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Universidad de Colima DOCTORADO EN CIENCIAS: ÁREA BIOTECNOLOGÍA

INDUCCIÓN DEL ENRAIZAMIENTO EN Agave salmiana Otto CON Agrobacterium rhizogenes Y COLONIZACIÓN DE RAICES

TRANSFORMADAS POR Glomus intraradices

TESIS QUE PRESENTA:

GUILLERMO RODRÍGUEZ HERNÁNDEZ

PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS, ÁREA BIOTECNOLOGÍA

ASESOR INTERNO: DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA ASESOR EXTERNO: DR. EUGENIO PÉREZ MOLPHE BALCH COASESOR: DRA. MARÍA DEL ROCÍO FLORES BELLO COASESOR: DR. JAVIER FARIAS LARIOS COASESOR: DR. JOSÉ GERARDO LÓPEZ AGUIRRE

TECOMÁN, COL., OCTUBRE DE 2002

UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

C. GUILLERMO RODRIGUEZ HERNANDEZEGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIASAREA: BIOTECNOLOGIA.P R E S E N T E .

Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: deBiotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Doctorado y en virtud de queefectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado 1os integrantes del mismo,se le autoriza la impresión de la tesis " Inducción del enraizamiento en Agave salmiana Ottocon Agrobacterium rhizogenes y colonización de raíces transformadas por Glomusintraradices ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Profesor-Investigador de la Universidad de Colima y el Dr. Eugenio Pérez Molphe Balch, Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma de Aguascalientes.

Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Doctor en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a forma ycontenido por los C.C. Dra. María del Rocío Flores Bello, Dr. Oscar Rebolledo Domínguez, Dr.Javier Farias Larios, Dr. José Gerardo López Aguirre, Profesores- Investigadores de laUniversidad de Colima y el Dr. Eugenio Pérez Molphe Balch, Profesor-Investigador de 1aUniversidad Autónoma de Aguascalientes.

Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.

A T E N T A M E N T E

BRE DEL 2002.

C.C.P.EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNOC.C.P.EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO. Of. No. 50112002.RVMD/Lery**

Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100Tel. 01 (313) 322 94 05 • Ext. 52251 • Fax 52252 • fcba@tecoman.ucol.rnx

OFICIO No. 501/2002

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DEDICATORIA A: mi esposa EMA VÁZQUEZ REYES A: mis hijas ROSALBA Y DENIA EDITH Por acompañarme en mis desvelos, desalientos y transformarlos en alegría. A: mis profesores y compañeros DE LA UNIVERSIDAD DE COLIMA. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS.

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AGRADECIMIENTOS

A NUESTRO PADRE DIOS, por haberme dado tanto. A PERSONAS: DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA, por la asesoría y dirección del trabajo de tesis. AL DR. EUGENIO PÉREZ MOLPHE BALCH, por la asesoría y dirección del trabajo de tesis. DR. MARÍA DEL ROCÍO FLORES BELLO, por la coasesoría y consejos recibidos del trabajo de tesis. DR. JAVIER FARIAS LARIOS, por la coasesoría y consejos recibidos del trabajo de tesis. DR. JOSÉ GERARDO LÓPEZ AGUIRRE, por la coasesoría y consejos recibidos del trabajo de tesis. DR. OSCAR REBOLLERO DOMÍNGUEZ, por sus comentarios y sugerencias sobre el presente trabajo de tesis. MC. SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ, por sus comentarios y sugerencias sobre el presente trabajo de tesis. MC. ARNOLDO MICHEL ROSALES, por sus comentarios y sugerencias sobre el presente trabajo de tesis. ING. RODOLFO V. MORENTIN DELGADO, por su apoyo y confianza brindada. PhD. ANDRÉS A. ESTRADA LUNA, por sus comentarios y sugerencias sobre el presente trabajo de tesis. DR. JUAN FLORENCIO GÓMEZ LEYVA, por sus comentarios y sugerencias sobre el presente trabajo de tesis. Así como por la donación de Glomus intraradices. DR. VÍCTOR OLALDE PORTUGAL, por sus comentarios y sugerencias sobre el presente trabajo de tesis. AL DR. RAFAEL GUTIÉRREZ CAMPOS, por los conocimientos y consejos recibidos. MC. JOSÉ HERNÁNDEZ MARTINÉZ, por sus comentarios y sugerencias sobre el presente trabajo de tesis. A LA T.L.Q. MARTHA E. PÉREZ REYES, por el valioso apoyo técnico recibido al presente trabajo de tesis. ING. CASIMIRO HERNÁNDEZ BENITES, por el valioso apoyo técnico recibido al presente trabajo de tesis.

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E INSTITUCIONES:

AL COMITÉ FUNDADOR DE LA UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS, Por darme la oportunidad de estudiar el Doctorado en Ciencias, Área: Biotecnología . AL CONACYT por el apoyo brindado a través de una beca. No. Registro 95910. A la UNIDAD ACADÉMICA DE AGRONOMÍA DE LA UAZ, a través del director DR. ARMANDO LEGASPI GUZMÁN, por su apoyo y confianza brindada.

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ÍNDICE Página ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS ABREVIATURAS RESUMEN ABSTRACT 1.-INTRODUCCIÓN 2.- ANTECEDENTES 2.1 Taxonomía y distribución de Agave salmiana Otto 2.2 Problemática de Agave salmiana Otto 2.3 Importancia de Agave salmiana Otto 2.4 Antecedentes sobre la micorriza 2.5 Clasificación de los diferentes tipos de hongos micorrízicos 2.5.1 Las endomicorrizas 2.5.1.1 Detección molecular de la colonización MA 2.5.1.2 Factores que influyen en la colonización 2.5.1.3 Dependencia de la micorriza arbuscular 2.5.1.4 Especificidad de la micorriza arbuscular 2.5.1.5 Relación de la micorriza arbuscular con la fertilidad del suelo 2.5.1.6 Beneficios de la simbiosis con la micorriza arbuscular 2.5.1.7 La micorriza arbuscular respecto la erosión del suelo 2.6 Generalidades sobre el cultivo in vitro de raíces 2.7 Transformación genética de plantas 2.7.1 Transformación directa de plantas 2.7.1.1 Transformación por fusión de liposomas 2.7.1.2 Transformación a través de la microinyección 2.7.1.3 Transformación por electroporación 2.7.1.4 Transformación a través del Polietilen-glicol 2.7.1.5 Transformación por biobalística 2.7.1.6 Métodos alternativos para la transformación de plantas 2.7.2 Transformación indirecta de plantas 2.7.2.1 Transformación mediada por virus 2.7.2.2 Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens 2.7.2.3 Transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes 2.7.3 Transformación a través de la mutagénesis

VIII VIII

IX X

XI 1 5 5 7 8 8

10 11 13 15 17 19 20 22 26 27 29 30 30 31 31 32 32 33 33 34 34 35 46

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ÍNDICE Página 2.8 Colonización con la MA en raíces transformadas con el ADN- T Ri 2.9 Características de Glomus intraradices 2.10 Técnicas para la extracción y desinfección superficial de las esporas 3.- MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Material biológico utilizado 3.1.1 Cepa de Agrobacterium rhizogenes 3.1.2 Plantas silvestres de Agave 3.1.3 Esporas de Glomus intraradices 3.2 Métodos 3.2.1 Técnica para la desinfección de las semillas de Agave 3.2.2 Procedimiento para la inducción del enraizamiento con A. rhizogenes en Agave salmiana Otto 3.2.3 Diseño experimental 3.2.4 Tinción histoquímica 3.2.5 Análisis molecular 3.2.6 Extracción y desinfección superficial de esporas 3.2.7 Cultivo monoxénico de raíces transformadas con G. intraradices 3.2.8 Técnica para el clareo y tinción de raíces colonizadas 3.2.9 Evaluación de la colonización MA en raíces 3.2.10 Registro y análisis de datos 4.- RESULTADOS 4.1 Respuesta a la inducción del enraizamiento con Agrobacterium rhizogenes en Agave salmiana Otto 4.2 Respuesta para el gen reportero uid A que codifica para la enzima β-glucoronidasa 4.3 Presencia de los genes rol B y nptII 4.4 Respuesta a la colonización en raíces silvestres 4.5 Respuesta a la colonización de las raíces transformadas 5.- DISCUSIÓN 6.- CONCLUSIONES 7.- BIBLIOGRAFÍA

46 52

52 53 53 53 53 54 54 54

55 57 58 59 62

63 65 66 67 68

68

72 72 74 74 77 82 83

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ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Clasificación taxonómica de los hongos micorrízicos

arbusculares Cuadro 2. Subdivisión de las endomicorrizas Cuadro 3. Síntesis de algunos metabolitos secundarios Cuadro 4. Efecto de los diferentes medios nutritivos Cuadro 5. Medio líquido para el cultivo de la bacteria Cuadro 6. Tratamientos evaluados para la inducción del enraizamiento con el ADN-T Ri en Agave salmiana Otto Cuadro 7. Solución de reacción para la tinción histoquímica Cuadro 8. Solución de extracción del ADN Cuadro 9. Programa para la reacción en cadena de la polimerasa Cuadro 10. Mezcla para la reacción en cadena de la polimerasa Cuadro 11. Formulación de medios nutritivos utilizados para la germinación de las semillas y cultivo monoxénico Cuadro 12. Compuestos utilizados para el clareo y tinción de raíces Cuadro 13. Respuesta para la inducción del enraizamiento Cuadro 14. Eficiencia de transformación genética de las raíces adventicias formadas

13 14 29 48 55

58 59 60 61 61

64 66 69

74

ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Propiedades de Agrobacterium para transferir genes Figura 2. Plásmido silvestre pRiA4 de Agrobacterium rhizogenes Figura 3. Vector binario pESC4 de Agrobacterium rhizogenes Figura 4.Curva para la determinación de la concentración de

A. rhizogenes Figura 5. Plantas de Agave salmiana Otto Figura 6. Inducción de raíces adventicias transformadas Figura 7. Respuesta a la inoculación con A. rhizogenes para A. salmiana Figura 8. Actividad para el gen reportero uid A Figura 9. Gel de agarosa en un transiluminador de luz UV Figura 10. Respuesta a la colonización en raíces silvestres Figura 11. Respuesta a la colonización en raíces transformadas

40 42 44

57 68 70

71 72 73 75 76

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ABREVIATURAS ABA (ácido abscísico) ADN-T (ácido desoxirribonucleico de transferencia) ADN-TI (ADN-T izquierda) ADN-TD (ADN-T derecha) AIA (ácido indolacético) ARN (ácido ribonucléico) Cab (promotor del gen de la proteína que une clorofila a/b del chícharo) CAM (metabolismo ácido de las crasuláceas por sus siglas en inglés) CaMV (virus del mosaico de la coliflor por sus siglas en inglés) CAT (cloramfenicol acetil transferasa) EM (ectomicorrizas) ED (endomicorrizas) EEM (ectoendomicorrizas) GUS (gen reportero uid A que codifica para la enzima β-glucoronidasa) HMA (hongos micorrízicos arbusculares) Kp (kilopares de bases) M (molar) MA (micorriza arbuscular) MS (Murashige y Skoog, medio basal) N (normalidad) NOS (nopalino sintetasa) nptII (neomicina fosfotransferasa II) nm (nanómetro) onc (oncogénico) pb (pares de bases) PCR (reacción en cadena de la polimerasa por sus siglas en inglés) PGPR (rhizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas por sus siglas en inglés) Ri (inductor del enraizamiento por sus siglas en inglés) Ti (inductor de tumores por sus siglas en inglés) µM (micromolar) Vol. (volúmenes) vir (virulencia) WDV (virus del enanismo del trigo por sus siglas en inglés) X-gluc (ácido 5-bromo-4cloro-3-indolil β-D- glucurónico) YM (medio líquido para el cultivo de la bacteria)

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INDUCCIÓN DEL ENRAIZAMIENTO EN Agave salmiana Otto CON Agrobacterium rhizogenes Y COLONIZACIÓN DE RAÍCES TRANSFORMADAS POR Glomus intraradices

RESUMEN

El presente estudio es el primer reporte sobre la inducción del enraizamiento in

vitro de Agave salmiana Otto, utilizando Agrobacterium rhizogenes. Para ello se trabajó

con diferentes concentraciones de bacterianas y de acetosiringona, así como también se

evaluaron diferentes sitios de inoculación en hojas, tallo y raíz. El tiempo de incubación en

la oscuridad fue de 6 días. Las raíces adventicias transformadas se presentaron a los 25 días

después de la inoculación. El mejor tratamiento resulto de la inoculación en tallo con:

1x108 bacterias ml-1 y 100 µm de acetosiringona, este tratamiento obtuvo un 57.5% para la

inducción de raíces transformadas en los puntos inoculados.

Para verificar la actividad y presencia de los genes foráneos, en las raíces

transformadas de Agave salmiana, se realizó de la siguiente manera: A) tinción

histoquímica, para la actividad de GUS la cual fue determinada en un 80% de las raíces

probadas, y B) mediante el análisis molecular a través de PCR, se verificó la presencia del

gene nptII y del gen rol B (ambos estuvieron presentes en un 60% de las raíces probadas).

En lo que respecta a la colonización micorrízica este es el primer reporte, en donde

se determinó un 85% de colonización en las raíces silvestres de Agave salmiana, por parte

de una micorriza arbuscular nativa. Así como también es el primer reporte sobre la

colonización de las raíces transformadas de Agave por Glomus intraradices Schenck y

Smith. El resultado del cultivo monoxénico fue el siguiente: la espora madre germinó a los

5 días, la colonización de las raíces transformadas fue de un 70%. Enseguida se procedió a

la recuperación de las esporas hijas, de las cuales se obtuvieron en promedio 300 esporas

hijas por caja petri, después de 6 meses de iniciada la inoculación.

Palabras clave: inducción del enraizamiento, Agave, A. rhizogenes, tallo, colonización, raíces transformadas, G. intraradices.

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ROOT INDUCTION OF Agave salmiana Otto WITH Agrobacterium rhizogenes AND

ROOTS TRANSFORMED COLONIZATION BY Glomus intraradices

ABSTRACT

The current work is the first report in vitro on root induction of Agave salmiana

Otto, using Agrobacterium rhizogenes. Several concentrations of bacteria and

acetosyringone were used, as well as different sites of inoculation were tested on leaves,

shaft and root. The time of incubation in the darkness was 6 days. The transformed

adventitious roots was presented 25 days after inoculation. The best treatment resulted

from inoculation of shaft with: 1x108 bacteria ml-1 and 100 µm acetosyringone and

resulted, in this treatment 57.5% to the inoculated points producer transformed roots

induction.

The activity and presence of the foreign genes in the transformed roots of Agave

salmiana, was verified as follows: A) histochemical staining for GUS activity was

determined in 80% of the tested root, and B) molecular analysis via PCR was made to

verify the presence of nptII gene and rol B gene (both were present in a 60% of the tested

root).

In what concerns to mycorrhizal colonization this is the first report, the 85% of the

wild roots of Agave salmiana were colonized by native arbuscular mycorrhiza. This is also

the first report, of the colonization of the transformed roots of Agave with Glomus

intraradices Schenck and Smith. The result of the monoxenic culture was as follows: the

mother spore germinated 5 days, the colonization of the transformed roots was 70%. Then

we proceeded to the recovery of the daughter spores, in which we obtained average 300

daughter spores per petri dish, 6 months after inoculation started.

Key words: root induction, Agave, A. rhizogenes, shaft, colonization, transformed roots, G.

intraradices.

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TITULO

INDUCCIÓN DEL ENRAIZAMIENTO CON Agrobacterium rhizogenes EN Agave salmiana Otto Y COLONIZACIÓN DE LAS RAICES TRANSFORMADAS CON Glomus intraradices

PREGUNTA CIENTÍFICA

¿Agrobacterium rhizogenes será capaz de lograr la inducción del enraizamiento en

Agave salmiana Otto, y las raíces transformadas que se formen podrán ser colonizadas con

Glomus intraradices?

HIPÓTESIS

Agrobacterium rhizogenes es capaz de lograr la inducción del enraizamiento en

Agave salmiana Otto, y las raíces transformadas que se formen pueden ser colonizadas con Glomus intraradices. El objetivo general es:

Evaluar el porcentaje para la inducción del enraizamiento con Agrobacterium

rhizogenes en Agave salmiana Otto, así como la colonización de Glomus intraradices sobre

raíces transformadas.

Los objetivos particulares son:

A).- Evaluar el porcentaje para la inducción del enraizamiento en hojas,

tallo y raíz de Agave salmiana Otto, inoculadas con diferentes

concentraciones de Agrobacterium rhizogenes y acetosiringona.

B).- Verificar la eficiencia de transformación genética en las raíces adventicias formadas,

provenientes de hojas, tallo y raíz, a través de la actividad de GUS y presencia de los genes

rol B y nptII.

C).- Determinar el porcentaje de colonización de las raíces silvestres de A. salmiana

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D) Evaluar la susceptibilidad de las raíces transformadas de Agave salmiana a la

colonización por Glomus intraradices.

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1.- INTRODUCCIÓN

Los tejidos y meristemos de Agave salmiana Otto, no son sensibles a los

reguladores del crecimiento, aunque existan condiciones favorables, en cambio presentan

un lento crecimiento y desarrollo, almacenando una gran cantidad de inulina en el

menzonte, la cual utilizará para reproducirse (Gentry, 1982; Nobel, 1985). Su forma de

reproducción puede ser sexual y asexual, la asexual a través de rizomas, es de mayor

importancia, ya que la mayoría de las plantas de A. salmiana provienen de hijuelos de

rizoma, esta forma de propagación ha provocado muy poca variación genética (Gentry,

1982; Nobel, 1985).

La lenta reproducción y crecimiento de A. salmiana, es debido a cambios

fisiológicos, bioquímicos y morfológicos que ha sufrido con la finalidad de poder adaptarse

y subsistir en climas áridos, requiriendo de por los menos ocho años para llegar a la

maduración (Harborne, 1982; Nobel, 1996). Como una alternativa, para tratar de resolver

el lento crecimiento y reproducción masiva de A. salmiana, es la transformación genética a

través de Agrobacterium rhizogenes (Tempé, 1989; Lambert et al., 1992).

Por otro lado esta la asociación simbiótica entre hongos del orden Endogonales y la

mayoría de las plantas de tipo mutualista llamada micorriza arbuscular (MA), esta puede

modificar el balance de reguladores del crecimiento como auxinas, citocininas, giberelinas

y ácido abscísico, así como también sintetiza la tiamina, la cual incrementa

significativamente la formación de raíces adventicias, incrementando de esta forma el

tamaño y longevidad de la raíz (Legue et al., 1996; Gianinazzi, 1991; Goicoechea et al.,

1997). En las diferentes etapas del crecimiento de las plantas bajo condiciones de estrés, la

síntesis de tiamina disminuye por parte de las hojas, hasta ser insuficiente para el desarrollo

del meristemo radical (Chee, 1995).

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A. rhizogenes es una bacteria fitopatógena, la cual tiene la característica de infectar

principalmente a plantas dicotiledóneas, las cuales al ser dañadas físicamente secretan en

forma natural como un sistema de defensa, compuestos fenólicos, de entre los cuales se

encuentra la acetosiringona en una concentración de 100 µm, la cual le permite a A.

rhizogenes realizar un reconocimiento bioquímico y molecular, hacia el tipo de células

adecuadas para ser infectadas, de esta manera se activan los genes vir, los cuales a través

del ADN-T Ri, permite la transformación genética de los tejidos (Van der Salm, 1996;

Jofre- Garfias et al., 1997).

Para vencer la dificultad de enraizar a las especies recalcitrantes como es el caso de

los agaves y hacer crecer a las raíces en forma indefinida, con lo que posteriormente se

puede intentar formar hijuelos de raíz, lo anterior es mediante el uso de la transferencia de

genes mediada por A. rhizogenes, ya que posee un mecanismo de patogenecidad, que está

basado en la trasferencia de genes bacterianos hacia el genoma de plantas dicotiledóneas.

En este caso, el trastorno que produce es conocido como raíz pilosa, esta bacteria es capaz

de introducir a las células vegetales la información genética requerida para desencadenar en

ella el proceso de rizogénesis (Tempé, 1989; Lambert et al., 1992).

Se ha observado que diferentes cultivares de trigo silvestres, tienen una mayor

capacidad de colonización, respecto a las nuevas variedades seleccionadas a través, de la

genética tradicional (Hetrick et al., 1992). Los maíces criollos responden más

eficientemente a la colonización con la MA respecto a los maíces híbridos, los cuales

fueron seleccionados a través de la genética tradicional. Las plantas generadas a través de la

genética tradicional requieren de grandes dosis de fertilizantes, frecuentes láminas de riego

y un complejo control de plagas y enfermedades (Khalil et al., 1994).

Cuando una planta es atacada por un hongo fitopatógeno, probablemente exista

como respuesta, la expresión de alguno o su respectiva combinación de los siguientes

genes: fitoalexinas, glucanasa y quitinasa.

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El gen de la quitinasa fue expresado en maíz, para tratar de contrarrestar el ataque

del hongo fitopatógeno Cochliobolus heterostrophus. La introducción de algunos genes que

son expresados, para dar resistencia contra hongos fitopatógenos de las plantas, también

reducen el efecto de colonización con la MA. Existe la posibilidad de manipular

genéticamente la síntesis de fitoalexinas, aunque es más complicado debido al número de

genes implicados (Toth et al., 1990).

Para tratar de resolver los problemas sobre sensibilidad a reguladores del

crecimiento, y dificultad de enraizamiento de las especies recalcitrantes, se ha utilizado la

transformación genética con Agrobacterium rhizogenes. Las plantas generadas in vitro,

pueden presentar en algunos casos, los siguientes pasos críticos para poder adaptarse al

medio ambiente externo: 1) al existir una alta humedad en el medio de cultivo provoca,

poco desarrollo de la cutícula y el mecanismo de cierre de los estomas se encuentra

atrofiado (Thorpe y Comer, 1991; Bergmann y Stomp, 1994), 2) la anatomía de las hojas,

son por lo general más delgadas y con menor concentración de clorofila, además de no

realizar el proceso de fotosíntesis normal, ya que sus requerimientos de carbono, son

satisfechos por el azúcar agregada al medio de cultivo, y 3) el enraizamiento del tejido

meristemático para algunos casos es difícil. No existe asociación simbiótica benéfica tanto

para Rhizobium, como para la MA. Con relación a lo anterior el proceso de adaptación al

medio ambiente externo de una planta generada in vitro es difícil (Bécard y Piché, 1990;

Leifert et al., 1995).

No obstante, el cultivo de tejidos vegetales, ofrece alternativas importantes, en

cuanto a la propagación de materiales seleccionados pudiendo obtenerse características

genéticas homogéneas, evitar la diseminación de patógenos presentes en el suelo, y

producir masivamente las plantas requeridas. Comparándolo con las técnicas de

propagación tradicional, se tiene la ventaja de que se puede obtener un mayor número de

plantas en menor tiempo y espacio a manera de un proceso continuo que no se ve afectado

por las variaciones ambientales y estaciónales (Bergmann y Stomp, 1994).

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De acuerdo con lo anterior, se planteó el siguiente cuestionamiento: ¿Agrobacterium

rhizogenes será capaz de lograr la inducción del enraizamiento en Agave salmiana Otto, y

las raíces transformadas que se formen podrán ser colonizadas por Glomus intraradices?

Para dar respuesta a la pregunta anterior se estableció la siguiente hipótesis:

Agrobacterium rhizogenes es capaz de lograr la inducción del enraizamiento en diferentes

partes vegetativas de Agave salmiana Otto, y las raíces transformadas que se formen

pueden ser colonizadas con Glomus intraradices.

El objetivo general fue:

Evaluar la inducción del enraizamiento con A. rhizogenes en A. salmiana, así como

la colonización de G. intraradices sobre raíces transformadas.

Los objetivos particulares fueron:

A).- Evaluar la inducción del enraizamiento en hojas, tallo y raíz de A. salmiana,

inoculadas con diferentes concentraciones de A. rhizogenes y acetosiringona.

B).- Verificar la eficiencia de transformación genética en las raíces adventicias formadas,

provenientes de hojas, tallo y raíz, a través de la actividad de GUS y presencia de los genes

rol B y nptII.

C).- Demostrar si las raíces silvestres de A. salmiana se encuentran colonizadas por una

MA.

D) Determinar la susceptibilidad de las raíces transformadas de A. salmiana a la

colonización por G. intraradices.

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2.- ANTECEDENTES

2.1 Taxonomía y distribución de Agave salmiana Otto

Gentry (1982) agrupa a los Agaves de Norteamérica de la siguiente manera: el

subgénero littaea está integrado por 8 secciones con 54 especies, 4 subespecies, 6

variedades y 7 formas. El subgénero Agave lo integran 12 secciones con 82 especies, 21

subespecies y 23 variedades, en total 197 taxas. Su clasificación taxonómica es: Reino:

Plantae, Subreino: Embryobionta, División: Manoliophyta, Clase: Liliopsida, Orden:

Liliales, Familia: Agavaceae, Género: Agave, Especie: salmiana Otto ex Salm ssp.

crassispina (Trel.) Gent ry).

El vocablo Agave es de origen árabe y significa admirable. El Agave salmiana es

una planta perenne monocotiledónea, con flor monocárpica y considerada como una de las

especies del género Agave más vigorosas de las regiones semiáridas de México. Forma

parte de los matorrales xerófilos, de las zonas áridas y semiáridas. La familia Agavaceae, es

endémica de América y se distribuye al sur de Canadá, México y Centroamérica, norte de

Suramérica e Islas del Caribe. En la región de Pinos, Zacatecas y el Altiplano Potosino, se

encuentra completamente distribuido el maguey verde o mezcalero (Agave salmiana Otto),

su uso principal esta destinado, para la agroindustria productora de mezcal. Su roseta mide

de 80 a 120 cm de grosor (Rzedowski, 1978).

Aunque en el área del Altiplano Potosino se encuentran plantas de hasta 180 cm de

altura, las cuales presentan un tallo fibroso suculento cuando vivo y leñoso cuando seco y

muerto, capaz de engrosar como órgano de almacenamiento (“Piña”) mediante la

eliminación de la yema floral. Raíces abundantes, fibrosas, radiadas y extendidas

superficialmente.

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Las hojas son relativamente pocas, anchas en forma lanceolada, suculentas con una

longitud de 60-90 cm y ancho de 16-25 cm, cóncavas a través de la mitad de la hoja y

anchas hacia la base convexa: rígidas, acuminadas, verde pardusca, el margen ondulado

arenífero, con dientes firmes y anchos en la base de 7-12 mm de largo, café oscuro,

cambiando a parduzco conforme crece la planta, 1-3 cm de separados: espinas subuladas de

5 a 9 cm de largo, acanalado arriba de los ¾ de su longitud (Rzedowski, 1978).

Presenta un escapo de 7 a 8 m de alto, el cual está imbricado en largas bracteas

flexibles, presentando en la parte superior una inflorescencia, la cual es una panícula ancha

de 15 a 20 umbelas descompuestas. Flores generalmente amarillas de 7 a 9 cm de largo

(Nobel, 1985).

En el Altiplano Potosino-Zacatecano se localizan 5 especies de maguey las cuales

son: Agave scabra spp. potosiensie, A. parrasana Berger, A. americana L., var oaxacensis,

A. mapisaga Trel. var. masipaga y Agave salmiana Otto que esta última especie es la de

mayor distribución, abundancia e importancia respecto a los otros magueyes, los cuales se

encuentran formando parte del componente del matorral crasicaule, y del matorral desértico

micrófilo. El clima donde se desarrollan es seco estepario (BS), según la clasificación de

Köppen, corresponde a los climas secos o áridos, con una precipitación pluvial escasa de

325.8 a 502.8 mm y una temperatura media anual de 16 a 18.70C, encontrándose a altitudes

que van de 1800 a 2400 msm y predomina en suelo litosol eútrico de textura media, con pH

de neutro a alcalino, también se adapta a suelos y laderas pedregosas, con pendientes

menores al 8% (García, 1973; Gentry, 1982).

La suculencia es una de las características de la familia Agavaceae, captan el agua

durante la época de precipitación y la disponen en los tiempos de sequía. El metabolismo de

los Agaves es el CAM (metabolismo ácido de las crasuláceas por sus siglas en inglés), en

las noche a 150C abren sus estomas para fijar CO2 y durante el día los mantienen cerrados,

llevando a cabo de esta manera la actividad de fotosíntesis, evitando así una pérdida

excesiva de humedad, por medio de la transpiración (Nobel et al., 1996).

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2.2 Problemática de Agave salmiana Otto

El aprovechamiento de los recursos naturales, constituye un renglón importante en

el desarrollo económico y social para la población. Debido al bajo precio de las piñas de

Agave ha propiciado el desmonte y tala inmoderada de la vegetación nativa de la región,

para tratar de abrirlas a cultivos más remunerativos (Rzedowski, 1978).

La nevada del 12 de diciembre de 1997 sumada a los otros factores antes

mencionados, es lo que ha provocado la carencia de Agave salmiana Otto, así como la

pérdida de la vegetación nativa y fauna silvestre natural. Esto ha traído como consecuencia

la escasez de piñas de Agave, observándose el decrecimiento en la producción en las

agroindustrias de la región, ya que a principios de siglo, se reportó la existencia de más de

50 mezcaleras en Pinos, Zacatecas. En 1964 sólo se encontraban 10, en 1981 existían 6 y

en 1996 sólo se encontraron trabajando 3 (Blomberg, 2000).

Las zonas ecológicas que han sufrido severos daños, debido al desmonte y tala

inmoderada de Agave salmiana Otto son los municipios de Pinos y Villa Hidalgo, en el

estado de Zacatecas; Ahualulco, Salinas de Hidalgo, Villa de Ramos, Mexquitic, Cedral,

Venado, Charcas, Moctezuma, Villa de Arriaga, Villa de Reyes, Armadillo de los Infante,

Soledad y Matehuala en el estado de San Luis Potosí; Cuencamé, Gómez Palacio y Ciudad

Lerdo del estado de Durango; Huajuapan de León del estado de Oaxaca; Altamirano y

Chilpancingo del estado de Guerrero (Rzedowski, 1978).

Además, Gentry (1982) registra algunas pequeñas colectas de Agave salmiana Otto

en: Saltillo, Coahuila, al norte de Querétaro, en el Cerro las Canteras del estado de

Hidalgo, al norte y suroeste de Tehuacán, Puebla, al norte de Oaxaca y Valle del Mezquital.

Los estados que producen mezcal, y cuentan con la denominación de origen a partir

de 1995 son: Oaxaca, Guerrero, Durango, San Luis Potosí y Zacatecas. Estos Estados

enfrentan, el gran problema de la escasez de Agave, como materia prima para la elaboración

del mezcal (Blomberg, 2000).

- 20 -

2.3 Importancia de Agave salmiana Otto

Las bebidas producidas con Agave son: aguamiel, pulque y mezcal. Además, el jugo

extraído de Agave salmiana tiene un alto precio en el mercado nacional e internacional por

ser rico en carbohidratos contiene 7% de fructosa y minerales (Fe, Ca, Mg y K). Su poder

endulzante es el doble que el azúcar común, es un excelente potenciador del sabor y del

aroma. Al ser consumido, no se requiere de insulina, en las primeras fases de su

metabolización (Valenzuela, 1997). El género Agave ha tenido y tiene una importancia muy

grande en diversos grupos de poblaciones de nuestro país. Se puede establecer que ningún

otro grupo de plantas silvestres, ha tenido tantas modalidades de utilización como los

magueyes, ya que también lo utilizan como forraje. El maguey ha sido un elemento

importante también para los moradores del Altiplano Potosino-Zacatecano (Blomberg,

2000).

Desde la época prehispánica, cuando la región era habitada por los Huachichiles

(chichimecas), el Agave era recolectado y aprovechado como alimento y vestido

principalmente, permitiéndoles subsistir en condiciones adversas. Del maguey tomaban

aguamiel y comían las hojas, raíces y tallos cocidos en hornillos que llamaban “mixcali”.

En lo que se refiere al Agave salmiana Otto una de las principales formas de utilización

actuales es para la fabricación de mezcal, realizándose ésta desde el tiempo de las

haciendas, englobándose dicha práctica, dentro del proceso de producción como una

agroindustria. De esta manera se origina el mezcal de Pinos, Zacatecas bebida embriagante

producto de la destilación del maguey (Rzedowski, 1978).

2.4 Antecedentes sobre la micorriza

Durante la segunda mitad del siglo XIX, varios investigadores notaron la presencia

de hongos en las raíces de las plantas, que no mostraban ningún síntoma de enfermedad o

necrosis. Las micorrizas son tan antiguas como las propias plantas, hecho deducido de la

observación del primer registro fósil, que se conoce de un vegetal, el fósil (Aglaophyton)

del cuarzo Rhynie fechado en 370 millones de años, en la fase temprana Devoniana

(Nicolson, 1975).

- 21 -

Cuando la vida era únicamente acuática, los vegetales podían utilizar directamente

los elementos minerales disueltos en el agua, y encontraban fácilmente recursos casi

inagotables. Posteriormente las plantas comenzaron a colonizar las tierras emergidas, hace

unos 400 millones de años en el período Devónico, en donde encontraron condiciones

totalmente adversas y hostiles. Los suelos procedentes de la degradación de las rocas, en

donde los elementos minerales se encontraban básicamente en forma insoluble, su

concentración fue extremadamente pequeña, en las soluciones del suelo y los intercambios

entre las formas solubles, e insolubles fueron lentos. Por lo tanto, las soluciones de

elementos minerales en el suelo se agotaban rápidamente, debido a la extracción que las

raíces llevaban a cabo sobretodo en la zona radical. Las primeras plantas terrestres tuvieron

que adaptarse, a estas condiciones tan especiales, y solamente las que pudieron asociarse a

hongos, y a ciertas bacterias consiguieron colonizar los continentes (Le Tacon, 1985).

Por lo anteriormente citado, se puede concluir, que las plantas y los hongos

micorrízicos, han evolucionado paralelamente, de tal manera que se han dado diferentes

grados, de interdependencia.

El término ¨micorriza¨, fue primeramente propuesto por el patólogo alemán Albert

Frank en 1885, quien lo tomó del Griego: m̈ykes¨ (hongo) y r̈hiza¨ (raíces) (Harrison,

1997). Las micorrizas son pues, las asociaciones entre ciertos hongos del suelo y las raíces

de las plantas, siendo consideradas como el fenómeno de la naturaleza más inesperado y

sorprendente. Cincuenta años antes de Frank, estas asociaciones ya eran consideradas, de

naturaleza parasítica, hasta que en 1987 se pudo demostrar que la colonización de las raíces

era más bien simbiótica en vez de parasitaria (Hayman, 1987).

Ames (1987) plantea que debido a que la micorriza tiene una gran distribución, entre

las plantas es necesario revisar el término de rizósfera, en otras palabras, se tendría que

adoptar posiblemente con más realidad el término de micorrizósfera.

- 22 -

2.5 Clasificación de los diferentes tipos de hongos micorrízicos

Peyronel et al., (1969) para salvar dificultades, que se presentaron para definir

dicha asociación, propuso dividir a las micorrizas en tres grupos: Ectomicorrizas (EM),

Ectoendomicorrizas (EEM) y Endomicorrizas (ED), posteriormente esta clasificación fue

modificado por Harley y Smith (1983).

La micorriza arbuscular (MA) puede en algunos casos ser reemplazada por una EM,

en diferentes hospederos bajo condiciones ecológicas alteradas, lo cual sugiere una

influencia climática en el suelo, y otros factores abióticos. Así como también se demuestra

la evidencia de la existencia, de genes para la simbiosis en forma dual entre la MA y la

EM, los cuales no se han perdido aun (Miller et al., 1982).

Este fenómeno es muy común en muchas especies de Pináceas, las cuales son

colonizadas naturalmente por la MA en el bosque. Como es el caso de los géneros: Prunus,

Populus, Casuarina, Salix y Acacia. Se encontró que la MA era sucedida por la EM,

presentándose en el sistema radical de Eucalyptus dumosa. Al ser sustituida la MA por la

EM, esta última no encuentra ninguna diferencia para formar su manto fúngico sobre la

MA existente, pero la EM deja una barrera que impide, la subsecuente colonización de otro

hongo micorrízico arbuscular. Las familias que forman tanto EM como MA son:

Juglandaceae, Tiliaceae, Myrtaceae, Salicaceae, Fagaceae y Cesalpiniaceae (Harley y

Smith, 1983).

Las micorrizas ericales se clasifican en tres grupos:

1).- micorriza monotropoide.

2).- micorriza arbutoide.

3).- micorriza de ericoides. Los dos primeros grupos pertenecen a las EEM, y el tercer

grupo pertenece a las ED (Reid, 1990).

- 23 -

2.5.1 Las endomicorrizas

El 90% de las especies vegetales existentes sobre la corteza terrestre, forman este

tipo de asociación. Se caracterizan por: la penetración ínter e intracelular en las células

corticales y epidérmicas de la raíz, formando arbúsculos que aseguran una gran superficie

de contacto entre ambos asociados, las endomicorrizas (ED) no se introducen a los sistemas

vasculares y meristemos. El abundante micelio, que se ramifica a través de la raíz y se

extiende hacia fuera del suelo, forma una maraña. Carecen del manto fúngico externo

visible de Sheating, y de la red interna de Hartig. Los hongos ED son ficomicetos

microscópicos de la familia Endogonaceae. Se pueden distinguir por su tinción en el

laboratorio, para discernir la estructura fúngica y el grado de colonización de la raíz

(Morton y Benny, 1990; Wilcox, 1991).

Las endomicorrizas ocupan la mayor atención y se subdividen según Scnnerini y

Bonfante-Fasolo (1982) en:

1).- Micorriza de ericoides, poco importante como biofertilizante, se encuentra en la

mayoría de los géneros de plantas, de la familia Ericaceae. Están generalmente asociadas

con sistemas radicales ramificados, carentes de pelos radicales y con diámetro radical muy

corto (1-3 capas de células corticales), penetran la pared de las células corticales e

invaginan la membrana plasmática. Se desarrollan principalmente en tierras árticas con clima

boreal. Tienen las siguientes estructuras características: sin manto de hifas, sin red de

Hartig, hifas retorcidas en las células radicales, hongos asociados Ascomycetes

(Basidiomycetes).

2).- Micorriza de orquídeas, no son consideradas importantes como biofertilizante, tan sólo

lo son para las orquídeas ya que promueven la germinación de sus diminutas semillas,

soportan el crecimiento de especies aclorofílicas. Se desarrollan principalmente en tierras

calientes, con pH ácido y en suelos pantanosos. Tienen las siguientes estructuras

características: sin manto de hifas, sin red de Hartig, hifas retorcidas en las células

radicales, posiblemente haustorio no ramificado micelio hialino, hongos asociados

Ascomycetes (Basidiomycetes).

- 24 -

3).- Micorriza arbuscular, la más extendida sobre el planeta, tanto por el número de

hospederos, como por su distribución geográfica. Ocurren en el 96%, de las plantas

vasculares (alrededor de 300,000 especies). Desde el punto de vista biofertilizante, el orden

de mayor interés, son los Glomales (Walker, 1992).

Morton y Benny (1990) definen dos estructuras que son características de la MA:

1) Las vesículas son grandes hifas infladas, en forma globosa usualmente llenas con

lípidos, las cuales son necesarias durante las primeras etapas de crecimiento de la MA,

además sirven como órganos de energía y almacenaje, o como estructuras reproductivas.

2) Los arbúsculos son minúsculas ramificaciones dicotómicas, muy finas intracelulares los

cuales invaginan la membrana plasmática, sirviendo como sitio de intercambio nutrimental

entre el hongo y el hospedero, los arbúsculos presentan una vida media de 9 a 15 días, al

cabo de los cuales se colapsan, o son digeridos por la célula hospedera, después de un gran

período de actividad metabólica. La interfase entre el plasmalema de los arbúsculos y la

membrana plasmática del hospedero están separadas por una matriz interfacial (espacio

apoplasto), tanto el plasmalema como la membrana plasmática, tienen actividad ATPásicas.

Estas micorrizas tienen abundante micelio, que ramifica a través de la raíz y se extiende

hacia fuera. Las hifas extraradicales tienen diferente función y morfología y pueden ser:

hifas infectivas, hifas de absorción e hifas fértiles, en las cuales su crecimiento, desarrollo

y senescencia son poco conocidos (INVAM, 1997).

Al observar en un microscopio estereoscópico las esporas, estas se separar con la

ayuda de una pipeta Pasteur, en grupos discretos de acuerdo a su tamaño, color, forma,

estructura basal, estructura de la pared, hifa de sostén y ornamentación, su morfología

puede cambiar de acuerdo a factores edáficos, y su color cambia de acuerdo a la edad de la

espora (Morton y Benny, 1990).

- 25 -

El orden Glomales incluye alrededor de 150 especies de HMA descritas, las cuales

se han clasificado en base a sus características morfológicas y estruc turales, de las esporas

asexuales (Cuadro 1).

Cuadro 1. Clasificación taxonómica de los hongos micorrízicos arbusculares División Subdivisión Clase Orden Suborden

Eumycota Zygomycotina Zygomycetes Glomales Familia

Géneros

Esporas del tipo

Forman:

Glomineae

Glomaceae Acaulosporaceae

Glomus Sclerocystis Acaulospora Entrophospora

Clamidospórico Clamidospórico Azigospórico Azigospórico

V y A V y A V y A V y A

Gigasporineae Gigasporaceae

Gigaspora Scutellospora

Azigospórico Azigospórico

A A

Azigospórico.- Esporas de origen partenogénico. Clamidospórico.- Esporas de origen asexual. V = Vesículas. A = Arbúsculos. Fuente: (Walker, 1992; Walker y Trappe, 1993).

Las MA no modifican la morfología de la raíz, y sus diferentes tipos de asociaciones

se pueden observar en el Cuadro 2.

2.5.1.1 Detección molecular de la colonización MA

La detección molecular de las raíces colonizadas por la MA, se puede realizar a través

de la amplificación enzimática del ADN, por medio de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) (Simón et al., 1993).

Para su desarrollo se utiliza el oligonucleótido universal para Glomales VANS14, en

conjunto con el oligonucleótido NS21, los cuales permiten la amplificación de un fragmento

550 pb, dentro de la secuencia del gen que codifica para la subunidad 18S del ADN ribosomal

(ADNr) de la MA, mientras que el ADN genómico de la planta no se amplifica. Los productos

de la amplificación se fraccionan en un gel de agarosa-TAE al 1.5% (Redecker, 2000).

- 26 -

Cuadro 2. Subdivisión de las endomicorrizas

Tipo de micorriza Clase del simbonte

Géneros de hongos micorrízicos

Árboles y plantas hospederos

Estructura característica de la MA

Endomicorrizas (ED) Se han reportado en regiones tropicales, templadas y árticas. Se subdividen en: micorriza de ericoides, micorriza de orquídeas y micorriza arbuscular (MA). La MA ocurre en el 96% de las plantas vasculares. (Alrededor de 300,000 especies).

El orden Glomales se subdivide en las siguientes familias: Glomaceae Acaulosporaceae Gigasporaceae

Glomus Sclerocystis Acaulospora Entrophospora Gigaspora Scutellospora

Trigo, maíz, tomate, cebolla, fresa, leguminosas, Oleaginosas, pastos, manzano, naranjo, limonero, Eucalyptus, Cupressus, Picea, Sequoia (VAM), Arbustos, árboles, plantas de las graminoides y herbáceas de las gimnospermas y angiospermas, plantas inferiores Algas y helechos de Bryophyta y Pteridophyta.

Sin manto de hifas, sin red de Hartig, hifas retorcidas en las células radicales, haustorio finamente ramificado o sin ramificar (arbúsculos), formación de vesículas en o entre las células, hifas aseptadas.

Fuente: (Brown, 1982; Walker, 1992; Walker y Trappe,1993).

El INVAM cuenta con su propia tabla de colores en la que se utilizan distintas

combinaciones de azul, magenta, amarillo y negro. En el caso de personas que no han

recibido, un amplio entrenamiento esta técnica de identificación, puede resultar de enorme

complejidad, por lo que los marcadores moleculares basados en el ADN, a través del

polimorfismo del ADN amplificado aleatoriamente (RAPDs), es posible obtener sus

¨huellas genéticas¨, por lo que podría ser una excelente herramienta, para estudios de:

taxonomía, relaciones evolutivas, variabilidad genética y relación filogenética ente los

HMA. Para su identificación en plantas colonizadas, se han usado métodos inmunológicos,

enzimáticos y sondas moleculares capaces de distinguir la especie del HMA colonizador, y

determinar si la raíz está colonizada por más de un endófito (INVAM, 1997).

- 27 -

2.5.1.2 Factores que influyen en la colonización

Para que se forme la colonización en un medio natural, dependerá de los siguientes

factores: la existencia de algún tipo de propágulo radical infectado con la MA en el suelo,

la presencia de una planta susceptible hacer dependiente de la MA. Así como la

especificidad de los hongos a las condiciones físicas, químicas y microbiológicas del suelo

(Morton y Benny, 1990).

Azcon et al., (1984) demostraron la interacción sinérgica entre Azotobacter

chroococcum, Rhizobium y Pseudomonas sp. (bacterias solubilizantes de fosfatos), las

cuales producen reguladores del crecimiento, los cuales son también un factor que les

permite incrementar la colonización de la MA en las plantas.

Por su tamaño y localización de las esporas, estas no pueden ser diseminadas por el

viento. Su desplazamiento y dispersión se debe principalmente por movimientos del suelo,

contacto radical, agua, así como también por la acción de pequeños animales o insectos que

pueden comerlas y eliminarlas en sus heces fecales. Esta restricción en el mecanismo de

dispersión tiene su significado, porque reduce la habilidad a colonizar plántulas que se

encuentran creciendo en medios artificiales, el cual carece de hongos que forman la MA

(Azcon et al., 1984).

Jaen (1989) y Harrison (1997) establecieron que son cuatro, los factores que pueden

determinar el éxito, para la eficiente colonización simbiótica con la MA:

a).- El genotipo de la planta hospedera, para el reconocimiento bioquímico y molecular, lo

cual esta en función de la relación gene – gene respectivamente.

b).- La efectividad de las especies de hongos endomicorrízicos, puede promover o inducir

la expresión genética la cual induce considerables cambios metabólicos, fisiológicos y

morfogenéticos en ambos simbiontes, promoviendo así la génesis de nuevos compuestos.

El apresorio no se forma en raíces no hospederas, ni en membranas o medios sintéticos.

- 28 -

c).- La cantidad de fósforo disponible en la solución del suelo, y la forma de defensa de la

planta.

d).- Los requerimientos de fósforo, por parte de la planta hospedera, para lograr una

mayor producción.

Al existir una menor cantidad de fósforo asimilable, en la solución del suelo se

incrementa en la planta la síntesis de la enzima fosfatasa, la cual inhibe a las lectinas y

permite el desarrollo de la MA. Al existir una mayor cantidad de fósforo asimilable,

decrecerá en la planta la síntesis de la enzima fosfatasa, lo anterior permite que no se

inhiban las lectinas promoviendo así que se bloqueé el desarrollo de la MA (Hayman,

1987).

Otros factores del suelo que participan, en la colonización de la MA son: la

temperatura, la humedad, el pH, el nivel de oxígeno en la rizósfera y luminosidad. Algunas

especies de la MA, alcanza el óptimo crecimiento desde los 10 hasta los 30, y a los 400C se

inhibe por completo su crecimiento. Las esporas de los hongos micorrízicos son inhibidas en

su germinación, bajo condiciones de estrés hídrico con la subsecuente, colonización deficiente

de las raíces (Reid y Bowen, 1977; Daniels, 1984).

En suelos muy húmedos e inundados, los cuales presentan escasa aireación, están

desprovistos de hongos MA. Las plantas con problemas de saturación de agua, dan origen a

que las esporas de las endomicorrizas se colapsen y no germinen, de este modo nuevamente la

colonización se reduce sensiblemente (Reid y Mexal, 1977).

Las altas intensidades de luz, estimulan una mayor síntesis de arbúsculos en

comparación con las bajas intensidades, lo cual esta íntimamente correlacionada con altos

suministros de carbohidratos en las raíces (Hayman, 1974). Una reducción del 50% de la

intensidad luminosa en tabaco, disminuyó el porcentaje de colonización de 85 a 31%

(Gerdeman, 1968; Mosse, 1968).

- 29 -

Las bajas intensidades de luz en los invernaderos durante el invierno, promueven que

se reduzca la colonización por parte de la endomicorriza. También los cultivos inoculados con

endomicorriza bajo condiciones de fuerte sombreado se observó que se redujo la formación de

esporas en un 80% (Mosse, 1973).

Los hongos micorrízicos arbusculares del género Glomus, prefieren suelos

ligeramente alcalinos o neutros. El encalado de suelos ácidos, favorece a que otros géneros

que son nativos o específicos de suelos ácidos no se desarrollen. En el sentido estricto, no

hay especificidad entre las plantas superiores y las especies de HMA, cualquier hongo

puede colonizar cualquier planta susceptible. Sin embargo, se presentan grandes diferencias

en cuanto a la morfología de la infección y el grado de colonización que producen, así

como en la efectividad de la simbiosis, cuando se utilizan determinados tipos de hongos y

especies de plantas (Nelsen et al., 1981).

Los HMA actúan en forma diferente, en diversos ambientes. Una especie de HMA

que presenta un costo neto en una situación, puede presentar un beneficio neto en otra.

Algunos HMA pueden ser patógenos en unos hospederos y simbiontes en otros (Trappe,

1987). La relativa abundancia de hifas y esporas encontradas en el suelo, para una especie

determinada, no necesariamente refleja la cantidad de raíces colonizadas, y su importancia

funcional como contribución a la biomasa, ya que también pueden estar presentes, algunas

especies de HMA que no esporulen, las esporas colectadas en el campo son difíciles de

identificar, como resultado de la degradación de la pared (Morton y Benny, 1990; Wilcox,

1991).

2.5.1.3 Dependencia de la micorriza arbuscular

Existen plantas que son totalmente independientes a la MA, como por ejemplo:

Cruciferae, Fumariaceae, Cyperaceae, Commelianaceae, Urticaceae, Polygonaceae y

Chenopodiaceae, lo anterior no debe considerarse como una regla debido a que se han estado

reportando algunas especies, con colonización micorrízica dentro de estas familias.

- 30 -

En cambio existen plantas que son dependientes a la MA, y son incapaces de

desarrollarse en suelos de elevada fertilidad como por ejemplo: las orquídeas, algunas

especies de cítricos. Las especies del orden Magnoliales, las angiospermas más primitivas,

ancestro de todas las mono y dicotiledóneas, son especialmente dependientes a la MA para

captar nutrientes, es decir, son altamente micotróficas, así como también existen plantas

que muestran facilidad a la simbiosis con la MA, como la cebolla y la zanahoria la cual

pertenece a la familia Umbelliferae (Bécard y Piché, 1990).

La respuesta a la micorrización no depende únicamente del hongo, sino también de

la planta huésped. Todos los árboles forestales tropicales, los naranjos, los limoneros, las

leguminosas, las liliáceas etc., son casi totalmente dependientes de la MA, por el contrario,

las gramíneas responden relativamente poco a la colonización. Estas diferencias de

respuesta guardan relación con el desarrollo del sistema radical y de los pelos absorbentes

de la planta huésped (Morton y Benny, 1990).

De esta forma, la arquitectura y morfología radical determina el número potencial

de los sitios de colonización. Generalmente aquellos frutales y las plantas en general con

raíces gruesas y pocos pelos radicales, son los que tienen una menor área de contacto raíz-

suelo, son los que se benefician más con la MA que aquellas que poseen una gran densidad

de raíces secundarias, terciarias y abundantes pelos radicales (Gerdemann, 1975).

Baylis (1975) plantea la hipótesis en donde se considera la morfología y la

geometría del sistema radical, como los factores determinantes del grado de micotrofia de

las plantas. Describe los sistemas radicales del tipo ¨magnoloides¨, como muy poco

ramificadas, en ellas las divisiones más pequeñas son raramente menores a 0.5 mm de

diámetro. Incluye también en este grupo, otras plantas pertenecientes a ordenes diferentes.

Estas raíces carecen de pelos radicales, o bien los tienen cortos y en escaso número, las

plantas que incluso los poseen, dependen de la colonización aún en suelos muy fértiles.

- 31 -

En el extremo opuesto Baylis (1975) sitúa, a las raíces del tipo ¨graminoide¨, como

muy ramificadas con diámetros que usualmente son menores a 0.1 mm, y frecuentemente

están cubiertas de largos pelos radicales.

Las plantas con raíces de este tipo, sólo responden a la inoculación a la MA, en

suelos deficientes en fosfatos asimilables, y son consideradas como micotróficas

facultativas.

Sin embargo Hayman (1987) señala que hay excepciones a esta hipótesis, ya que

encontró plantas con raíces del tipo graminoide, fuertemente dependientes de la MA. Azcon

et al., (1984) sugieren la existencia de otros factores de tipo fisiológico o anatómico, que

influyen en la mayor o menor dependencia de una determinada planta a la MA.

La captación de nutrientes en una forma más eficiente por parte de la raíz

colonizada con la MA, permitirá trasladarlos a las hojas receptoras, ocasionando así que la

planta cuente con un buen abastecimiento de macro y micronutrimentos, propiciando de

esta manera una mejor producción de materia verde. En cambio la MA recibe de la planta

hospedera, algunos productos de la fotosíntesis como fuente de energía. Como

consecuencia, el peso seco de la parte aérea así como el peso seco de la raíz, será

normalmente más alto en plantas colonizadas respecto a plantas no colonizadas (Smith,

1980).

2.5.1.4 Especificidad de la micorriza arbuscular

Existen varios factores importantes a considerar cuando se habla de la especificidad,

los cuales están relacionados con las condiciones del suelo como: físicos, químicos y

microbiológicos involucrados en la interacción planta con MA. Los niveles de macro y

micronutrientes asimilables, dentro de los macro influye en forma determinante, la cantidad

de fósforo asimilable. El pH del suelo, influye selectivamente sobre las distintas especies de

HMA (Morton y Benny, 1990).

- 32 -

Se ha demostrado que existe cierta especificidad, entre determinados factores del

suelo respecto las especies de HMA predominantes. En poblaciones de plantas en donde la

simbiosis ha ocurrido en forma natural y en suelos no alterados, la mejor forma de evaluar la

actividad extensiva, el potencial simbiótico y el potencial de sobrevivencia de los HMA, es

examinando microscópicamente las raíces de la vegetación presente.

Estos hongos tienen la capacidad de colonizar muchas especies de plantas con flores,

en diferentes hábitats y en casi todos los tipos de suelos, por lo que se les considera

cosmopolita (Harrison, 1997).

Los HMA han sido encontrados en suelos tropicales, templados, áridos, árticos, e

incluso especies individuales pueden tener una amplia distribución. De esta forma, los HMA

son generalmente abundantes en praderas, savanas, selvas, bosques perennifolios, bosques

caducifolios, taiga, tundra, desiertos, semidesiertos y dunas de arena. Desde el punto de vista

práctico, el hecho de seleccionar un determinado tipo de HMA específico, que sea

altamente eficiente para un determinado sistema: suelo, planta y clima, es la clave para

lograr una mayor eficiencia en la producción y abaratar costos en la producción, evitado de

este modo el uso indiscriminado de agroquímicos (Gianinazzi, 1991).

2.5.1.5 Relación de la micorriza arbuscular con la fertilidad del suelo

Diversos factores pueden afectar el desarrollo, actividad y sobrevivencia de la

micorriza arbuscular. Dentro de los más importantes se encuentran las prácticas culturales

agrícolas, particularmente la adición de fertilizantes, aplicaciones de pesticidas y rotaciones de

cultivos, de igual forma los factores medioambientales son determinantes (Gianinazzi, 1991).

Los cambios en la fertilidad del suelo, debido a correcciones con fertilizantes minerales o

materia orgánica, pueden afectar marcadamente la actividad de la población micorrízica del

suelo, en términos de la cantidad de raíz colonizada y el número de esporas producidas

(Hayman, 1981).

- 33 -

Generalmente una alta fertilización química con N, P y K en forma completa al

suelo, conducen a una colonización mínima por parte de la micorriza arbuscular, a tal grado

que difícilmente se encontrarán asociaciones simbióticas, en suelos cultivados

intensivamente, en donde la MA tiende a extinguirse(Gianinazzi, 1991).

La fertilización química aplicada, puede disminuirse de un 50 a 80%, ya que la MA

mejora la absorción de nutrientes del suelo.

Del 40 al 50% de los fertilizantes químicos aplicados, se lixivian contaminado:

suelos, ríos, arroyos, mantos friáticos y la atmósfera (Plenchette et al., 1983; Harrison,

1997).

La micorriza arbuscular aparentemente no desempeña un papel importante en la

absorción directa del nitrógeno, pero se ha demostrado que incrementa la capacidad de la

fijación de nitrógeno en las leguminosas. La mayoría de las plantas colonizadas se benefician

con la simbiosis y muestran un incremento en el crecimiento, su absorción de nutrientes, su

fijación de N2 atmosférico (si también se le asocia con Rhizobium o con Frankia) etc., sin

embargo, la mayoría de las plantas muestran estas respuestas fisiológicas, a la MA a niveles

bajos de P en la solución del suelo. Así como también con una alta fertilización

nitrogenada, se ha demostrado que se afecta negativamente la simbiosis con la micorriza

arbuscular (Daft y El-Giahmi, 1974; Boisson-Dernier et al., 2001).

El nivel de P en la solución del suelo, está relacionado con la colonización radicular

por la MA, al haber un nivel bajo de P, hay un bajo nivel de fosfolípidos en la membrana

vegetal, que conduce a una mayor exudación radicular, lo cual trae como consecuencia una

estimulación en la colonización del endófito. Las formas existentes del fósforo en el suelo,

son poco solubles en el agua y por ello su concentración es muy pequeña, en la solución del

suelo (0.03 mg litro-1) (Nelsen et al., 1981).

- 34 -

Entre el 95-99% del fósforo del suelo, no está disponible para las plantas, esto

incluye las formas orgánicas y mineral insoluble. La adición de cantidades bajas de

fertilizante fosfatado es compatible, e incluso beneficia la simbiosis con la MA, ya que

estimula el crecimiento de la planta, pero al incrementar la dosis se comienza a interferir la

formación de la simbiosis, llegándose incluso a la inhibición de la infección. Las diferentes

especies de HMA, muestran distintos grados de resistencia a la aplicación de fertilizantes y

productos fitosanitarios, lo anterior trae como consecuencia, el interés práctico en relación

con la selección de los HMA, específicos para una planta en un determinado suelo, que ha

recibido dichos aportes (Hayman, 1982).

El transporte del fosfato, desde la solución del suelo, hacia la planta se presenta en

tres fases: 1) el fosfato es captado por las hifas externas de la planta, unas 1000 veces más

rápido, que por la difusión a través de la solución del suelo, 2) posteriormente el fosfato es

trasladado a través de las hifas intra radicales, y 3) finalmente se da la trasferencia al

citoplasma o es acumulado en las vacuolas, en forma de gránulos de polifosfato, el cual es

impulsado a través del lumen de las hifas, por corrientes citoplasmáticas hacia los

arbúsculos, en donde el polifosfato es degradado y el ion fósforo es transferido a la célula

hospedadora (Le Tacon, 1985).

Las micorrizas facilitan la absorción de los elementos menos solubles y móviles

como: fósforo, amonio, potasio, cobre, fierro y zinc. Para la formación de los gránulos de

polifosfatos, intervienen las polifosfatoquinasas específicas situadas en las hifas externas,

mientras que en la degradación de dichos gránulos intervienen, las fosfatasas alcalinas

(Subramanian et al., 1995; Estrada y Davies, 2001).

2.5.1.6 Beneficios de la simbiosis con la micorriza arbuscular La MA

La MA proporciona, los siguientes beneficios a las plantas hospederas: rompen la

latencia de algunas semillas, producen antibióticos que pueden, reducir el efectos de

patógenos fúngicos, supresión del efecto de nematodos parásitos.

- 35 -

Incremento en la absorción de agua ya que: el potencial hídrico, resistencia

estomatal, tasa de traspiración, área foliar y tasa fotosintética son mayores en plantas con la

MA. Mayor tolerancia a suelos salinos y sequía, se aumenta la longevidad de los pelos

radicales, mayor absorción de macro y micronutrimentos. Mejor tolerancia a toxinas del

suelo y metales pesados, pH adverso, resistencia a altas y bajas temperaturas (Hayman,

1987; Shenck y Siqueira, 1987; Subramanian et al., 1995; Del Val et al., 1999).

El micelio de la espora del hongo micorrízico penetra en las raíces secundarias, en

los períodos de crecimiento activo, la anatomía radicular cambia a un nuevo órgano

llamado micorriza. Durante el proceso de infección, la micorriza invade la epidermis de la

raíz y células de la corteza, pero no entran en el cilindro vascular o el meristemo, el cual

esta cubierto por la capa radical (Ferguson, 1984).

En la naturaleza las MA otorgan una amplia gama de beneficios a las plantas

hospederas, ya que las hifas de éstas profundizan en el suelo considerablemente más que

los pelos radiculares, aumentando de este modo la zona de absorción (Shenck, 1985).

La MA favorece la supervivencia de las plantas, al inc rementar la absorción de agua

y nutrientes (N, P, Ca, Mg, Cu, Zn, Fe y S). También se favorece la absorción del K, lo cual

es probablemente debido al incremento en la absorción del P, el K es responsable de la

osmoregulación, mantiene el equilibrio entre la respiración, la transpiración y el

anabolismo. En reciprocidad el hongo recibe de la planta hospedera, carbohidratos,

sacarosa, glucosa, fructosa y otros productos de la fotosíntesis, los cuales son

transformados por la micorriza en glucógeno y manitol. Durante la etapa de floración y

fructificación la cual esta asociada con grandes requerimientos de fósforo, así como de altas

tasas de respiración y fotosíntesis, es cuando más es requerida la simbiosis MA (Shenck y

Siqueira, 1987; Reid, 1990; Harrison, 1997; Estrada y Davies, 2001).

- 36 -

La MA acumula manitol y trehalosa, en las vacuolas de las células vegetales, al

contrario de lo que ocurre normalmente con otro tipo de micorriza, el material de reserva en

la MA se acumula en forma de lípidos, ya que la mitad del peso del micelio, lo constituye

material lipídico (Cooper et al., 1978), esto permite una mayor resistencia al estrés hídrico,

reduce la incidencia al ataque de patógenos, por medio de los rizomorfos los cuales son

bandas alargadas de hifas paralelas, que forman una maraña que sirve como barrera física,

contra la entrada de patógenos (Siqueira, 1988).

Estos beneficios son en parte a consecuencia de que las hifas del hongo, exploran

volúmenes del suelo cientos y miles de veces más que, lo que pueden hacer las raíces

normales. Un cm de raíz colonizada puede tener hasta 134 cm de hifas, y en el suelo

adyacente pueden haber 55 m de hifas por g de suelo. Mientras que un pelo radical puede

poner a disposición de una raicilla, nutrientes y agua que se encuentran hasta 2 mm de la

epidermis, las hifas de la MA pueden hacerlo hasta 80 mm. Lo que significa que pueden

explorar un volumen de suelo 40 veces mayor (Hayman, 1987).

La MA también acumula en la rizósfera compuestos fenólicos, incremento de

niveles de ovitinasa, así como la lignificación de las células corticales de la raíz. La

producción de la enzima peroxidasa, la cual produce paredes celulares secundarias y

suberización de las mismas, puede contribuir a crear resistencia a subsecuentes

microorganismos patógenos invasores. La micorriza secreta enzimas pectolíticas que

disuelven las laminillas medias, permitiendo así que las hifas crezcan a través de las

regiones intercelulares. Así como también la micorriza puede sintetizar los siguientes

compuestos: etanol isobutanol, ácido butírico, monoterpenos, sesquiterpenos, 3-carendreno,

β- phellendreno, ácido ascórbico, etileno, arginina, proteínas, isoflavonoides y fitoalexinas,

los cuales puede inhibir el crecimiento de otros hongos fitopatógenos como Pythium,

Phytophthora y Phomes (Allen et al., 1980; Hayman, 1987).

- 37 -

La MA puede afectar, el balance hormonal de las plantas hospederas como: ácido

abscísico (ABA), ácido indolacético (AIA), citocininas, giberelinas, vitaminas y

compuestos volátiles, incrementando de esta forma el tamaño y longevidad de la raíz, así

como lograr un mejor crecimiento y desarrollo del vegetal (Gianinazzi, 1991).

Es mayor la concentración de AIA y de citocininas, en plantas colonizadas que en

aquellas que no lo están (Allen et al., 1980). Hay una correlación entre el incremento, de las

citocininas y la tasa de intercambio de CO2, conductancia estomatal y la traspiración. El ABA

ejerce un poderoso control en el cierre de los estomas, aún en concentraciones tan bajas como

10-6 M. Las plantas micorrizas están mejor capacitadas, para soportar condiciones de estrés

durante el trasplante o en períodos de sequía, en suelos con niveles tóxicos de aluminio,

manganeso y sodio, o en suelos inestables donde las hifas contribuyen a la agregación del

suelo (Hayman, 1980; Goicoechea et al., 1997).

Además, la inoculación con la MA estimula el enraizamiento (Barrows y Roncadori,

1977), da protección a plántulas y estacas durante el trasplante, y estimula su crecimiento

(Kormanik et al., 1978). Deprime la penetración y el crecimiento de patógenos fungales y

fitoparásitos radiculares (Roncadori y Hussey, 1977).

La colonización micorrízica disminuye los efectos patológicos de las enfermedades,

que se dan a nivel de raíces por exclusión física de los sitios ya ocupados por las micorrizas

(Stewart y Pfleger, 1977). También se ha cuantificado un mayor contenido de clorofilas a y b

en plantas colonizadas de tomate, las cuales son menos afectadas por las enfermedades

vasculares (Dehne y Chonbeck, 1975).

Las raíces de tabaco colonizadas contienen más arginina que inhibió la infección y

esporulación de un patógeno radical. Ciertas combinaciones planta-hongo micorrízicos pueden

incrementar la resistencia de las plantas a algunos patógenos radicales y nematodos. Lo

anterior puede ocurrir, debido a una exclusión física, al momento de competir por sitios de

infección en la rizósfera y rizoplano de las raíces, o por cambios metabólicos involucrando la

producción de antibióticos no ha sido aclarado (Hayman, 1981).

- 38 -

Se han observado otros efectos de la MA sobre el huésped como el incremento en la

absorción del agua (Safir et al., 1971; 1972; Allen, 1982). Mejoran la tolerancia de las plantas

halófitas a suelos con cantidades extremadamente altas en sodio, potasio, calcio y magnesio

(Pond et al., 1984), son determinantes en la sucesión vegetal (Janos, 1980).

2.5.1.7 La micorriza arbuscular respecto la erosión del suelo

Otro aspecto importante a considerar sobre los hongos micorrízicos arbusculares, es su

influencia en la colonización de nuevos hábitats. En efecto, se ha observado que intervienen en

la estabilización de suelos sueltos y dunas, mediante la formación de agregados de arena por el

micelio fúngico. Los factores que contribuyen a mejorar la estructura del suelo son: las hifas

de la MA y las raíces de las plantas, las cuales enredan físicamente a los micro agregados

formando así macro agregados, los residuos microbianos, exudados radicales y substancias

pegajosas (polisacaridos) producidas por la MA, los cuales disminuyen de esta forma la

erosión del suelo (Clough y Sutton, 1978; Tisdall et al., 1997).

En los ecosistemas perturbados, debido a la erosión de los suelos se ha observado, que

las poblaciones de los HMA nativos disminuyen drásticamente (Barea y Azcón-Aguilar,

1983).

En trabajos de campo, se ha observado el efecto benéfico de los hongos micorrízicos

arbusculares, sobre el desarrollo de las plantas creciendo en zonas erosionadas y resultando

una mayor productividad agrícola, por lo cual estos hongos deben ser incluidos en los

programas de revegetación de suelos desnudos. Sin embargo, las dificultades de llevarlo a la

práctica con cierta posibilidad de éxito son considerables, ya que las plantas pueden

desarrollar colonizaciones mezcladas, mediante el predominio del endófito de la MA,

introducida o del hongo nativo. Por lo tanto, es necesario que el hongo a inocular tenga una

gran capacidad competitiva y una excelente eficiencia, en la búsqueda y translocación de

nutrientes (Mukerji et al., 1988; Tisdall et al., 1997).

- 39 -

2.6 Generalidades sobre el cultivo in vitro de raíces

White (1934), quien cultivó exitosamente ápices aislados de raíces de tomate, las

cuales hizo crecer durante 25 años en un medio líquido que contenía sales inorgánicas,

sacarosa, extracto de levadura y AIA. Fue uno de los primeros logros importantes, dentro

del cultivo de tejidos vegetales.

El cultivo in vitro de raíces, es un modelo de gran interés para el estudio de los

procesos metabólicos, que se llevan a cabo en estos órganos y que se relacionan con el

metabolismo de carbohidratos, síntesis de vitaminas, síntesis de reguladores del

crecimiento, producción de metabolitos secundarios, absorción y translocación de

nutrientes. Así como también se han utilizado en cocultivo, para poder ver su interacción

con microorganismos como virus, Rhizobium, nematodos y crecimiento de la MA, en raíces

transformadas de zanahoria por Agrobacterium rhizogenes (Toivonen, 1993; Bécard y

Piché, 1990; Oksman et al., 1994; Bago et al., 1998; Boisson-Dernier et al., 2001).

La respuesta de las raíces al cultivo in vitro, varía dependiendo del genotipo, medio

de cultivo y condiciones de incubación, así como del tiempo en que las raíces pueden ser

mantenidas creciendo (Oksman et al., 1994). Con respecto a lo anterior se definen tres

grupos de especies:

1).- Raíces que pueden desarrollarse indefinidamente in vitro, las cuales requieren

únicamente del medio adecuado y de los subcultivos apropiados. Las raíces de tomate,

clavo (Syzygium aromaticum) y Datura, así como otras especies muestran este

comportamiento.

2).- Raíces que crecen y se desarrollan in vitro, durante períodos variables de tiempo, pero

que no se ha logrado que lo hagan de manera indefinida, por lo que tarde o temprano, se

presenta una disminución paulatina en la tasa de crecimiento, se inhiben la formación de

raíces laterales y el cultivo finalmente muere. Este comportamiento se ha visto, en raíces de

chícharo y trigo.

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3).- Raíces que hasta el momento, no se ha logrado que se prosperen in vitro, ni siquiera por

períodos limitados de tiempo. A este grupo pertenecen muchas especies leñosas. Algunas

raíces de especies leñosas, como el limón se han podido desarrollar indefinidamente in

vitro, a través de su transformación genética con Agrobacterium rhizogenes (Pérez-Molphe

y Alejo-Ochoa, 1998)

Actualmente se pueden tener dos clases de raíces en cultivo: 1) raíces normales las

cuales se mantienen mediante la adición de un medio adecuado y auxinas, 2) raíces

transformadas las cuales tan sólo requieren del medio adecuado, y no requieren de la

aplicación exógena de auxinas. Estas últimas se obtienen mediante la transformación de

cualquier tejido vegetal, al ser infectados con la bacteria fitopatógena Agrobacterium

rhizogenes, ésta integra parte del ADN-T Ri (ácido desoxirribonucleico de transferencia,

inductor del enraizamiento) en el genoma del tejido vegetal infectado (Chilton et al., 1982;

Legue et al., 1996).

Dicha integración le permite a las células transformadas biosintetizar su propio

AIA, así como el de incrementar por parte del tejido transformado la sensibilidad a

reguladores de crecimiento, también producen una serie de compuestos nitrogenados

(opinas), que utilizará posteriormente la bacteria para su crecimiento. Estas raíces tienen

una tasa de crecimiento mayor respecto a las raíces normales, debido principalmente a su

gran capacidad de ramificación, no requieren la aplicación exógena de auxinas, son estables

genéticamente (Aird et al., 1988; Legue et al., 1996), y presentan una elevada producción

de metabolitos secundarios (Loyola-Vargas y Miranda-Ham, 1995), varios de los cuales se

ha comprobado que desempeña un papel importante en la interacción planta-

microorganismo. Las plantas son la principal fuente de productos usados en la industria

química como farmacéutica, saborizantes, colorantes, fragancias, y pesticidas. Los

metabolitos secundarios excretados por las plantas superiores, están valuados en varios

dólares por libra, como por ejemplo el sedativo codeína o el insecticida peritrina, incluso

algunos metabolitos secundarios están valorados en cientos de dólares por libra como el

aceite de jazmín, los alcaloides antitumorales (vinblastina y vicristina), los cuales alcanzan

en el mercado, más de $ 6,000 dólares por gramo (al menudeo).

- 41 -

El mercado de los farmacéuticos, derivados de las plantas está estimado en 9

billones de dólares por año, solo en los Estados Unidos. En la actualidad, únicamente

existen cuatro productos de valor comercial, que se obtienen en el ámbito industrial por

medio del cultivo in vitro de células y órganos de plantas superiores como la shikonina, la

berberina, la purpurina y las raíces del gingseng para la producción de saponinas

(Toivonen, 1993; Loyola-Vargas y Miranda-Ham, 1995; Zhang, 1995; Jeong et al., 2002).

Debido a las ventajas que presentan las raíces transformadas, de crecimiento

acelerado e indefinido, recientemente ha tomado importancia su cultivo, sobre todo en el

campo del estudio y producción, de metabolitos secundarios (alcaloides) de interés. En

raíces transformadas por Agrobacterium rhizogenes, se ha logrado la síntesis de algunos

metabolitos secundarios (Dörnenburg et al., 1993), como se observa en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Síntesis de algunos metabolitos secundarios, obtenidos en raíces transformadas por A. rhizogenes

Especie de planta Metabolito secundario obtenido

Tagetes spp. Polisacáridos Beta vulgaris Betalainas Nicotiana rústica Atropina y Anabasina Hyscyamus spp. Hiosciamina y escolamina Atropa belladona Atropina y escopolamina Scopolia japónica Escopolamina Bidens spp. Poliacetatos Lythospermun erythrorhyson Shikonina Nicotiana spp. Nicotina, anatabina, anabasina y

Nornicotina Datura stramonium Hiosciamina

Fuente: (Dörnenburg et al., 1993; Toivonen, 1993)

2.7 Transformación genética de plantas

El reciente surgimiento de las técnicas de la ingeniería genética de plantas, a través

de la tecnología del ADN recombinante, la cual permite aislar, manipular y transferir genes

de interés agronómico. La fuente de esta nueva información puede ser cualquier ser vivo,

por lo que no existen barreras taxonómicas cuando se utiliza esta tecnología.

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La transformación genética de plantas es un proceso por el cual el ADN extraño, es

introducido al núcleo de las células vegetales, éstas pueden ser parte de un explante en un

cultivo morfogénico o protoplastos. Una vez que el ADN es introducido, se regenera una

planta completa transformada genéticamente partiendo de dichas células unicelulares

transformadas. El ADN que se introduce le confiere ventajas a la planta para hacerla más

resistente y productiva, junto con esta información es conveniente introducir genes que

permitan saber que la inclusión del ADN extraño fue exitosa, dichos genes son los llamados

marcadores de selección y reporteros, los cuales codifican para expresar ciertas enzimas, y

mediante la detección de la expresión de estas enzimas específicas, es como se puede

demostrar si el tejido está o no transformado (Draper et al., 1988).

La transformación genética de las plantas puede realizarse de las tres siguientes

formas:

a) puede llevarse a cabo en forma directa, en la cual el ADN puro se introduce en forma

directa a la célula.

b) en forma indirecta en donde el ADN primero es introducido, a un microorganismo vector

como un virus o bien Agrobacterium, mediante la cual posteriormente se introducirá al

núcleo de la célula vegetal y.

c) mutagénesis de las plantas (Dandekar, 1992).

Las técnicas sobre la transformación genética de las plantas se describen

brevemente a continuación:

2.7.1 Transformación directa de plantas

2.7.1.1 Transformación por fusión de liposomas

Los liposomas son vesículas de lípidos o saquitos fabricados con membrana celular,

el ADN extraño el cual puede codificar para una proteína, reguladores del crecimiento,

resistencia contra antibióticos, o bien para un gen de interés agronómico.

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Es encapsulado dentro de los liposomas utilizando las poliaminas que compactan al

ADN hasta diez veces su tamaño, ya que el ADN en solución se expande muchísimo

debido a sus cargas eléctricas negativas. Después se ponen en contacto con las células a las

que se pretende transformar, la bicapa de los liposomas se fusiona con la membrana celular

atravesándola limpiamente, de esta forma el ADN extraño emigra a través del citoplasma

hasta llegar al núcleo. Mediante el proceso de la división celular es posible que se de la

integración del ADN extraño, ocurriendo de esta forma la transformación genética de

plantas. Esta técnica no es muy eficiente, ya que se han obtenidos pocos resultados en

plantas que no puedan regenerarse ha partir de un protoplasto (Songstad y Griesbach,

1995).

2.7.1.2 Transformación a través de la microinyección

La técnica de microinyección, fue originalmente desarrollada por Greassmann y

Diacumakos en 1970 para células animales. Mediante esta técnica se puede introducir:

ADN, RNA, proteínas, partículas virales, núcleos y organelos. Las micro pipetas tienen

una punta de vidrio de 0.5-10 µm de diámetro, la cua l se introduce en el citoplasma o

núcleo. En vegetales el ADN extraño se tiene que inyectar al núcleo de una célula con

capacidades embriogénicas como embrión, polen, óvulos, células del tejido nucelar y

protoplastos. Mediante el proceso de la embriogénesis somática es como se da la

transformación genética de plantas. La pared celular en algunas ocasiones puede llegar a

tapar la aguja de vidrio, debido a la forma tridimensional de la célula si no esta bien

orientada durante el proceso de su fijación, es prácticamente imposible localizar el núcleo.

El equipo es sumamente caro y se requiere de personal altamente calificado para su manejo

y operación (Songstad y Griesbach, 1995).

2.7.1.3 Transformación por electroporación

En células de ratón Newman en 1982 utilizó esta técnica, la cual es un sistema

artificial que involucra la formación de poros momentáneos, en las membranas biológicas

mediante la descarga de corriente eléctrica con una potencia de 1.5 KV/cm2.

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El ADN extraño puede viajar a través del citoplasma hasta llegar al núcleo, por

medio de los poros creados en la membrana los cuales tienen 30 nm de diámetro, los poros

se abren durante varios minutos después de la pulsación. La transformación de protoplastos

mediante este método es útil para emplearse en especies no susceptibles a la infección por

Agrobacterium han obtenidos pocos resultados en plantas, que pueden regenerarse ha partir

de un protoplasto. También es posible utilizar la electroporación en polen, segmentos de

hoja, embriones, tejido calloso, yemas, etc., (Dandekar, 1992; Potrykus, 1995).

2.7.1.4 Transformación a través del Polietilen-glicol

Este método se basa en la formación de micro poros, en los protoplastos los cuales

son inducidos por el Polietilen-glicol (PEG), el ADN extraño puede viajar a través del

citoplasma hasta llegar al núcleo, por medio de los poros creados en la membrana. El PEG

a una concentración de (30-40% w/v) es una molécula extremadamente hidrofílica, el cual

minimiza los efectos de repulsión entre las cargas negativas de la membrana del protoplasto

y el ADN, promoviendo de esta manera la entrada por endocitosis a través de los micro

poros de ADN, cloroplastos, liposomas e incluso bacterias. Es adecuado para especies

mono y dicotiledóneas, requiere de un sistema de regeneración eficiente a partir de un

protoplasto (Draper et al., 1988; Potrykus, 1995)

2.7.1.5 Transformación por biobalística

Es un método artificial, que involucra la transferencia de genes en tejidos vegetales,

empleando microproyectiles de oro o tungsteno recubiertos con ADN extraño, dichos

microproyectiles pueden penetrar la pared celular, plasmalema, citoplasma, hasta llegar al

núcleo. Una vez en el núcleo el ADN, extraño se recombina mediante el proceso de la

división celular, para formar así células transformadas genéticamente. Se emplean diversas

herramientas para acelerar los microproyectiles como un cartucho de una pistola calibre 22,

arco eléctrico de descarga, rifle de aire y helio de alta presión. El ADN extraño con que se

cubren los microproyectiles, se solubiliza dentro de la célula y se expresa de forma

transitoria, mediante esta técnica se ha logrado la transformación del tabaco y el maíz.

- 45 -

Este sistema no ha resultado ser muy eficiente para la regeneración de plantas

transformadas (Dandekar, 1992).

2.7.1.6 Métodos alternativos para la transformación de plantas

Además de los métodos antes mencionados, que son sin duda los más utilizados,

existen algunos sistemas alternativos que si bien se han empleado menos, resultan

interesantes. El primero de ellos es la transformación mediante el uso de fibras de carbono

de silicona (Songstad y Griesbach, 1995).

El método es muy sencillo y consiste en agitar en vortex una mezcla del ADN a

introducir, junto con las fibras de carburo de silicona y las células vegetales a transformar.

Durante la agitación, las fibras causan heridas en las células por las cuales se introduce el

ADN. Se trata en apariencia de un sistema sencillo y de bajo costo, el cual aún esta en fase

de desarrollo. Otra forma senc illa de introducir ADN en células vegetales podría ser, la

ultrasonicación de tejidos inmersos en un amortiguador que contenga los plásmidos a

introducir. Zhang et al., (1991) afirman haber obtenido una frecuencia de transformación de

un 22%, utilizando este método con segmentos de hoja de tabaco.

Otro método de transformación alternativo, para la introducción de ADN exógeno

en semillas germinadas de cebada, es mediante la electroforesis desarrollado por Ahokas

(1989), el cual no se ha extendido a pesar de que hay algunos reportes que confirman su

éxito.

2.7.2 Transformación indirecta de plantas

La transformación indirecta de plantas, se puede realiza a través de virus y

Agrobacterium. Las técnicas sobre la transformación indirecta de plantas se describen

brevemente a continuación:

- 46 -

2.7.2.1 Transformación mediada por virus

Más del 90% de los virus de los vegetales son de ARN (ácido ribonucléico) de

hebra simple, lo que dificulta notablemente su utilización como vectores de transformación

genética. El cauliflower mosaic virus (CaMV) o Caulimovirus tiene ADN de doble cadena,

y el wheat dwarf virus (WDV) o Geminivirus tiene ADN circular de cadena sencilla, la

gama de hospederos de estos virus, es muy baja ya que no pueden infectar a la mayoría de

las monocotiledóneas y leguminosas (Songstad y Griesbach, 1995).

2.7.2.2 Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens

El género Agrobacterium pertenece a la familia Rhizobiaceae y los miembros de

esta familia son organismos aeróbicos, facultativos gram-negativos, los cuales habitan en el

suelo y rizósfera. Sus células normalmente son bacilos que miden de 0.6 a 1.0 µm, no

forman endoesporas y se mueven por medio de 1-6 flagelos peritricos (Zupan, 1995).

Generalmente producen una secreción considerable de polisacáridos, cuando se les

permite crecer en un medio con carbohidratos (Songstad y Griesbach, 1995). Agrobacterium tumefaciens tiene la capacidad de formar tumores, provocada por la

enfermedad conocida como agalla de la corona, la cual afecta principalmente a las plantas

dicotiledóneas.

La transformación se efectúa por medio de la transferencia de un segmento

bacteriano del plásmido Ti (inductor de tumores), conocido como ADN-T (ácido

desoxirribonucleico de transferencia) dentro del genoma nuclear de la planta susceptible.

La transferencia del ADN-T hacia las células vegetales se realiza a través de funciones

codificadas por la región vir o de virulencia del plásmido Ti, las cuales son esenciales para

realizar el proceso. En el ADN-T se encuentran varios genes codificados, los cuales son

transcritos y traducidos en el tejido vegetal, produciendo proteínas que han sido

caracterizadas como enzimas involucradas en la síntesis de auxinas (ácido indol-3-acético),

citocininas (ribosilzeatina) y opinas (Zupan, 1995).

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La sobreproducción de auxinas y citocininas es responsable de la formación del

tumor. Dichos genes pueden ser removidos, es decir se puede desarmar el plásmido Ti y

reemplazarlos con genes de interés los cuales pueden ser introducidos al tejido vegetal. La

infección permite la regeneración de plantas morfológicamente normales las cuales

contienen el gen extraño introducido, dichos genes muestran estabilidad y se incorporan al

genoma de la planta (Klee, 1989). La eficiencia de la transformación depende de cuatro

factores:

a) La capacidad de Agrobacterium para infectar la mayoría de los tejidos vegetales, la cual

depende de factores genéticos y fisiológicos de la bacteria, así como de las características

intrínsecas de las células huésped.

b) La eficiente selección de todas las células transformadas.

c) La eficiente regeneración de las células transformadas para poder obtener las plantas.

d) La estabilidad del ADN incorporado al genoma de la planta.

2.7.2.3 Transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes

Esta bacteria, es un patógeno natural que ataca principalmente a plantas

dicotiledóneas herbáceas o leñosas, en las cuales causa un trastorno conocido como "raíz

pilosa" caracterizado por un crecimiento descontrolado de la raíz, y un incremento notable

en la producción de pelos radicales (Dandekar et al., 1992).

El crecimiento de las raíces pilosas o transformadas se caracteriza por ser autónomo,

acelerado, indefinido y plagiotrópico. Este desarrollo anormal de las raíces en las plantas

afectadas, se debe a la transferencia hacia las células infectadas de un segmento del ADN

bacteriano (ADN-T), que contiene entre otros genes, los implicados en la síntesis de

auxinas, o bien en la sensibilidad de los tejidos transformados a las mismas y a otros

reguladores del crecimiento.

- 48 -

Agrobacterium puede producir fenotipos diferentes, al momento de transferir genes

hacia las células vegetales, y esto se debe principalmente a que la bacteria introduce en el

genoma, de la célula huésped información genética, diferente contenida en el segmento del

ADN-T, información que es transferida en el plásmido Ri (inductor del enraizamiento)

(Aird et al., 1988).

Sin embargo, las células oncogénicas dentro de las agallas de la corona, son

incapaces de regenerar plantas completas transformadas, a menos que se modifique su

ADN-T, por lo tanto esta técnica es de uso limitado. Por otro lado, las raíces individuales

transformadas tomadas como explantes de los tumores de raíz pilosa son de origen clonal, y

no contienen células no transformadas. A diferencia de las agallas de la corona, se han

reportado éxitos en la regeneración de brotes a partir de tumores de raíz pilosa y en algunos

casos, tales brotes se han desarrollado en plantas maduras y fértiles (Draper et al., 1988).

Estas plantas transformadas, que han sido regeneradas de raíz pilosa, se ha podido

observar que con frecuencia exhiben varios grados de anormalidad, en su morfología tales

como pigmentación, entrenudos cortos, hoja arrugada en forma desigua l y encogida, flores

morfológicamente anormales, reducida dominancia apical, tiempo de regeneración o

fertilidad variable, pérdida de geotropismo positivo. Sin embargo, en algunas ocasiones las

plantas regeneradas a partir de raíces transformadas, tienen un genotipo completamente

normal (Nuutila et al., 1995).

La razón de la pérdida del fenotipo, es actualmente desconocida. La característica

más importante, de las raíces transformadas por A. rhizogenes es su mayor tasa de

crecimiento con respecto a las raíces normales, propiedad que conservan al ser cultivadas in

vitro. Otra ventaja, es el hecho de que adicionalmente o en substitución de la información

genética normal transferida por la bacteria, mediante manipulaciones moleculares del

plásmido Ri, puede transferirse otro tipo de información genética que pueda resultar de

interés. A. rhizogenes, también permite realizar estudios con Rhizobium, nematodos, virus y

del crecimiento y desarrollo de los hongos micorrízicos arbusculares, en raíces transgénicas

(Toivonen, 1993; Nuutila et al., 1995; Bago et al., 1998; Hildebrandt et al., 2002).

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La herida realizada al tejido vegetal con una jeringa para insulina, puede tener tres

funciones: (1) proveer acceso a la bacteria a los sitios de reconocimiento sobre la superficie

celular, (2) promover la división celular lo cual hace a las células vegetales competentes,

para transformación y, (3) estimular la producción de algunos compuestos fenólicos

asociados a la herida, los cuales son característicos de cada especie vegetal, tales como

acetosiringona, α-hidroxiacetosiringona, ácido sinapínico y ácido cafeico los cuales atrae

por quimiotaxis a Agrobacterium e induce la expresión de los genes vir, requeridos para

transferir el ADN-T Ri (Draper et al., 1988; Tzfira et al., 1996).

La agalla de la corona provocada por A. tumefaciens y la inducción de raíz pilosa,

normalmente ocurre en sitios que previamente han sido heridos, y en células que son

competentes para la transformación durante un corto período de tiempo, estas células se

encuentran en la fase S del ciclo celular cuando la replicación del genoma está iniciando.

Cuando se intentó transformar células vegetales, basados en plásmidos Ti o Ri, los

investigadores se enfrentaron con cinco problemas, respecto a la selección de las células

transformadas (Tempé, 1989) como:

A) el medio de cultivo, también fomenta el crecimiento de células no transformadas, las

cuales son con mucho la mayoría. El corte del tejido transformado de los tumores de agalla

de la corona, y de raíz pilosa es relativamente simple, ya que las células neoplásticas crecen

fuera del explante (Tempé, 1989).

B) la mayoría de los análisis a la fecha, indican que las células oncogénicas, en la mayoría

de agallas de la corona son derivadas de una, o solo unas pocas células competentes,

inicialmente transformadas en el sitio de la herida. Las células no transformadas, presentes

en los tumores de la agalla de la corona, se cree que son soportadas por alimentación

cruzada, de fitohormonas de las células del tumor (Van der Salm, 1996).

- 50 -

C) las raíces individuales de tumores de raíz pilosa, son conocidas por ser de origen clonal.

Las auxinas secretadas por las raíces transformadas, de los plásmidos Ri también estimulan

el desarrollo de raíces, a partir de células no oncogénicas, presentes en el sitio de la herida o

en los tumores de raíz pilosa. Una vez concluido el proceso de transferencia de genes, la

agrobacteria tiene que ser controlada con Claforán, el cual puede perjudicar las capacidades

de crecimiento y regeneración, de las células cultivadas. Aunque es razonablemente seguro,

asumir la eficiente expresión de los genes marcadores en la mayoría, si no en todas las

especies de plantas, se debe tener mucho cuidado en la elección del gen marcador, ya que

diferentes especies de plantas, varían enormemente en la sensibilidad a los agentes

selectivos (Aird et al., 1988). Por ejemplo, la resistencia a kanamicina ha sido usada

exitosamente, como fenotipo selectivo en la transformación de varias especies de plantas,

pero es ocasionalmente ineficiente en otras, principalmente como un resultado ya sea de

tolerancia, a altos niveles de este compuesto, o supersensibilidad, resultando en una masa

necrosa de los tejidos vegetales, en los puntos de selección (Draper et al., 1988; Boisson-

Dernier et al., 2001).

D) en muchas situaciones las células transformadas, las cuales fueron inoculadas, deben

multiplicarse antes de ser transplantadas al medio de selección. Sin embargo, si el

trasplante se realiza en forma tardía se corren dos riesgos: por una parte que la

Agrobacteria se multiplique en forma exagerada en el medio de cultivo, y posteriormente

no se pueda controlar, por la otra se puede afectar cualquier análisis molecular y tinción

histoquímica, lo cual puede influir en su interpretación (Tempé, 1989).

E) pueden existir células adyacentes e inoculadas dañadas, las cuales producen compuestos

fenólicos tóxicos, resultantes de los productos de la necrosis e infección, de dichas células,

por lo que es necesario aislar y transplantar, las células transformadas para evitar su muerte

(Aird et al., 1988).

- 51 -

La iniciación de la enfermedad de raíz pilosa inducida por A. rhizogenes, es análoga

a la transformación por A. tumefaciens. Bajo el control de una región de virulencia, dos

regiones separadas del ADN-T del plásmido pRiA4 son transferidas al genoma de la planta,

y son llamadas ADN-TIzquierda y ADN-TDerecha. El ADN-TD contiene genes para la

producción de opinas, las cuales son secretadas al suelo en donde son utilizadas como

fuente de nitrógeno y carbono por Agrobacterium. Además, el ADN-TD contiene dos genes

que codifican para la síntesis de auxinas de A. tumefaciens, y se ha mostrado que son

capaces de complementar razas de A. tumefaciens, transportando mutaciones en sus genes

de auxinas. El ADN-TI es el otro juego, no tiene homología con el ADN-T de A.

tumefaciens, ha sido secuenciado y contiene menos de dos marcos de lectura abierta,

similares a los encontrados en genomas eucarióticos, los cuales tienen el promotor

necesario, y elementos de poliadenilación requeridos, para la función sobre la transferencia

dentro del genoma de la planta (Aird et al., 1988).

El plásmido silvestre pRiA4 contiene dos regiones la región ADN-TIzquierda la cual

contiene 18 marcos de lectura abierta, de los cuales el 10, 11, 12 y 15 corresponden a los

llamados genes rol A, B, C y D. Los cuales son responsables de la enfermedad conocida

como raíz pilosa en las plantas que lo contienen, además de incrementar la respuesta a

reguladores del crecimiento por parte de los tejidos transformados, y la región ADN-TDerecha

la cual porta los genes para la biosíntesis y catabolismo de la agropina, y dos genes en los

loci Tms para la sobreproducción de auxinas (Van der Salm, 1996).

La cepa bacteriana de A. rhizogenes, contiene el plásmido silvestre pRiA4. Además,

contiene el vector binario pESC4, el cual tiene el gen reportero uid A que codifica para la

enzima β-glucoronidasa (GUS), bajo el control del promotor del gen de la apoproteína que

une las clorofilas a/b (PCab), este promotor es inducible por luz y por citocininas. Además,

este vector contiene el gen marcador de selección, que da resistencia a kanamicina (nptII),

bajo el control del promotor del gen de la nopalino sintetasa (nos), en la Fig. 1 se puede

observar como se pueden transferir genes en las células vegetales (Draper et al., 1988; Van

der Salm, 1996).

- 52 -

Fig. 1. Propiedades de Agrobacterium para transferir genes en las células vegetales.

Simbología:

Plásmido Ti = de Agrobacterium tumefaciens.

Ti = inductor de tumores.

Plásmido Ri = de Agrobacterium rhizogenes.

Ri = inductor del enraizamiento, el cual se encuentra dentro del plásmido silvestre pRiA4.

Km = gen de resistencia a Kanamicina, el cual se encuentra dentro del vector binario pESC4.

Fuente: (Van der Salm, 1996; Jofre -Garfias et al., 1997).

- 53 -

Se ha demostrado que el gen rol A es responsable de la producción de hojas rizadas,

favorece los entrenudos cortos e incrementa la síntesis de poliaminas. El gen rol B aumenta

la ¨sensibilidad¨ a las auxinas en las plantas transformadas, por lo que es responsable de la

formación de la raíz pilosa. El producto del gen rol B tiene la capacidad de liberar auxinas

por medio de la hidrólisis de: complejos auxinas-proteínas (se libera triptófano),

conjugados auxinas-aminoácidos (aspártico y glutámico) y glucósidos auxinas-azúcares

(Inositol, d-glucanasa y arabinasa) con actividad de indoxil-β-glucosidasa (Stomp,1992).

La expresión del gen rol B bajo el control de su propio promotor se da de manera

preferencial, en los ápices y regiones de mayor división celular de la raíz. En órganos

maduros la expresión del gen rol B se da en el tejido vascular. El producto del gen rol C

tiene un efecto tipo citocinina en las plantas transformadas, disminuyendo la dominancia

apical y produciendo entrenudos cortos (Tempé, 1989).

El gen rol C aumenta la ¨sensibilidad¨ a citocininas mediante su liberación, la cual

se presenta por medio de la hidrólisis de conjugados citocininas-aminoácidos y glucósidos

citocininas-azúcares (citocinina-β-glucosidasa). La expresión del gen rol C bajo el control

de su propio promotor se da preferencialmente en el floema. Por último se ha observado

que el gen rol D induce la floración temprana en tabaco, aun cuando sus transcritos se

encuentran en la raíz (Van der Salm, 1996; Jofre-Garfias et al., 1997).

Estos genes no son homólogos a ningún gene conocido, ni hay homologías

significantes con el ADN-T de A. tumefaciens (tipo octopina). El ADN-TD no es

absolutamente requerido, para el mantenimiento del fenotipo de raíz pilosa. Sin embargo,

las razas de A. rhizogenes poseen ambos ADN-TD y ADN-TI son más virulentas, en un

rango amplio de especies vegetales, que las razas que poseen solamente un ADN-T

(Tempé, 1989) (Fig. 2).

- 54 -

Figura 2. Plásmido silvestre pRiA4 de Agrobacterium rhizogenes. Los genes rol se localizan en la región ADN-TI

Simbología:

Ori = Origen de replicación

Vir = Genes de virulencia

Tms = Genes para la biosíntesis de auxinas (auxina 1 y auxina 2)

ags = Genes para la biosíntesis de agropinas

agc = Genes para el catabolismo de agropinas

Fuente: (Van der Salm, 1996; Jofre - Garfias et al., 1997).

- 55 -

El vector binario pESC4 contiene el gen reportero uid A que codifica para la enzima

β-glucoronidasa (GUS), bajo el control del promotor del gen, de la apoproteína que une las

clorofilas a/b (PCab), este promotor es inducible por luz y por citocininas. Además el

vector binario, contiene el gen marcador de selección de la neomicina fosfo transferasa

(nptII), con promotor 35S que confiere resistencia al tejido transformado a los siguientes

antibióticos: kanamicina, neomicina y paramomicina, bajo el control del promotor del gen

de la nopalino sintetasa (nos) (Jofre-Garfias et al., 1997; Boisson-Dernier et al., 2001) (Fig.

3).

Entre las limitantes del sistema de transformación con Agrobacterium, se puede

mencionar la especialización hospedador-huesped, que es un factor decisivo y

determinante, para lograr la infección en las gimnospermas y angiospermas leñosas.

Aunque la mayoría de las especies pueden ser infectadas, es un hecho que la sensibilidad

varía. Por lo tanto, el uso del sistema Agrobacterium se encuentra limitado por las

complejas relaciones hospedador-huesped (Martínez-Pulido, 1993), teniéndose que en

algunas especies no se produce la infección y en otras especies como Pinus nigra si fue

posible (Mihaljevic, 1996).

Una etapa inicial en la especialización hospedador-huesped es la atracción de

Agrobacterium a los sitios heridos de la planta por un gradiente de compuestos fenólicos,

siendo el más potente la acetosiringona e α-hidroxiacetosiringona. Las cuales son

activamente excretadas por las células heridas, los mismos compuestos son también

responsables de la activación de los genes vir, y se ha demostrado que la acetosiringona

purificada en una concentración aproximada a los 100 µm, puede inducir la expresión de

los genes vir, y la expresión de la porción del ADN-T en ausencia de células vegetales. Se

cree, que la segunda etapa es la unión de agrobacteria a sitios específicos de

reconocimiento, sobre la superficie de la célula vegetal (Aird et al., 1988; Tempé, 1989).

- 56 -

pESC415900

12000

14000SalI

SalIRB

15900PstI

2000

HindII

4000

PstI

6000

PstI

3’OCS8000

LB

SalI

10000

Figura 3. Vector binario pESC4 de Agrobacterium rhizogenes.

Simbología:

PCab = Promotor de la apoproteína que une las clorofilas a y b del chícharo

GUS = Gen reportero uid A que codifica para la enzima β-glucoronidasa

CAT = Fragmento del gen de la cloramfenicol acetil-transferasa

3’OCS = Terminador de la octopina sintetasa

NOS-nptII-NOS = Promotor NOS – gen de la neomicina fosfotransferasa

tipo II – terminador de la nopalina sintasa

LB = Borde izquierdo

RB = Borde derecho

Fuente: (Van der Salm, 1996; Jofre -Garfias et al., 1997).

17 200

- 57 -

Hay algunas confusiones en torno a la identidad de la molécula receptora, pero

recientes evidencias tenderían a sugerir, que es ya sea proteínica o péctica en forma natural.

Concretamente con el posible reconocimiento específico, de un componente de la superficie

celular, esta la rápida producción de fibrillas de celulosa por la agrobacteria. Se ha

demostrado que la producción in vitro de fibrillas, es estimulada por un material celulósico

en el medio. El efecto neto sobre esta producción de celulosa no específica, es que muchas

bacterias y células vegetales llegan a ser atrapadas en una red de fibrillas, resultando en la

producción de grandes agregados célula vegetal / bacteria. Los mutantes con menos

celulosa de Agrobacterium, tienden a unirse débilmente a la superficie de la célula vegetal,

y así un importante papel de la síntesis de celulosa puede ser para el anclaje de

Agrobacterium, sobre la superficie de las células vegetales, a los sitios heridos, anterior a la

transferencia del ADN-T (Zupan et al., 1995).

Las células vegetales que se encuentran en la etapa embrionaria de germinación, son

las que presentan mayor división celular, estas células son del tipo quiescentes

(indeterminadas), son las que mejor sirven para el anclaje, integración del ADN-T y

continúe creciendo Agrobacterium (Aird et al., 1988).

Mientras que aquellas células vegetales, donde se ha logrado la infección en partes

donde estas células, son potencialmente disponibles, para entrar rápidamente en una

división celular, y formaban parte del parénquima, meristemos y tejidos vasculares del

cambium y procámbium floemático, están también en una condición referida como

indeterminada. Esto es, que son capaces de cambiar rápidamente a diferentes rutas de

desarrollo, dependiendo del medio ambiente impuesto sobre ellas, posteriormente en

algunos caso pueden tener problemas las agallas de secarse y ser expulsadas, cuando los

árboles se desarrollan. Dos ejemplos simples son la respuesta de la planta a una herida,

durante la cual las células indeterminadas rodean el área herida, desdiferenciandose y

sufriendo rápida división celular, para formar un callo indiferenciado, y el desarrollo de

raíces adventicias, que surgen cuando las estacas de plantas se propagan (Aird et al., 1988).

- 58 -

Por contraste, las células que se han desarrollado a un punto más allá del que fueron

destinadas para dar origen a tipos de células especializadas, tales como los elementos

vasculares lignificados del xilema, tejidos del floema y células de corcho suberizado, no

son capaces de rediferenciación y han alcanzado el estado llamado determinado. Lo

anterior provoca que en algunos casos se presente el fenómeno de topófisis o

¨plagiotropismo¨, que se manifiesta en que los propágulos siguen la tendencia de crecer en

forma semejante a la parte del árbol de donde provienen. Este tipo de tejido es el que por lo

general no sirve para el anclaje e integración del ADN-T (Draper et al., 1988).

2.7.3 Transformación a través de la mutagénesis

Las variaciones a nivel citogenético, genético y epigenético pueden ocurrir en

forma natural al momento de crecer y dividirse las células del tejido calloso, o bien

también pueden ser inducidas a través de mutágenos físicos o químicos (Dandekar, 1992).

Entre los mutágenos físicos se cuenta con las radiaciones con luz UV, rayos X y

rayos gamma. En lo que respecta a los mutágenos químico más utilizados son

etilmetanosulfonato (EMS), metilmetanosulfonato (MMS), nitrosoguanidina (NTG) y la

etilnitrosourea (ENU). EL problema que presenta la mutagénesis natural, física y química

es que no es posible dirigirla hacia un determinado cromosoma, y mucho menos hacia un

segmento específico de ADN que contenga los genes de interés agronómico. Además es

difícil obtener los mutantes deseados, por lo que estos trabajos consumen mucho tiempo y

no son seguros (Songstad y Griesbach, 1995).

2.8 Colonización con la MA en raíces transformadas con el ADN-T Ri

El hongo micorrízico arbuscular es un simbionte obligado, ya que no puede

completar su ciclo de vida, sin la presencia de la planta hospedera. La MA no se ha podido

aun cultivar in vitro, lo cual ha impedido estudiar, el desarrollo de las esporas reproductoras

(ontogenia). Su reproducción es clonal, las esporas son vástagos somáticos multinucleados

(Bécard y Piché, 1990; INVAM, 1997).

- 59 -

Ninguno de los medios nutritivos, comúnmente utilizados en el laboratorio para el

crecimiento de bacterias, plantas, hongos, etc., pueden cubrir las necesidades básicas para

el crecimiento y desarrollo de los HMA, solo se han podido hacer crecer y desarrollarse, en

raíces normales (las cuales requieren la adición de AIA) y transformadas. El modelo de

colonización in vitro en medios gelificados, en donde se encuentran creciendo en forma

dual una raíz y un HMA (dos organismos en cultivo puro), es a lo que se le conoce como

cultivos monoxénicos (Mugnier y Mosse, 1987; Bécard y Fortín, 1988; Bago et al., 1998;

Abdul-Khaliq et al., 2000; Hildebrandt et al., 2002).

Desafortunadamente, la casi nula disponibilidad en el mercado, del inóculo

micorrízico arbuscular de alta calidad, impide su aplicación en la agricultura de forma

extensiva. Hace poco comenzó a investigarse la posibilidad, de utilizar la técnica de la

ingeniería genética de plantas, para producir inóculo micorrízico (Mugnier y Mosse, 1987;

Bécard y Fortín, 1988; Bécard y Piché, 1989a; Abdul-Khaliq et al., 2000).

La idea central de esta línea de investigación, consiste en establecer colonias de

hongos micorrízicos en raíces transformadas genéticamente con Agrobacterium rhizogenes,

la cual a través del ADN-T permite la expresión del plásmido Ri en tejidos vegetales

cultivados in vitro. Esto permitiría producir inóculo micorrízico bajo condiciones

controladas, garantizar que se trata de un hongo en particular y no de una mezcla, o en su

caso producir mezclas específicas de hongos con los cuales se quiera inocular un cultivo en

particular (Karandashov et al., 2000; Hildebrandt et al., 2002).

Mugnier y Mosse (1987) aprovecharon las características de Agrobacterium

rhizogenes, para formar la "raíz pilosa". Las raíces de las plantas infectadas presentaron

un desarrollo indefinido, lo anterior fue debido a la expresión de los genes Tms (biosíntesis

de auxinas), además se incremento la sensibilidad de los tejidos transformados, a los

reguladores del crecimiento debido a la expresión de los genes rol B. Las raíces

transformadas de zanahoria (Daucus carota L.), utilizadas como hospedero de Glomus

mosseae y Gigaspora margarita Becker & Hall, fue todo un éxito.

- 60 -

Con el modelo de la colonización in vitro de las raíces transformadas, propuesto

inicialmente por Mugnier y Mosse (1987), se ha podido demostrar que concentraciones

elevadas de fósforo, en el medio de cultivo, repercuten negativamente sobre el desarrollo de

la micorriza arbuscular (Bécard y Fortin, 1998).

El modelo de la colonización in vitro de las raíces transformadas, también permite

el estudio sobre el efecto que tienen los diferentes macro, micronutrientes y suplementos

orgánicos en el establecimiento de la MA. Este es un factor clave para poder llegar a

producir inóculo en un sistema in vitro. Por ejemplo, se ha demostrado que los azúcares

(principalmente sacarosa) y ácidos orgánicos pueden ser inhibitorios de la colonización

micorrízica (Koske, 1981; Bécard y Fortin, 1998). Se probaron in vito cuatro medios

nutritivos formulados para el crecimiento de raíces transformadas de zanahoria (Daucus

carota L.), en donde se pudo determinar que el valor más alto correspondió para el medio

mínimo (M) con 83% del total de colonización.

Mientras que para las otras modificaciones de los medios nutritivos (MM1, MM2 y

MM3) se determinó, que tuvieron efectos negativos Cuadro 4.

Cuadro 4. Efecto de diferentes medios nutritivos, respecto a las diferentes etapas de colonización. Medios utilizados

Número de unidad experimental

Adherido con una no nueva extensión %

intercelular extensión

intracelular extensión

Total de colonización (ínter + intracelular

M 12 0 17 67 83 MM1 14 0 0 0 0 MM2 15 13 0 7 7 MM3 10 10 20 20 40 Fuente: (Bécard y Fortin, 1998)

Con el medio mínimo (M), se pudo lograr una mejor germinación de las esporas,

además de estimular el crecimiento de la hifa. El Gel-gro es derivado de polisacáridos,

altamente purificados y contiene menos impurezas, el cual permitió un excelente

crecimiento de las raíces transformadas, al ser transparente se pudo observar mejor las

raíces y el crecimiento de la MA (Bécard y Piché, 1992a; Tiwari et al., 2002).

- 61 -

Bécard y Fortin (1998) transformaron genéticamente a la zanahoria con una

suspensión bacteriana de Agrobacterium rhizogenes, la cual mantuvieron en crecimiento

durante dos días. Dicha suspensión, la inocularon en rebanadas de zanahoria, y tres

semanas después, pudieron observar la proliferación de raíces transformadas, a las cuales

les realizaron análisis moleculares para comprobar su transformación genética. Las raíces

transformadas de zanahoria con 10 mm de longitud y con 20 días de haberse formado, las

utilizaron como hospedero para el establecimiento de Gigaspora margarita Becker & Hall,

él cual fue sensible a la concentración, presencia o ausencia de sodio, sulfato, sacarosa y

fósforo.

Bécard y Piché (1989b) colocaron esporas de Gigaspora margarita Becker & Hall,

las cuales germinaron a 27ºC en un medio mínimo (M).

En una caja petri de 9 X 15 mm con 40 ml de (M), fueron 3 esporas madre

colocadas en la parte inferior, las cuales germinaron al cuarto día, lo anterior se pudo

observar gracias a la emergencia de los tubos germinativos de las esporas, los cuales

presentaron un geotropismo negativo, creciendo hacia arriba dentro de un medio sólido. En

la parte superior del medio sólido, se depositó una raíz transformada de zanahoria, de

aproximadamente 7 cm de longitud, a la cual el hongo penetro formándose así la simbiosis.

Después de una año se obtuvo una producción aproximadamente de 500 esporas hijas.

Estas esporas, pueden ser mantenidas por más de dos años, en su caja petri inicial a 28ºC

sin perder su viabilidad. Al momento de poner a germinar las esporas hijas, en un nuevo

medio, se ha podido determinar que germinan fácilmente, incluso sin la presencia de raíces

o ningún tratamiento previo.

Se ha calculado, que las plantas colonizadas con la MA aumentan un 37% su tasa de

respiración, aumentando en consecuencia la cantidad de carbono, el cual se utiliza casi en

su totalidad, para el crecimiento y mantenimiento de la MA. Se utilizó 14C marcado, el

cual fue captado por las hifas del hongo y fijado en las raíces adventicias transformadas de

la planta (Bécard y Piché, 1989b; Tiwari et al., 2002).

- 62 -

Con lo anterior se pudo demostrar que el CO2 es una fuente esencial de carbono.

Con el uso del CO2 al 2% se logró un eficiente control de la germinación de las esporas y

crecimiento de la hifa de Gigaspora margarita Becker & Hall, mientras que los exudados

radicales no tuvieron ningún efecto, en la germinación de las esporas y el crecimiento de la

hifa (Bécard y Piché, 1989b).

En raíces transformadas con el ADN-T Ri de zanahoria se pudo valorar que los

flavonoides, promovieron el crecimiento de la MA por ejemplo, el kaempferol, quercetina,

y myricetina, son esenciales para la germinación de las esporas, así como para el

crecimiento del tubo germinativo de la espora. En maíz y tabaco, esto es posible ya que

estos compuestos tienen efectos que regulan el crecimiento de los hongos (Bécard y Piché,

1995; Abdul-Khaliq et al., 2000).

La quercetina (10µM) prolongó el crecimiento de la hifa, de esporas germinadas de

Gigaspora margarita Becker & Hall de 10 a 42 días, la quercetina también estimuló el

crecimiento de Glomus etunicatum. Mientras que flavonas, flavanonas e isoflavonas

probaron ser generalmente inhibitorias, así como la chalcona paró totalmente el

crecimiento, de Gigaspora margarita Becker & Hall y Glomus etunicatum. Los flavonoides

no son necesarios, para que la planta los utilice como señales de reconocimiento

bioquímico, hacia la MA (Bécard y Piché, 1995).

La colonización in vitro entre raíces transformadas de una especie vegetal y un

hongo micorrízico ha sido establecida, en los siguientes medios nutritivos White

modificado, MM1, MM2, MM3. obteniéndose mejores resultados con el medio mínimo

(M), con Glomus mosseae y Gigaspora margarita Becker & Hall con Daucus carota L.

(Bécard y Fortín, 1988; Bécard y Piché, 1989a; 1989b; 1990); mutantes de Pisum sativum

L. con Gigaspora margarita Becker & Hall (Boovaraghan et al., 1995), y recientemente

Nuutila et al., (1995) han obtenido la colonización de raíces transformadas con el ADN-T

Ri de fresa (Fragaria x Ananassa Duch.) mediante la inoculación con esporas asépticas de

Glomus fistulosum V123.

- 63 -

En fresa se empleó un método eficaz para inocular plántulas micropropagadas, en

un sistema in vitro se cultivó Glomus intraradices en raíces de zanahoria y tomate

transformadas genéticamente con el ADN-T Ri, utilizadas como fuente potencial activa de

inóculo en la colonización de plantas micro propagadas. Después de 20 días de cultivo, las

plantas en contacto con el endófito fueron colonizadas. Las raíces de zanahoria y tomates

transformadas tuvieron un alto potencial como fuente de inóculo, a los 30 días las plantas

de fresa tuvieron un sistema radical extenso y un diámetro mayor del tallo respecto a los

testigos. La simbiosis endomicorrízica redujo el potencial osmótico de las plántulas debido

a una preadaptación en la etapa de aclimatación (Elmeskaoui et al., 1995).

El modelo de raíces transformadas con el ADN-T Ri, se ha empleado mayormente

para estudios básicos de ontogenia, sin embargo en busca de su optimización y posible

aplicación práctica, sobre la base de que las raíces transformadas tienen las siguientes

ventajas, respecto a las raíces no transformadas: no requieren la aplicación exógena de

auxinas, son más sensibles a los reguladores del crecimiento, crecen más rápido y se

pueden mantener creciendo indefinidamente, incluso en especies que normalmente no lo

hacían (Boovaraghan et al., 1995; Tiwari et al., 2002).

Por lo que este sistema podría representa un modelo potencial para la producción,

de los HMA a gran escala en condiciones controladas. Los birreactores bajo el sistema de

agitación por aire, ofrecen las mejores características por su facilidad de operación, sus

resultados muestran una amplia superioridad sobre otros métodos artificiales de cultivo,

respecto a la cantidad de esporas producidas en porcentaje de germinación, colonización

y de viabilidad. Lo que constituye la más reciente aproximación de inóculo de micorrizas a

niveles industriales (Bago et al., 1998; Jolicoeur et al., 1999; Karandashov et al., 2000;

Hildebrandt et al., 2002).

Autores como Lambert et al., (1991) y Bergmann y Stomp (1994) definen a las

plantas quiméricas como las que el sistema radical está transformado (lleva genes

foráneos), mientras que la parte aérea no sufre modificación genética alguna.

- 64 -

Además de lograr el enraizamiento con el ADN-T Ri, esta metodología permite la

introducción de genes de interés al sistema radical de las plantas generadas, sin que los

productos de los mismos se expresen en los tejidos aéreos de la planta.

2.9 Características de Glomus intraradices

G. intraradices Schenck y Smith forma clamidosporas las cuales pueden estar solas

y en agregados dentro de la raíz, raramente fuera de esta. Son predominantemente de color

amarillo-café brillante, el rango del color de la espora es de amarillo a gr is-castaño,

aparecen verde-castaño en luz de transmitancia. La hifa sustentora es como una llama recta

y ligeramente reducida (10-20µm) de ancho, la espora base tiene paredes de 1-5 µm de

grueso. La forma de la espora es globosa o subglobosa. El tamaño de la espora tiene un

rango de 40-190 µm, pero lo más frecuente es de 90 y 100 µm (Schenck y Smith, 1985).

La pared de la espora tiene dos distintas capas, la capa exterior es lisa, hialino o

blanco con 1-2 µm de grueso, muy fuertemente adherida a un pigmento amarillo pálido a

castaño, con una capa laminar (estructura en arco micro fibrilar) con estructuras

cementadas en forma laminar entre capas. Reacción al reactivo de Melzer´s, el pigmento

tiñe de rojo las paredes así, como algunas esporas. El reactivo de Melzer´s esta compuesto

por yoduro de potasio 5 g, yoduro 1.5 g, agua destilada 100 ml y cloruro hidratado 100 g

(Koske, 1985).

2.10 Técnicas para la extracción y desinfección superficial de las esporas

La separación de esporas del suelo es de gran importancia en el estudio de la ecología,

fisiología y taxonomía de la MA. Existen diversos métodos para extraer las esporas del suelo y

se basan en el diámetro y densidad de las esporas, una vez separadas es posible el análisis

cualitativo o cuantitativo. El método que más se utiliza es el de tamizado y decantación en

húmedo de Gerdemann y Nicolson (1963), este método permite la extracción de esporas en un

buen porcentaje, y para logra una buena separación de las esporas del material orgánico, se

aplica enseguida el método de Jenkins (1964). Las esporas son simultáneamente desinfectadas

para su inoculación posterior in vitro, mediante la centrifugación se eliminan las esporas

muertas, que se encuentran como residuos.

- 65 -

Todos los pasos deben realizarse con soluciones frías a 40C, desde el tamizado hasta su

desinfección superficial. Al momento de trabajar en la campana de flujo laminar, todo el

equipo en general que se empleará deberá de ser estéril como las pipetas Pasteur, tubos de

micro centrífuga, goteros, soluciones utilizadas, cajas petri, malla de 44 micras, agua destilada

etc. Los métodos para la desinfección superficial de las esporas, para su trabajo in vitro que

han resultado ser más eficientes son (Mugnier y Mosse, 1987; Bécard y Piché, 1992b; Bago

et al., 1998).

3.- MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo de investigación se realizó en los siguientes laboratorios de

Biotecnología Vegetal: de la Universidad de Colima, Universidad Autónoma de

Aguascalientes y de la Universidad Autónoma de Zacatecas, así como en el Laboratorio de

Biofertilidad de la Universidad de Colima.

3. 1 Material biológico utilizado

3.1.1 Cepa de Agrobacterium rhizogenes

El presente estudio, se realizó utilizando la cepa bacteriana A4 de Agrobacterium

rhizogenes, la cual es del tipo agropina. Esta bacteria contiene el plásmido silvestre pRiA4

(Fig. 2), y además contiene el vector binario pESC4. El vector anterior fue construido por

los Drs. June Simpson Williamson y Luis Herrera Estrella, en el Departamento de

Ingeniería Genética de Plantas del CINVESTAV-IPN (Jofre-Garfias et al., 1997) (Fig. 3).

3.1.2 Plantas silvestres de Agave

El 8 de agosto del 2000, se seleccionaron plantas silvestres de Agave salmiana Otto,

las cuales se encontraban distribuidas en el altiplano Potosino- Zacatecano, ubicadas a

100º31´40 de longitud W y 22º30´15 de latitud N, con clima seco estepario (BS) (García,

1973; Gentry, 1982). A los Agaves se les corto el escapo floral, posteriormente se colecto

la panícula junto con las cápsulas, las cuales contenían en su interior las semillas.

- 66 -

3.1.3 Esporas de Glomus intraradices

Se extrajeron esporas de Glomus intraradices, de acuerdo al método

propuesto por Gerdemann y Nicolson (1963). Después se utilizó el método para la

desinfección superficial de las esporas, para trabajar in vitro propuesto por Mugnier y Mosse

(1987); Bécard y Piché (1992a) y Bago et al., (1998).

3.2 Métodos

3.2.1 Técnica para la desinfección de las semillas de Agave

La técnica para la desinfección de las cápsulas, las cuales contenían en su interior

las semillas, constó de 5 pasos. Después de cada paso las cápsulas se enjuagaron 3 veces

con agua destilada estéril.

1) se lavaron 3 veces con agua corriente y Tween 20 (1 ml litro-1), las cuales se

mantuvieron en continua agitación durante 15 min, después se decantó para retirar la

solución.

2) enseguida se les agregó Oxicloruro de cobre 5 g litro-1, se mantuvieron en continua

agitación durante 15 min, se decantó para retirar la solución.

3) después se les agregó etanol al 70% y se mantuvieron en continua agitación durante 15

min, se decantó para retirar la solución.

4) posteriormente se les agregó hipoclorito de sodio 90%, las cuales se mantuvieron en

continua agitación durante 10 min, se decantó para retirar la solución.

5) enseguida a las cápsulas se les aplicó agua oxigenada (12.5 Vol.), se mantuvieron en

continua agitación durante 10 min, se decantó para retirar la solución. Una vez esterilizadas

las cápsulas, en la campana de flujo laminar se les desprendió la cubierta, promoviendo así

la separación de las semillas.

- 67 -

3.2.2 Procedimiento para la inducción del enraizamiento con

A. rhizogenes en Agave salmiana Otto

Las semillas se pusieron a germinar en 100 vasos PhytacomTM (Sigma, St. Louis,

MO, USA) para 100 m1 de medio de cultivo. De esta manera se pudo obtener plantas en

forma axénica, para su posterior trabajo in vitro. El medio de cultivo que se utilizó fue el

propuesto por Murashige y Skoog (1962) (MS). La cepa de A. rhizogenes se mantuvo

subcultivándola cada 60 días en medio YMA sólido (Hooykaas et al., 1977), adicionada

con 50 mg litro-1 de rifampicina y 50 mg litro-1 de kanamicina Cuadro 5.

Cuadro 5. Medio líquido para el cultivo de la bacteria (YMB) Medio YMB: (Para 100 ml) Manitol 1g MgSO4-7H2O 20 mg K2HPO4-3H2O 50 mg Extracto de levadura 40 mg NaCI 10 mg Rifampicina 5 mg Kanamicina 5 mg pH 7.0 Fuente: (Hooykaas et al., 1977)

YMA: este medio fue elaborado exactamente igual al medio YMB más 15 g litro-1

de agar.

El medio para la dilución de la bacteria fue el YMB líquido.

El medio utilizado para el cocultivo fue el MS con 8 g litro-1 de agar, sin

reguladores, ni antibióticos. El medio de selección fue el MS con 8 g litro-1 de agar, sin

reguladores y con 500 mg litro-1 de Claforán como bactericida.

Para la inoculación in vitro de las plántulas recién germinadas de A. salmiana, y

poder lograr así la producción de raíces adventicias transformadas, se realizó un cocultivo

con la cepa de A. rhizogenes A4, pESC4.

- 68 -

La bacteria se mantuvo creciendo dentro de un matraz de 250 ml con 50 ml de

medio líquido YMB, en un agitador orbital durante 72 h a 120 rpm.

Al medio líquido YMB, se le adicionaron los siguientes antibióticos rifampicina

con una concentración de 50 mg litro-1, y kanamicina con una concentración de 50 mg litro-

1 para seleccionar así la cepa bacteriana utilizada.

La dilución del cultivo bacteriano fue, en YMB. Se probaron las siguientes

concentraciones bacterianas: 1x107, 1x108 y 1x109 bacterias por ml. La obtención de la

concentración bacteriana se hizo mediante espectrofotometría, determinada a una

absorbancia de 620 nm y utilizando una curva patrón (Fig. 4).

Se utilizó la concentración de acetosiringona purificada (Aldrich) a: 0, 100 y 200

µm, para inducir la expresión de los genes vir y la consecuente transferencia, de la porción

del ADN-T Ri hacia los tejidos infectados.

Para el caso de los tratamientos que se utilizaron como testigos, estos no llevaron

suspensión bacteriana ni acetosiringona, en su lugar se inocularon con YMB (Van der

Salm, 1996).

La introducción de la dilución bacteriana, para lograr la inducción a la infección de

Agave salmiana, se realizó a través de una jeringa para insulina 29 G X 13 mm,

infectando hojas, tallo y raíz.

Una vez inoculadas las plántulas con A. rhizogenes, se incubaron durante 6 días en

la obscuridad a 250C, para después transferirlas a luz continua a la misma temperatura. A

los 14 días después de haber sido inoculadas las plantas, se procedió a cambiarlas, a un

medio de selección MS y complementado con 500 mg litro-1 de Claforán (Russell) como

bactericida (Tzfira et al., 1996).

- 69 -

Figura 4. Curva para determinar la concentración de Agrobacterium rhizogenes Fuente: (Van der Salm, 1996; Jofre-Garfias et al., 1997).

3.2.3 Diseño experimental

El diseño experimental utilizado fue el completamente al azar, cuyo modelo es yij =

µ + Ti + ε ij (Steel y Torrie, 1985; Wayne, 1987). La unidad experimental fue el sitio de

inoculación, especificado para cada tratamiento.

La técnica de herida fue con una jeringa para insulina (29G x 13 mm), mediante la

cual se aplicaron las diferentes concent raciones de bacteria y de acetosiringona. Se

probaron en total 12 tratamientos con 5 plantas cada uno. Cada tratamiento se repitió 8

veces, el tiempo de incubación en la oscuridad fue de 6 días, los recipientes utilizados

fueron vasos PhytacomTM (Sigma, St. Louis, MO, USA) (Cuadro 6).

- 70 -

Cuadro 6. Tratamientos evaluados para la inducción del enraizamiento con

el ADN-T Ri en Agave salmiana Otto.

Trata-miento

[B] 1x107

Bacterias ml-1

[B] 1x108

Bacterias ml-1

[B] 1x109 Bacterias

ml-1

[A] 0 µm

[A] 100 µm

[A] 200 µm

Sitios de inoculación

T .1 ü ü Hojas T .2 ü ü Tallo T .3 ü ü Raíz T. 4 ü ü Hojas T. 5 ü ü Tallo T. 6 ü ü Raíz T. 7 ü ü Hojas T. 8 ü ü Tallo T. 9 ü ü Raíz T.10 0 0 0 0 0 0 Hojas T.11 0 0 0 0 0 0 Tallo T.12 0 0 0 0 0 0 Raíz

[B] Concentración de las bacterias en ml. [A] Concentración de acetosiringona en µm.

Los T.10, T.11 y T.12 son los testigos y contenían medio líquido para el cultivo de

la bacteria (YMB). Como variables independientes fueron concentración de bacterias,

concentración de acetosiringona, YMB y sitio de inoculación. La variable dependiente

evaluada fue el porcentaje para la inducción del enraizamiento, los datos se tomaron cada

semana.

3.2.4 Tinción histoquímica

Las raíces adventicias formadas a partir de hojas, tallo y raíz, las cuales

presuntamente estaban transformadas genéticamente, se analizaron para comprobar la

supuesta transformación estable, mediante la tinción histoquímica para el gen reportero uid

A que codifica para la enzima β-glucoronidasa (GUS).

El procedimiento fue el siguiente: se colocaron las raíces en recipientes separados, a

los cuales se les agregó a cada uno 1000 µl de la solución de reacción Cuadro 7, hasta

cubrir completamente las raíces, los cuales se cubrieron para evitar su evaporación.

- 71 -

Después se incubaron a 37ºC durante 24 h, enseguida se eliminó la clorofila de las

raíces, mediante lavados continuos con etanol al 70%, hasta que los tejidos quedaron

transparentes y se pudiera observar la tinción azul. La transformación genética de plantas se

pudo detectar claramente, cuando la construcción lleva el gen reportero uid A, y se observó

una tinción de color azul en las zonas del xilema y floema donde solamente se expresa este

gen. La reacción ocurrió entre X-gluc y la enzima β-glucoronidasa (GUS), el ferrocianuro

de potasio y el ferricianuro de potasio, estuvieron presentes en la mezcla de reacción, para

acelerar la dimerización oxidativa del compuesto intermediario de la reacción. El ion

ferroso pasó de ferroso a férrico, el EDTA mitigó la inhibición parcial de la enzima, por la

catálisis de oxidación (Stomp, 1992).

Cuadro 7. Solución de reacción para la tinción histoquímica

Compuestos Cantidad en µl Concentración

Buffer fosfato de sodio PH 7.0 1 M

100 100 mM

EDTA pH 8.0 0.25 M 40 10 mM K4Fe(CN)6.3H2O 5 mM 100 0.5 mM K3Fe(CN)6.3H2O 5 mM 100 0.5 mM Tritón 10% 10 0.1% X-gluc 40 mM 50 2 mM

Agua destilada 600 Total ∑ 1000

Fuente: (Stomp, 1992)

3.2.5 Análisis molecular

La extracción del ADN de las raíces transformadas genéticamente, para su

amplificación enzimática por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se

realizó por el método propuesto por Edwards et al., (1991).

El procedimiento fue el siguiente: se pesaron 50 mg de tejido vegetal y se

congelaron a – 70ºC durante 24 h, después se trituró el tejido con nitrógeno líquido.

Posteriormente se homogeneizó con 200 µl de la solución de extracción Cuadro 8.

Enseguida se centrífugo durante 5 min a 1500 rpm. Después se tomaron 150 µl del

sobrenadante, el cual se transfirió a un tubo limpio.

- 72 -

Enseguida se añadió 1 volumen de isopropanol. Después se incubó 10 min en hielo.

A continuación se centrífugo durante 10 min a 1500 rpm. Posteriormente se secó la pastilla

a 60ºC durante 5-10 min.

Después se lavó la pastilla con etanol al 70%. Posteriormente se resuspendió en 100

µl de TE. A continuación se realizó la fenolización con fenol-cloroformo-alcohol

isoamílico, saturado en TAE 24-24-1. Se tomó una muestra de 100 µl, y se agregó 1

volumen de fenol-alcohol- cloroformo isoamílico. Posteriormente se centrífugo durante 10

min a 1500 rpm. Para después colectar la fase acuosa y pasarla a un tubo limpio.

Enseguida se agregó 1 µl de isopropanol frío y se precipitó durante 20 min en hielo.

Cuadro 8. Solución de extracción del ADN para homogeneización

Para 100 ml Concentración final 10% SDS 5 ml 0.5% NaCl 1.46 g 250 mM Tris-HCl pH 8 1M 10 ml 100 mM EDTA 0.25 M 10 ml 25 mM TE: (para resuspender) Para 100 ml Tris HCI pH 8 1 M 1ml 10 mM EDTA 0.25 M 0.4 ml 1 mM

Fuente: (Edwards et al., 1991)

Después se centrífugo durante 15 min a 1500 rpm. Posteriormente se procedió a

secar y lavar la pastilla con etanol al 70% frío. Finalmente se resuspendió la pastilla con

100 µl de TE. Para tan solo utilizar 1 µl de este extracto para una reacción de 25 µl de PCR.

Hecha la extracción del ADN de las raíces transformadas genéticamente,

posteriormente se procedió ha realizar la amplificación enzimática de las secciones

específicas de los genes rol B y nptII, por medio de PCR en un termociclador Perkin Elmer

480, para lo cual se siguió el programa Cuadro 9. Para lograr la amplificación enzimática

de la sección específica de cada gen respectivo, se le agregó a cada muestra de extracción

de ADN, la mezcla para la reacción en cadena de la polimerasa Cuadro 10.

- 73 -

Cuadro 9. Programa para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

1 ciclo 30 ciclos 94ºC 4 min. 94ºC 1 min 55ºC 1 min. 55ºC 1 min 72ºC 3 min. 72ºC 3 min 72ºC 7 min 4ºC Hasta interrumpir

Cuadro 10. Mezcla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Mezcla de reacción en 50µl µl Agua desionizada estéril 25.5 Buffer TAE 1 X 5 Mg Cl2 25 mM 3 DNTP 200 µm de c/u 8 Primers 0.4 µM de c/u 5 Templado ADN 5 Taq ADN polimerasa 2.5 u 2.5

Cubrir con unas gotas de aceite mineral.

Las muestras del templado ADN que se amplifican a través de PCR, se corrieron en

un gel de agarosa al 1%, en la cámara de electroforesis a la cual se le agregó el Buffer TAE

1 X (tris acetato 0.04 M, EDTA 0.001M) hasta cubrir el gel.

En un trozo de papel parafilm se colocaron 5 µl de la tinción de corrida (azul de

bromofenol 0.25%) y se mezcló con 15 µl de las muestras del templado ADN, las mezclas

de ADN y los marcadores de peso molecular se colocaron en cada pozo, después se

conectó la cámara de electroforesis a 80 volts durante 1 h. Una vez terminada la

electroforesis se tiñó el gel con bromuro de etidio (BrEt), las moléculas de BrEt (10 mg

litro-1) se intercalaron con las del ADN dando una florescencia rojo-anaranjado, después se

eliminó el BrEt enjuagando el gel con agua durante 5 min, posteriormente se colocó el gel

en un transiluminador de luz UV (con un pico de emisión de 260 a 360 nm) para su

interpretación y fotografiado (Simón et al., 1993).

- 74 -

3.2.6 Extracción y desinfección superficial de esporas

Los métodos para la desinfección superficial de las esporas, para su trabajo in vitro

propuestos por Mugnier y Mosse (1987); Bécard y Piché (1992a); Bago et al., (1998) se

modificaron como se explica a continuación:

En un vaso de precipitado se agregó 100 g de suelo asociado a la rizósfera, en 1000

ml de agua corriente, se agitó mecánicamente durante 5 min, se dejó reposar durante 3

min, se decantó el sobrenadante de la mezcla, para su filtración a través de una columna

de tamices graduados (500, 150, 74 y 44) micras de diámetro de poro. Después se agregó

nuevamente 1000 ml de agua, para repetir así el paso anterior. Las fracciones retenidas en

las mallas de 74 y 44 micras, se colocaron en tubos de centrífuga por separado y se aforo

con agua destilada, después se centrifugó durante 3 min a 2000 rpm.

Las esporas, arcilla y partículas finas se precipitaron, quedando como sobrenadante

la materia orgánica. A continuación, se decantó el sobrenadante y se sacó la materia

orgánica adherida a la pared interna del tubo. Se le agregó un gradiente de glicerol al 50% al

tubo, para purificar las esporas.

Enseguida se centrifugó durante 3 min a 2000 rpm. Las esporas quedaron en el

sobrenadante, mientras que la arcilla y partículas finas se precipitaron junto con el glicerol.

Posteriormente en la campana de flujo laminar, fue extraído el sobrenadante con una pipeta

Pasteur el cual contenía las esporas, a un tubo nuevo estéril, al cual se le agregó etanol al

70% para iniciar el proceso de desinfección. Después se centrifugó durante 3 min a 1500

rpm, lo cual provocó la precipitación de las esporas, el sobrenadante fue extraído.

Posteriormente al tubo se le agregó hipoclorito de sodio al 20% para darle así un

segundo lavado. El cual se centrifugó durante 3 min a 1500 rpm, lo anterior provocó la

precipitación de las esporas y el sobrenadante fue extraído.

- 75 -

Para darle el tercer lavado, se le aplicó la solución desinfectante la cual contenía:

200 mg litro-1 de estreptomicina, 100 mg litro-1 de gentamicina, 20 g litro-1 cloramina T y

20 gotas litro-1 de Tween 80. Posteriormente se centrifugó durante 3 min a 1500 rpm, las

esporas se precipitaron y el sobrenadante fue extraído.

Después se añadió agua destilada estéril, se centrifugó durante 3 min a 1500 rpm,

las esporas se precipitaron y el sobrenadante fue extraído. Este paso se repitió por 4 veces.

Las esporas que se encontraron precipitadas fueron extraídas con una pipeta Pasteur,

para posteriormente ser colocadas de 10 a 15 esporas por caja petri, la cual contenía agar

agua (8 g litro-1 de agar).

Las cajas petri se sellaron con parafilm y se almacenaron a 40C en forma invertida y

en la obscuridad. Las esporas mantuvieron su viabilidad durante 7 meses. También se

almacenaron a 250C en la obscuridad, en la primera o segunda semana la mayoría de las

esporas comenzaron a formar sus tubos de germinación, lo cual se pudo observar en un

microscopio estereoscópico, lo anterior indicó que ya están listas para su cultivo

monoxénico definitivo.

3.2.7 Cultivo monoxénico de raíces transformadas con Glomus

intraradices

Una vez obtenidos por separado los cultivos in vitro axénicos, de raíces

transformadas con el ADN-T Ri, y de Glomus intraradices se procedió a su cultivo

monoxénico, en donde se pusieron a crecer en forma dual, una raíz transformada de Agave

salmiana Otto provenientes de hojas, tallo y raíz las cuales tenían 90 días de haberse

formado, junto con un racimo de 3 esporas germinadas de MA, se realizó de la siguiente

manera:

- 76 -

El medio mínimo (M) se preparó de acuerdo al Cuadro 11, el cual se colocó en un

matraz para su esterilización en autoclave a 1.05 kg/cm² de presión, y a una temperatura de

121ºC durante 25 min.

Cuadro 11. Formulación de medios nutritivos utilizados para la germinación de las semillas y cultivo monoxénico

Elementos minerales (Murashige y

Skoog, 1962) (Bécard y Fortin, 1988) Medio mínimo (M)

Macronutrientes mg litro-1 mg litro-1 NH4 NO3 1650 0.0 KNO3 1900 80 CaCl2. 2H2O 440 0.0 MgSO4. 7H2O 370 731 KH2 PO4 170 4.8 NaH2 PO4. 2H2O 0.0 0.0 KCl 0.0 65 Ca(NO3)2. 4H2O 0.0 288 Micronutrientes mg litro-1 mg litro-1 MnSO4. H2O 16.90 0.0 ZnSO4. 7H2O 8.60 2.65 H3BO4 6.20 1.5 Kl 0.83 0.75 Na2MoO4. 2H2O 0.25 0.0024 CuSO4. 7H2O 0.025 0.13 CoCl2. 6H2O 0.025 0.0 Na2SO4. 10H2O 0.0 0.0 MnCl2. 4H2O 0.0 6.0 Fierro mg litro-1 mg litro-1 NaFeEDTA 0.0 8.0 Na2 EDTA 37.30 0.0 FeSO4.7H2O 27.8 0.0 Suplementos orgánicos mg litro-1 mg litro-1 Tiamina – HCl 0.1 0.1 Ácido Nicotínico Ac. Libre 0.5 0.5 Piridoxina – HCI 0.5 0.1 Glicina (Base libre) 2.0 3.0 Myo – Inositol 100.0 50.0 Agar o Phytagel

8000.0 2500.0

Gel-gro 3000.0

Sacarosa 30,000.0 10,000 El pH se ajusta a: 5.7 5.5

Fuente: (Bécard y Fortín, 1988).

- 77 -

Se preparó un litro para 25 cajas petri esterilizadas de 9 x 15 mm, a las cuales se les

agregó 40 ml a cada una de M ya esterilizado, lo anterior se realizó en la campana de flujo

laminar. A las esporas utilizadas, primeramente se les rompió su latencia, dejándolas durante

24 h a 4ºC, posteriormente se pasaron a incubar en la obscuridad a 25ºC. Pasados 5 días se

pudo observar a las esporas, que comenzaron ha formar sus tubos de germinación.

Después en la campana de flujo laminar, bajo condiciones de completa esterilidad se

transfirien, con la ayuda de una pipeta Pasteur un racimo de 3 esporas madre junto con una

raíz transformada de Agave, de aproximadamente 7 cm y una raíz no transformada, de 7 cm

de longitud.

Las esporas germinadas se colocaron próximas a las zonas subapicales, de rápido

crecimiento radical. Después se sellaron las cajas petri con parafilm, posteriormente se

pasaron a incubar en forma invertida en la obscuridad a 25ºC.

Para la recuperación de esporas hijas, las cuales estuvieron en cultivo monoxénico

dentro de la caja petri, se realizó en la campana de flujo laminar con todo el material

completamente estéril, con unas pinzas se retiraron las raíces transformadas, después sólo

se colocó el M con una espátula en un vaso de licuadora y se le agregó una solución de

citrato sódico (ácido cítrico 1.9 g litro-1 pH 6 con NaOH 2N) de tal manera que cubriera el

gel, después se mezcló a 15000 rpm durante 5 seg. Enseguida se tamizó con una malla de 44

micras de diámetro de poro, posteriormente se lavó con agua destilada estéril para eliminar el

citrato sódico (Bago et al., 1998). Lo anterior permitió evaluar el número de esporas de

Glomus intraradices, que se encontraron en simbiosis con las raíces transformadas de

Agave salmiana.

3.2.8 Técnica para el clareo y tinción de raíces

Una vez que se colectaron 25 raíces, estas se colocaron dentro de cápsulas de acero

inoxidable, en frascos esterilizables, para su clareo y tinción se siguió la técnica propuesta por

Kormanik et al., (1980) (Cuadro 12).

- 78 -

Cuadro 12. Compuestos utilizados para el clareo y tinción de raíces Compuesto ml ml ml FAA 50 de Formol 50 de ácido acético glacial 900 de alcohol (96%) H202 alcalino 3 de NH4OH 567 de agua 30 de H202 (10%) Lactoglicerol 875 de ácido láctico 62 de agua + colorante 63 de glicerol

Fuente: (Kormanik et al., 1980)

A las raíces se les agregó hidróxido de potasio (KOH) al 10% hasta cubrir la cápsula.

Enseguida se aplicó el primer ciclo de esterilización en autoclave, a 1.05 kg/cm² de presión y a

una temperatura de 121ºC, durante 10 min. Después se retiró el KOH de los frascos

esterilizados, se procuró que no se abrieran las cápsulas. Se enjuagó bien, por los menos 3

veces con agua de la llave, hasta eliminar el exceso de KOH. A continuación se aplicó el H202

alcalino para cubrir la cápsula, la cual se dejó en agitación durante 10 min, a una temperatura

de 20ºC, hasta que las raíces se pusieron más claras. Después se decantó el H202 alcalino, y se

enjuagó 3 veces con agua de la llave.

Posteriormente para lograr acidificar las raíces, las cápsulas se sumergieron en HC1

al 1% y se agitó durante 3 min. Después se retiró el HC1, y no se lavaron las raíces.

Enseguida se agregó la solución colorante con 0.05% de fucsina ácida diluida en

lactoglicerol. A las raíces con la solución colorante se les aplicó, el segundo ciclo de

esterilización en autoclave, a 1.05 kg/cm² de presión y a una temperatura de 121ºC, durante

10 min. Después se retiró la solución colorante. Para eliminar el remanente de colorante, se

añadió lactoglicerol limpio.

La tinción también se llevó a cabo in situ, en el medio de cultivo monoxénico de la

caja petri, la cual se inundó con fucsina ácida diluida en lactoglicerol y se dejó incubar

durante 12 h. Con esta técnica se coloreó solamente el micelio externo (Bago et al., 1998).

3.2.9 Evaluación de la colonización MA en raíces

Para determinar la colonización de las raíces, fue necesario evaluar microscópicamente

la morfología interna de la MA (Phillips y Hayman, 1970).

- 79 -

Se colocaron los fragmentos de raíces coloreadas en portaobjetos. De 25 segmentos

de aproximadamente 2 cm de longitud por tratamiento. Después se agregó de una a tres gotas

de lactoglicerol limpio, en los extremos de las raíces para clarificar. Enseguida se tomó un

cubreobjetos, para dejarlo caer suave y verticalmente, sobre la preparación. Se procuró

eliminar las burbujas de aire que se formaron.

Enseguida se quitó el exceso de lactoglicerol, con un algodón humedecido en alcohol

al 96%. Después se selló herméticamente la preparación, con esmalte transparente. Con la

ayuda del microscopio óptico con el aumento de 100 X, y colocando una gota de aceite de

inmersión, se pudo observar la presencia de las estructuras fúngicas. Posteriormente se realizó

la evaluación de los campos colonizados o no colonizados.

3.2.10 Registro y análisis de datos

La toma de datos se realizó, de acuerdo a lo especificado en el Cuadro 6, en donde

se tomaron los datos para la respuesta a la inoculación con A. rhizogenes en hojas, tallo y

raíz de Agave salmiana Otto.

Se determinó, si existió diferencia significativa entre los 12 diferentes tratamientos

con 5 plantas cada uno. Para ello se empleó la prueba para el análisis de varianza no

paramétrico, para el diseño experimental completamente al azar, propuesta por Kruskal-

Wallis, en el cual no se asume la distribución normal, ya que tan solo es una aproximación

de Gaussian (Steel y Torrie, 1985; Wayne, 1987). Al aceptar la hipótesis alternativa, se

realizó la prueba para las medias de los rangos múltiples estandarizados de Tukey-Kramer,

con la finalidad de seleccionar el mejor tratamiento (Cochran y Cox, 1983).

Las variables independientes fueron: concentración de bacterias, concentración de

acetosiringona, YMB y sitio de inoculación. Las variables dependientes fueron: porcentaje

para la inducción del enraizamiento, porcentaje de colonización con Glomus intraradices y

número de esporas. Las respuestas se valoraron en forma cualitativa (a simple vista y bajo el

microscopio óptico), en forma periódica.

- 80 -

4.-RESULTADOS

4.1 Respuesta a la inducción del enraizamiento con Agrobacterium

rhizogenes en Agave salmiana Otto

El tiempo promedio de germinación para las semillas de Agave salmiana Otto fue

de 5 días, y el porcentaje de germinación fue de un 90% (Fig. 5 A). La respuesta a la

inoculación con A. rhizogenes para el testigo 11 (Figs. 5 B y 5 C) fue nula. El Agave que

fue reproducido asexualmente in vito, e inoculado en tallo con 1x108 bacterias ml-1 y 100

µm de acetosiringona, la respuesta también fue nula (Fig. 5 D).

Figura 5. Plantas de Agave salmiana Otto. A) semillas in vitro con 5 días de germinación. B) testigo con 30 días de crecimiento (Tratamiento 11). C) testigo con 60 días (Tratamiento 11). D) planta proveniente del cultivo in vitro con 90 días, reproducida asexualmente.

- 81 -

Se realizó el análisis de varianza no paramétrico, por haberse tomado los datos en

forma cualitativa, para lo cual se empleó la prueba propuesta por Kruskal-Wallis (Steel,

1985; Wayne, 1987). En donde se encontró que JI-cuadrada para un nivel de significancia

de 0.05 alcanzó un valor de 19.06751. En relación a lo anterior se acepta la hipótesis

alternativa (Ha), en la cual se planteó que al menos dos tratamientos son diferentes. Para

determinar cuales fueron los tratamientos diferentes, se realizó la prueba para las medias de

los rangos múltiples estandarizados de Tukey-Kramer (Cochran y Cox, 1983).

En el Cuadro 13 se pude observar que la mejor respuesta, en lo que respecta al

porcentaje para la inducción del enraizamiento, fue para tallo y hojas. La inducción de

raíces adventicias transformadas se presento a los 25 días después de la inoculación con A.

rhizogenes. Se encontró diferencia significativa para algunos de los diferentes tratamientos

planteados, para el análisis de varianza (P = 0.05) en donde se observó que:

Cuadro 13. Respuesta a la concentración de bacterias y acetosiringona en diferentes partes vegetativas

Trata-miento No.

[B] bacterias ml-1

[A] µm Hojas Tallo Raíz Porcentaje de enraizamiento

T .1 1x107 0 ü 2.5 d T .2 1x107 0 ü 10.0 d T .3 1x107 0 ü 5.0 d T. 4 1x108 100 ü 35.0 bc T. 5 1x108 100 ü 57.5 a T. 6 1x108 100 ü 15.0 cd T. 7 1x109 200 ü 40.0 ab T. 8 1x109 200 ü 60.0 a T. 9 1x109 200 ü 17.5 cd T.10 0 0 ü 0.0 d T.11 0 0 ü 0.0 d T.12 0 0 ü 0.0 d

[B] Concentración de bacterias por ml. [A] Concentración de acetosiringona en µm. Los T.10, T.11 y T.12 son los testigos y contenían YMB (Cuadro 5). Los tratamientos con una misma letra, no resultaron ser significativos para la prueba de Tukey-Kramer al 0.05.

- 82 -

Los tratamientos 6 y 9, a pesar de que contenían acetosiringona y bacterias, no

resultaron ser significativos respecto a los tratamientos que no la contenían (1, 2, 3, 10, 11 y

12). Existió respuesta significativa para la aplicación de acetosiringona, lo anterior se

demostró en los tratamientos (1, 2, 3, 10, 11 y 12) los cuales no la contenían respecto a los

tratamientos que si la contienen (4, 5, 7 y 8). Los tratamientos 7 y 8 no resultaron ser

significativos, a pesar de que contenían una mayor concentración de acetosiringona y

bacterias, respecto a los tratamientos 4 y 5.

En la Fig. 6 se puede apreciar la inducción del enraizamiento, después de la

inoculación con Agrobacterium rhizogenes para Agave salmiana Otto.

Figura 6. Inducción de raíces adventicias transformadas. A) la planta tiene 60 días de haber sido inoculada, y muestra la inducción de raíces en tallo. B) el Agave tiene 60 días de haber sido inoculado y muestra la inducción del enraizamiento en tallo y hoja, a pesar de que se corto el tallo. C) fragmento de hoja de Agave la cual tiene 60 días de haber sido inoculada, y muestra la inducción de raíces. D) el Agave tiene 90 días de haber sido inoculado y muestra la inducción de raíz en hoja.

- 83 -

Los mejores tratamientos para la inducción de raíces fueron 4 y 5, los cuales

resultaron se significativos respecto a los tratamientos (1, 2, 3, 6, 9, 10, 11 y 12). Con

relación a lo anterior el mejor tratamiento para la inducción del enraizamiento, resulto ser el

5 con un 57.1% el cual fue inoculado en tallo con 1x108 bacterias ml-1 y 100 µm de

acetosiringona. Estos resultados se muestran en la Fig. 7, en donde se observa la respuesta

a la inoculación con Agrobacterium rhizogenes para Agave salmiana Otto.

Figura 7. Respuesta a la inoculación con A. rhizogenes para A. salmiana. A) formación de raíz adventicia transformada en tallo, el Agave tiene 60 días de haber sido inoculado. B) la raíz adventicia transformada se bifurca en tallo, la planta tiene 90 días de haber sido inoculada. C) la raíz adventicia transformada se bifurca en tallo, también se puede apreciar la inducción del enraizamiento en las raíces originales, el Agave tiene 5 meses de haber sido inoculado. D) formación de raíz adventicia transformada en tallo, la planta tiene 5 meses de haber sido inoculada. E) desarrollo de cuatro raíces adventicias transformadas en tallo, el Agave tiene 5 meses de haber sido inoculado.

- 84 -

4.2 Respuesta para el gen reportero uid A que codifica para la enzima ββ-glucoronidasa

La transformación genética para las raíces adventicias formadas de Agave salmiana

Otto, de los tratamientos (4, 5 y 6) expresaron al gen reportero uid A, el cual se encuentra

formando parte del vector binario (pESC4), se observó una tinción de color azul en las

zonas del xilema y floema, donde solamente se expresa este gene (Fig. 8).

Figura 8. Actividad para el gen reportero uid A, el cual codifica para la enzima β-glucoronidasa (GUS). A) la tinción azul se pudo observar en una raíz adventicia transformada de Agave salmiana Otto, la cual tenía 60 días de haber sido inoculada con A. rhizogenes, y B) amplificación de la raíz adventicia transformada.

4.3 Presencia de los genes rol B y nptII

Una vez realizada la extracción del ADN de las raíces transformadas genéticamente

de Agave salmiana Otto, a través del método propuesto por Edwards et al., (1991),

posteriormente se amplificaron en forma enzimática los genes rol B y nptII, por medio de

la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

- 85 -

Las muestras del templado ADN (genes rol B y nptII) que se amplificaron a través

de PCR, posteriormente se corrieron en un gel de agarosa en una cámara de electroforesis.

Después se tiñó el gel con bromuro de etidio, el cual se intercaló con las bandas del ADN

dando una florescencia rojo-anaranjado, posteriormente se colocó el gel en un

transiluminador de luz UV (Fig. 9).

pb

2000

1200

800 780 rol B

517 NPTIIT.4 T.5 T.6 T.4 T.5 T.6

H T R H T R

O A A O A A

J LL Í J LL Í

A O Z A O Z

S S

Fig. 9. Gel de agarosa en un transiluminador de luz UV. En donde se demuestra que existió respuesta positiva para la presencia de los genes rol B y nptII.

En el Cuadro 14 se verificó la eficiencia de transformación genética, para las raíces

adventicias formadas de los tratamientos 4, 5 y 6, los cuales fueron positivos para la

actividad de GUS, así como para la presencia de los genes rol B y nptII para el Agave

salmiana Otto.

- 86 -

Cuadro 14. Eficiencia de transformación de las raíces adventicias formadas Tratamiento No. Parte vegetativa % de la

actividad de GUS

% de la presencia del gen rol B

% de la presencia del gen nptII

4 Hoja 30 20 20 5 Tallo 80 60 60 6 Raíz 20 15 15

Se muestrearon 25 raíces para cada tratamiento, los porcentajes representaron la

media para cada tratamiento

.

4.5 Respuesta a la colonización en raíces silvestres

Las raíces de las plantas silvestres de Agave salmiana Otto, las cuales se encontraron

distribuidas en el altiplano Potosino- Zacatecano, se les practicó la técnica de clareo y

tinción de Kormanik et al., (1980). En donde se pudo determinar que existió colonización.

Posteriormente se utilizó la técnica de Phillips y Hayman (1970) en la cual resultó un 85% de

colonización por parte de hongos MA nativos (Fig. 10).

4.6 Respuesta a la colonización de las raíces transformadas

Las raíces transformadas de Agave salmiana Otto con el ADN-T Ri, provenientes de

hojas, tallo y raíz, las cuales se colocaron en cultivo monoxénico en un medio mínimo (M),

en forma dual junto con Glomus intraradices. Se prepararon 25 cajas petri, las cuales

contenían en su interior M, un racimo de 3 esporas madre de G. intraradices, una raíz

transformada de 7 cm y una raíz no transformada de 7 cm de longitud. Las cajas petri se

mantuvieron en forma invertida en la obscuridad a 25ºC, lo anterior dio como resultado lo

siguiente:

- 87 -

Figura 10. Respuesta a la colonización en raíces silvestres . A) planta silvestre de Agave salmiana Otto. B) esporas de la raíz de A. salmiana. C) izquierda formación de vesícula, derecha hifa. C) arriba espora y abajo señalización de la hifa sustentora.

La espora madre germinó a los 5 días, a los 25 días se pudo observar la continuación

de la colonización, al extender la espora madre el tubo germinativo, el cual penetró a la raíz

transformada con el ADN-T Ri y posteriormente se ramificó. Mientras que la raíz no

trasformada, no fue penetrada por el hongo. A los 6 meses se realizó la técnica de clareo y

tinción de Kormanik et al., (1980), y después se utilizó la técnica de Phillips y Hayman

(1970) en la cual resultó un 70% de colonización de las raíces transformadas (Fig. 11).

- 88 -

Figura 11. Respuesta a la colonización en raíces transformadas. A) izquierda raíz transformada, centro raíz no transformada, derecha racimo de 3 esporas madre de G. intraradices. B) la espora madre extendió su tubo germinativo hacia la raíz transformada, foto tomada 25 días después de la inoculación. C) formación de 5 esporas hijas en una raíz transformada. D) izquierda formación de vesículas, derecha formación de esporas en una raíz transformada. E) arriba raíz transformada, abajo racimos de esporas. F) amplificación de la espora y señalización de la hifa sustentora.

Posteriormente se procedió a la recuperación de las esporas hijas (Bago et al., 1998),

en donde se analizaron 10 cajas petri y se obtuvieron en promedio 300 esporas hijas, por caja

petri después de 6 meses de haberse iniciado la incubación.

- 89 -

5.- DISCUSIÓN

En base a los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, se

demostró que el Agave salmiana Otto fue susceptible a la infección con Agrobacterium

rhizogenes al lograr la inducción del enraizamiento, además las raíces trans formadas

pudieron ser colonizadas con Glomus intraradices. Hasta el momento, tal parece ser que

este es el primer reporte respecto a la inducción del enraizamiento in vitro de A. salmiana

utilizando el ADN-T Ri, colonización MA de las raíces silvestres, así como también se

logro obtener el cultivo monoxénico y colonización de las raíces transformadas de A.

salmiana con G. intraradices. Con relación a lo anterior, se ha cumplido en dar respuesta a

la pregunta científica, y se acepta la hipótesis planteada en el sentido que A. rhizogenes fue

capas de inducir el enraizamiento, para diferentes partes vegetativas de A. salmiana.

Evaluación a la inducción del enraizamiento en hojas, tallo y raíz

La técnica de herida utilizando una jeringa para insulina (29G X 13 mm) realizada

en trabajos de Tzfira et al., (1996) y Villalobos et al., (2002) demuestran la necesidad de

realizar una herida profunda en los trabajos de transformación genética con A. rhizogenes,

ya que al momento de analizar en el microscopio electrónico, se observa que la

regeneración de nuevas células transformadas, no ocurre en la epidermis ni en la

subepidermis, la regeneración se da en el estele y células del cambium, presentándose aun

más en células inmaduras (recién germinadas) del estele y células del cambium. De acuerdo

a los resultados obtenidos en este trabajo, se encontró que existió una respuesta favorable

usando la técnica de herida con una jeringa para insulina tal como lo recomiendan los

autores arriba mencionados para A. salmiana, el tratamiento 5 (inoculado en tallo con 1x108

bacterias ml-1 y 100 µm de acetosiringona) resultó con un 57.5% para la inducción de raíces

transformadas en los puntos inoculados. Este valor de inducción al enraizamiento es

comparable al reportado por López et al., (1996) quienes reportan una eficiencia de un 65%

de enraizamiento para Pinus nigra ssp. Salzmanii.

- 90 -

Calixto y Pais (1997) registran una eficiencia de enraizamiento de un 60% en P.

pinaster y el más reciente Villalobos et al., (2002) con una eficiencia de enraizamiento de

un 60% en P. maximartinezii y una eficiencia de enraizamiento de un 67% en P. pinceana.

Se trabajó con diferentes concentraciones de bacterias y acetosiringona, así como

también se evaluaron diferentes sitios de inoculación en hojas, tallo y raíz. En donde se

encontró que el mejor tratamiento resultó ser el 5. Tzafira et al., (1996) mencionan que al

incrementar los periodos de incubación por arriba de los 6 días, influyen para que se pueda

presentar altos porcentajes de necrosis y mortalidad de tejidos. Es por ello que se empleó el

tiempo de incubación en la oscuridad de 6 días. El tratamiento 5 obtuvo un 57.5% para la

inducción de raíces transformadas en los puntos inoculados. La formación de raíces

adventicias se presentó a los 25 días, después de haber realizado la inoculación con A.

rhizogenes.

A. rhizogenes infecta principalmente a plantas dicotiledóneas, las que al momento

de sufrir una herida secretan la acetosiringona, la cual atrae por quimiotaxis a A.

rhizogenes, e induce la expresión de los genes vir, que se encuentran dentro del ADN-T Ri

(Zupan et al., 1995). Draper et al., (1988) plantean que la acetosiringona purificada puede

inducir la expresión de los genes vir, incluso en ausencia de células vegetales.

A. salmiana se reproduce tanto sexual como asexualmente, en ambas formas de

reproducción la inulina y la tiamina son almacenadas en el menzonte o tallo (Gentry 1982,

Nobel, 1985). La tiamina es un factor de enraizamiento que actúa directamente sobre las

células meristemáticas que se encuentran en división celular, este compuesto es

biosintetizado en hojas y luego movilizado hacia el órgano de reserva, en este caso el

menzonte (Chee, 1995). Esto combinado con la acción de la inoculación de A. rhizogenes,

pudo haber influido para que ocurriera la inducción al enraizamiento, en hoja, tallo y raíz,

pero más en los dos primero órganos.

- 91 -

Verificación de la eficiencia de transformación genética en las raíces

adventicias formadas

Los genes presentes en el ADN-T Ri, los cuales codifican para expresar ciertas

enzimas, y mediante la detección de la expresión de dichas enzimas específicas, es como se

pudo demostrar si el tejido estaba o no transformado.

La evaluación de la actividad y presencia de los genes foráneos, se puede realizar a

través de los 2 siguientes procedimientos: 1) tinción histoquímica, mediante la cual se

puede determinar la actividad del gen GUS, y 2) mediante el análisis molecular a través de

PCR se puede verificar la presencia de los genes nptII y rol B (Draper et al., 1988;

Potrykus, 1995; Van der Salm, 1996; Jofre-Garfias et al., 1997). Para esta investigación

ambos métodos fueron realizados, efectivamente se demostró que mediante la tinción

histoquímica para el tallo, se obtuvo el valor más alto el cual fue de un 80% para la

actividad del gen GUS. Mediante el análisis molecular a través de PCR, se verificó la

presencia del gen nptII y del gen rol B, ambos estuvieron presentes en un 60%.

En la Fig. 1 se muestran las propiedades de Agrobacterium para transferir genes en

las células vegetales, para A. rhizogenes en donde se pudo demostrar que los dos

plásmidos, se pueden expresar al azar en 3 distintas formas, en los tejidos vegetales, los

cuales pueden ser: 1) Ri (pRiA4) (Fig. 2) en su análisis molecular solamente existirá

respuesta para el gen rol B, 2) Ri (pRiA4) y Km (pESC4) Fig. 3 en su análisis molecular

existirá respuesta para los genes rol B y nptII, así como para la actividad de GUS y 3) Km

(pESC4) en su análisis molecular existirá solamente respuesta para la actividad de GUS

(Draper et al., 1988; Jofre-Garfias et al., 1997). Como se puede comprobar existe mayor

probabilidad de encontrar respuesta para la actividad de GUS, respecto al gen rol B. Lo

citado anteriormente coincide con los resultados obtenidos en este estudio ya que fue

posible demostrar la actividad y presencia de los genes foráneos.

- 92 -

Los genes nptII obtuvieron un 60% de presencia, aunque era de esperarse un

resultado mayor no fue así, debido a las circunstancias siguientes, aunque se tomaron todas

la medidas necesarias y pertinentes, para la técnica de extracción de ADN por el método

propuesto por Edwards et al., (1991) pudo haber existido oxidación del ADN, lo cual

influyó notablemente en la presencia del gen nptII .

Este sistema permitirá, la posibilidad de introducir genes de interés agronómico al

sistema radical para A. salmiana, sin afectar con ello a la parte aérea de la misma,

conservando sus características agronómicas. Generándose así plantas quiméricas con el

sistema radical transformado genéticamente (Lambert et al., 1991; Bergmann y Stomp,

1994).

Determinación de la susceptibilidad de las raíces transformadas de A.

salmiana a la colonización por G. intraradices

White (1934) quien cultivó exitosamente ápices aislados de raíces de tomate, las

cuales hizo crecer durante 25 años en un medio líquido que contenía sales inorgánicas,

sacarosa, extracto de levadura y AIA. De los compuestos mencionados anteriormente, se

encontró que en ausencia del AIA las raíces no crecen. Los HMA, Rhizobium y las PGPR,

pueden afectar el balance hormonal de la rizósfera ya que secretan, una gran cantidad de

reguladores del crecimiento como: ABA, AIA, citocininas, giberelinas, vitaminas y

compuestos volátiles. De tal suerte se ha demostrado que el AIA es la hormona que

promueve principalmente la colonización MA en la raíz hospedera (Gianinazzi, 1991;

Bethlenfalvay y Schuep, 1994; Hodge, 2000). Lo antes citado coincide con los resultados

obtenidos, ya que en las raíces adventicias transformadas de Agave salmiana, se

expresaron los genes Tms (Fig. 2) y rol B, los cuales promovieron la colonización.

- 93 -

Diversos trabajos como el de Bécard y Fortin (1998), Bécard y Piché (1992b) y

recientemente Wenkart et al., (2001), obtienen mediante la técnica de las raíces

transformadas con el ADN-T Ri, la colonización de las raíces trasformadas por parte de un

hongo micorrízico, los dos primeros con Gigaspora margarita y el último con Tuber

melanosporum un hongo ectomicorrízico. Bécard y Fortin, (1998) logran la colonización en

un 83% en raíces transformadas de zanahoria. Bécard y Piché (1992b) encontraron que la

germinación de las esporas se presentó al cuarto día, y recuperaron 500 esporas hijas

después de un año de haber iniciado el cultivo.

Finalmente Wenkart et al., (2001) inocularon el hongo ectomicorrízico Tuber

melanosporum, en raíces transformadas de Cistus incanus y encuentran que después de 5

meses, se presentó la formación del manto externo, así como la red miceliar interna de

Hartig. Los autores citados anteriormente realizaron sus cultivos monoxénicos en el medio

mínimo (M).

Aunque la zanahoria y Cistus incanus son dicotiledóneas, esta condición no fue una

limitante para que A. salmiana que es monocotiledónea respondiera favorablemente a la

aplicación de 1x108 bacterias ml-1 y 100 µm de acetosiringona, para lograr la inducción de

raíces transformadas.

Al realizar el cultivo monoxénico utilizando medio mínimo (M), las raíces

transformadas de A. salmiana e inoculadas con G. intraradices, se encontró que la espora

madre germinó a los 5 días. Existió un 70% de colonización de las raíces. A los 6 meses se

procedió a la recuperación de las esporas hijas, en donde se obtuvieron en promedio 300

esporas hijas por caja petri.

- 94 -

6.- CONCLUSIONES

Se demostró que fue posible lograr la inducción del enraizamiento in vitro de Agave

salmiana Otto, utilizando Agrobacterium rhizogenes. El mejor tratamiento resultó el que

fue inoculado en tallo con 1x108 bacterias ml-1 y 100 µm de acetosiringona. El tiempo de

incubación en la oscuridad fue de 6 días. El tratamiento anterior obtuvo un 57.5% para la

inducción de raíces transformadas en los puntos inoculados. La formación de raíces

adventicias se presento a los 25 días, después de haber realizado la inoculación con A.

rhizogenes.

Se demostró la actividad y presencia de los genes foráneos en las raíces

transformadas de Agave salmiana, por medio de la tinción histoquímica para el gen

reportero uid A, que codifica para la enzima β-glucoronidasa (GUS ), en donde se encontró

un 80% de actividad. Mediante el análisis molecular a través de PCR se demostró la

presencia del gene nptII y del gen rol B, ambos estuvieron presentes en un 60%.

En lo que respecta a la colonización con una micorriza, este es el primer reporte, en

donde se determinó un 85% de colonización en las raíces silvestres de A. salmiana, por

parte de una micorriza arbuscular nativa.

Así como también es el primer reporte sobre la colonización de las raíces

transformadas de Agave en cultivo monoxénico con G. intraradices. La colonización de las

raíces transformadas fue de un 70% y se obtuvieron en promedio 300 esporas hijas por caja

petri, después de 6 meses de haberse iniciado la inoculación.

- 95 -

7- BIBLIOGRAFÍA

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Universidad de ColimaE S T U D I A - L U C Il A - T R A B A J A

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIASPOSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA

ING. RODOLFO V. MORENTÍN DELGADODIRECTOR DE LA F.C.B.A.PRESENTE

En atención a que el C. Guillermo Rodríguez Hernández, alumno egresado delDoctorado en Ciencias, área Biotecnología, con número de cuenta 99-3030, harealizado todas las correcciones al manuscrito de tesis que presentó al cuerpoacadémico de revisores, constituido por: Dra. María del Rocío Flores Bello, Dr.Oscar Rebolledo Domínguez, Dr. Javier Farías Larios, Dr. José Gerardo LópezAguirre profesores-investigadores de la U de C y el Dr. Eugenio Pérez MolpheBalch Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. Medirijo respetuosamente para solicitarle la autorización de impresión de la tesistitulada: “Inducción del enraitamiento en Agave salmiana Otto conAgrobacterium rhizogenes y colonización de raíces transformadas porGlomus intraradices”.

Esta tesis ha sido dirigida por el Dr. Sergio Aguilar Espinosa, y el Dr EugenioPérez Molphe Balch.

Sin otro asunto más que tratar, reciba saludos

Atentamente

Tecomán, Colima a 23 de Septiembre de 2002

Responsable de Posgrado

c.c.p. Expediente Académico del Alumnoc.c.p Interesado

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIASPOSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA

Dr. Sergio Aguilar EspinosaResponsable del PosgradoP R E S E N T E . -

Por este conducto me permito comunicar que he revisado el documento doctoral“Inducción del enraizamiento en Agave salmiana Otto con Agrobacterium rhizogenes ycolonización de raíces transformadas por Glomus intraradices", que presenta el C.Guillermo Rodríguez Hernández. mismo que considero que incluyó las revisiones que elcomité revisor recomendó, por lo que expreso mi aprobación para que se sigan los tramitesacadémicos que correspondan.

Sin otro particular. le saludo cordialmente

A T E N T A M E N T ETecomán. Colima 19 de Septiembre de 2002

Profesor-Investiogadorsaguilar@col.mx

c.c.p. Ing. Rodolfo Valentino Morentín Delgado.- Director de la FCBAc.c.p. Interesado.c.c.p. Archivo Personal

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSACOORDINADOR DEL PROGRAMA DE POSGRADO DE LA FCBAUNIVERSIDAD DE COLIMAPRESENTE:

Aguascalientes, Ags. 18 de Septiembre de 2002

Por medio de la presente me permito comunicarle que he revisado las correcciones hechaspor el alumno de doctorado Guillermo Rodríguez Hernández a su tesis titulada “Inducción delenraizamiento con Agrobacterium rhizogenes en Agave salmiana Otto y colonización de lasraíces transformadas con Glumus intraradice". Estas correcciones le fueron sugeridas en suexamen predoctoral presentado el pasado mes de mayo del presente año. En mi opinión lascorrecciones fueron hechas de manera satisfactoria. Por lo anterior considero que puedeprocederse a la impresión definitiva de esta Tesis de Doctorado en Ciencias.

Sin otro asunto a tratar por el momento, me despido de Usted enviándole un cordialsaludo.

ATT.

Dr. Eugenio Pérez Molphe BalchDpto. de Química. C. de Ciencias Básicas

Universidad Autónoma de AguascalientesEdificio 60. Av. Universidad 940

20 1 OO Aguascalientes, Ags. MéxicoTel. (449)910 84 20 Fax. (449)910 84 01

eperezmb@correo.uaa.mx

UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE MEDICINA V ETERINARIA Y ZOOTECNIA

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSARESPONSABLE DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIASPRESENTE

Por este conducto, hago de su conocimiento que después de haber revisado elborrador de tesis de doctorado titulado “Inducción del enraizamiento con Agrobacteriumrhizogenes en Agave salmiana Otto y colonización de las raíces transformadas con Glomusintraradices” . que presenta el C. Guillermo Rodriguez Hernández. considero que reúne loselementos suficientes de contenido y forma de un documento de doctorado en ciencias. Porlo que expreso mi aprobación para que se sigan los tramites académicos que correspondan.

Sin otro particular, me despido de usted

ATENTAMENTETecomán. Col.. a 19 de septiembre de 2002

ARIA DEL ROCIO FLORES BELLODIRECTORA

c.c.p. Ing. Rodolfo V. Morentin Delgado.- Director de la F:C:B:A:c.c.p. Interesadoc.c.p. Archivo personal

Kilómetro 40, autopista Colima-Manzanillo; Tecomán, Colima, México, C.P. 28100Tel. 01 (313) 322 94 07, Ext. 52301, Ext.. Fax 52302

UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA

Asunto: Revisión de tesis de Doctorado.

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSACOORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍAP R E S E N T E .

De la manera más atenta me permito comunicarle que he concluido con la revisión delInforme en Extenso de los estudios de Doctorado en Ciencias del C. Guillermo RodríguezHernández, titulado “INDUCC/ÓN DEL ENRAIZAMIENTO EN Agave salmiana Otto,CON Agrobacterium rhizogenes Y COLONIZACIÓN DE RAÍCES TRANSFORMA DASPOR Glomus intraradices”. Luego de su revisión he encontrado que el documento reúnelos requisitos necesarios, tanto en su contenido como en su forma. Por lo anterior, deseoexpresarle mi aceptación para su impresión final.

Agradezco la oportunidad brindada para fungir como revisor de este documento, a lavez que ratifico mi firme deseo de continuar contribuyendo en la formación de recursoshumanos altamente calificados y con carácter independiente.

Sin otro particular, aprovecho la presente para enviarle un cordial saludo.

A T E N T A M E N T ETecomán, Col., a 19 de Septiembre del 2002.

DR.P R

C.c.p. Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal. Delegado Regional No. 2.C.c.p. Ing. Rodolfo Valentino Morentín Delgado. Director de la FCBA.C.c.p. Archivo.

Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias

Tecomán, Col., a 20 de Septiembre de 2002

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSACOORDINADOR DEL POSGRADO EN BIOTECNOLOGIAPRESENTE

Pos este medio me dirijo a Usted para comunicarle que he realizado la revisión delmanuscrito que presenta el C. Guillermo Rodríguez Hernández, titulado “INDUCCIÓNDEL ENRAIZAMJENTO EN Agave salmiana Otto CON Agrobacterium rhizogenes YCOLONIZACIÓN DE RAICES TRANSFORMADAS POR Glomus intraradices”.Una vez finalizada esta revisión he constatado que dicho manuscrito reúne los requisitosnecesarios, tanto en forma como en contenido, para ser presentado como Tesis Doctoral,por lo que no tengo inconveniente en expresar mi aceptación y autorización de la impresiónfinal de él.

Sírvase también aceptar mis agradecimientos por la oportunidad que me otorgó para fungircomo revisor del mencionado manuscrito, quedando a sus respetables ordenes para seguircontribuyendo a la formación de recursos humanos de alta calidad.

Sin más por el momento, me despido de Usted enviándole un cordial saludo

ATENTAMENTE

D R . JOSÉ GERARDO LÓPEZ AGUIRREProfesor-Investigador del Posgrado

c.c.p. Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal. Delegado Regional No. 2.c.c.p. Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado. or de la F.C.B Ac.c.p. Archivo

Carretera Jiquilpan-Manzanillo, km 260 / Tecomán. Colima, 28100, A.P. 36 / Telefax 01 (332) 4 42 37, 4 46 42E-mail: dfcba@tecoman.ucol.mx

Facutad de Ciencias Biológicas y Ag ropecuarias

Dr. Sergio Aguilar EspinosaCoordinador del Posgrado de la FCBAP r e s e n t e .

Por este conducto y de la manera más atenta informo a usted, que leí, analicé y evalué el borradorde tesis doctoral, titulada “INDUCCIÓN DEL ENRAIZAMIENTO EN Agave salmiana OTTO,CON Agrobacterium rhizogenes Y COLONIZACIÓN DE RAÍCES TRANSFORMADAS PORGlomus intraradices”, y considero, que cumple con los requisitos suficientes para que continúe lostramites de titulación que correspondan.

Agradezco el alto honor con que me distingue, para fungir como revisor de tesis.

Sin mas por el momento, aprovecho la oportunidad para saludarle afectuosamente y reiterarle lamas alta de mis consideraciones.

ATENTAMENTETecomán Col., a 19 de Septiembre de 2002.

Docente de la FCBA

c.c.p.- Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado.- Director de la FCBA.c.c.p.- C. Guillermo Rodríguez Hernández.- Interesado.c.c.p.- Archivo.

Carretera Jiquilpan-Manzanillo, km 260 / Tecomán. Colima, 28100, A.P. 36 / Telefax 01 (332) 4 42 37, 4 46 42E-mail: dfcba@teccmaiucol.mx