0.5%) con HAP

en más de 400 pacientes estudiados, en cambio; Perez y Kramer 28, observaron solo un 9% de

casos en un estudio de seguimiento a 3 años. Cabe mencionar, que en estos estudios fue detectada

la presencia de HAP en pacientes vivos usando estudios clínicos invasivos, por el contrario;

nuestro estudio demostró que la prevalencia obtenida en autopsias puede ser mayor en base a

diferentes factores, que incluyen: a) una búsqueda intencionada de las lesiones de las arterias

pulmonares, b) una mayor sensibilidad de los estudios histopatológicos y c) que los

pacientes de autopsias sufrieron una mayor severidad de la enfermedad de fondo, lo cual;

puede influir en una mayor frecuencia de involucramiento a diversos órganos.

De los 18 casos estudiados con LES un 28% presentaban solo cambios mínimos de

proliferación de las capas íntima y media de las arterias, con una discreta reacción linfocitaria

sin llegar a una vasculitis definida. Estos cambios en el endotelio, túnicas media e íntima

aparecen como normales en la histología en los grados I-II de Heat-Edwards, excepto por un

ligero engrosamiento de la media en la histología y su presencia ya ha sido descrita con

anterioridad36. En nuestros casos, hasta un 34% presentaron cambios de proliferación

concéntrica de la íntima acompañadas o no de lesiones plexiformes (Ver Anexo IV: Fig. 15 ).

Algunos autores han reportado, que la presencia de la reacción inflamatoria observada

en las arterias pulmonares sugiere fuertemente que ciertas citocinas y factores de

crecimiento celulares liberados por las células inflamatorias influyen directamente en el

desarrollo de las lesiones plexiformes (Grado IV de Heat-Edwards) 37.

En los pacientes con LES + HAP se observaron diferencias estadísticamente

significativas en la frecuencia Colágena IV y Tenascina-C en el intersticio pulmonar en

comparación con los controles sin LES, este aumento en Colágena IV y Tenascina-C puede

explicar algunas de las diferencias subyacentes en la patogénesis de la afección pulmonar de

estos pacientes ya que la Tenascina-C se ha asociado con la proliferación celular de

fibroblastos, colágena y otros componentes de la matriz extracelular. En las arterias

pulmonares de los pacientes con LES + HAP se observó una mayor frecuencia de positividad


49

para Tenascina-C y Serotonina que en los controles sin LES, alcanzando una

significancia estadística. La Tenascina-C puede funcionar como un disparador de la

proliferación endotelial en pacientes con enfermedad arterial pulmonar, mientras que la

Serotonina puede intervenir en algunos fenómenos de vasoconstricción que son

frecuentemente observados en estos pacientes.

En el parénquima pulmonar nosotros observamos una mayor frecuencia de tinción de

inmunohistoquímica positiva para Tenascina-C en los casos de HAP asociada a LES en

comparación con los controles con LES sin HAP. A pesar de esta mayor frecuencia no se

observó una diferencia estadística, la cual puede ser explicada por el pequeño tamaño de

muestra evaluado, que requeriría grandes diferencias para ser reflejadas en el valor de p.

Así mismo, la presencia de Tenascina-C en arterias pulmonares también fue observada

más frecuentemente en los casos de HAP asociada a LES que en los controles de LES sin HAP,

pero tampoco fue observada una diferencia estadística.

Aunque no se alcanzó diferencia estadística en la frecuencia de positividad para estos

inmunoreactantes, la intensidad de la inmunohistoquímica fue estadísticamente diferente

entre los pacientes con HAP asociada a LES y los pacientes con LES sin HAP. Hasta un

64% de los pacientes con LES + HAP tuvieron de moderada a alta positividad, para

Tenascina-C en las paredes de las arterias pulmonares, en tanto que solo el 14% de los

pacientes con LES sin HAP tuvieron esta intensidad de tinción (p=0.025). Esto sugiere que

más que la presencia o ausencia de Tenascina-C, es el grado en la producción de ésta la que

podría propiciar los cambios histológicos de HAP. En el análisis de correlación de Spearman,

los pacientes con mayor grado de HAP tuvieron un mayor grado de depósito de

Colágena IV (rho = 0.47, p=0.02) y Tenascina-C (rho=0.43, p=0.03) respectivamente en las

arterias.

La Colágena IV es un constituyente de la matriz extracelular de la mayoría de los

órganos y ocupan entre un 15-20% del peso seco del pulmón 13. En los vasos sanguíneos, la

colágena IV fundamentalmente se encuentra en membranas basales y puede ser producida

por algunos fibroblastos. A este respecto en nuestro estudio, encontramos una positividad

intersticial para la Colágena IV en el 94% de los casos con LES, en comparación de un

89% de los controles sin LES (p<0.05), lo que sugiere una proliferación de Colágena IV


50

intersticial pulmonar en pacientes con LES asociada a HAP ( Ver Anexo IV: Figura 16 ).

En el análisis de correlación de Spearman, los pacientes con mayor grado de HAP tuvieron

un mayor grado de depósito de Colágena IV representado por un valor limítrofe de la rho

de Spearman = 0.38, p=0.06.

En cuanto a otros componentes de la matriz extracelular en los pulmones, se

observó una positividad variable para Fibronectina y Laminina 36-37. Ambas substancias, son

importantes glicoproteínas constituyentes de las membranas basales, promueven el

desarrollo, diferenciación y movilidad de una gran variedad de células incluyendo las

células endoteliales, constituyendo un estímulo para que dichas células formen luces

capilares 38-39. También se ha demostrado que estas substancias promueven la invasión

tisular y metástasis en tumores, así como la producción de Colágena IV 39-41. En nuestro

estudio, encontramos un aumento en la frecuencia de positividad en el intersticio pulmonar

y en las arterias pulmonares de los casos con LES + HAP, que puede hablar de un estímulo

para la producción de esta substancia que lleva a la proliferación vascular en pacientes con

LES (Ver Anexo IV: Fig. 17).

Para el caso de la fibronectina observamos una mayor positividad a nivel

intersticial en los casos de LES + HAP con significancia estadística, en comparación de los

controles sin LES (p<0.05). La fibronectina es una proteína de importancia en la

formación de fibrillas en el intersticio pulmonar, promueve la adhesión, migración,

cito-diferenciación, fagocitosis y crecimiento celular. Se encuentra principalmente en

membranas basales, alrededor de células de músculo liso y alvéolos. Esto explica

nuestros hallazgos que indican positividad tanto en vasos sanguíneos como en

intersticio pulmonar (Ver Anexo IV: Fig. 18).

En el caso de la Serotonina, esta fue observada principalmente en los casos de LES

con HAP en comparación con los controles sin LES (73%, p=0.035). La Serotonina se asocia

a mecanismos de migración celular y vasoconstricción, es liberada por ciertas células

inflamatorias (macrófagos). En un estudio realizado en pacientes con Hipertensión Pulmonar

Primaria (HPP) se demostró una mayor frecuencia de la variedad LL del receptor para Serotonina

a nivel pulmonar, así como una mayor proliferación de las células musculares lisas arteriales

en comparación de los controles 42. Lo anterior puede compararse con nuestros hallazgos en

los casos de LES + HAP, pudiendo contribuir a explicar los cambios histopatológicos arteriales

en estos pacientes (ver Anexo IV: Fig. 19).


51

El hallazgo más interesante de nuestro estudio, es el incremento de la expresión de

Tenascina-C en pacientes con HAP asociada al LES. La Tenascina-C, es una

glicoproteína de la matriz extracelular asociada a la proliferación celular durante la

embriogénesis y algunos procesos patológicos. En un estudio realizado en ratas se observó

una amplia distribución de esta substancia en la túnica media y subendotelio de vasos

sanguíneos que fueron sometidos a un estress hipertensivo continuo y la expresión de

esta substancia fue asociada al desarrollo de cambios de hiperplasia e hipertrofia vascular 43.

Esta Tenascina-C, podría estar implicada en la génesis de la HAP en LES. Nosotros encontramos

que hasta un 82 % de los pacientes con LES + HAP tuvieron Tenascina-C positiva,

comparada con solo el 43% de pacientes con LES sin HAP. Cuando comparamos la

intensidad de la tinción para Tenascina-C en los pacientes con HAP asociada a LES

tuvieron una mayor intensidad en comparación con el grupo de LES sin HAP. Esta

intensidad para Tenascina-C correlacionó también con el grado de HAP por Heat-Edwartds

observándose que en aquellos pacientes con mayor grado de intensidad tenían un mayor grado

de HAP (ver Anexo IV: Fig. 20).

En un estudio realizado en ratas, la Tenascina-C fue relacionada a la remodelación

muscular cardiaca 44. Otro estudio, también realizado en ratas demostró la inducción de la

síntesis de Tenascina-C por las arterias siguiendo a los cambios en el fenotipo de las células

musculares 45. En niños con defectos cardiacos congénitos quienes desarrollaron HAP, se ha

sugerido que la Tenascina-C a nivel de las arterias funciona como un modulador del

factor de crecimiento vascular epidérmico, ligado a la proliferación de las células musculares

lisas de la íntima además, en presencia de fibronectina se facilita un gradiente para la migración

de las células musculares de la media a la íntima 46. Algunos autores han propuesto que la

Tenascina-C interviene en la activación de los fibroblastos, generando stress mecánico sobre

la pared del vaso arterial, lo que originaría una cascada de producción de componentes de la

matriz extracelular 47. Múltiple evidencia existe de que la Tenascina-C se incrementa por

diversos factores entre los cuales destaca el stress mecánico 48-49.


52

Nosotros proponemos el siguiente esquema para explicar el papel de la Tenascina-C

en la HAP secundaria al LES:

El presente estudio tiene diversas limitaciones: resalta que los casos con LES fueron

más jóvenes (36±14 años) en comparación de los controles sin LES (54±15 años). Esta

diferencia de edad podría incrementar la expresión de algunas substancias en los sujetos

más viejos, lo cual podría disminuir las diferencias observadas en nuestro estudio,

desgraciadamente el pequeño tamaño de muestra impide un ajuste estadístico por edad,

por lo que los resultados deberán de ser considerados a la luz de esta limitación.

Otra limitante es la posibilidad de que importantes antígenos se hubieran perdido

durante el procesamiento; sin embargo, esto no constituiría un sesgo de evaluación

diferencial ya que tanto en los pacientes con Lupus + HAP como los de Lupus sin HAP o

los controles sin enfermedad autoinmune, estos antígenos tendrían la misma probabilidad de

perderse y los riesgos permanecerían siendo los mismos.

Por otro lado, el investigador que evaluó la positividad de los reactantes de la

inmuhistoquímica se encontraba ciego a los valores de la clasificación de Heat-Edwards,

esto disminuye los sesgos en la evaluación de las variables independientes y es una

fortaleza de nuestro estudio.


53

Nuestro trabajo da algunas aportaciones importantes que deben de tomarse en

cuenta; 1) Pocos estudios han abordado las características inmunohistoquímicas de los

pacientes con LES que desarrollaron HAP, 2)En su mayoría, los estudios adolecen de

controles y se limitan a series de casos, 3)Este estudio posibilita hacer comparaciones

con controles con LES sin hipertensión pulmonar y controles sin enfermedad

autoinmune, 4)El estudio sugiere que la Tenascina-C juega un papel importante en la

génesis de la hipertensión arterial pulmonar en el Lupus Eritematoso Sistémico, 5)Nuevos

estudios incluyendo modelos experimentales podrán ser realizados en base a nuestros

resultados para investigar el papel de la Tenascina-C en la génesis de la Hipertensión

Arterial Pulmonar en estos pacientes, 6)Nuevas aportaciones en otros centros hospitalarios

son requeridas para confirmar los datos observados en nuestro estudio.

Por último cabe mencionar que, el presente estudio es el primero en su tipo que

evalúa en un diseño más sólido la presencia de reactantes de inmunohistoquímica en

pacientes con Lupus e Hipertensión Arterial Pulmonar comparado con controles. El

presente trabajo, permite considerar que la Tenascina-C, que no ha sido anteriormente

involucrada en la génesis de la hipertensión pulmonar en LES, puede tener un papel

importante en el desarrollo y progresión de esta Hipertensión Arterial Pulmonar. Otros

estudios derivados de la medición en vivo de esta sustancia con seguimiento de

pacientes, pueden ser útiles para evaluar la validez de nuestros hallazgos.


54

CONCLUSIONES:

1. Se observaron datos histológicos de Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) en 62%

de las autopsias de pacientes con lupus eritematoso sistémico.

2. La presencia de Tenascina-C en el parénquima pulmonar fue más frecuente en los casos

de LES + HAP que en LES sin HAP aunque sin alcanzar diferencia estadística.

3. A nivel intersticial los pacientes con LES + HAP presentaron una mayor frecuencia de

positividad para Colágena IV y Tenascina-C que para los controles sin enfermedad

autoinmune.

4. En las arterias pulmonares los pacientes con LES + HAP, se observó una mayor

frecuencia de positividad que los controles sin enfermedad autoinmune en Serotonina

y Tenascina-C.

5. Se observó, una diferencia estadísticamente significativa en la intensidad de positividad

para Tenascina-C en las arterias pulmonares de pacientes con HAP, en comparación

con aquellos sin HAP.

6. Hasta un 64% de los pacientes con LES + HAP tuvieron de moderada a alta

positividad, comparado contra solo el 14% de los pacientes con LES sin HAP

(p=0.025).

7. Una correlación estadísticamente significativa fue observada entre el grado de

Hipertensión Arterial Pulmonar (Heat - Edwards) y el grado de depósito de

Tenascina-C (rho= 0.43, p= 0.03) y para la Colágena IV (rho= 0.47, p=0.02) a nivel

arterial.


55

ANEXOS:


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58


59


60

Hipertensión Arterial Pulm

onar en Lupus

61

Hipertensión Arterial Pulm

onar en Lupus

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63

ANEXO IV: FOTOGRAFÍAS MICROSCÓPICAS:


64


65


66


67

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