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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN SULFOLOBUS METALLICUS DURANTE LA BIOLIXIVIACIÓN DE CALCOPIRITA MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA PAOLA DOMÍNGUEZ ZAMBRANO PROFESOR GUÍA: TOMÁS VARGAS VALERO MIEMBROS DE LA COMISIÓN: ORIANA SALAZAR AGUIRRE BLANCA ESCOBAR MIGUEL SANTIAGO DE CHILE JUNIO 2007
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN
SULFOLOBUS METALLICUS DURANTE LA BIOLIXIVIACIÓN DE CALCOPIRITA
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA
PAOLA DOMÍNGUEZ ZAMBRANO
PROFESOR GUÍA:
TOMÁS VARGAS VALERO
MIEMBROS DE LA COMISIÓN:
ORIANA SALAZAR AGUIRRE
BLANCA ESCOBAR MIGUEL
SANTIAGO DE CHILE
JUNIO 2007
RESUMEN DE LA MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE
INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA POR: PAOLA DOMÍNGUEZ ZAMBRANO
FECHA: 03/07/2007 PROF. GUIA: Sr. TOMÁS VARGAS VALERO.
“ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN SULFOLOBUS METALLICUS
DURANTE LA BIOLIXIVIACIÓN DE CALCOPIRITA”
La biolixiviación de calcopirita a 70 °C con Sulfolobus metallicus es un proceso que resulta en una eficiente disolución de este mineral. Sin embargo, hay variados aspectos relacionados con los fundamentos del mecanismo de disolución y el tipo de actividad oxidativa de Sulfolobus metallicus en este proceso que no están totalmente clarificados. Por otra parte, no existen reportes sobre la expresión de proteínas de este microorganismo durante la biolixiviación de calcopirita. Esta información es útil para caracterizar el tipo de actividad oxidativa de Sulfolobus metallicus y puede permitir entender mejor el mecanismo de catálisis que utiliza.
El objetivo principal del presente Trabajo de Título es identificar la expresión proteica de S. metallicus con el fin de entender mejor cual es la actividad oxidativa de este microorganismo durante la biolixiviación de calcopirita. Para ello, se caracterizó la expresión de proteínas por electroforesis bidimensional de células de S. metallicus crecidas en calcopirita (CuFeS2) y en azufre elemental (S0). Mediante este método las proteínas son individualizadas por peso molecular (PM) y punto isoeléctrico (pI).
Se cultivó las células en S0 y CuFeS2 en matraces agitados a 70 °C, hasta alcanzar el material biológico suficiente que proveyera la cantidad necesaria de proteínas para su visualización. Se recolectaron las células planctónicas y luego de extraer las proteínas se hizo geles bidimensionales en azufre y calcopirita, con 50 μg de proteínas en cada gel y teñidos con plata, obteniendo el patrón de la expresión proteica en ambas condiciones de crecimiento.
De la comparación de los geles preparados en base a células de Sulfolobus metallicus crecidas en calcopirita y azufre se pudo observar que las proteínas más altamente expresadas formaban parte de los microorganismos crecidos en ambos substratos. La comparación de los pIs y PMs de estas proteínas más expresadas en ambos geles con aquellas proteínas de las bases de datos de otros microorganismos de la especie Sulfolobus, indicaron que estas corresponden en general a proteínas de su cadena respiratoria.
Los resultados anteriores sugieren que en la biolixiviación de calcopirita con Sulfolobus metallicus hay una importante actividad oxidativa de este microorganismo sobre azufre elemental. Esto permite confirmar que durante la descomposición de la calcopirita se forma azufre como un compuesto intermedio. Estudios complementarios efectuados en este laboratorio indican que este compuesto es probablemente disuelto por Sulfolobus metallicus mediante un mecanismo cooperativo.
iii
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, a mi madre que ha estado siempre a mi lado, a su infinito amor,
esfuerzo y gran fortaleza, que me ha permitido llegar a este momento. Una admirable y
valiosa mujer de firmes convicciones y gran corazón, a quién he tenido el privilegio de
llamar “mamá”. A mis abuelos, con quiénes crecí como una hija más, a su esfuerzo aun
cuando los años pesaban, pero el amor era más fuerte. Especialmente, a mi abuelo,
quién fue para mí un padre. Aunque hoy no puedo agradecerles directamente todo lo
que hicieron por mí, ni decirles lo mucho que los amé, lo plasmo en este papel. Espero
que desde el infinito donde se encuentran, sepan que su nieta ha alcanzado las metas
que se ha impuesto hasta ahora.
A mi pequeña familia materna, la única que ha estado presente, mis tíos y primos.
En especial, a mi tía Ivonne, quién me ha brindado todo su amor y apoyo.
A mi amado Rodrigo, quién me ha acompañado estos últimos cinco años de mi
vida, dándome todo su amor y apoyándome pacientemente en los difíciles momentos
de estrés y cansancio.
A mis profesores de la comisión por su apoyo y comprensión, como también al
profesor Héctor Toledo por enseñarme el método de electroforesis bidimensional de
O’Farrell.
A aquellos que me ayudaron y apoyaron durante la realización de mi Memoria.
Principalmente, a Sra. Emma quién estuvo a mi lado en los momentos más difíciles,
como también a Sra. Nancy y a Verónica Gautier.
A todos mis amigos que no han dudado en alentarme este último tiempo, quiénes
son capaces sinceramente de alegrarse con mis logros. A mis amigos de los
Departamentos de Ingeniería Química y Biotecnología, y de Ingeniería Industrial, por su
apoyo y aliento, especialmente a Patricia Díaz, quién me ayudó más de una vez cuando
nadie podía.
Finalmente, a todos aquellos que me apoyaron y que por descuido olvidé
mencionar.
iv
INDICE DE CONTENIDOS CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................1
1.1. Introducción........................................................................................................................1 1.2.1. Microorganismos usados en lixiviación ........................................................................1 1.2.2. Mecanismos propuestos para la biolixiviación..............................................................2 1.2.3. Calcopirita .....................................................................................................................4 1.2.4. Metabolismo energético de microorganismos lixiviantes .............................................5 1.2.5. Sulfolobus metallicus .....................................................................................................6
1.2.5.1. Cadena respiratoria de S. metallicus.......................................................................7 1.2.5.2. Biolixiviación de calcopirita por S. metallicus .....................................................10
1.2.6. Electroforesis de proteínas y su uso en el estudio de microorganismos lixiviantes ....11
1.3. Descripción del Proyecto y Justificación ........................................................................12
1.4. Objetivos...........................................................................................................................13 1.4.1. Objetivo Principal........................................................................................................13 1.4.2. Objetivos Específicos ..................................................................................................13
1.5. Alcances ............................................................................................................................14
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA ................................................................................................15
2.1. Materiales ..........................................................................................................................15 2.1.1. Microorganismos.........................................................................................................15 2.1.2. Mineral ........................................................................................................................15 2.1.3. Reactivos .....................................................................................................................15 2.1.4. Equipamiento...............................................................................................................16 2.1.5. Medios de cultivo ........................................................................................................17
2.2. Metodologías .....................................................................................................................17 2.2.1. Monitoreo de los cultivos de S. metallicus ..................................................................17 2.2.2. Cultivo y recuperación del material Celular................................................................18 2.2.3. Obtención de Extractos Crudos ...................................................................................20 2.2.4. Electroforesis bidimensional .......................................................................................21 2.2.5. Tinción de geles...........................................................................................................23
CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIONES ....................................................................26
3.1. Recolección de células de Sulfolobus metallicus ............................................................26
3.2. Comparación de las eficiencias de distintos métodos de lisis de células ......................28
3.3. Implementación de metodología de electroforesis bidimensional en el laboratorio...28
3.4. Estimación de la cantidad óptima de proteínas para su detección según método bidimensional de O’Farrell (1975) para la expresión proteica de S. metallicus................30
3.5. Descripción de la expresión proteica de S. metallicus en azufre y calcopirita............32
3.6. Comparación de la expresión de proteínas de S. metallicus cultivados en azufre y calcopirita .................................................................................................................................41
3.7. Expresión proteica y mecanismo de oxidación de calcopirita ......................................44
CAPÍTULO 4. CONCLUSIONES ...............................................................................................45
v
CAPÍTULO 5. RECOMENDACIONES......................................................................................46
CAPÍTULO 6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................47
ANEXOS .......................................................................................................................................53
A. Teoría de la electroforesis bidimensional .........................................................................53
B. Cultivos ................................................................................................................................58
C. Obtención y determinación de la concentración de proteínas.......................................59
D. Especificaciones de reactivos usados en la metodología de electroforesis 2D ...............66
E. Detalles de la metodología de electroforesis 2 D de O’Farrell (1975) ............................70
F. Estimación de puntos isoeléctricos y pesos moleculares..................................................75
1
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
1.1. Introducción
El creciente valor del cobre estos últimos años, ha despertado un gran interés en
la recuperación del mismo. En esto, la biolixiviación de minerales sulfurados de cobre
ha jugado un papel importante, dado que ha permitido tratar los minerales de cobre de
baja ley en botaderos (dump leaching), como también “in situ”. Gracias a la
biolixiviación se ha podido recuperar el mineral de cobre desde minerales de descarte,
que antes no se había podido tratar, ya que las tecnologías existentes no eran
económicamente rentables. De esta forma, se han incorporado a las reservas, millones
de toneladas de minerales de descarte acumulados durante años en las minas de
cobre del mundo. Además, se ha aplicado en minerales ya procesados, tales como la
biolixiviación de los minerales de cobre secundarios en pilas (calcosina, covelina y
bornita) y de concentrados en reactores agitados (calcopirita y enargita).
La mayor tasa de solubilización de cobre ocurre a elevadas temperaturas (>65°C),
siendo así atractivo el uso de microorganismos hipertermófilos hierro y azufre oxidantes
en la biolixiviación (Stott y cols., 2002). De esta forma, se hace necesario estudiar su
actividad oxidativa, para así lograr conocer las condiciones óptimas del proceso.
1.2. Antecedentes Bibliográficos
1.2.1. Microorganismos usados en lixiviación
Los microorganismos que participan en lixiviación utilizan el mineral como
substrato energético, tomando electrones para sus propósitos de supervivencia,
realizando un trabajo útil donde liberan minerales y calor sin necesidad de energía
externa al proceso. Existen reportes que indican que se han usado microorganismos en
lixiviación desde los años 50, donde se observó que bacterias acidófilas como
Acidithiobacillus ferrooxidans, oxidaban minerales como hierro y azufre, surgiendo de
esta forma la primera patente al respecto de los autores Zimmerley y cols. (1958). Sin
embargo, aun cuando este microorganismo ha llegado a ser el más estudiado y usado,
es menos efectivo en la biolixiviación de minerales refractarios, como calcopirita y
molibdenita. Se han estudiado diversas bacterias acidófilas, tanto mesófilas, como
2
termófilas moderadas, incluyéndose en los últimos años estudios en archaeas, algunos
de los cuales son microorganismos acidófilos y termófilos extremos. Estos últimos
pueden aumentar apreciablemente la velocidad de extracción de metales.
1.2.2. Mecanismos propuestos para la biolixiviación
Inicialmente, la explicación de la biolixiviación de minerales, se basaba en los
postulados de mecanismo directo e indirecto. En el mecanismo directo, los
microorganismos se adhieren al mineral, generando un biofilm, de tal manera que, las
oxidaciones ocurren mediante interacciones bacteria/sustrato, disolviendo directamente
el sulfuro o el azufre elemental. La membrana bacterial interactúa directamente con el
sulfuro usando mecanismos enzimáticos.
Las reacciones asociadas a este mecanismo son las siguientes:
422 MSOOMS →+ (1)
4222 2232 SOHOHOS o →++ (2)
En el mecanismo indirecto los microorganismos adheridos como los que se
encuentran en solución, en presencia de oxígeno y de H+ pueden oxidar el Fe+2 a Fe+3,
según:
OHFeHOFe 23
22 222/12 +→++ +++
(3)
El Fe+3 es un muy buen oxidante de sulfuros, a través de la siguiente reacción:
024
3 SFeMSOFeMS ++→+ ++ (4)
La reacción (4) se puede expresar formalmente como:
044342 2)( SFeSOMSOSOFeMS ++→+ (5)
Entonces, estos microorganismos permiten regenerar Fe+3 a través de la
oxidación de Fe+2 de tal manera que Fe+3 esté disponible para la lixiviación de los
3
minerales sulfurados. Sin embargo, como esta reacción consume H+, se puede producir
precipitación de Fe+3 de la forma Fe(OH)3.
++ +→+ HppOHFeOHFe 3)(3 323
(6)
Estos precipitados llevan el nombre de jarositas las que se adhieren fuertemente
a la superficie del mineral y pueden formar una barrera física que impide el acceso a
los microorganismos catalizadores de la disolución, disminuyendo la difusión del ión
férrico y de los productos de las reacciones que ocurren en la superficie del mineral.
Para evitar la formación de jarositas, se debe mantener un pH bajo.
A fines del siglo pasado se propuso nuevas teorías acerca del mecanismo de
biolixiviación. W. Sand propuso que el mecanismo directo de oxidación de sulfuros no
existiría, dado que no habrían mecanismos en ausencia de Fe+3. De esta forma,
propuso los mecanismos del tiosulfato y del polisulfuro.
El mecanismo del tiosulfato se llevaría a cabo en bisulfuros insolubles en ácido
como FeS2, MoS2 y WS2 los que serían disueltos por varios pasos de oxidación con el
ión Fe+3. A partir de la acción de Fe+3 sobre el sulfuro se produciría Fe+2 y tiosulfato
(S2O3-2). Fe+2 es oxidado por los microorganismos para ser regenerado a Fe+3, y el
tiosulfato, intermediario principal, es oxidado principalmente a sulfato (SO4-2). Por otro
lado, el mecanismo del polisulfuro, ocurre en los otros sulfuros metálicos solubles en
ácido como CuFeS2 y CuS, los que serían disueltos por Fe+3 y H+. A partir del sulfuro,
se produciría polisulfuro, azufre elemental y sulfato como producto final, siendo el
polisulfuro (H2Sn) el compuesto clave en este mecanismo (Sand y cols., 2001).
Por otro lado, H. Tributsch propuso que para que se produzca la oxidación del
sulfuro es necesario que las bacterias se contacten con el sulfuro a través de los EPS
(extracellular polymeric substances). Según Tributsch existirían tres mecanismos:
lixiviación indirecta, por contacto, y cooperativa (Figura 1).
El mecanismo indirecto no sufrió modificación, mientras que el mecanismo de
contacto fue el nuevo nombre que se le dio al mecanismo directo. En este mecanismo,
las bacterias se adhieren al sulfuro con el propósito de condicionar la superficie del
4
mineral y facilitar la dilución electroquímica directa del ataque del mineral por Fe+3,
contenido dentro del exopolímero que sería generado por las células para atacar el
mineral. Por otro lado, la lixiviación cooperativa es un nuevo concepto que se introduce,
en el que los microorganismos adheridos al mineral y los libres en solución cooperan
entre sí. Las bacterias adheridas liberan especies metálicas oxidables, las cuales son el
recurso energético de los microorganismos en solución (Tributsch, 2001).
Figura 1: Mecanismos de biolixiviación de contacto, indirecto y cooperativo (Tributsch,
2001).
1.2.3. Calcopirita
La calcopirita es el mineral sulfurado de cobre más abundante del mundo, y
también el más refractario a la lixiviación, tanto química como biológica, traduciéndose
en bajas tasas de disolución. La principal causa de su carácter refractario es la
formación de una capa sólida pasiva sobre la superficie del mineral durante su
disolución, la cual limita el contacto entre los reactivos y la difusión de productos y
reactivos. Esto disminuye el ataque al sulfuro, y eventualmente, detiene completamente
el ataque. Aunque, se sabe que la capa pasiva es responsable del comportamiento
refractario de la calcopirita, la naturaleza exacta de esta capa está en discusión
(Rodríguez y cols., 2003). No obstante, aparentemente, las archaeas termófilas crean
condiciones en la solución que mantienen relativamente bajos los potenciales de la
5
solución, evitando el efecto de “pasivación”. Según Petersen y cols. (2006) a altas
temperaturas se promovería un bajo potencial de operación, en términos del radio
férrico/ferroso, lo que favorecería la lixiviación de calcopirita, al menos inicialmente.
Luego, la calcopirita puede ser disuelta en tasas convenientes en la presencia de
microorganismos termófilos, tales como, Sulfolobus metallicus, Acidianus brierley o
Metallosphera sedula.
La lixiviación de calcopirita está dada por la reacción:
02232 2SFeCuFeCuFeS ++→+ +++ (7)
1.2.4. Metabolismo energético de microorganismos lixiviantes
El hierro y el azufre de los minerales sirven como donantes de electrones durante
la cadena respiratoria de los microorganismos capaces de oxidarlos. Posteriormente,
los productos de la oxidación, Fe+3 y/o ácido sulfúrico, atacan químicamente a los
sulfuros metálicos permitiendo su solubilización. Sin embargo, las cadenas de
transporte de electrones y enzimas relacionadas variarían de un microorganismo a otro.
Los mecanismos más estudiados de la oxidación de hierro y compuestos
reducidos de azufre son los de la bacteria Acidithiobacillus ferrooxidans donde se han
desarrollado varios modelos que tratarían de explicarlos (Rawlings, 2005; Quatrini,
2006). En este caso, después de la oxidación inicial del substrato, los electrones desde
el ión ferroso y compuestos reducidos de azufre entran a las cadenas respiratorias y
son transportados al oxígeno a través de varias proteínas redox. Además, se provee
electrones para la reducción de NAD(P) que es requerido para algunos procesos
metabólicos como la fijación de CO2 y el nitrógeno.
En un estudio anterior (Ramírez y cols., 2004) se estudió las proteínas inducidas
de Acidithiobacillus ferrooxidans bajo distintos sustratos, sugiriendo la separación de
las vías metabólicas utilizadas en la oxidación del hierro y azufre dado que las
proteínas altamente expresadas en una condición eran poco expresadas en la otra. Por
otro lado, en sulfuros metálicos que contenían hierro, como pirita y calcopirita, las
proteínas altamente sintetizadas correspondían a proteínas altamente expresadas en
ambas condiciones, azufre e ión ferroso, indicando que las dos vías metabólicas eran
6
inducidas simultáneamente dependiendo del tipo y concentración de los sustratos
oxidables disponibles.
Los trabajos anteriores indican que la identificación de proteínas expresadas en
microorganismos da un indicio sobre el tipo de actividad metabólica que cada
microorganismo tiene en determinadas condiciones.
1.2.5. Sulfolobus metallicus
Este microorganismo es un archaea termófilo extremo, autotrófico obligado,
anaerobio facultativo y acidófilo que crece en ión ferroso, oxida compuestos de sulfuro
inorgánicos o minerales sulfurados (Figura 2). Crece en un óptimo de 68 ºC y
preferiblemente dentro de un rango de pH 1,3-1,7. Su tiempo de duplicación es de 8
horas (Han, 1998). Este microorganismo, además tiene una alta tolerancia a la
presencia de iones metálicos, como por ejemplo, altas concentraciones de sulfato de
cobre (entre 100 y 200 mM (Remonsellez y cols., 2006)).
La influencia de S. metallicus en biolixiviación de calcopirita está parcialmente
relacionada con la catálisis de la oxidación de ión ferroso. De esta forma, la
biolixiviación de calcopirita promueve el aumento de las tasas de disolución de cobre.
La biolixiviación de calcopirita con S. metallicus debe ser realizada aproximadamente a
70 ºC en reactores agitados, ya que el microorganismo necesita de esta temperatura
para crecer en forma óptima. Sin embargo, estos microorganismos son sensibles a las
condiciones hidrodinámicas, por lo que una intensa agitación, aireación y atrición,
asociada a los sistemas de tanques de biolixiviación, pueden influir adversamente en la
actividad de las células. Luego, para poder utilizar su potencial en las operaciones de
biolixiviación a gran escala es necesario estudiar el tamaño de las partículas de
mineral, la densidad de la pulpa y el diseño mecánico del bioreactor (Nemati y cols.,
2000).
7
Figura 2: SEM (scanning electron microscopy) de S. metallicus en grietas de la
superficie de calcopirita natural después de 10 días. La barra en la figura mide 10 µm
(Gautier, 2007a).
1.2.5.1. Cadena respiratoria de S. metallicus
Dentro de las cadenas respiratorias de los genomas disponibles dentro de la
especie Sulfolobus (S. acidocaldarius, S. solfataricus, S. tokodaii), se encuentra el
complejo proteico SoxABCD (oxidasa con grupo hemo aa3-CuB) y un supercomplejo
SoxM (con grupo hemo bb3-CuB) que sirven como oxidasas aeróbicas terminales
(Bathe y Norris, 2007). SoxABCD es una quinol oxidasa, que consiste en 4
subunidades, de 64, 39, 27 y 14 kDa, codificadas por el operón SoxABCD, en S.
acidocaldarius (Gleibner y cols., 1996). La subunidad SoxM en conjunto con SoxH, que
tiene unido un centro CuA, recibirían los electrones desde SoxE (Sulfocianina).
Las proteínas de Riesgo con centro FeS en S. acidocaldarius, SoxF y SoxL, al
igual que el complejo CbsAB/SoxL2N serían quinol oxidasas intermediarias semejantes
al citocromo bc1.
S. metallicus tiene actividades NADH y succinato deshidrogenasa, y citocromos
b562, a586 y a600 en el sistema de reducción de oxígeno (Gomes y cols., 1998a). La
proteína NADH quinona oxidoreductora tipo II, de 49 kDa, es la primera proteína
respiratoria aislada de Sulfolobus metallicus, y es capaz de transferir protones desde
NADH a varias quinonas, incluyendo ubiquinona 1, ubiquinona 2 y quinonas caldariella
(Bandeiras y cols., 2003).
8
Las ferrodoxinas (Fd) en S. metallicus, FdA de 5,689 kDa, y FdB de 5,714 kDa,
las cuales son hierro-azufre proteínas transfieren electrones en una amplia variedad de
reacciones metabólicas (Gomes y cols., 1998b).
Los genes relacionados con la oxidación de ión ferroso han sido denominados
genes fox (foxD, C, B, G, H, I, J, E, F, A). Todas las proteínas Fox tendrían una región
transmembrana potencial, menos FoxH (Tabla 1). En los extremos 5’ y 3’ del cluster,
aparecen ORFs parciales, orf1 no relacionado al cluster de S. tokodaii y orf2 similar a
ATPasas relacionadas con la división celular y plegamiento de proteínas. Los genes
foxA, foxB y foxC son altamente inducidos durante la oxidación de ión ferroso,
probablemente, éstos codificarían proteínas de membrana involucradas en los
procesos de transporte de electrones, y para proteínas similares a SoxB/M, SoxH y
CbsA, respectivamente. Estas últimas podrían ser subunidades de otro tipo de
complejo aeróbico terminal en archaeas termofílicas similares al tipo Sulfolobus, junto
con las proteínas de los complejos SoxABCD, SoxM y oxidasas del tipo Dox oxidasas.
Los tres genes anteriores junto con foxE son los más altamente expresados en la
oxidación de ión ferroso y pirita (Figura 3). FoxA es detectada como una dominante
proteína de membrana en el crecimiento en pirita, pero no en azufre. Los otros genes
del cluster, podrían estar involucrados en tareas como señales de transducción o
regulación de genes, pudiendo existir alguna proporcionalidad entre los niveles de
transcripción y las cantidades finales de proteínas sintetizadas (Bathe y Norris, 2007).
Con respecto a la existencia de una proteína oxigenasa reductasa de azufre, se
ha observado una alta transcripción del gen sor (sulfur oxygenase-reductase) durante
el crecimiento en azufre y baja en cultivos de hierro, indicando una dependencia al
substrato en la regulación transcripcional (Bathe y Norris, 2007). Esta proteína tendría
teóricamente un peso molecular de 36,25 kDa y un punto isoeléctrico de 6,09.
9
Tabla 1: Proteínas deducidas desde los ORFs de S. metallicus (Bathe y Norris, 2007).
Proteína Peso Molecular (kDa) Punto Isoeléctrico Número de dominios de
transmembrana
FoxD 36 8,9 11
FoxC 59 6,3 1
FoxB 22 5,4 1
FoxG 69 9,2 11
FoxH 34 8,6 0
FoxI 17 5,0 2
FoxJ 30 7,7 7
FoxE 22 8,8 6
FoxF 67 9,3 16
FoxA 67 8,6 12
Figura 3: Expresión relativa de los niveles de los ORFs de los fragmentos secuenciados
del genoma de S. metallicus y el gen de la proteína azufre-oxidasa-reductasa (sor)
medida por qRT-PCR y normalizada con la expresión del gen de 16S rRNA en los
cultivos individuales (Bathe y Norris, 2007).
10
1.2.5.2. Biolixiviación de calcopirita por S. metallicus
Durante la biolixiviación de calcopirita cerca del 68 % de S. metallicus crece
adherido a las partículas del mineral, mientras el 32 % restante crece en solución. El
porcentaje asociado a células adheridas coincide con la fracción de microorganismos
unida a calcopirita después de la adición del inóculo (Escobar y cols., 2003)
Durante la lixiviación de calcopirita en presencia de S. metallicus ocurre un
deterioro progresivo de la superficie del sulfuro, pero más intenso y heterogéneo que
en el caso abiótico, lo que se evidencia con la aparición de zonas fuertemente
erosionadas y la formación de grandes grietas, fracturas y picados. Mientras aumentan
las zonas de grietas y rupturas en la superficie del mineral durante la lixiviación, se
observa una mayor concentración de microorganismos en estas zonas con respecto a
las superficies planas, pudiéndose identificar cúmulos o agregados microbianos (Figura
4). Sin embargo, no se observa formación de picados (pitting) en las zonas de contacto
de las células al mineral. Esta mayor interacción por estas zonas, se puede deber a un
efecto de quimisorción preferencial, dado que la estructura cristalina de la calcopirita se
encontraría destruida en estas zonas, permitiendo la liberación de diversos iones y
compuestos intermedios, facilitándose su acceso al sustrato S0, Fe+2 y compuestos
reducidos de azufre. Además, no existe formación de biofilm que medie en la
adherencia al sulfuro, como sí ocurre en la lixiviación de pirita por Acidithiobacillus
ferrooxidans, por lo que la fluodinámica puede ser un factor determinante, dado que en
estas zonas el fluido presenta menos velocidad y turbulencia. Luego, el patrón de
adherencia de estas células es diferente al de Acidithiobacillus ferrooxidans (Davis,
2005).
En la lixiviación de calcopirita por este microorganismo a 70 °C hay una eficiente
oxidación de compuestos reducidos de azufre, es decir, azufre y polisulfuros los cuales
son formados durante la disolución del sulfuro. La oxidación de compuestos de
reducidos de azufre involucraría la participación de un mecanismo de catálisis química
desencadenada por la presencia de oxígeno disuelto en solución. Este mecanismo
permitiría tener una oxidación eficiente de los compuestos reducidos de azufre en la
biolixiviación de calcopirita con S. metallicus inclusive en situaciones cuando el
11
microorganismo no es capaz de alcanzar la superficie del mineral (Jordan y cols.,
2006).
Según un reciente estudio (Gautier y cols., 2007b), la biolixiviación de calcopirita
en la presencia de S. metallicus sería el resultado de la acción cooperativa de células
adheridas las cuales catalizarían la disolución de cobre a través de la formación de
tiosulfato, sulfito y bisulfito, y células planctónicas que oxidarían estos compuestos
intermedios a bisulfato y sulfato.
Figura 4: SEM de S. metallicus a 70 °C en grietas de la superficie de calcopirita
sintética particulada después de 18 días. La barra en la figura mide 10 µm (Davis,
2005).
1.2.6. Electroforesis de proteínas y su uso en el estudio de microorganismos lixiviantes
El término electroforesis es usado para describir la migración de una partícula
cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. La electroforesis de proteínas es un
método de separación de acuerdo a pequeñas diferencias en las propiedades de las
proteínas, tales como peso molecular, movilidad electroforética, punto isoeléctrico o la
combinación de éstas. En el caso de la electroforesis bidimensional, las proteínas son
separadas por dos características, punto isoeléctrico y peso molecular. Para más
detalles acerca de la teoría de este método ver Anexo A.
La electroforesis bidimensional de proteínas permite comparar patrones de
expresión proteica bajo distintas condiciones, por lo que también ha sido utilizada para
comparar la expresión proteica de microorganismos lixiviantes como Acidithiobacillus
12
ferrooxidans para así tratar de entender el mecanismo biológico detrás de la lixiviación
(Amaro y cols., 1991; Felício y cols., 2003; Ramírez y cols., 2004).
En Ramírez y cols. (2004) se estudió la expresión proteica de Acidithiobacillus
ferrooxidans crecidos en ión ferroso, compuestos sulfurados y sulfuros metálicos,
comparando las bandas obtenidas en los distintos substratos. Las bandas de interés,
es decir, aquellas que estaban significativamente baja o altamente expresadas, fueron
posteriormente secuenciadas y confrontadas con bases de datos para ser relacionadas
con proteínas secuenciadas de función conocida. Se puede observar las distintas
intensidades de las bandas en la expresión proteica diferencial de Acidithiobacillus
ferrooxidans crecidos en ión ferroso en la Figura 5A y azufre elemental en la Figura 5B.
Este estudio aunque no permitió asignar roles definitivos en el metabolismo energético
del microorganismo, al menos fue un primer acercamiento al entendimiento de las
respuestas adaptativas del microorganismo frente a los distintos substratos.
Figura 5: Electroforesis bidimensional de Acidithiobacillus ferrooxidans crecidos en ión
ferroso (A) y azufre elemental (B). El gradiente de pH está entre 3 y 10 de derecha a
izquierda (Ramírez y cols., 2004).
1.3. Descripción del Proyecto y Justificación
S. metallicus permite una alta tasa de disolución de cobre desde concentrados de
calcopirita en reactores agitados. Sin embargo, no se conoce el tipo de actividad
oxidativa que predomina en este microorganismo durante la biolixiviación de calcopirita,
haciéndose necesario estudiar su metabolismo energético cuando oxida calcopirita. El
estudio de sus genes se ve limitado, ya que su genoma no es conocido, salvo
13
principalmente algunos genes de carboxilasas (Burton y cols., 1999) y algunos genes
expresados en azufre elemental, ión ferroso y pirita, publicados recientemente (Bathe y
Norris, 2007). Además, no existen reportes anteriores de la expresión proteica
bidimensional de S. metallicus crecido en calcopirita (CuFeS2) ni la comparación de los
patrones de expresión proteica con sus componentes (S0 y Fe+2), y esta información
podría contribuir a un mejor entendimiento de su acción oxidativa en calcopirita. Por
otro lado, en un estudio anterior (Gautier y cols., 2007b) se sugirió que el mecanismo
de biolixiviación utilizado por este microorganismo sería cooperativo al oxidar
calcopirita. Por esto, se propone comparar la expresión proteica bidimensional de
células planctónicas de S. metallicus crecidas en calcopirita y azufre, porque de ser un
mecanismo cooperativo se esperaría que el patrón de expresión proteica de células
libres crecidas en azufre fuese similar al de las células libres crecidas en calcopirita.
Dado que las proteínas del microorganismo no son conocidas, se puede comparar la
aparición, desaparición e intensidades de las bandas de proteínas en ambas
condiciones y así analizar la similitud de los patrones, además de sugerir la identidad
de las proteínas comparando los puntos isoeléctricos y pesos moleculares con bases
de datos de otras archaeas. Este enfoque abre un nuevo campo de investigación en un
área de gran interés científico y tecnológico.
1.4. Objetivos
1.4.1. Objetivo Principal
Identificar y comparar los patrones de expresión de proteínas en S. metallicus
cultivados en azufre y calcopirita.
1.4.2. Objetivos Específicos
• Desarrollar una metodología para la generación de células y para la extracción
de proteínas de S. metallicus.
• Desarrollar la metodología de electroforesis bidimensional en el laboratorio.
• Caracterizar la expresión de proteínas en S. metallicus durante la oxidación de
azufre elemental.
14
• Caracterizar la expresión de proteínas en S. metallicus durante la oxidación de
calcopirita.
• Comparar la expresión proteica entre los distintos sustratos.
• Discutir la implicancia de estos resultados sobre el entendimiento del mecanismo
de la acción catalítica de S. metallicus en la biolixiviación de calcopirita.
1.5. Alcances
Se pretende iniciar el entendimiento del metabolismo energético de S. metallicus
en su acción catalítica en la lixiviación de calcopirita para ser continuado en estudios
posteriores.
15
CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA
2.1. Materiales
2.1.1. Microorganismos
Se utilizó una cepa de S. metallicus mantenida por años en el laboratorio en pirita,
calcopirita y azufre.
2.1.2. Mineral
Se usó azufre elemental en perlas de diferentes tamaños preparado previamente
según Laishley y cols. (1986), y calcopirita proveniente de Andina (-100+200#),
Candelaria (-100+200#) y una muestra proveniente de Australia (-500#).
2.1.3. Reactivos
Los reactivos usados en los medios de cultivo son sulfato de amonio (Merck),
sulfato de magnesio heptahidrato (Merck), fosfato di-ácido de potasio (Merck) y ácido
sulfúrico (Merck). Estos reactivos son de pureza para análisis (P. A.).
El agua utilizada fue Milli-Q, destilada o desionizada (0,054 µS/cm).
Los reactivos principales usados en la obtención de proteínas son RNAsa A
(Sigma), perlas de vidrio (Sigma), cloruro de magnesio (Merck), Triton X-100 (Sigma) y
Tris base (Winkler).
Los reactivos principales utilizados en la electroforesis son acrilamida (Bio-Rad),
bisacrilamida (Bio-Rad), TEMED (Bio-Rad), persulfato de amonio (Bio-Rad), anfolitos
pH 3-10 (Bio-Rad), urea (Life Technologies), 2-mercaptoetanol (Bio-Rad), glicina
(Winkler), glicerol (Winkler), SDS (Bio-Rad), Tris (Winkler), marcador de pI (Amershan
Biosciences) y de peso molecular pre-teñido (Fermentas). Los reactivos son de pureza
para electroforesis o para biología molecular. Además, se usó ácido fosfórico 85 %
(Merck) e hidróxido de sodio (Merck), ambos reactivos son de pureza P. A.
Los reactivos principales utilizados en la tinción de los geles son: nitrato de plata
(Merck), ácido acético (Merck), carbonato de sodio (Merck), ácido cítrico monohidrato
16
(Winkler), formaldehído 37 % estabilizado con metanol 10 % (Merck), metanol (TCL),
DTT (Bio-Rad) y Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Los reactivos son de
pureza P. A., salvo los dos últimos que son de pureza para electroforesis.
Los reactivos usados para ajustar pH son ácido clorhídrico fumante 37 % (Merck)
y ácido sulfúrico 95-97 % (Merck). Ambos reactivos son de pureza P. A.
2.1.4. Equipamiento
En la tabla 2, se presentan los equipos utilizados en las experiencias de
laboratorio.
Tabla 2: Equipamiento utilizado en el laboratorio
Equipo Marca Modelo Agitador ambiental Lab-Line Agitador orbital FinePCR SH30 Balanza analítica Precisa XB220A Balanza semianalítica Precisa 1620 C Cámara de electroforesis Bio JSP Para 1 ° dimensión Cámara de electroforesis Bio JSP Para 2 ° dimensión Cámara de recuento celular Petroff Hausser PA 19044 Centrífuga para 1,5 ml Heraeus Sepatech Biofuge A Centrífuga para mayores volúmenes Dupont Sorvall RC-5B Desionizador de agua Millipore Simplicity Electrodo de pH Oakton Electrodo de EH Oakton Electrodos y cables de cámaras Bio JSP Espectrofotómetro UV visible Agilent 8453 Fuente de poder (usada en 1 D) Buchler 3-1500 Fuente de poder (usada en 2 D) Life Technologies PS3002 Medidor de EH Hanna pH211 Medidor de pH Corning 340 y 320 Separadores (grosor 0,75 mm) Bio JSP Sonicador Misonix Tubos de vidrio (14 cm y diámetro 2,5 mm) Heyn Ultrasonido Cole-Palmer 8851 Vidrios (16,5 x18,5 cm), con y sin biselado Bio JSP Vórtex Thermolyne 16700 Mixer Equipo filtración MFS
17
2.1.5. Medios de cultivo
Para los cultivos de S. metallicus en azufre y calcopirita, se usó medio Norris pH
2,3 y pH 1,5 (anexo B.1.1.), respectivamente.
2.2. Metodologías
2.2.1. Monitoreo de los cultivos de S. metallicus
Recuento directo de células
Para realizar el recuento celular, se requiere un microscopio de contraste de fase
y una cámara Petroff Hausser, en la cual se coloca una muestra de 8 µl de cultivo. La
cámara cuenta con 25 cuadrantes que a su vez se dividen en 16 cuadrados. Se
procede a contar las células, si hay pocas células, se cuenta en los cuadrados grandes,
y si hay muchas, en los cuadrados pequeños. Se deben hacer por lo menos 5
mediciones en el mismo tipo de cuadrado, las que se deben promediar, y luego
multiplicar por 1,25 x 106 o 2 x 107, respectivamente. De esta forma, se obtiene las
células/ml que se encuentran aproximadamente en el cultivo.
Control de pH en cultivos
Se ajustó el pH de los cultivos en calcopirita a 1,6 para evitar la precipitación de
Fe+3 como hidróxido férrico y el consiguiente arrastre de las células. Para esto, se
ajustó el pH de los cultivos de acuerdo a la ecuación [1], usando ácido sulfúrico
concentrado. Se realizó 5 mediciones de pH a la semana, y se ajustó el pH, cuando el
pH estaba 0,05 unidades de pH sobre 1,6.
( )21 101042
42
42
pHpH
SOH
SOHcultivoSOH d
PMVV −− −×⎟
⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ ×= [1]
42SOHV = Volumen de ácido sulfúrico concentrado a agregar (ml).
cultivoV = Volumen del cultivo que se quiere ajustar (ml)
42SOHPM = Peso molecular de ácido sulfúrico (98,08)
42SOHd = Densidad de ácido sulfúrico a 25 °C (1,84 g/ml)
pH1 = pH deseado
18
pH2 = pH a ser ajustado
Medición de Eh
Se midió el potencial redox (Eh) de los cultivos en calcopirita para poder medir el
aumento de la oxidación bacteriana dado que el Eh está relacionado con la razón
23
+
+
FeFe de acuerdo a la ecuación [2] de Nerst. Para ello, se usó un electrodo
Ag/AgCl2 y se tomó 5 veces a la semana una muestra de 2 ml de cada cultivo de 100
ml.
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛×+=
+
+
2
3
log0591,077,0FeFe
FEh [2]
Criterios para la estimación de la masa celular una vez recolectadas las células
Se usó dos criterios: conteo directo celular y medición de la masa del pellet de
células.
2.2.2. Cultivo y recuperación del material Celular
Cultivo de S. metallicus en Azufre
Se cultivó S. metallicus en azufre (anexo B.1.2.1.) a 70 °C con una agitación de
entre 100 y 150 RPM continua, en medio de cultivo Norris a pH 2,3. Los cultivos se
desarrollaron en matraces de 300 y 1.000 ml, con cultivos de 100 y 500 ml,
respectivamente. El primer cultivo requirió un inóculo de células, pero no los
subsiguientes, puesto que no es necesario inocular una vez colonizado el azufre, a
menos que se quiera incrementar la cantidad de células iniciales. El cultivo se detuvo a
los 5 días de renovado el medio de cultivo, dado que la masa celular en este tiempo es
alta y el pH no es muy bajo, si el pH fuese inferior al rango óptimo de crecimiento (1,3-
1,7) las células sufrirían de estrés y se expresarían proteínas relacionadas al estrés
que no estarían relacionadas con la oxidación del mineral. Luego, se tomó el cultivo sin
el mineral el cual fue centrifugado a 21.500 x g por 15 minutos para sedimentar las
células. Posteriormente, se lavó las células con medio de cultivo Norris estéril a pH 2,3,
centrifugando a 21.500 x g. Luego, se centrifugó a 128 x g por 15 minutos para
19
descartar el azufre residual. Por último, el cultivo se centrifugó a 21.500 x g y 18.000 x
g por 15 minutos para sedimentar las células. El pellet de células fue almacenado a -20
°C por un mes y medio como máximo.
Cultivo de S. metallicus en Calcopirita
Para adaptar S. metallicus a calcopirita, primero se cultivó los microorganismos a
70 °C en un concentrado de minerales que contenía en mayor porcentaje calcopirita,
con una agitación entre 100 y 150 RPM continua, en cultivo Norris a pH 1,5 (anexo
B.1.2.2.). Una semana después, cuando fue evidente la acción microbiana por el
cambio de color del cultivo por la presencia de Fe+3, se utilizó inóculos de éste para
hacer un cultivo en calcopirita en las mismas condiciones. Este nuevo cultivo se detuvo
a los 15 días aproximadamente, cuando el Eh aumentó hasta superar 600 mV, lo que
evidenciaba una alta oxidación de Fe+2 a Fe+3 por parte de las células, y así mismo una
alta cantidad de células. Luego, se recolectó las células las que fueron almacenadas a -
20 °C en condiciones estériles por un mes y medio como máximo.
Los cultivos siguientes se realizaron a partir de inóculos obtenidos de los cultivos
anteriores. Se controló el pH para que no se superara el pH 1,6 (+ 0,05) y así disminuir
el riesgo que precipitase el Fe+3. Se retiró las células cuando el Eh fuese superior a 600
mV o antes que precipitase el hidróxido férrico, ya que el control de pH se realizaba
sólo una vez al día y no se contaba con un sistema en línea.
Posteriormente, se filtró el cultivo incluyendo la calcopirita y después para retener
los microorganismos se filtró el sobrenadante con un microfiltro Millipore de 0,1 µm de
diámetro de poro. El microfiltro con células adheridas, fue remojado en medio de cultivo
Norris a pH 1,5 para separar los microorganismos. Se centrifugó a 21.500 x g y 18.000
x g por 15 minutos y se obtuvo un pellet de células el cual fue almacenado a -20 °C. La
calcopirita filtrada se dejó secar y se usó para realizar nuevos cultivos. Cuando había
presencia de Fe+3 en la calcopirita, se hizo varios lavados con HCl 5 N, y se enjuagó
con agua destilada antes de hacer los cultivos. De esta forma, se perdió las células
adheridas a la calcopirita que corresponde aproximadamente al 68 % de las células del
cultivo (Escobar y cols., 2003).
20
Para evitar la pérdida de las células adheridas al mineral en los cultivos siguientes
no se filtró la calcopirita. En vez de ello, sólo se tomó el sobrenadante del cultivo
eludiendo la calcopirita. Este paso se realizó de dos formas, agitando adicionalmente la
solución una vez sacada del agitador ambiental, y otra sin agitación previa. En el primer
caso, se necesitó centrifugar a 128 x g por 15 minutos para separar la calcopirita más
fina y el precipitado, y en el segundo caso se omitió dicha centrifugación por no ser
necesaria. Posteriormente, se centrifugó el cultivo sin calcopirita a 21.500 x g y 18.000
x g por 15 minutos, y el pellet de células fue almacenado a -20 °C en condiciones
estériles como máximo un mes y medio. De esta forma, se dejó la calcopirita con las
células adheridas a ella para el inicio de un nuevo cultivo, y en el caso que hubiese
habido presencia de Fe+3, se procedía a enjuagar la calcopirita sutilmente con un poco
de medio de cultivo Norris estéril a pH 1,5.
El cultivo en calcopirita se realizó a un pH menor que en azufre dado que durante
la oxidación de Fe+2 a Fe+3 por acción de los microorganismos se consume protones lo
que aumenta el pH del medio. Esto favorece la precipitación de hidróxido férrico en
forma de jarositas, y la de células junto a éstas. Del mismo modo, en el cultivo de
azufre el pH del medio de cultivo debe ser más alto porque la oxidación del azufre
implica la producción de protones, lo que baja el pH del cultivo hasta niveles donde se
inhibe el crecimiento celular.
2.2.3. Obtención de Extractos Crudos
Ruptura Celular
Se utilizó dos métodos de obtención de proteínas: sonicación y molienda con
perlas de vidrio. Para el método de sonicación, los pellets de células que fueron
almacenados a -20 °C, fueron resuspendidos en 250 µl de buffer de sonicación (anexo
C.2.) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. A continuación, la solución fue sonicada 8 veces
por 30 segundos cada vez, con pausas de 1 minuto puesta en hielo, esto último para
evitar la degradación de las proteínas a causa de las altas temperaturas.
En el caso del uso de molienda con perlas de vidrio, los pellets de células que
fueron almacenados a -20 °C, fueron resuspendidos en 400 µl de buffer de molienda
con perlas de vidrio (anexo C.3.) en un tubo Eppendorf. A continuación, la mezcla fue
21
agitada por vortex 5 veces por 1 minuto, con pausas en hielo de 1 minuto entre cada
agitación, y luego 5 veces por 2 minutos con los mismos recesos en hielo.
Clarificación del Extracto Crudo
Se centrifugó el producto sonicado o molido con perlas de vidrio, a 18.000 x g por
15 minutos, para separar las proteínas de las células rotas y las que no se rompieron.
Fueron guardados a – 20 °C en condiciones estériles tanto las proteínas como el pellet
para ser posteriormente reutilizado.
Cuantificación de Proteínas
Se usó un método de cuantificación de proteínas basado en el método de
Bradford para cuantificar las proteínas obtenidas. Para ello, se hizo una curva de
calibración utilizando albúmina sérica de bovino (BSA) como proteína estándar (anexo
C.4.).
Liofilización de los Extractos Crudos
Se liofilizó la muestra de proteínas para disminuir el volumen de la solución, para
así cargar un menor volumen de proteínas en el gel de la primera dimensión de la
electroforesis bidimensional.
2.2.4. Electroforesis bidimensional
El método que se utilizó para la electroforesis bidimensional fue el de O’Farrell
(1975). Sin embargo, previamente se probó el método descrito por Fuentes (2004), el
cual fue descartado.
Los principales pasos a seguir en la electroforesis bidimensional de O’Farrell
(1975) fueron los siguientes:
1. Se preparó los geles de primera dimensión (anexo D.2.7.1.) en tubos de vidrio de 14
cm x 2,5 mm de diámetro interno (Figura 6), y los geles de corrida de segunda
dimensión (anexo D.2.7.2.) el día anterior de la electroforesis de primera dimensión.
22
2. Se colocó ácido fosfórico 10 mM en el compartimiento superior e hidróxido de sodio
20 mM en el compartimiento inferior de la cámara de primera dimensión (Figura 7).
3. Se cargó la muestra de proteínas liofilizadas y resuspendidas en 45 µl de buffer de
lisis (anexo D.2.4.). Para proteger la muestra, se agregó sobre ésta 20 µl de urea 8 M,
y encima ácido fosfórico10 mM hasta llenar el tubo.
4. Se realizó la electroforesis de la primera dimensión a 400 Volts por 5,5 horas, con
amperaje inferior a 20 mA.
5. Se preparó el gel concentrador (anexo D.2.7.3.) y luego se colocó una cubierta de
agarosa 1% en buffer de equilibrio sobre éste (anexo D.2.5).
6. Una vez finalizada la electroforesis, se colocó el gel de primera dimensión sobre la
cubierta de agarosa. Para ello, antes el gel debió ser sacado del tubo cuidadosamente.
7. Se cubrió el gel recostado con buffer de equilibrio por 1 hora.
8. Se retiró el buffer de equilibrio y se tapó el gel con agarosa 1% en buffer de
equilibrio, preparado con un poco de azul de bromofenol, para poder visualizar el frente
de corrida.
9. Se realizó la electroforesis de la segunda dimensión a 50 V por 15 horas.
10. Se retiró los geles de corrida y se tiñeron.
Dada la complejidad del método, se adjuntan los detalles en anexo E.
Figura 6: Tubo con tapón portatubo para colocar el gel en cámara de electroforesis la
para primera dimensión.
23
Figura 7: Cámara de electroforesis (Bio JSP) para la primera dimensión con 2 tubos
colocados.
2.2.5. Tinción de geles
Los geles realizados con el protocolo de electroforesis bidimensional usado por
Fuentes (2004) fueron teñidos con plata. Por otro lado, se usó dos métodos de tinción
para los geles realizados de acuerdo a O’Farrell (1975): tinción con Coomassie Blue R-
250 y tinción con plata con previa tinción con Coomassie Blue R-250.
Tinción con Plata
Se incubó el gel en una solución: 40 % etanol y 10 % ácido acético en agua
desionizada. Al incubar los geles antes de teñir, las proteínas se fijan al gel o al menos
se retarda su difusión, también se remueve sustancias que interfieren con la tinción
como detergentes, agentes reductores o componentes de los buffers como la glicina
(Hames, 1990).
Luego, se retiró la solución y el gel fue lavado con agua desionizada varias veces
o remojado durante toda la noche. Es importante eliminar todo el ácido acético, ya que
éste interfiere en la tinción (Bollag y cols., 1996). Después, se quitó el agua y se remojó
en una solución de DTT 0,0005 % (p/v) por 30 minutos ya que el ditiotreitol (DTT)
aumenta la sensibilidad de la tinción. Posteriormente, se eliminó la solución con DTT y
se incubó el gel en una solución de AgNO3 0,1 % (p/v) por 30 minutos a oscuras.
24
A continuación, se reveló el gel. Para ello, se colocó en una solución de NaCO3
0,36 % (p/v) y 0,06 % (v/v) de formaldehído al 37 % con agua desionizada. Se agregó
un poco de la solución y se fue renovando a medida que la plata precipitaba, hasta que
cesó de hacerlo. El formaldehído en pH alcalino es utilizado ya que produce la
reducción de la plata de iónica a metálica formándose la banda. Por otro lado, el uso de
NaCO3 aumenta la tinción (Hames, 1990). Posteriormente, se esperó a que
aparecieran las bandas e inmediatamente se agregó ácido cítrico para detener la
reacción por acidificación (6 g para 250 ml de solución de revelado). Por último, se
eliminó la solución y se lavó con agua desionizada por lo menos 3 veces, y se dejó en
ésta.
Es importante el uso de agua desionizada en la tinción con plata, pues el cloruro
puede causar la precipitación de la plata.
Tinción con Coomassie Brilliant Blue R-250
Se colocó solución de tinción (0,2 % Coomassie Blue R-250, 25 % metanol y 7,5
% ácido acético) por 1 o 2 horas si la solución de tinción era fresca o toda la noche si la
solución era reutilizada. Luego, el gel se colocó en solución de destinción hasta que se
vio claramente las manchas correspondientes a las proteínas en estudio, y que no
hubiera presencia de manchones azules. Para remover el Coomassie Blue R-250
residual, se colocó una hoja de papel toalla anudada junto al gel en la solución de
destinción con agitación suave.
Tinción con plata con previa tinción con Coomassie Brilliant Blue R-250
Para asegurar que los geles que van a ser teñidos con plata, no presenten
manchones relacionados con la tinción de anfolito, se incubó el gel en ácido
tricloroacético 10 % (TCA) por 10 minutos, y luego con TCA 1 % por 2 horas. El TCA
cumple la misma función que la solución de destinción.
Posteriormente, se tiñó el gel con Coomassie Blue R-250, y se procedió a
desteñir. Para ello, se dejó el gel en solución de destinción hasta que aparecieran las
bandas sobre un background limpio, es decir, sin que hubiera tinción de anfolitos. A
25
continuación, se lavó los geles con agua desionizada varias veces o se dejó remojando
toda la noche, para eliminar los reactivos anteriores que pudieran interferir con la
tinción. Después, se incubó con DTT 0,0005 % (p/v) por 30 minutos, se eliminó e
incubo con nitrato de plata 0,1 % (p/v) a oscuras por 30 minutos. Finalmente, se realizó
el revelado y se dejó el gel en agua desionizada. Esta metodología debiera asegurar la
no existencia de tinción de anfolitos, ya que si no se tiñeron con Coomassie Blue no
debieran teñirse con plata. Por otro lado, la pre-tinción reduciría la variabilidad y
aparentemente incrementaría la sensibilidad de la tinción con plata, porque según
Hames (1990) las moléculas teñidas unidas a las bandas de proteínas, proveerían de
sitios adicionales para la deposición de la plata.
26
CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1. Recolección de células de Sulfolobus metallicus
Para determinar el momento adecuado para la recolección de las células se
efectuó estudios cinéticos de S. metallicus en azufre y calcopirita. En los cultivos en
azufre se monitoreó la densidad celular (células/ml) y el pH. Por otro lado, en los
cultivos en calcopirita se midió la densidad celular (células/ml), el pH y el Eh.
1
100
10.000
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (días)
Den
sida
d ce
lula
r x 1
0^-5
(c
élul
as/m
l) E
scal
a lo
garít
mic
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
pH
células/mlpH
Figura 8: Variación de la densidad celular (células/ml x 10-5) y pH de Sulfolobus
metallicus crecidos en azufre con respecto al tiempo.
27
1
10
100
1.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (días)
Den
sida
d ce
lula
r x 1
0^-5
(c
élul
as/m
l) E
scal
a Lo
garít
mic
a
A B
Figura 9: Variación de la densidad celular (células/ml x 10-5) de dos cultivos A y B en
calcopirita con respecto al tiempo, a los cuales se agregó a los 8 días un inóculo
adicional de 5,36 x 108 células.
De los resultados en los cultivos en azufre (Figura 8) se observó que
aproximadamente al quinto día se alcanzaba el mayor valor de células/ml dentro de la
etapa exponencial de crecimiento, aun cuando eso depende del número de células
iniciales. Además, dentro de los 5 días todavía el pH está en el rango de óptimo de
crecimiento del microorganismo, de tal forma que no existe riesgo de la expresión de
proteínas relacionadas con estrés.
De los resultados en los cultivos en calcopirita, las células se recolectaron
aproximadamente cuando el aumento en la densidad celular se estancaba y el Eh
había alcanzado los 550 mV, o si había 5 x 107 células/ml y el Eh comenzaba a
disminuir. Por otro lado, según la Figura 9 en la que se muestra el efecto de agregar un
inóculo adicional a dos cultivos con distintas densidades celulares, sería favorable
agregar inóculo adicional a los cultivos con menor densidad celular.
Con respecto a la recolección de células, el método más apropiado fue el uso de
centrifugación sin agitación adicional del matraz, porque en este caso la pérdida de
células fue imperceptible a diferencia de usar agitación adicional donde se recuperaba
sólo el 65 % de las células libres, dado que se tenía que centrifugar adicionalmente
para retirar el mineral más fino.
28
Con respecto a los criterios de la estimación de la masa celular recolectada, el
conteo directo de las células recolectadas resultó ser más confiable, dado que la
medición de la masa del pellet no representa fehacientemente la cantidad de células
contenidas ya que incluye un poco de mineral que no logró ser removido,
correspondiente al mineral más fino. Aunque este mineral se podría separar,
significaría la pérdida adicional de células en el proceso
3.2. Comparación de las eficiencias de distintos métodos de lisis de células
Se obtuvo las proteínas con los métodos de sonicación y molienda con perlas de
vidrio, y se calculó la eficiencia de la obtención de proteínas de acuerdo a la cantidad
de proteínas contenidas en el peso húmedo de las células (anexo C.5.1). Además, se
calculó la eficiencia de acuerdo a la ecuación [6] de la curva de calibración del método
utilizado en Fuentes (2004) para comparar las eficiencias.
Con el método de sonicación de Fuentes (2004) se obtuvo una eficiencia de
0,15 % (anexo C.5.2.), por la sonicación de O’ Farrell (1975) se logró 4,34 % (anexo
C.5.3.) y con el de molienda con perlas de vidrio, 12,2 % (anexo C.5.4.). Luego, la
mayor eficiencia se alcanzó en la molienda con perlas de vidrio.
3.3. Implementación de metodología de electroforesis bidimensional en el laboratorio
Primero, se utilizó el método de electroforesis bidimensional utilizado en Fuentes
(2004) y se determinó que no se formaba el gradiente de pH entre 3 y 10 a causa del
tamaño de los geles utilizados, dado que en Fuentes (2004) se usó geles más grandes
de 11 x 12 cm de lo que indica la metodología original de Bollag y cols. (1996) donde
se usan Minigeles Bio-Rad de 7 x 8 cm.
Con el fin de mejorar la metodología de Fuentes (2004), se corrió los geles de
primera dimensión con una corrida previa de 75 Volt-hora (150 Volts por 30 minutos), y
luego, se corrió el mismo gel a 575 Volt-hora (150 V por 30 minutos y luego a 200 V por
2,5 horas) tal como el protocolo original (Bollag y cols. (1996)). De esta forma, se formó
un gradiente de pH entre 7,5 y 10 (Figura 10), mejor que el caso sin pre-corrida en que
había sido menor el avance de las proteínas a lo largo del gel. También se corrió un gel
a 300 Volt-hora, distribuidos de la siguiente forma: 200 V por 15 minutos, 300 V por 30
29
minutos y 400 V por 30 minutos (condición de pre-corrida usada en O’Farrell y cols.
(1977)), formándose un gradiente de pH entre 4,5 y 10 (Figura 11) cuya linealidad fue
mejor que la del gradiente de la Figura 10.
y = -0,0434x + 11,44R2 = 0,7768
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 20 40 60 80 100
Distancia medida desde arriba (mm)
pI
Figura 10: Linealidad de la gradiente de pI obtenida con pre-corrida anexa a
metodología de Fuentes (2004).
y = -0,077x + 11,387R2 = 0,9612
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 20 40 60 80 100
Distancia medida desde arriba (mm)
pI
Figura 11: Linealidad de la gradiente de pI obtenida de acuerdo a condición de pre-
corrida usada en O’Farrell y cols. (1977).
30
Luego, en los experimentos de geles de mayor dimensión se necesitaría un
mayor Volt-hora o una distinta distribución de los Volt-hora, para que se localicen
adecuadamente los anfolitos a lo largo del gel y después las proteínas.
Para asegurar la formación del gradiente de pH, no se usó geles en lámina para
el desarrollo de la primera dimensión, sino geles cilíndricos de acuerdo al
procedimiento utilizado por O’Farrell (1975).
3.4. Estimación de la cantidad óptima de proteínas para su detección según método
bidimensional de O’Farrell (1975) para la expresión proteica de S. metallicus
Se hizo geles bidimensionales de acuerdo a O’Farrell (1975) con proteínas de S.
metallicus crecidos en azufre obtenidas por sonicación las que fueron teñidas con
Coomassie Blue R-250. Estos geles fueron realizados con distintas cantidades de
proteínas: 25, 55, 284 y 385 µg como se muestra en la Figura 12A, B, C y D,
respectivamente. Determinándose que la cantidad adecuada de proteínas era 250 µg
para este tipo de tinción dado que se pueden visualizar más proteínas.
El gel de la Figura 12D presenta distorsión, dado que la segunda electroforesis
se realizó en una cámara doble que no poseía un sistema de disipación de calor, luego
los geles presentaron una deformación, tanto el gel como la distribución de las
proteínas, las cuales aparecen distorsionadas (“smiling”) incluyendo el marcador de
peso molecular incluido en este gel. El denominado “smiling” se origina cuando la
movilidad de la muestra disminuye en los bordes del gel, debido a la desigual
disipación de calor, ya que el centro del gel está más caliente que los bordes (Bollag y
cols., 1996). Como es conocido, a voltaje constante, la corriente disminuye en el tiempo
y la resistencia aumenta, luego se origina calor, el cual en este caso es mucho mayor
por la resistencia de ambos geles, necesitando un medio de disipación de calor.
Los geles de la Figura 12 presentan una mancha en la parte inferior debido a la
tinción del anfolito. Esto puede evitarse, eliminando el anfolito de los geles antes de su
tinción, incubando con un protocolo donde se utilice ácido tricloroacético o con solución
de destinción (25 % metanol y 7,5 % ácido acético).
31
Figura 12: Geles de expresión proteica de S. metallicus en azufre de proteínas
obtenidas a través de sonicación y teñidas con Coomassie Blue R-250. Los geles A, B,
C y D poseen distintas cantidades de proteínas: 25, 55, 284 y 385 µg, respectivamente.
En el gel D, la distribución de las proteínas está distorsionada dado que la segunda
electroforesis de este gel fue realizada en una cámara doble sin disipador de calor.
El gel de la Figura 12C presenta una imperfección ocasionada probablemente por
una burbuja de aire presente en el gel (Andrews, 1986) o por una polimerización
demasiado rápida (Righetti y cols., 1990).
En los geles C y D de la Figura 12, se presenta una zona de muchas bandas en el
origen del gel, esto se debe a proteínas que no pudieron ingresar al gel, porque
estaban agregadas, lo que se podría evitar, centrifugando las muestras antes de la
32
electroforesis, sin embargo, esto significaría la pérdida de una importante parte de la
muestra de proteínas. Esto se evidenciaría más en estos geles dado que la cantidad de
proteínas es superior a la de los geles A y B (Righetti y cols., 1990).
Considerando que la tinción con plata es más sensible que la de Coomassie Blue
R-250 se usó menos cantidad de proteínas, 50 µg (Mahn, 2007) y para mejorar la
tinción se pretiñó con Coomassie Blue R-250, obteniéndose los geles de las Figuras
13, 14 y 15. La cantidad de proteínas visualizadas al teñir con plata con pre-tinción con
Coomassie Blue R-250 fue inferior a la obtenida en los geles teñidos con Coomassie
Blue R-250 con más de 50 µg de proteínas. Este resultado estaría relacionado a que se
usó proteínas totales, por lo que se necesitaría una muestra con una mayor cantidad de
proteínas, ya que la cantidad de proteínas en µg estaría distribuida en un alto número
de proteínas. Luego, si los geles se van a teñir con plata se necesita usar una cantidad
de proteínas tal que también permita detectar numerosas proteínas en Coomassie Blue
R-250. Por otro lado, en la etapa de espera del revelado, donde se debe esperar hasta
que aparezcan las bandas, si la cantidad de proteínas es muy baja, el tiempo de espera
será excesivo y el gel terminará ennegreciéndose.
Por lo anterior, el método de tinción más apropiado sería Coomassie Blue R-250 y
se necesitaría 250 µg de proteínas. Luego, utilizando el método de extracción de
proteínas a través de molienda con perlas de vidrio se necesitaría aproximadamente 4
x 1010 células de S. metallicus (anexo C.5.3.) lo que sería suficiente para visualizar
apropiadamente las señales en la electroforesis bidimensional.
3.5. Descripción de la expresión proteica de S. metallicus en azufre y calcopirita
Para el análisis de los geles bidimensionales primero se confrontó los geles de la
expresión proteica en azufre de la Figura 12, empezando desde los que tenían menos
a más concentración de proteínas, para ello se denominó Pi a las bandas,
reconociéndolas por coincidencia en ubicación y forma, y que aparecieran en el gel de
la Figura 13, dado que este gel tenía un marcador de peso molecular de referencia a
diferencia de los geles de la Figura 12. Es relevante señalar que el número de bandas
marcadas con Pi no corresponde al número total de proteínas visibles en el gel, sino a
aquellas bandas que coincidían entre los geles.
33
En el gel de la expresión proteica en azufre teñido con Coomassie Blue R-250,
con 25, 55 y 284 µg de proteínas, se marcó 10, 14 y 15 bandas, respectivamente
(Figura 12A, B y C). Como se esperaba, a medida que iba aumentando la
concentración de proteínas fue aumentando la cantidad de proteínas visibles. Por otro
lado, se marcó 20 bandas en el gel de la expresión proteica en azufre de la Figura 13
que había sido teñido con Coomassie Blue R-250 y posteriormente con plata.
Figura 13: Gel de la expresión proteica de S. metallicus en azufre con 50 µg proteínas
obtenidas por sonicación. Este gel fue pre-teñido con Coomassie Blue R-250 y luego
teñido con plata.
34
Una vez que se individualizó algunas bandas desde los geles de la expresión
proteica en azufre, se procedió a buscar estos patrones en los geles de la expresión
proteica en calcopirita a los que se añadió aquellas bandas que no aparecían en los
geles de la expresión en azufre. En el gel de la expresión proteica en calcopirita de
proteínas extraídas por sonicación (Figura 14) y molienda con perlas de vidrio (Figura
15), ambas con 50 µg, se marcó 13 y 19 proteínas, respectivamente. Estas incluyen
algunas de las proteínas individualizadas anteriormente y aquellas altamente
expresadas en los geles de la expresión proteica en calcopirita. El número de bandas
marcadas en los geles de la expresión proteica en calcopirita se vio limitado por la
presencia de áreas muy oscuras en los geles como resultado de una tinción excesiva
por un exceso en el tiempo de tinción con plata.
Se observó que en el gel de la expresión proteica en calcopirita de proteínas
extraídas por molienda (Figura 15), aparecían más proteínas que por sonicación
(Figura 14) lo que podría deberse a que se utilizó Triton X-100 en el buffer usado en la
molienda con perlas de vidrio, ya que este detergente no iónico ayuda a solubilizar las
proteínas de membrana. También, podría deberse a que no se haya cargado
efectivamente 50 µg de proteínas en ambos geles.
35
Figura 14: Gel de la expresión proteica de S. metallicus en calcopirita con 50 µg de
proteínas obtenidas por sonicación. Este gel fue pre-teñido con Coomassie Blue R-250
y luego teñido con plata.
36
Figura 15: Gel de la expresión proteica de S. metallicus en calcopirita con 50 µg
proteínas obtenidas por molienda con perlas de vidrio. Este gel fue pre-teñido con
Coomassie Blue R-250 y luego teñido con plata.
Para determinar los pesos moleculares (PM) y puntos isoeléctricos (pI) de las
bandas Pi, primero se midió la distancia en cm de las bandas a lo largo de los ejes X e
Y, usando el vértice inferior derecho de los geles como referencia. Luego, se reemplazó
estos valores en las ecuaciones basadas en las escalas de pI y PM que se definieron
en el anexo F, obteniendo como resultado el pI y el PM de las bandas marcadas
(Tablas 3, 4 y 5). Los valores de los pesos moleculares y puntos isoeléctricos variaron
de acuerdo a la escala, sin embargo se mantuvieron dentro de un rango. Se esperaba
que al no usar gradientes de pH inmovilizados, los gradientes de pH no fueran
reproducibles y variaran unos de otros.
37
Tabla 3: Punto isoeléctrico y peso molecular de las proteínas que se visualizan en los
geles de la expresión proteica de S. metallicus en azufre (Figuras 12 y 13).
Banda
Distancia de migración en eje X
(cm)
Distancia de migración en eje Y
(cm)
Punto isoeléctrico Peso Molecular (kDa)
P1 6 4,6 6,66 23,8 P2 5,5 4,6 6,41 23,8 P3 5,1 7,4 6,21 47,7 P4 5,8 8,2 6,56 58,1 P5 4,6 8,8 5,96 67,5 P6 4,4 7,7 5,86 51,3 P7 3,1 3,6 5,21 18,5 P8 2,7 2 5,01 12,5 P9 3,2 0,9 5,26 9,5
P10 2,1 7,2 4,72 45,3 P11 8,3 6,3 7,80 36,3 P12 7,2 6,3 7,25 36,3 P13 4,9 2,5 6,11 14,1 P14 2,3 2,5 4,81 14,1 P15 3,2 5,6 5,26 30,5 P16 3,1 6,4-6,2 5,21 37,2-35,4 P17 7,2 2,3 7,25 13,4 P18 2,3 7,7 4,81 51,3 P19 1,2 7,4 4,27 47,7 P20 - - - - P21 10 0,5 8,65 8,6 P22 3,4 9,3 5,36 76,4 P23 - - - - P24 - - - - P25 - - - - P26 - - - - P27 - - - - P28 - - - - P29 - - - - P30 - - - - P31 - - - - P32 - - - - P33 - - - -
Obs.:
• Se usó como referencia el vértice inferior derecho de los geles.
• Aparentemente, P16 corresponde a 2 proteínas, luego se hicieron 2
mediciones.
38
Tabla 4: Punto isoeléctrico y peso molecular de las proteínas que se visualizan en el
gel de la expresión proteica de S. metallicus en calcopirita de proteínas obtenidas por
sonicación, teñidas con plata y preteñidas con Coomassie Blue R-250 (Figura 14).
Banda
Distancia de migración en eje X
(cm)
Distancia de migración en eje
Y (cm)
Punto isoeléctrico Peso Molecular (kDa)
P1 6,2 5,1 6,75 26,8 P2 5,7 5,1 6,51 26,8 P3 - - - - P4 - - - - P5 - - - - P6 - - - - P7 3,1 3,7 5,21 19,4 P8 - - - - P9 3,2 1,6 5,26 11,9
P10 2,3 7,6 4,81 47,8 P11 - - - - P12 - - - - P13 - - - - P14 - - - - P15 - - - - P16 3,3-3,7 6,4-6,6 5,31-5,51 36,2-37,9 P17 - - - - P18 2,8 8 5,06 52,5 P19 1,4 7,7 4,37 48,9 P20 - - - - P21 11,2 1,2 9,24 10,9 P22 3,7 9,5 5,51 74,2 P23 3,7 2,2 5,51 13,7 P24 9 2,3 8,15 14 P25 - - - - P26 - - - - P27 - - - - P28 - - - - P29 - - - - P30 - - - - P31 - - - - P32 - - - - P33 - - - -
Obs.:
• Se usó como referencia el vértice inferior derecho de los geles.
• Aparentemente, P16 corresponde a 2 proteínas, luego se hicieron 2
mediciones.
39
Tabla 5: pI y peso molecular de proteínas que se visualizan en el gel de la expresión
proteica de S. metallicus en calcopirita con proteínas extraídas por molienda con
perlas de vidrio, teñidas con plata y preteñidas con Coomassie Blue R-250 (Figura
15).
Banda
Distancia de migración en eje X
(cm)
Distancia de migración en eje Y
(cm)
Punto Isoeléctrico
Peso Molecular (kDa)
P1 5,2 4,2 7,15 21,38 P2 4,6 4,2 6,85 21,38 P3 - - - - P4 - - - - P5 - - - - P6 - - - - P7 - - - - P8 - - - - P9 1,4 1,8 5,26 12,10
P10 - - - - P11 - - - - P12 - - - - P13 - - - - P14 - - - - P15 2,2 6,4 5,51 36,02 P16 1,9-2,2 6,6-6,8 5,51-5,66 37,7-39,61 P17 - - - - P18 1,3 7,9 5,21 51,42 P19 - - - - P20 9,3 3,4 9,19 17,68 P21 9,7 1,6 9,39 11,54 P22 2,5 9 5,81 66,75 P23 - - - - P24 7,5 2,6 8,3 14,63 P25 3,4 6 6,31 32,76 P26 3,4 5,8 6,31 31,24 P27 3,2 5,6 6,16 29,8 P28 2,7 5,5 5,91 29,1 P29 2,7 5,3 5,91 27,75 P30 2,3 5,5 5,71 29,1 P31 1,8 5,5 5,46 29,1 P32 1,1 5,5 5,11 29,1 P33 1 6 5,06 32,76
Obs.:
• Se usó como referencia el vértice inferior derecho de los geles.
• Aparentemente, P16 corresponde a 2 proteínas, luego se hicieron 2
mediciones.
40
La tabla 6 muestra las intensidades relativas de las bandas Pi de los geles de la
expresión proteica en azufre y calcopirita, y se puede apreciar que las proteínas
obtenidas por sonicación más expresadas en azufre también se encuentran altamente
expresadas en calcopirita.
Tabla 6: Intensidades de las bandas de proteínas que se visualizan en los geles de la
expresión proteica de S. metallicus crecidos en azufre y calcopirita.
Banda
Gel de la expresión de proteínas en azufre
obtenidas por sonicación
Gel de la expresión proteica en calcopirita obtenidas por
sonicación
Gel de la expresión proteica en calcopirita obtenidas por
molienda con perlas de vidrio P1 ++ ++ + P2 ++ ++ + P3 + - - P4 + - - P5 + - - P6 + - - P7 + + ? P8 + ? ? P9 ++ ++ ++
P10 ++ + ? P11 + - - P12 + - - P13 + ? ? P14 + ? ? P15 + + + P16 ++ + ++ P17 + - - P18 ++ + + P19 + ++ ? P20 - - + P21 ++ ++ + P22 + ++ ++ P23 - ++ ? P24 - ++ + P25 - - + P26 - - + P27 - - + P28 - - + P29 - - + P30 - - + P31 - - + P32 - - + P33 - - +
Obs.: - no se expresa
+ se expresa
++ altamente expresada
? área oscura bloquea visualización
41
3.6. Comparación de la expresión de proteínas de S. metallicus cultivados en azufre y
calcopirita
Una vez que se asignó los valores de punto isoeléctrico y peso molecular a las
bandas Pi, se comparó en las Figuras 16 y 17 los geles de la expresión de proteínas
extraídas por sonicación de S. metallicus crecidos en azufre (Figura 13) con cada uno
de los geles de la expresión proteica en calcopirita de las proteínas obtenidas por
sonicación (Figura 14) y las obtenidas por molienda con perlas de vidrio (Figura 15),
respectivamente.
En la Figura 16, se muestra la expresión de S. metallicus de proteínas extraídas
por sonicación. Estos dos geles son comparables, dado que tienen la misma cantidad
de proteínas (50 µg) y porque son proteínas obtenidas por el mismo método. Las
proteínas que están altamente expresadas, y que coinciden en el gel de azufre y
calcopirita, son las bandas P1, P2 y P9.
Figura 16: Comparación de la expresión de proteínas de S. metallicus expresadas en
azufre (A) y calcopirita (B), extraídas por sonicación. La escala de pI y peso molecular
representadas no están a escala. En los círculos se encerraron las proteínas más
expresadas que coinciden en ambos geles que corresponde a las bandas P1, P2 y P9.
42
En la Figura 17, se muestra la expresión de proteínas de S. metallicus en azufre y
calcopirita, extraídas por sonicación y molienda, respectivamente. Estos dos geles no
son comparables, dado que las proteínas fueron obtenidas por distintos métodos. Sin
embargo, proteínas altamente expresadas en ambos geles coinciden. Las bandas
altamente expresadas que concuerdan son P1, P2, P9 y P16.
Figura 17: Comparación de la expresión en azufre (A) y calcopirita (B) de proteínas de
S. metallicus extraídas por sonicación y molienda con perlas de vidrio,
respectivamente. El gel de calcopirita está distorsionado con respecto al peso
molecular y la escala de punto isoeléctrico es más corta. En los círculos se encerraron
las proteínas más expresadas que coinciden en ambos geles que corresponde a las
bandas P1, P2, P9 y P16.
Luego, usando las coordenadas de las bandas (pI, PM) de las proteínas P1, P2,
P9 y P16 se buscó similitud en bases de datos (Expasy, NCBI, etc.) con las proteínas
conocidas de las especies Sulfolobus y otras archaeas mencionadas en la introducción.
Para ello, también se usó herramientas en línea ubicadas en las páginas
43
www.expasy.org/cgi-bin/tagident.pl y www.expasy.org/tools/pi_tool.html1. De este
modo, se encontró entre las proteínas posibles algunas que eran afines:
• P1 y P2, cuyos pIs son cercanos a 7 y sus pesos moleculares están entre 22 y
27 kDa, podrían estar relacionadas con la proteína Sulfocianina que se
encuentra entre un pI 4-8 y un peso molecular entre 14 y 24 kDa (Q53765,
YP256683, ZP01600593) en las archaeas S. acidocaldarius y Metallosphera
sedula. Si fuese así, estaría relacionada con la cadena respiratoria. Por otro
lado, podría ser una Peroxiredoxina por estar entre un pI 5-7 y peso molecular
22-25 kDa (P81543, P81539), y estaría relacionada al estrés oxidativo (S.
metallicus).
• P9, cuyo pI es aproximadamente 5 y su peso molecular está entre 10 y 12 kDa,
podría estar relacionada con la proteína NADH quinona oxidoreductasa
(Q4J6F9), que posee un pI 5,2 y peso molecular 10,4 kDa (S. acidocaldarius).
Si fuese así, esta proteína estaría relacionada con la cadena respiratoria.
• P16, cuyo pI se encuentra entre 5 y 6, y su peso molecular entre 35 y 40, podría
ser una oxido-reductasa de azufre, dado que ésta posee un pI 6 y peso
molecular entre 35 y 36 kDa en S. tokodaii y Aciadianus ambivalens (NP377053,
BAB66162, CAA39952). Además, en S. metallicus esta proteína tiene un peso
molecular de 36,250 kDa y pI 6,09 (ABN04222). Esta proteína sería capaz de
oxidar y reducir azufre, y producir sulfito, tiosulfato y H2S, de acuerdo a la
descripción de la proteína de código CAA39952.
Dada la importancia que tiene descartar proteínas que pudieran interferir en el
análisis, es necesario indicar que la banda P21 podría ser RNAsa A, que se utilizó en el
proceso de extracción de proteínas. P21 tiene un pI entre 9,2 y 9,4, y un peso
molecular entre 11 y 12 kDa, y RNAsa A comercial (Sigma, R5503) tiene un pI de 9,3 y
peso molecular de 13,7 kDa.
No se pudo identificar las demás proteínas que aparecían en los geles, ni
reconocer las proteínas Fox que se describieron en la introducción, aunque se comparó
1 Visitadas el 3 de mayo de 2007.
44
con las bases de datos existentes y con la bibliografía estudiada. Probablemente,
porque la mayoría de las proteínas Fox son de membrana y por su naturaleza
hidrofóbica no avanzarían en el gel, acumulándose en el extremo ácido del gel, tal
como se puede ver en la Figura 13. Por un lado, porque la metodología de extracción
utilizada no era específica para la obtención de proteínas de membrana, y por otro,
porque el método de electroforesis bidimensional de O’Farrell (1975) sería hidrofílico, a
diferencia de las proteínas de transmembrana que son hidrofóbicas (Toledo, 2007).
Cabe señalar que sería necesario comparar los patrones de expresión proteica
obtenidos en calcopirita y azufre con el obtenido en el crecimiento en ión ferroso (Fe+2)
para corroborar los resultados, usando el mismo método de lisis celular en las células
crecidas en las tres condiciones. Para sugerir la asociación de las proteínas a cada uno
de los metabolismos energéticos relacionados, habría que considerar aquellas bandas
de la expresión proteica en los sustratos S0 y Fe+2 que presentaran marcadas
diferencias en sus intensidades entre una condición y la otra, y que apareciesen a su
vez en la expresión proteica en calcopirita. Luego, éstas podrían ser secuenciadas y
equiparadas con bases de datos tal como se hizo en Ramírez y cols. (2004).
3.7. Expresión proteica y mecanismo de oxidación de calcopirita
De acuerdo a la caracterización de la expresión de proteínas de los geles
comparables de la Figura 16, aparentemente la mayoría de las proteínas altamente
expresadas y visibles de la expresión en calcopirita, también lo son en azufre y estarían
vinculadas a proteínas de la cadena respiratoria. Este resultado indica que durante la
biolixiviación de calcopirita en presencia de S. metallicus, una acción oxidativa de S.
metallicus consiste en la oxidación de azufre elemental. Esto confirma a su vez que el
azufre elemental es un compuesto intermedio obtenido durante la descomposición
oxidativa de calcopirita. La actividad oxidativa de S. metallicus sobre los compuestos de
azufre se hace en parte por la población adherida, que oxida hasta S+2, S+4, y las
planctónicas que oxidan estos compuestos intermediarios hasta SO4-2(Gautier y cols.,
2007b). La población de microorganismos usada para la electroforesis bidimensional
fue la planctónica, luego es posible que en ella predomine la acción oxidativa de S+4,
S+2 a SO4-2. De esta forma, los resultados coincidirían con el mecanismo cooperativo
(Tributsh, 2001; Gautier y cols., 2007b).
45
CAPÍTULO 4. CONCLUSIONES
Con respecto a los resultados y discusiones realizadas en el presente estudio, se
puede concluir que:
• Se desarrolló y estableció un proceso de generación y recolección de células de
S. metallicus crecidas en azufre y calcopirita.
• Se determinó un método de extracción de proteínas para células de S.
metallicus.
• Se montó satisfactoriamente en el laboratorio un método de electroforesis
bidimensional de acuerdo a O’Farrell (1975).
• Se logró obtener el patrón de la expresión proteica de S. metallicus obtenido
durante su crecimiento en base a la oxidación de azufre y calcopirita.
• Se logró identificar proteínas comunes altamente expresadas en S. metallicus
durante su crecimiento en ambos sustratos. Estas proteínas de acuerdo a sus
pesos moleculares y puntos isoeléctricos es probable que estén relacionadas a la
cadena respiratoria del microorganismo.
• La comparación del patrón de la expresión proteica en ambos sustratos sugiere
que la acción oxidativa de S. metallicus involucra también la oxidación de azufre
elemental formado como compuesto intermedio durante la descomposición
oxidativa de este sulfuro.
46
CAPÍTULO 5. RECOMENDACIONES
Se recomienda repetir los geles bidimensionales de la expresión de S. metallicus
crecidos en azufre, calcopirita e ión ferroso, usando en cada uno de ellos el mismo
método de extracción de proteínas.
Se recomienda usar el método de extracción por molienda, porque
aparentemente se ven más proteínas y tiene una mayor eficiencia. Además, para ver
más proteínas se debiera hacer los geles con 250 µg de proteínas y teñir con
Coomassie Blue R-250. Luego, considerando la eficiencia de este método de extracción
y el requisito de 250 µg de proteínas, se debería procesar 4 x 1010 células de S.
metallicus para estos experimentos.
47
CAPÍTULO 6. BIBLIOGRAFÍA
• Andrews A. T. 1986. “Electrophoresis. Theory, Techniques and Biochemical and
Clinical Applications”. p: 46.
• Amaro A. M., Chamorro D., Seeger M., Arredondo R., Peirano I., Jerez A. 1991.
“Effect of external pH perturbations on in vivo protein síntesis by the acidophilic
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53
ANEXOS
A. Teoría de la electroforesis bidimensional
A.1. Isoelectroenfoque (IEF)
La primera separación en una electroforesis de dos dimensiones es el
isoelectroenfoque, donde las proteínas, compuestos anfotéricos, cuya carga varía
desde la carga neta positiva en el pH ácido a carga neta negativa en el pH alcalino, son
separadas por su punto isoeléctrico a lo largo de un gradiente de pH. Las proteínas
están formadas por cadenas de aminoácidos ionizables, los cuales tienen distintas
cargas superficiales de acuerdo al medio en que se encuentren. Luego la carga neta de
una proteína estará dada por la suma algebraica de todas las cargas de sus
aminoácidos. Por ejemplo, los grupos ácido carboxílicos (-COOH) en las proteínas no
están cargados en soluciones ácidas y están disociados en la forma aniónica (-COO-)
en los valores sobre pHs cercanos a pH 3. Por otro lado, las aminas (-NH2) no están
cargadas en el pH alcalino, pero son catiónicas bajo pHs cercanos a pH 10 (por
ejemplo, -NH3+). Luego, si el número de grupos ácidos excede al número de grupos
básicos, el pI de la proteína será de pH bajo y la proteína será clasificada como ácida.
De la misma forma, si el número de grupos básicos es mayor al de grupos ácidos, el pI
de la proteína será de pH alto y estará catalogada como básica (Ivory, 2000; Garfin,
2000).
La carga neta de una proteína es una propiedad fisicoquímica característica, que
permitirá separarla de otras proteínas. Esta carga superficial irá cambiando a lo largo
del gradiente de pH, de acuerdo a su curva de titulación hasta que alcance su posición
de equilibrio, donde su pH es igual a su punto isoeléctrico. Luego, la dirección de
migración es hacia la disminución de la carga y movilidad.
Durante su movimiento a través del gradiente de pH, la proteína gana y pierde
electrones variando su carga neta. Las proteínas estarán cargadas positivamente en un
medio de pH bajo su punto isoeléctrico y cargadas negativamente en un medio de pH
sobre su punto isoeléctrico. En la electroforesis, la carga neta de la proteína
determinará su dirección de migración (movilidad electroforética). Cuando una proteína
está bajo un campo eléctrico, se moverá hacia el electrodo de carga opuesta. En
54
valores de pH bajo su pI, las proteínas migrarán hacia el cátodo, el electrodo negativo.
Por el contrario, a pH sobre su pI, las proteínas migrarán hacia el ánodo, el electrodo
positivo. Cuando una proteína no responde al campo eléctrico significa que su carga
neta es cero y se encuentra en su pI (Figura 18).
Figura 18: Una molécula anfotérica como una proteína, migrará a través de la celda con
su carga neta, decreciendo en velocidad de migración hasta que alcance su punto
isoeléctrico (Ivory, 1990).
Condiciones de Corrida (Garfin, 2000)
Las actuales condiciones de corrida varían con el equipo, el grosor del gel, la
solución de la muestra y los anfolitos. Los geles deberían ser corridos al más alto voltaje
compatible con las capacidades de disipación de calor de la celda electroforética, para
lo cual es necesario chequear las condiciones de corrida del producto. Al principio de la
corrida, cuando el voltaje es aplicado, la corriente posee el mayor valor, porque los
anfolitos no se han enfocado aún y los iones de la muestra todavía no han migrado a
los extremos de los electrodos del gel. Cuando la corrida progresa, la conductividad del
gel y la corriente caerá. De acuerdo a la expresión V=IxR, a un voltaje constante el
aumento en la resistencia implicará la caída de la corriente.
Se acostumbra caracterizar la extensión del enfoque con el tiempo integral del
voltaje aplicado, expresado como “volt-horas”. El volt-hora (V-hr) se explica como un
estándar para las condiciones de enfoque. Aunque no tiene significado físico, permite
alcanzar la reproducibilidad entre corridas, una vez que se ha establecido las
condiciones donde se alcanza el estado de equilibrio. Sin embargo, no es definitivo,
55
porque correr por pequeños tiempos a un alto voltaje resulta en mejores separaciones
que correr por mucho tiempo a un bajo voltaje, aunque los volt-horas de las dos corridas
sean idénticos.
i. Gradiente de pH
i.1. Tipos de gradientes
El gradiente de pH puede ser creado durante la electroforesis o se pueden utilizar
gradientes inmovilizados (IPGs). En el primer caso, el gradiente es creado y mantenido
a través del paso de un campo eléctrico, a través de una solución de compuestos
anfotéricos sintéticos, llamados anfolitos, que abarcan un determinado rango de pH, los
que se ubican en sus pIs, y el gradiente de pH va aumentando desde el ánodo al
cátodo. En cambio, en los gradientes de pH inmovilizados, el gradiente existe antes que
el gel sea corrido, ya que éste está copolimerizado, y de esta forma, insolubilizado
dentro de las fibras de una matriz de poliacrilamida. Estos últimos fueron desarrollados
para proveer un medio para obtener predecibles y reproducibles corridas de
electroenfoque (Garfin, 2000).
i.1.1. Gradiente formado por Anfolitos
En el principio de la corrida el medio tiene un pH uniforme, el cual es igual al
promedio del punto isoeléctrico de los anfolitos (Figura 19A). Cuando el voltaje es
aplicado, iones de hidrógeno son producidos en el ánodo y los iones hidroxilo en el
cátodo. La región en la vecindad del ánodo se va acidificando, mientras que la del
cátodo se va haciendo básica (Figura 19B). En respuesta al campo, los pequeños
anfolitos se mueven hacia sus pIs. Los anfolitos más ácidos, de menor pI, se mueven
hacia el ánodo, donde se concentra una zona donde el pH es igual a su pI de esta
misma forma, los más básicos, de mayor pI, se dirigen hacia el cátodo. Los anfolitos
siendo buffers, establecen pequeñas “mesetas” (línea curva) (Garfin, 2000) de pH en
sus pIs en los extremos de la celda (Figura 19C). Este proceso continúa desde los
extremos hacia el centro, formándose una multitud de “mesetas” de pH en sus
respectivos pIs a medida que los anfolitos se van enfocando, para, eventualmente
formar un gradiente de pH aproximadamente lineal desde un pH bajo en el ánodo, a un
pH alto en el cátodo (Figura 19D). Si los anfolitos entraran hacia zonas distintas a su pI,
56
estos se cargarían y por el voltaje aplicado regresarían a su pI (Garfin, 2000; Righetti,
1990).
Al aplicarse el voltaje, las proteínas comienzan una lenta migración dirigida por el
pH del medio donde se encuentran inicialmente. Las proteínas con pIs en los extremos
del gradiente de pH, comienzan a formar bandas antes que las que tienen su pI en la
mitad del gradiente. Finalmente, luego de un tiempo, todas las proteínas se ubicarán en
el gradiente de pH establecido.
Figura 19: Creación de un gradiente de pH con anfolitos (Garfin, 2000).
i.1.2. Inestabilidad del gradiente de pH
Los gradientes de pH generados con anfolitos son estables una vez que el estado
estacionario ha sido alcanzado. Sin embargo, durante extensos electroenfoques los
gradientes se han encontrados deteriorados. Esto se caracteriza con el desplazamiento
de los gradientes hacia el cátodo y es acompañado por la acidificación del ánodo,
aplastamiento del gradiente en la región del pH neutro, y la pérdida de bandas alcalinas.
El mecanismo de inestabilidad ha sido llamado “desplazamiento catódico” y no está
completamente entendido (Garfin, 2000).
57
i.1.3. Gradiente Inmovilizado (IPG)
El gradiente inmovilizado se logra usando como buffers un set de seis ácidos y
bases débiles no-anfotéricos, teniendo la siguiente composición química general:
CH2=CH-CO-NH-R, donde R puede ser dos diferentes grupos carboxilo débiles con
valores de pK 3,6 y 4,6 o cuatro grupos amino terciarios, con pK 6,2, 7,0, 8,5 y 9,3,
disponibles bajo el nombre “Immobiline” de Pharmacia. Un set más amplio comprende
diez químicos, un buffer ácido de pK 3,1, un buffer básico de pK 10,3 y 2 titulantes
fuertes (un ácido de pK 1 y una base cuaternaria de pK mayor a 12) disponibles como
“pI select” en Fluca, Buchs, Suiza. Como estas moléculas tienen dobles enlaces, ellas
copolimerizan con la acrilamida y la red de metilenbisacrilamida (Righetti, 2004,
Westermeier y Görg, 1998). Los IPGs permiten la mayor resolución posible hasta ahora
y la más amplia colección de bandas en los mapas bidimensionales (Righetti, 2004). En
los geles bidimensionales es necesario una alta precisión donde cientos de proteínas
puedan ser separadas y comparadas, primero por pI y luego por peso molecular. La alta
resolución y comparaciones consistentes requieren que todas las proteínas en
diferentes muestras sean enfocadas completamente en sus verdaderos puntos
isoeléctricos, y además que las posiciones de las proteínas en los geles de IEF sean
idénticas de un gel a otro. Esto requiere tiempos de enfoque suficientemente largos
para que todas las proteínas alcancen sus posiciones de estado de equilibrio. Parece
ser que esto sólo se cumple inmovilizando los gradientes de pH. De hecho, los IPGs
parecen proveer el mejor método disponible para separar proteínas básicas con pIs
sobre pH 12.
A.2. Gel de Poliacrilamida (PAGE)
La polimerización es iniciada por el persulfato de amonio y TEMED. TEMED
(Tetrametiletilenodiamina) acelera la tasa de formación de radicales libres desde
persulfato y estos a su vez catalizan la polimerización. Los radicales libres de persulfato
convierten los monómeros de acrilamida a radicales libres, los cuales reaccionan con
monómeros inactivos para iniciar la reacción en cadena de la polimerización. Las
cadenas del polímero en crecimiento, se unen al azar a la bisacrilamida, resultando un
gel con una porosidad característica, la cual depende de las condiciones de
polimerización y concentraciones del monómero. En una base molar, la acrilamida es
58
lejos el componente más abundante en la solución de acrilamida y bisacrilamida (Figura
20).
Figura 20: Polimerización del gel de acrilamida (Fuente: Boletín Nº 1156 de Bio-Rad)
B. Cultivos
B.1. Medios de Cultivo
B.1.1. Medio de cultivo Norris
Para preparar el medio de cultivo se necesita 0,4 g/l de sulfato de amonio
((NH4)2SO4), 0,5 g/l de sulfato de magnesio (MgSO4 x 7H2O) y 0,2 g/l de fosfato di-ácido
de potasio (KH2PO4). El pH se ajusta con H2SO4 de acuerdo a metodología.
B.1.2. Cultivos en distintos minerales
B.1.2.1. Cultivo de S. metallicus en azufre
Para preparar el cultivo de S. metallicus en azufre, se necesita 30 g/l de azufre,
5% de inóculo de células, en agua destilada. Si el azufre estuviese colonizado no es
necesario agregar inóculo.
B.1.2.1.1. Pre-tratamiento del azufre
Con el fin de eliminar posibles toxinas en el azufre, éste se coloca en matraces
con medio de cultivo, dentro de una olla a presión sin válvula. Se hierve por 30 minutos
y luego se dejan a temperatura ambiente por 24 horas. Transcurridas las 24 horas, se
bota y renueva el medio de cultivo, para después repetir el procedimiento de hervor por
59
30 minutos sin válvula. Una vez fríos los matraces, se bota y renueva el medio. Acto
seguido, se inoculan los matraces y son llevados al agitador ambiental a 70 °C.
B.1.2.2. Cultivo de S. metallicus en Calcopirita
Para preparar el cultivo de Sulfolobus metallicus en calcopirita, se necesita 10 g/l
de calcopirita, 5 % de inóculo de células, en agua destilada. Si la calcopirita estuviese
colonizada no es necesario agregar inóculo.
C. Obtención y determinación de la concentración de proteínas
C.1. Especificaciones de reactivos utilizados en la preparación de extractos crudos
MgCl2: Este reactivo entrega Mg+2, el cual es un cofactor necesario para la acción de la
enzima Ribonucleasa A.
Ribonucleasa A (RNasa A) o pancreática: Esta enzima corta el fosfato 3’ del
nucleótido pirimidina, el cual forma parte de las bases nitrogenadas: uracilo, citosina y
timina. Por esto, destruye el RNA. Los ácidos nucleicos interfieren en la carga de las
proteínas por la carga negativa de sus fosfatos, luego es necesario eliminarlos de la
muestra de proteínas. Esta enzima tiene un peso molecular de 13.700 Da y su pI es 9,6,
lo que debe considerarse al momento de analizar los geles bidimensionales.
Tris HCl (pH 7,4): Utilizado como tampón para mantener las proteínas en un pH neutro
y así no afectar su separación por pI.
Lisozima: Esta enzima rompe los enlaces 1,4 - glicosídicos de los peptidoglicanos de
las bacterias, que son largas cadenas de N-acetilglucosamina y ácido N-
acetilmurámico. Luego, no es capaz de romper los pseudopeptidoglicanos, que pueden
contener algunos tipos de archaeas, ya que éstos están formados por N-
acetilglucosamina y ácido N-acetilalosaminurónico, que tienen enlaces 1,3- glicosídicos,
en vez de 1,4 - glicosídicos. Entonces, no se puede utilizar lisozima para la lisis de S.
metallicus.
60
C.2. Buffer de Sonicación
El buffer de sonicación contiene TrisHCl 10 mM (pH 7.4), MgCl2 5 mM y 50
µg/ml de RNasa A. Este buffer se puede almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 °C.
C. 3. Buffer para Molienda con perlas de vidrio
El buffer para molienda con perlas de vidrio contiene TrisHCl 10mM (pH 7.4),
MgCl2 5 mM, 50 µg/ml de RNasa A, Triton X-100 2% (p/v) y una relación 1:1 (v/v) de
perlas de vidrio (Sigma) y muestra de proteínas. Este buffer se puede almacenar en
alícuotas de 1 ml a -20 °C.
C. 4. Cálculo de la concentración de proteínas
Para realizar la curva de calibración, se obtuvo las absorbancias de 5 distintas
concentraciones a 595 y 465 nm. Para hacer las mediciones en el espectrofotómetro, se
necesitó las siguientes cantidades de reactivos:
Blanco:
• 1,4 ml de agua destilada
Blanco sin muestra:
• 1 ml de agua destilada
• 400 µl de Coomassie
Muestra:
• 960 µl agua destilada
• 400 µl de Coomassie
• 40 µl de proteínas
Luego, se graficó la absorbancia (eje Y) de las muestras dadas por la ecuación 3
versus las distintas concentraciones (eje X).
[3] ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
muestrablancodelnmaAbsmuestrablancodelnmaAbs
muestraladenmaAbsmuestraladenmaAbsY
sin465sin595
465595
61
Posteriormente, se usó la ecuación [4] de la línea de tendencia recta del gráfico de
la Figura 21 para obtener la concentración de proteínas de acuerdo a [5].
y = 6,4251x - 0,026 [4]
R2 = 0,9983
[5]
y = 6,4251x - 0,026R2 = 0,9983
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Concentración de proteínas (mg/ml)
Abs
orba
ncia
(nm
)
Figura 21: Curva de calibración del método de Bradford.
C. 5. Cálculo de las eficiencias de distintos métodos para la obtención del extracto
crudo
C.5.1. Determinación del contenido proteico del peso húmedo de células
Contenido proteico del peso húmedo de células de E. coli
Usando como referencia que el 55 % del peso seco de E. coli corresponde a
proteínas (Brock, 1997) y que entre 30 % del peso húmedo corresponde a peso seco
(Robertson, 1998). Se determinó que el 17 % del peso húmedo sería aproximadamente
el contenido proteico de E.coli.
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=4251.6
026.0yx
62
húmedopesoxhúmedopesoxx 165,030,055,0 =
Considerando que el peso seco de una célula de E. coli es 2,8 x 10-13 célulag ,
luego su peso húmedo es 9,33 x10-13 célulag .
célulagxcélula
gx13
13
1033,930,0
108,2−
−
=
Entonces, el contenido proteico de una célula de E. coli sería 1,59 x 10-7
célulagµ .
célulagxxcélula
gx 1313 10586,117,01033,9 −− =
Contenido proteico del peso húmedo de células de Sulfolobus metallicus
Usando como referencia que el 55 % del peso seco de E. coli corresponde a
proteínas (Brock, 1997) y que entre el 15 y el 30 % del peso húmedo corresponde a
peso seco, dependiendo del microorganismo (Robertson, 1998). Se determinó que el
8,3 % del peso húmedo sería aproximadamente el contenido proteico de S. metallicus.
húmedopesoxhúmedopesoxx 0825,015,055,0 =
Considerando que el peso seco de una célula de E. coli es g10 x 2,8 -13 , siendo
mx µ31 sus dimensiones (Brock, 1997) y que S. metallicus es de forma globular de
diámetro mµ1 , se supuso que el peso seco de una célula de S. metallicus sería la
tercera parte, es decir, g-1410 x 9,33 .
célulagxcélula
gx14
13
1033,93
108,2−
−
=
Luego, el peso húmedo de una célula de S. metallicus sería gx 131022,6 − .
63
célulagxcélula
gx13
14
1022,615,0
1033,9−
−
=
Entonces, el contenido proteico de una célula de S. metallicus sería g-1410 x 5,16 .
célulagxxcélula
gx 1413 1016,5083,01022,6 −− =
De esta forma, una célula de S. metallicus obtenida por centrifugación o filtración
tendría gµ -810 x 5,16 de proteínas.
C.5.2. Cálculo de la eficiencia de la obtención de proteínas del método utilizado en
Fuentes (2004) en S. metallicus
El método de extracción utilizado en Fuentes (2004) es el siguiente: Las células
resuspendidas en buffer de lisis: Tris 50 mM (pH 8,8) y sacarosa 10 %, y almacenadas
a -20 °C, son sonicadas en un número de 8 ciclos de 30 segundos de sonicación en
hielo seguidos por 30 segundos de espera.
Sea [6] la ecuación de la curva de calibración de concentración de proteínas
versus número de células en Fuentes (2004):
10,26 X x 0,7058 Y += [6]
Siendo Y la concentración de proteínas obtenidas (ppm), y X, el número de células
x 1 x 10-6/ml.
Reemplazando Y con 100 mg/l, luego X es 1,27 x 108 células/ml. Entonces, con
1,27 x 108 células, se obtiene 1x10-2 µg de proteínas. De esta forma, de una célula se
obtiene 7,87 x 10-11 µg de proteínas.
Luego, la eficiencia (η ) para el método de extracción de proteínas utilizado por
Fuentes (2004) es 0,15 %.
64
%15,0%1001016,5
1087,7
8
11
=⎟⎠⎞⎜
⎝⎛
⎟⎠⎞⎜
⎝⎛
=−
−
x
célulaproteínasdegx
célulaproteínasdegx
µ
µ
η
C.5.3. Cálculo de la eficiencia de la obtención de proteínas, usando buffer de sonicación
de O’Farrell (1975) en S. metallicus
Considerando, la obtención de proteínas desde 4 pellets de células de Sulfolobus
metallicus crecidos en azufre (Pe1, Pe2, Pe3, Pe4), los cuales, a su vez, se juntaron
con los pellets anteriores para ser reutilizados en la extracción de proteínas (tabla 3)
usando sonicación con buffer de sonicación (anexo C.2.). Se obtiene, una eficiencia de
4,34 %.
La eficiencia fue calculada de la siguiente manera:
Sea Zi el número de células totales de cada pellet, sin incluir las células de los
pellets reutilizados, y Uj los µg de proteínas obtenidas.
Entonces,
⎟⎠⎞⎜
⎝⎛== −
∑
∑célula
proteínasdegxcélulasx
proteínasdeg
Z
U
i
j µµ 9114
1
5
1 1024,21061,2
584
Luego, se extrae 2,24 x 10-9 µg de proteínas de cada célula de S. metallicus.
Entonces,
%34,4%1001016,5
1024,2
8
9
=⎟⎠⎞⎜
⎝⎛
⎟⎠⎞⎜
⎝⎛
=−
−
x
célulaproteínasdegx
célulaproteínasdegx
µ
µ
η
Obteniéndose una eficiencia (η ) del 4,34 % usando el buffer de sonicación de
O’Farrell (1975).
65
Tabla 3: Obtención de proteínas de pellets reutilizados
Pellet Zi
Número de células totales
Uj
Proteínas obtenidas
(µg)
Pe1 2,1 x 1010 25
Pe2 3,6 x 1010 55
Pe3 1,2 x 1011 284
Pe4 8,4 x 1010 180
Pe5 - 40
Obs:
• El número de células no incluye las células provenientes de los pellets
reutilizados.
• Pe5 corresponde a la reutilización de Pe4.
C.5.4. Eficiencia de la obtención de proteínas, usando buffer de molienda con perlas de
vidrio en Sulfolobus metallicus
Se usó molienda con perlas de vidrio en un pellet de 3,31 x 1010 células de S.
metallicus crecidas en calcopirita, obteniéndose 208 µg de proteínas. Luego, para una
célula se logró obtener 6,28 x 10-9 µg de proteínas, correspondiente a una eficiencia (η )
de 12,2 %.
⎟⎠⎞⎜
⎝⎛= −
célulaproteínasdegx
célulasxproteínasdeg µµ 9
10 1028,61031,3
208
%19,12%1001016,5
1028,6
8
9
=⎟⎠⎞⎜
⎝⎛
⎟⎠⎞⎜
⎝⎛
=−
−
x
célulaproteínasdegx
célulaproteínasdegx
µ
µ
η
C.5.5. Cantidad teórica de células necesaria para obtener 250 µg de proteínas de
acuerdo a eficiencias calculadas
Se calculó la cantidad de células necesaria de acuerdo a las metodologías de
extracción de proteínas realizadas a S. metallicus.
66
Se necesita 3,98 x 1010 células, utilizando la molienda con perlas de vidrio.
célulasxgxgx
célula 109 1098,3250
1028,61
=−
µµ
Se necesita 1,12 x 1011 células, utilizando la sonicación con buffer de sonicación
de O’Farrell (1975).
célulasxgxgx
célula 119 1012,1250
1024,21
=−
µµ
Se necesita 3,18 x 1012 células, utilizando la metodología usada en Fuentes
(2004).
célulasxgxgx
célula 1211 1018,3250
1087,71
=− µµ
D. Especificaciones de reactivos usados en la metodología de electroforesis 2D
D.1. Aspectos relevantes de algunos reactivos utilizados en la electroforesis
Urea: Es un agente disociador que trabaja rompiendo los puentes de hidrógeno, de esta
forma, solubiliza las proteínas y elimina las interacciones proteína-proteína y proteína-
lípido. Esto permite que la separación de las proteínas ocurra más rápidamente y
aumente la resolución. Se necesita una alta concentración, aproximadamente 8 M.
Debe estar presente durante la electroforesis para mantener el estado denaturado de
las proteínas. La ventaja de la urea es que no afecta la carga intrínseca de las
proteínas. Además, la urea reduce, aunque no elimina el arrastre catódico (Bollag y
cols., 1996). Se debe evitar el calentamiento de soluciones que contengan urea, ya que
se podría formar cianatos, los cuales interactúan con los grupos amino, para formar
derivados carbamilados estables, que modifican las cargas de las proteínas (Patel,
1994).
SDS: Detergente aniónico, pues su grupo principal posee cargas negativas. Se une a
las proteínas, siendo las cargas intrínsecas de las proteínas insignificantes con respecto
a las negativas proveídas por éste. Luego, la densidad de carga será esencialmente
67
idéntica entre los complejos de SDS-polipéptido y la migración en los geles de
poliacrilamida de porosidad estrictamente correcta será de acuerdo al tamaño del
polipéptido.
Triton X-100: Son detergentes no iónicos que tienen como grupos principales grupos
hidrofóbicos no cargados. A menudo, son utilizados para denaturar soluciones y así
ayudar a mantener las proteínas solubles especialmente las de membrana (proteínas
hidrofóbicas). Algunos autores recomiendan detergentes zwitteriónicos como CHAPS y
Zwittergent 3-14, los cuales tienen como grupos principales grupos que contienen tanto
cargas negativas, como positivas, siendo mejores que los detergentes no iónicos en
romper las interacciones proteína-proteína, y denaturan menos las proteínas que los
detergentes iónicos (Bollag y cols., 1996).
2-mercaptoetanol: Corta los enlaces de disulfuro para completar la denaturación de las
estructuras terciarias y cuaternarias.
D.2. Soluciones
D.2.1. Solución A
Está solución está constituida por 28,38 % (p/v) de acrilamida y 1,62 % (p/v) de
bisacrilamida, en agua ultrapura. Es importante que la pureza de los componentes de
esta solución, sea lo más alta posible para los geles de la primera dimensión. Los
componentes son neurotóxicos, por lo que se deben tomar las medidas de seguridad
correspondientes.
D.2.2. Solución B
Esta solución está constituida por TrisHCl 1,5 M, pH 8,8 y 0,4 % (p/v) de SDS.
D.2.3. Solución C
Esta solución está constituida por TrisHCl 0,5 M, pH 6,8 y 0,4 % (p/v) de SDS.
68
D.2.4. Buffer de Lisis
La solución de buffer de lisis consta de Urea 9,5 M, 2% (p/v) de Tritón X-100,
anfolitos pH 3-10 2 % (v/v) y 2-mercaptoetanol 5 % (v/v). Este buffer se puede
almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 °C.
D.2.5. Buffer de Equilibrio
El buffer de equilibrio consta de Glicerol 10 % (v/v), 2-Mercaptoetanol 5 % (v/v),
SDS 2,3 % (p/v) y TrisHCl 0,0625 M, pH 6,8.
D.2.6. Buffer de corrida para la segunda dimensión
Este buffer está compuesto por Tris base 0,025 M, glicina 0,192 M y SDS 0,1 %
(O’Farrell, 1975) en agua destilada.
D.2.7. Solución de geles
D.2.7.1. Gel de primera dimensión
La solución debe ser añadida a tubos de 14 cm de longitud y 2.5 mm de diámetro,
con un nivel de llenado de 11,5 cm.
Tabla 7: Solución de gel de primera dimensión
Componentes para 5 geles Masa (g)
Volumen (µl)
Urea 1,72 -
Solución A - 416
Tritón X-100 (10 % p/v) - 625
Agua Ultrapura - 616
Anfolitos 3-10 - 160
Persulfato de Amonio (10 % p/v) - 6,3
TEMED - 4,4
Es importante que los reactivos de los geles usados en la primera dimensión sean
de la más alta pureza.
69
La acrilamida es neurotóxica, por lo que es necesario evitar el contacto con este
reactivo2.
Se recomienda usar una solución fresca de persulfato de amonio 10 % (p/v),
porque es un fuerte agente oxidante y se descompone rápidamente. Se puede
comprobar que el persulfato de amonio sólido se encuentra en buenas condiciones, si al
prepararlo al 10 % p/v, éste crepita. Se puede almacenar bien cerrado a 4 °C.
TEMED debe ser almacenado bien tapado a 4 °C. Después de 10 a 12 meses, se
puede producir una reducción de su reactividad. Este reactivo es corrosivo, por lo que
es necesario evitar su contacto3.
D.2.7.2. Gel de Corrida de segunda dimensión
Tabla 8: Solución para solución del gel de corrida para 5 geles
Componentes para 5 geles Volumen (ml)
Agua destilada 35
Glicerol 2
Solución A 38,3
Solución B 25
Solución C -
10% p/v Persulfato de Amonio 0,37
TEMED 0,3
Obs.: SDS-PAGE Acrilamida 11,5 %.
2 http://www.jtbaker.com/msds/englishhtml/A1550.ht 3 http://www.jtbaker.com/msds/englishhtml/t2080.htm
70
D.2.7.3. Gel Concentrador o Stacking de segunda dimensión
Tabla 9: Solución para gel concentrador
Componentes para 5 geles Volumen (ml)
Agua destilada 15
Glicerol -
Solución A 4
Solución B -
Solución C 6,25
(10% p/v) Persulfato de Amonio 75
TEMED 25
E. Detalles de la metodología de electroforesis 2 D de O’Farrell (1975)
E.1. Confección de los Geles de la Primera y Segunda Dimensión
El gel de primera dimensión contiene urea, cuya presentación es en cristales, los
cuales deben ser disueltos en solución. Para esto, no se debe aplicar calor, pues existe
el riesgo de que a las altas temperaturas se denature la urea, impidiendo la correcta
corrida de las proteínas en el gel. Por lo tanto, se debe ir moviendo en círculos el
matraz Erlenmeyer cada vez que se agregue un ingrediente. Se puede aplicar calor
leve, usando únicamente el calor de la palma de la mano. Como el persulfato de amonio
10 % (p/v) y TEMED son los ingredientes que desencadenan y catalizan la reacción de
polimerización del gel respectivamente, estos deben ser los últimos en ser agregados
en la solución homogénea. Cuando se agregue el persulfato de amonio 10 % (p/v),
también se debe homogenizar la solución, de tal manera que la reacción catalizada por
el TEMED, también sea homogénea y así no se formen coágulos de gel.
Para hacer los geles de la primera dimensión, se utilizó tubos de 14 cm. x 2,5 mm
de diámetro interno, los que se llenaron hasta los 11,5 cm de longitud. Para asegurar
esto, se hizo una marca que indicase el nivel de llenado y se colocaron en un soporte
para mantenerlos en posición vertical y así obtener un gel de superficie lisa. Se usó una
jeringa de 20 ml con una aguja gruesa, larga y roma para llenar los tubos, y se verificó
que la aguja no estuviese taponada. La aguja debe ser más larga que el tubo, para
71
asegurar que no se formen burbujas en la parte inferior del gel y suficientemente gruesa
para que la gelificación del gel dentro de la aguja no interfiera en el llenado de los tubos.
El extremo inferior de los tubos se selló con papel Parafilm-M para evitar que se
derramase la solución. A medida que se llenaban los tubos se debió ir subiendo la
aguja sin que ésta dejase de tener contacto con la solución, hasta que se llegó al nivel
de llenado. De esta forma, se evitó la formación de burbujas que afectarían el correcto
corrimiento del gel. El llenado debe hacerse rápido para evitar la gelificación de la
solución dentro de la aguja, la cual debe ser lavada con agua luego de ser utilizada.
Para asegurar la correcta gelificación de los geles, se dejó los tubos a temperatura
ambiente para ser utilizados al día siguiente.
Para hacer los geles para la segunda dimensión, se utilizó dos vidrios de 16,5 x 19
cm, uno de ellos con un bolsillo de 12,6 x 3 cm y un biselado. Primero, se colocó una
delgada línea de vaselina blanca en los bordes inferior y laterales del vidrio sin bolsillo,
para ello se utilizó una jeringa con aguja roma. Luego, se colocaron tres separadores de
un espesor de 0,75 mm, de tal modo que el de abajo tuviera una separación con los
separadores laterales, la cual se llenó con un poco de vaselina, para luego colocar
encima el vidrio sin bolsillo. Después, se colocó clips en los lados y en la base, para
mantener juntos los vidrios del sándwich y con los mismos mantenerlos en forma
vertical. En el caso de disponer de un soporte de maxigeles, se debe seguir los mismos
pasos pero omitiendo el separador y la vaselina utilizada en el borde inferior, en vez de
ello se debe presionar adecuadamente el borde inferior del sándwich en la silicona del
soporte para evitar el derrame de la solución. Posteriormente, se agregó
aproximadamente unos 18 ml de la solución de gel de corrida (anexo D.2.6.) a cada
sándwich de vidrios. Si se formaban burbujas se eliminaban porque interfieren en el
correcto desplazamiento de las proteínas a través del gel, para esto se ladeó levemente
el sándwich de geles para eliminarlas. Sobre el gel de corrida colocó un par de
milímetros de agua para asegurar que la superficie del gel de corrida fuese pareja.
E.2. Carga y corrida de los geles de la Primera Dimensión
Se sacó los tubos del soporte y retiró cuidadosamente el papel Parafilm colocado
en el extremo inferior de los tubos. Si en la parte inferior de los geles se hubiese
72
formado una burbuja, ésta debía ser llenada con la misma solución de corrida (NaOH
0,02 M) en que estaría en contacto dicho extremo del gel.
Se colocó cada tubo en un tapón y luego en los agujeros de la cámara de
electroforesis de la primera dimensión, manteniendo la misma disposición que en el
soporte. Los tubos fueron colocados de tal manera que sobresaliese la misma longitud
del tubo sobre los tapones, y se debió asegurar que los tubos tuvieran en contacto con
las soluciones ácida y básica de corrida. Aquellos agujeros de la cámara que no fueron
utilizados se taparon para que no escurriese la solución de corrida superior hacia la
inferior.
Se agregó un poco de la solución ácida (H3PO4 0,01 M) en el compartimiento
superior sin cubrir los tubos sólo para confirmar que no existiese fugas a través de los
agujeros de la cámara superior hacia abajo. Luego, se agregó la solución básica de
corrida (NaOH 0,02 M) en el comportamiento inferior, colocando el electrodo positivo
(electrodo rojo) en la solución ácida de corrida y el negativo en la básica (electrodo
negro).
Cada muestra de proteínas liofilizadas fue resuspendida en 45 µl de buffer de lisis
(anexo D.2.4.) y luego colocada con una jeringa de aguja delgada y larga en el tubo
(jeringa Hamilton). Para proteger la muestra de proteínas de la solución de corrida, se
agregó 20 a 30 µl de una solución de urea 8 M sobre ésta. Finalmente, se colocó un
poco de la solución de corrida para luego terminar de colocar la solución ácida de
corrida en el compartimiento superior de tal manera de cubrir los tubos. Una vez
terminado esto, se debía observar la diferencia entre las 3 fases.
Se conectaron los cables de los electrodos a la fuente de poder, ésta se programó
por 5,5 horas a 400 V y un amperaje inferior a 20 mA (2200 V-hora). Entonces, si se
dispusiese de una cámara de electroforesis de una capacidad mayor de voltaje, por
disponer de algún tipo de sistema de enfriamiento, se podría correr, por ejemplo, por
dos horas a 1.100 V.
Mientras se está corriendo los geles de la primera dimensión, se terminó de alistar
los geles de la segunda dimensión eliminando el agua que se había colocado sobre el
gel de corrida y agregando la solución de Stacking o concentradora hasta antes del
73
biselado (anexo D.2.7.3.). Se debió evitar la formación de burbujas en el gel y en la
interfase. Entonces, se formaban burbujas en la interfase se debían moviendo el
sándwich de geles o golpeando suavemente sobre éstas. Además, se colocó unos
milímetros de agua sobre este gel de la misma manera que se hizo sobre el gel de
corrida.
E.3. Carga y corrida de los geles de la Segunda Dimensión
Una vez cumplidas las 5,5 horas de electroforesis de la primera dimensión, se
apagó la fuente de poder, se desconectó los electrodos y botó las soluciones de corrida.
Se sacó con cuidado los tubos desde la cámara de electroforesis, y se retiraron los
tapones sin olvidar el sentido de corrida de los geles. Además se procedió a enjuagar
los electrodos y la cámara de electroforesis con agua, para evitar la corrosión de éstos
a causa de la base y el ácido.
Se hizo una solución agarosa 1 % (p/v) en buffer de equilibrio, para lo cual se
calentó la solución para derretir la agarosa, cuidando de que ésta no saltase en el
proceso.
Se comprobó que el gel concentrador había gelificado, si al ladear el sándwich de
vidrios sólo se movía el agua, y luego se eliminó el agua. Acto seguido, se colocó la
solución agarosa 1 % (p/v) en buffer de equilibrio sobre el gel concentrador, llenando
hasta la mitad del biselado del vidrio y se esperó su gelificación. Una vez gelificado, se
procedió a sacar los geles cilíndricos contenidos dentro de los tubos. Primero, se soltó
el gel, agregando agua en ambos extremos con una jeringa de 20 ml con agua
desionizada o MilliQ, para ello se colocó la aguja junto al gel sin penetrarlo. Esto
provocó que el gel se soltase y saliera un poco del tubo, luego se usó una jeringa de 60
ml con agua desionizada, que en vez de aguja contaba un pequeño tubo de goma cuyo
diámetro interior era igual al diámetro exterior del tubo para poder conectarlo a éste.
Una vez conectados, se ejerció presión cuidadosamente y a medida que fue saliendo el
gel se fue depositando a lo largo de una espátula acanalada. Cuando el gel estaba por
salir completamente del tubo, la presión ejercida en el émbolo de la jeringa fue mucho
menor o nula para evitar que el gel saliera sorpresivamente del tubo y fuese arrojado
fuera de la espátula. Una vez que recuperado el gel, se pudo observar que el extremo
74
expuesto al NaOH presentaba un estrangulamiento que es una forma de reconocer el
sentido de la corrida del gel ya que el pH básico se encontrará en este extremo.
Se eliminó el agua que cubría el gel cilíndrico sobre la espátula, para ello se ladeó
la espátula hacia uno de sus costados, controlando de no botar el gel. Se colocó el gel
dentro del biselado sobre la agarosa 1 % (p/v) en buffer de equilibrio colocada
previamente.
Se agregó buffer de equilibrio sobre el gel para ser incubado por una hora. Pasado
este tiempo, se retiró el buffer de equilibrio con una micropipeta cuidadosamente para
no romper el gel. Sobre el gel, se colocó agarosa 1 % (p/v) en buffer de equilibrio con
un poco de azul de bromofenol. Esto evitaría que el gel flotase al agregar el buffer de
corrida, y el colorante permitiría ver el avance de la muestra.
Se debe sacó el separador colocado en la parte inferior del sándwich de vidrios,
para permitir el paso de la corriente durante la electroforesis. Posteriormente, se colocó
el sándwich de vidrios en la cámara de electroforesis de la segunda dimensión con el
vidrio con bolsillo y biselado hacia el compartimiento superior de la cámara para permitir
que el buffer de corrida se vertiera sobre el gel.
Se colocó el buffer de corrida en el compartimiento superior e inferior de la
cámara, prefiriendo el uso de buffer recién preparado en el compartimiento superior. Si
se formaban burbujas en el espacio que dejó separador que se retiró se debían
eliminar, usando cuidadosamente una jeringa con aguja doblada para pasarla entre los
vidrios.
En el compartimiento superior, se colocó el electrodo negativo y en el inferior, el
positivo. De tal forma que las proteínas que están cargadas negativamente por la acción
del SDS, se desplazasen desde cátodo al ánodo para ser separadas por su peso
molecular.
Se conectó los electrodos a la fuente de poder la cual fue programada a 50 V por
15 horas (750 V-hora), dejando esta etapa del procedimiento preferentemente durante
la noche. Considerando que 750 V-hora es equivalente a realizar una electroforesis a
75
150 V por 5 horas, podría también realizarse por 5 horas en vez de esperar toda la
noche.
Una vez transcurrido el tiempo de corrida, se apagó la fuente de poder, se
desconectó los electrodos, se botó el buffer de corrida y se sacó los sándwiches de
vidrios. Para sacar el gel desde el sándwich de vidrios, se utilizó una espátula para
hacer palanca en el extremo inferior del sándwich. De esta forma, el gel quedó
recostado sobre uno de los vidrios y se procedió a marcar el extremo donde se cargó la
muestra de la primera dimensión, cortando un cuadradito en el extremo inferior del gel
correspondiente. Esta zona estará manchada con azul bromofenol, por lo que no habrá
riesgo de la existencia de proteínas en dicho lugar.
Al marcar el gel, se pudo recordar el sentido del gradiente de pH a lo largo del eje
X del gel bidimensional ya que la marca estaría en el extremo de menor pH del
gradiente (pH 3).
Al sacar el gel, el gel concentrador se separó del de corrida, como también el gel
cilíndrico y la agarosa. Luego, se procedió a teñir el gel de corrida.
F. Estimación de puntos isoeléctricos y pesos moleculares
F.1. Estimación de peso molecular
PM en gel de expresión proteica en azufre
Para el gel de la expresión de proteínas en azufre (Figura 13) se usó como
referencia el marcador de peso molecular pre-teñido (tabla 10) de la Figura 22. Se
graficó la variación del peso molecular de las bandas del marcador pre-teñido con
respecto a la distancia del Eje Y como se muestra en la Figura 23, obteniéndose la
ecuación [7].
76
Figura 22: 30 µg de marcador de peso molecular cuya electroforesis se realizó junto con
la segunda electroforesis de los geles de la expresión proteica de S. metallicus en
azufre y calcopirita pre-teñidos con Coomassie Blue R-250 y posteriormente teñidos con
plata.
)2485,0(5772,7 YxExpPM ×= [7]
PM= peso molecular
Y=distancia migrada en Eje Y
De esta forma, se obtuvo el peso molecular para el gel de la expresión proteica de
S. metallicus en azufre de acuerdo a la ecuación [7]. Los pesos moleculares de las
bandas se muestran en tabla 3.
Tabla 10: Pesos moleculares conocidos de marcador pre-teñido Fermentas con
respecto a su posición en el eje Y
Proteína estándar Peso molecular (kDa)
Coordenada Y (cm)
β-galactosidasa 117 10,9
Albúmina sérica bovina 85 9,8
Ovalbúmina 49 7,5
Anhidrasa carbónica 34 6,1
β-lactoglobulina 25 5
Lisozima 19 3,5
77
y = 7,5772e0,2485x
R2 = 0,9975
10
100
1000
0 2 4 6 8 10 12Distancia (cm)
Peso
Mol
ecul
ar (k
Da)
Esca
la lo
garít
mic
a
Figura 23: Curva de calibración para determinación del PM en el gel de la expresión
proteica en azufre. Se usó la línea de tendencia exponencial en un gráfico
semilogarítmico.
PM en gel de expresión proteica en calcopirita con proteínas obtenidas por molienda
Para el gel de la expresión de proteínas en calcopirita con proteínas obtenidas por
molienda, se usó como referencia el marcador de peso molecular que se corrió en el
mismo gel en la electroforesis de segunda dimensión (Figura 15). Se graficó la variación
del peso molecular de las bandas del marcador pre-teñido Fermentas (Figura 24) con
respecto a la distancia del Eje Y, obteniéndose la ecuación [8].
)2372,0(8939,7 YxExpPM ×= [8]
PM= peso molecular
Y=distancia migrada en Eje Y
De esta forma, se obtuvo el peso molecular para el gel de la expresión proteica de
S. metallicus en calcopirita con proteínas obtenidas por molienda de acuerdo a la
ecuación [8]. Los pesos moleculares de las bandas se muestran en la tabla 5.
78
Tabla 11: Pesos moleculares conocidos de las bandas del marcador con respecto a su
posición en el eje Y
y = 7,8939e0,2372x
R2 = 0,9914
10
100
1000
0 2 4 6 8 10 12
Distancia (cm)
Peso
mol
ecul
ar (k
Da)
Esca
la L
ogar
ítmic
a
Figura 24: Curva de calibración para determinación del PM en el gel de la expresión de
proteínas en calcopirita con proteínas obtenidas por molienda. Se usó la línea de
tendencia exponencial en un gráfico semilogarítmico.
PM en gel de expresión proteica en calcopirita con proteínas obtenidas por sonicación
Para el gel de la expresión de proteínas en calcopirita con proteínas obtenidas por
sonicación (Figura 14), se usó como referencia las coordenadas de algunas bandas del
Proteína estándar
Peso Molecular (kDa)
Distancia migrada (cm)
β-galactosidasa 117 11 Albúmina sérica bovina 85 10,3 Ovalbúmina 49 7,7 Anhidrasa carbónica 34 6,3 β-lactoglobulina 25 5,1 Lisozima 19 3,4
79
gel de la expresión de proteínas en calcopirita con proteínas obtenidas por molienda
(Tabla 12). Se graficó la variación del peso molecular de algunas bandas del gel en
calcopirita con proteínas obtenidas por molienda (Figura 25) con respecto a la distancia
del Eje Y, obteniéndose la ecuación [9].
)2317,0(2176,8 YxExpPM ×= [9]
PM= peso molecular
Y=distancia migrada en Eje Y
De esta forma, se obtuvo el peso molecular para el gel de la expresión proteica de
S. metallicus en calcopirita con proteínas obtenidas por sonicación de acuerdo a
ecuación [9]. Los pesos moleculares de las bandas se muestran en la tabla 4.
Tabla 12: Referencia de peso molecular usando bandas de gel de calcopirita de
proteínas obtenidas por molienda
Banda Peso Molecular (kDa)
Coordenada Y (cm)
P21 11,9 1,6
P9 12,5 1,8
P17 15 2,6
P1 21,7 4,2
P10 47,6 7,6
80
y = 8,2176e0,2317x
R2 = 1
10
100
0 2 4 6 8 10Distancia (cm)
Peso
mol
ecul
ar (k
Da)
Esc
ala
Loga
rítm
ica
Figura 25: Curva de calibración para determinación del PM en el gel de la expresión de
proteínas en calcopirita con proteínas obtenidas por sonicación. Se usó la línea de
tendencia exponencial en un gráfico semilogarítmico.
F.2. Estimación de punto isoeléctrico
pI en gel de expresión proteica en azufre y calcopirita con proteínas obtenidas por
sonicación
Se usó una foto del marcador de punto isoeléctrico Amersham Biosciences
(Figura 26), para graficar el punto isoeléctrico de las proteínas estándar con respecto la
distancia entre las bandas (tabla 13), considerando el largo del gel (11,5 cm) y el rango
de pI relacionado con los anfolitos usados (3,5 – 9,5 aprox.). En consecuencia, se
obtuvo el gráfico de la Figura 27 y luego la ecuación [10].
6703,34975,0 +×= XpI [10]
pI= punto isoeléctrico
X= distancia migrada en Eje X
De esta forma, se obtuvo el punto isoeléctrico para los geles de la expresión
proteica de S. metallicus en azufre y en calcopirita con proteínas obtenidas por
sonicación. Los puntos isoeléctricos se muestran en las tablas 3 y 4, respectivamente.
81
Tabla 13: Relación de distancia migrada y pI de proteínas del marcador de pI.
Coordenada X (cm)
pI
0,2 3,5
1,7 4,55
2,5 5,2
4,2 5,85
5,9 6,55
6,4 6,85
7,4 7,35
9 8,15
9,7 8,45
10,2 8,65
11,2 9,3
Figura 26: Marcador de punto isoeléctrico de rango amplio (Amersham Biosciences)
82
y = 0,4975x + 3,6703R2 = 0,9947
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Distancia (cm)
pI
Figura 27: Curva de calibración para la determinación del pI en los geles de la
expresión en azufre y calcopirita de proteínas obtenidas por sonicación.
pI en gel de expresión proteica en calcopirita con proteínas obtenidas por molienda
Se usó como referencia la escala de la tabla de punto isoeléctrico, pero se
desplazó dado que el gel de primera dimensión se estiró, y 1,8 cm del extremo ácido
del gel de primera dimensión se perdió. Se procedió entonces a desplazar la escala 1,8
cm a lo largo del Eje X y se obtuvo el grafico de la Figura 28 y la ecuación [11] para
calcular el punto isoeléctrico.
5657,44975,0 +×= XpI [11]
pI= punto isoeléctrico
X= distancia migrada en Eje X
De esta forma, se obtuvo el punto isoeléctrico para los geles de la expresión
proteica de S. metallicus en calcopirita con proteínas obtenidas por molienda con perlas
de vidrio. Los puntos isoeléctricos se muestran en tabla 5.
83
y = 0,4975x + 4,5657R2 = 0,9947
55,5
66,5
77,5
88,5
99,510
0 2 4 6 8 10Distancia (cm)
pI
Figura 28: Curva de calibración para la determinación del pI en gel de la expresión en
calcopirita de proteínas obtenidas por molienda.
