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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUIMÍCA
PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DE GRASA DE RES POR VÍA ENZIMÁTICA
TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO
AUTOR: ANDREA GISSELLE CASTELLANOS BECERRA
TUTORA: ING. LORENA ELIZABETH VILLARREAL VILLOTA, M. Sc.
QUITO
2015
iii
APROBACION DEL TUTOR
Certifico que el trabajo de grado titulado: “PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR
DE GRASA DE RES POR VÍA ENZIMÁTICA”, es original y ha sido desarrollada por la Srta.
Andrea Gisselle Castellanos Becerra, bajo mi dirección y conforme a todas las observaciones
realizadas.
En la ciudad de Quito, a los 27 días del mes de Febrero de 2015
iv
AUTORIZACION DE LA AUTORIA INTELECTUAL
Yo, ANDREA GISSELLE CASTELLANOS BECERRA en calidad de autor del trabajo
de grado realizado sobre PRODUCCION DE BIODIESEL A PARTIR DE GRASA DE
RES POR VIA ENZIMATICA, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD
CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o
de parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
En la ciudad de Quito a los 27 días del mes febrero de 2015
v
Con todo mi amor a mi madre Lucía,
a mis abuelos Hernando y Gloria,
a toda mi familia
vi
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Central del Ecuador por ser el establecimiento que abriga un gran
conocimiento y cultura donde generaciones de profesionales se han formado. A la muy querida
Facultad de Ingeniería Química donde he obtenido todos los conocimientos necesarios para mi
formación profesional.
A la Ing. Lorena Villarreal por su generosa y paciente colaboración el la realización de este
trabajo y los conocimientos compartidos.
A la empresa Granotec por la gentil donación de las enzimas necesarias para los ensayos
realizados en esta tesis.
A mi familia, por su incondicional apoyo en todas las etapas de este gran proyecto, en especial a
mi madre, pilar fundamental que me ha guiado y alentado en cada emprendimiento, sin su
paciencia y entrega nada de esto seria posible.
A David por su paciencia y comprensión durante este viaje, por iluminar mis días y siempre
estar ahí para mi.
A todos mis compañeros y amigos que me apoyaron durante todo el curso de mis estudios.
vii
CONTENIDO
pág.
LISTA DE TABLAS .................................................................................................................... xi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xii
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................................. xiii
RESUMEN ................................................................................................................................. xiv
ABSTRACT ................................................................................................................................ xv
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
1. MARCO TEORICO .............................................................................................................. 3
1.1. Biodiesel ............................................................................................................................ 3
1.1.1. Definición. ........................................................................................................................... 3
1.1.2. Características. ................................................................................................................... 3
1.1.3. Requisitos. ........................................................................................................................... 4
1.1.4. Antecedentes del uso del biodiesel. ..................................................................................... 5
1.1.5. Demanda de Biodiesel en el Ecuador. ................................................................................ 5
1.1.6. Producción de Biodiesel. ..................................................................................................... 5
1.1.7. Materias primas utilizadas para la elaboración de biodiesel. ............................................ 5
1.2. Grasa de Res ........................................................................................................................... 7
1.2.1. Características. ................................................................................................................... 7
1.2.2. Composición teórica. .......................................................................................................... 7
1.2.3. Fundamentos del análisis físico químico de la grasa de res. .............................................. 8
1.3. Combustibles de primera, segunda y tercera generación. ...................................................... 9
1.4. Tecnologías para obtención de biodiesel.............................................................................. 10
1.4.1. Micro emulsiones. ............................................................................................................. 10
1.4.2. Pirólisis. ............................................................................................................................ 10
1.4.3. Transesterificación. ........................................................................................................... 11
1.4.3.1. Transesterificación química. .......................................................................................... 12
1.4.3.2. Transesterificación enzimática. ..................................................................................... 13
viii
1.4.3.3. Uso de co-solvente. ........................................................................................................ 13
1.4.3.4. Condiciones de operación supercríticas. ....................................................................... 13
1.4.3.5. Método de reacción ultrasónica. .................................................................................... 13
1.4.3.6. Método de microondas. .................................................................................................. 14
1.5. Variables que afectan la transesterificación ......................................................................... 14
1.5.1. Relación molar alcohol – grasa. ....................................................................................... 14
1.5.2. Temperatura. ..................................................................................................................... 14
1.5.3. pH. ..................................................................................................................................... 15
1.5.4.Tipo de alcohol. .................................................................................................................. 15
1.5.5. Uso de solvente. ................................................................................................................ 15
1.5.6. Contenido de agua. ........................................................................................................... 15
1.5.7. Desactivación enzimática por alcohol. ............................................................................. 16
1.6. Enzimas ................................................................................................................................ 16
1.7. Lipasas .................................................................................................................................. 17
1.7.1. Lipasas vegetales............................................................................................................... 17
1.7.2. Lipasas de microorganismos. ............................................................................................ 18
1.7.2.1. Lipasa Extracelular. ....................................................................................................... 18
1.7.2.2. Lipasa Intracelular. ........................................................................................................ 18
1.7.3.Selectividad de las lipasas. ................................................................................................. 18
1.7.4. La lipasa de Rhizopus oryzae. ........................................................................................... 19
1.8. Reactores para la transesterificación enzimática. ................................................................. 20
1.9. Glicerol ................................................................................................................................. 20
1.10. Espectroscopia infrarroja .................................................................................................... 21
1.11. Cromatografía de gases ...................................................................................................... 22
1.12. Diseño factorial .................................................................................................................. 23
1.12.1. Diseño factorial 2k. ......................................................................................................... 23
1.12.2. Metodología de superficie de respuesta. ......................................................................... 24
2. MARCO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 26
2.1. Materiales y equipos............................................................................................................. 26
2.2. Sustancias y reactivos........................................................................................................... 27
2.3. Diagrama de Flujo ................................................................................................................ 27
2.4. Caracterización de la grasa de res ........................................................................................ 29
2.5. Extracción de la grasa de res ................................................................................................ 29
2.6. Preparación de la solución de enzima .................................................................................. 29
2.7. Obtención del biodiesel ........................................................................................................ 29
ix
2.8. Separación del biodiesel ....................................................................................................... 29
2.9. Diseño experimental ............................................................................................................. 30
2.10. Influencia de la cantidad de agua en la reacción de transesterificación ............................. 31
2.11. Espectroscopía infrarroja .................................................................................................... 32
2.12. Cromatografía de gases ...................................................................................................... 32
3. DATOS ............................................................................................................................... 33
3.1. Extracción de la grasa de res ................................................................................................ 33
3.2. Rendimiento de biodiesel ..................................................................................................... 33
4. CALCULOS ............................................................................................................................ 36
4.1. Extracción de la grasa de res ................................................................................................ 36
4.2. Rendimiento de biodiesel ..................................................................................................... 36
4.2.1. Cálculo modelo para N=1 usando metanol. ...................................................................... 37
5. RESULTADOS ....................................................................................................................... 38
5.1. Extracción de la grasa de res ................................................................................................ 38
5.2. Caracterización de la grasa de res ........................................................................................ 38
5.3. Rendimiento de biodiesel ..................................................................................................... 40
5.4. Caracterización del Biodiesel ............................................................................................... 43
5.4.1 Espectroscopía infrarroja. ................................................................................................. 43
5.4.2. Cromatografía de gases. ................................................................................................... 44
5.5 Análisis Estadístico ............................................................................................................... 46
5.5.1. Regresión múltiple de los datos obtenidos. ....................................................................... 46
5.5.1.1. Regresión múltiple para la reacción usando metanol. ................................................... 47
5.5.1.2. Regresión múltiple para la reacción usando etanol. ..................................................... 48
5.6. Optimización del método ..................................................................................................... 49
5.6.1. Optimización del método para la reacción con metanol................................................... 49
5.6.2. Optimización del método para la reacción con etanol. .................................................... 52
6. DISCUSION ........................................................................................................................... 55
6.1. Extracción de grasa de res .................................................................................................... 55
6.2. Caracterización de la grasa de res ........................................................................................ 55
6.3. Obtención de Biodiesel ........................................................................................................ 56
6.4. Rendimiento de Biodiesel .................................................................................................... 57
6.5. Análisis estadístico ............................................................................................................... 57
x
6.6. Optimización del método ..................................................................................................... 58
7. CONCLUSIONES .................................................................................................................. 59
7.1. Extracción de grasa de res .................................................................................................... 59
7.2. Caracterización de la grasa de res ........................................................................................ 59
7.3. Obtención de Biodiesel ........................................................................................................ 59
7.4. Caracterización del biodiesel ............................................................................................... 60
7.5 Rendimiento de Biodiesel ..................................................................................................... 60
7.6. Análisis estadístico ............................................................................................................... 60
7.7. Optimización del método ..................................................................................................... 61
8. RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 62
8.1. Extracción de grasa de res .................................................................................................... 62
8.2. Obtención de Biodiesel ........................................................................................................ 62
8.3. Rendimiento de Biodiesel .................................................................................................... 63
CITAS BIBLIOGRAFICAS ....................................................................................................... 64
BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................... 69
ANEXOS..................................................................................................................................... 70
xi
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Requisitos para Biodiesel: norma ASTM D6751 ........................................................................ 4
Tabla 2. Composición teórica de la grasa de res ........................................................................................... 8
Tabla 3. Fundamentos del análisis físico químico ....................................................................................... 9
Tabla 4. Factores constantes del proceso ...................................................................................................... 31
Tabla 5. Datos Experimentales generados en Statgraphics ..................................................................... 31
Tabla 6. Datos experimentales de la extracción de la grasa de res ....................................................... 33
Tabla 7. Peso de biodiesel obtenido ................................................................................................................ 34
Tabla 8. Pesos moleculares ................................................................................................................................ 34
Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de biodiesel usando diferentes proporciones de agua ........... 35
Tabla 10. Porcentaje de Rendimiento de la extracción de la grasa de res .......................................... 38
Tabla 11. Propiedades Fisicoquímicas de la Grasa de Res ...................................................................... 39
Tabla 12. Perfil Lipídico de la Grasa de Res ............................................................................................... 40
Tabla 13. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel ................................................................................... 41
Tabla 14. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel variando la proporción de agua ...................... 42
Tabla 15. Regresión múltiple para la reacción usando metanol ............................................................. 47
Tabla 16. Regresión múltiple para la reacción usando etanol ................................................................ 48
Tabla 17. Variables respuesta a ser medidas ................................................................................................ 49
Tabla 18. Factores experimentales que van a variar .................................................................................. 49
Tabla 19. Selección del diseño experimental ............................................................................................... 49
Tabla 20. Modelo a ajustar a los resultados del experimento ................................................................. 49
Tabla 21. Factores establecidos y Óptimo para la reacción con metanol ........................................... 50
Tabla 22. Factores establecidos y Óptimo para la reacción con etanol ............................................... 52
xii
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Reacción de transesterificación de un aceite con alcohol. .................................................... 11
Figura 2. Esquema ilustrativo de la concentración de componentes durante la
transesterificación. ................................................................................................................................................ 12
Figura 3. Representación tridimensional de la lipasa de Rhizopus oryzae. ....................................... 19
Figura 4. Diagrama de bloques de un espectrómetro infrarrojo de transformadas de
Fourier de haz simple. ......................................................................................................................................... 22
Figura 5. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de gases típico .................................................... 23
Figura 6. Representación del diseño factorial 22 ....................................................................................... 24
Figura 7. Representación y construcción del diseño de composición central para
k=2 factores ............................................................................................................................................................ 25
Figura 8. Diagrama de Flujo del proceso de transesterificación enzimática ...................................... 28
Figura 9. Diagrama de Bloque .......................................................................................................................... 30
Figura: 10. Cromatograma correspondiente al perfil lipídico de la grasa de res .............................. 39
Figura 11. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de Biodiesel ............................... 42
Figura 12. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de biodiesel
usando diferentes proporciones de agua ........................................................................................................ 43
Figura 13. Espectrograma del Biodiesel obtenido ...................................................................................... 44
Figura 14. Espectrograma del Diesel de petróleo ....................................................................................... 44
Figura 15. Cromatografía de gases de la grasa de res ............................................................................... 45
Figura 16. Cromatografía de Gases del Biodiesel ...................................................................................... 46
Figura 17. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con
metanol ..................................................................................................................................................................... 50
Figura 18. Superficie de respuesta estimada de la reacción con metanol ........................................... 51
Figura 19. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con
metanol ..................................................................................................................................................................... 52
Figura 20. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol ....... 53
Figura 21. Superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol ............................................... 53
Figura 22. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol ................ 54
xiii
LISTA DE ANEXOS
pág.
ANEXO A. Hoja Técnica de la Enzima de Rhizopus Oryzae .................................................71
ANEXO B. Resultados del Análisis Fisicoquímico de la grasa de res ....................................73
ANEXO C. Resultados del índice de yodo de la grasa de res ..................................................74
ANEXO D. Resultados del perfil lipídico de la grasa de res ...................................................75
ANEXO E. Reporte fotográfico ...............................................................................................77
xiv
PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DE GRASA DE RES POR VÍA
ENZIMÁTICA
RESUMEN
Obtención de biodiesel a partir de grasa de res, usando, como biocatalizador una solución de
lipasa de Rhizopus Oryzae, hexano como solvente para a mejorar la solubilidad del alcohol con
los demás componentes de la reacción y dos tipos de alcohol: etanol y metanol.
Se utilizó un diseño factorial 22, en donde las variables evaluadas fueron: la cantidad de enzima
y la temperatura, en 10 pares experimentales. La temperatura varió de 32,76°C a 41,2°C y la
cantidad de enzima de 1,95% a 10% en peso. Usando el software Statgraphics se obtuvieron las
condiciones óptimas de operación para cada alcohol, siendo el metanol el que proporcionó la
mayor conversión. Con las condiciones óptimas se hicieron nuevos ensayos con metanol,
variando la concentración de agua de la solución: 0%, 30%, 50% y 70%. Se realizaron análisis
de espectroscopia infrarroja y cromatografía de gases al biodiesel para determinar
cualitativamente la presencia de esteres en el mismo.
El mejor rendimiento de la experimentación fue del 71,34%, utilizando alcohol metílico, a 37°C
y 0,85 g de enzima y las condiciones óptimas de operación calculadas mediante el programa
estadístico fueron usando metanol; 0,60 g de enzima y a 39°C.
PALABRAS CLAVE: GRASA DE RES / LIPASAS / RHIZOPUS ORYZAE
/TRANSESTERIFICACIÓN ENZIMÁTICA/ BIODIESEL/OPTIMIZACIÓN/AGUA/
xv
THE PRODUCTION OF BIODIESEL FROM LIVESTOCK FAT THROUGH
ENZYMATIC CHANNELING
ABSTRACT
This research project considers the extraction of biodiesel from livestock fat, using lipase
solution called Rhizopus Oryzae as a biocatalyst, a solvent hexane un order to improve the
alcohol’s solubility with the rest of the reacting components, and two types of alcohol: ethane
and methane.
A 22 factorial design was employed, where the variables being assessed were: the quantity of
enzyme and temperature, down in 10 experimental pairs. The temperature varied from 32,76°C
to 41,2°C, and the amount of enzyme varied from 1,95% to 10% in weight. Using Statgraphics
software, the optimal operating conditions were obtained for each alcohol, methane being the
one that provide a higher level of conversion. New test were performed with methane in optimal
conditions, varying the concentration of water in the solution: 0%, 30%, 50% and 70%. Infrared
spectroscopy and chromatography of gas to biodiesel were analyzed in order to qualitatively
determine the presence of esters.
The best result of the experiment was 71,34%, using methylated spirits at 37°C and 0,85 g of
enzyme, and the optimal operating conditions calculated by a statistic program were with
methane: 0,60 g of enzyme at 39°C.
KEY WORDS: /LIVESTOCK FAT / LIPASES / RHIZOPUS ORYZAE
/TRANSESTERIFICATION/ ENZYMES/ BIODIESEL/OPTIMIZATION/
1
INTRODUCCIÓN
En la actualidad, la dependencia de los combustibles fósiles representa un gran problema para el
planeta en cuanto a contaminación y a la limitada cantidad de este recurso, esto hace que la
búsqueda de nuevas tecnologías para la producción de energía limpia sea una prioridad para las
nuevas generaciones de investigadores. Actualmente, aunque existen muchos trabajos sobre la
producción de biodiesel a través de diferentes procesos, la elaboración de este producto a nivel
industrial aun necesita mejorarse. Este es un campo que requiere mucha investigación para
poder obtener biodiesel de manera sostenible, aprovechando de ser posible desechos de otras
industrias y causando el menor impacto ambiental.
El producir biodiesel proveniente de grasa de res tiene algunas ventajas sobre las fuentes
tradicionales de triglicéridos como los aceites vegetales. La grasa de res es un recurso que
generalmente es descartado sin darle un uso posterior, está disponible todo el año y cada vez en
mayor cantidad por la creciente demanda de cárnicos. Al no constituir una fuente de alimento
para los humanos, no se vulnera la seguridad alimentaria.
El uso de enzimas tiene algunas ventajas sobre los procesos que usan catalizadores
homogéneos, la principal es que el desperdicio del agua es mínimo en contraste con la
transesterificación homogénea que necesita gran cantidad de agua para eliminar el catalizador
del biodiesel.
El objetivo del trabajo es obtener biodiesel mediante transesterificación por vía enzimática,
usando grasa de res como fuente de triglicéridos y lipasa de Rhizopus Oryzae como catalizador.
Analizar el uso de alcohol etílico y metílico como reactivos; buscar las condiciones de
temperatura y cantidad de enzima que proporciona el mejor rendimiento de la reacción de
transesterificación; finalmente determinar la influencia que tiene el agua sobre el rendimiento de
la reacción.
Previo a obtener el biodiesel por vía enzimática, se realizó la caracterización de la grasa, esto se
hizo determinando propiedades como: densidad, índice de refracción, índice de yodo, índice de
peróxido, índice de saponificación, índice de acidez y perfil lipídico. Con el fin de encontrar la
mejor condición de operación, se utilizó un modelo factorial 22, tomando como factores la
2
cantidad de enzima y la temperatura, manteniendo constante el resto de variables: tiempo de
reacción, pH, cantidad de alcohol, solvente y grasa. Cada ensayo se hizo usando primero
alcohol etílico y luego alcohol metílico. Para el análisis de los datos se empleó el método de
superficie de respuesta y con la ayuda del programa Statgraphics se encontró la condición de
operación que proporciona el mejor porcentaje de conversión de triglicéridos a ésteres de ácidos
grasos.
Finalmente se planteó el estudio de la influencia del agua en la reacción. Una vez obtenida la
mejor condición de operación, se adicionó agua en distintas proporciones, de 0% a 70%, para
establecer la cantidad agua que brinda una mayor conversión. Con el uso de la espectroscopia
infrarroja y cromatografía de gases se determinó que, en efecto, la sustancia resultante del
proceso al cual fue sujeta la grasa de res, es biodiesel.
Se puede afirmar que es posible obtener biodiesel por vía enzimática con los recursos
disponibles en el país. Es un proceso que si bien es amigable con el medio ambiente y puede ser
aplicado a grasas con alto contenido de ácidos grasos libres tarda mucho tiempo en realizarse y
aún debe resolver algunos problemas para poder ser llevado a escala industrial.
3
1. MARCO TEORICO
1.1. Biodiesel
1.1.1. Definición. Según la norma ecuatoriana INEN 2482:2009, se define al biodiesel como
una mezcla de ésteres monoalquílicos de ácidos grasos, de cadena larga y media, derivados de
aceites vegetales o grasas animales [1]. Este combustible puede ser utilizado en motores de
ignición con pocas modificaciones. La técnica más utilizada para producir biodiesel es la
transesterificación, esta reacción se puede llevar a cabo con distintos tipos de catalizadores y
condiciones de operación variadas [2]. Dependiendo del alcohol que se utilice, metanol o etanol,
la mezcla será de ésteres metílicos o etílicos respectivamente [3].
1.1.2. Características. El biodiesel es una fuente de energía limpia muy importante y una
alternativa al diésel de petróleo. Algunas de las ventajas de este combustible son su fácil
transportación por su alto punto de inflamación, siendo éste de alrededor 130°C frente al del
diesel que es de aproximadamente 60°C, el contenido de oxígeno es del 10 al 11% en masa lo
que ayuda a la combustión, presenta mejores propiedades lubricantes que el diésel generando
menos partículas de desgaste, posee un bajo contenido de aromáticos y azufre, alta eficiencia de
combustión y número de cetano mayor que el diésel, además es biodegradable y no tóxico.
Las desventajas del biodiesel son su alto precio, mayor viscosidad, menor contenido energético
que los derivados de petróleo, altos puntos de nube y vertido, mayor emisión de óxidos de
nitrógeno, produce una baja potencia y velocidad del motor, al ser un compuesto orgánico
puede absorber hasta 40 veces más agua que el diésel lo que genera oxidación en el sistema de
inyección, aumenta la conductividad eléctrica del combustible y puede crear un medio para la
proliferación de microorganismos, esto ocasiona corrosión y taponamientos [4].
La combustión del biodiesel produce gases que son menos nocivos para la salud, en
comparación con los derivados de petróleo, las emisiones de monóxido de carbono,
hidrocarburos no combustionados, sulfatos, material particulado, aromáticos policíclicos y
policíclicos nitrogenados son significativamente menores [5].
4
1.1.3. Requisitos. Existe una variedad de normas internacionales a partir de las cuales se rigen
distintos países del mundo para normalizar sus prácticas y productos, unas de las más conocidas
y aceptadas son las normas ASTM. En éste trabajo se tomará en cuanta estas normas como guía
en cuanto a los requisitos del biodiesel. La Tabla 1 muestra los requisitos para el biodiesel
según la norma ASTM D6752.
Tabla 1. Requisitos para Biodiesel: norma ASTM D6751
Fuente: st n y oan-Adrian (2011). Biodiesel Quality, Standards and
Properties, Biodiesel- Quality, Emissions and By-Products. Disponible en: http://www.intechopen.com/
books/biodiesel-quality-emissions-and-by-products/biodiesel-quality-standards-and-properties, p7.
Propiedad Método de
ensayo
Limites Unidades
min. máx.
Calcio y Magnesio, combinados EN 14538 – 5 ppm
(μg/g)
Punto de Inflamación (copa cerrada) D 93 93 – °C
Control de Alcohol (una debe coincidir):
1. Contenido de Metanol EN 14110 – 0.2 % (m/m)
2. Punto de Inflamación D93 130 – °C
Agua y Sedimentos D 2709 – 0.05 % (v/v)
Viscosidad Cinemática, a 40 °C D 445 1.9 6.0 mm2/sec.
Ceniza Sulfatada D 874 – 0.02 % (m/m)
Azufre: S Grado 15 D 5453 – 0.0015 % (m/m)
S Grado 500 D 5453 – 0.05 % (m/m)
Corrosión a la Lámina de Cobre D 130 – 3 No.
Cetano D 613 47 – –
Punto de Nube D 2500 reportar °C
Residuo de Carbón , 100% de la muestra D 4530 – 0.05 % (m/m)
Número de Acidez D 664 – 0.05 mg KOH/g
Glicerina Libre D 6584 – 0.020 % (m/m)
Glicerina Total D 6584 – 0.240 % (m/m)
Contenido de Fósforo D 4951 – 0.001 % (m/m)
Destilación Atmosférica equivalente
a la temperatura del 90% de recuperado D 1160 – 360 °C
Sodio/Potasio, combinados EN 14538 – 5 ppm
(μg/g)
Estabilidad de oxidación EN 15751 – 3 horas
5
1.1.4. Antecedentes del uso del biodiesel. Desde los años 1900 se tiene registro del uso de
biodiesel como combustible, en la feria de París se presentó un motor a diésel que funcionaba
con aceite de maní. Durante las siguientes décadas, a causa del bajo costo del diésel de petróleo,
la investigación en el campo del biodiesel no tuvo adelantos significativos. El 31 de agosto de
1937, el científico de la universidad de Bruselas, G. Chavanne obtuvo una patente para el
“Procedimiento para la transformación de aceites egetales y su uso como combustibles”
(Patente Belga 422,877). Esta patente describe la alcohólisis de aceites vegetales usando etanol
para separar los ácidos grasos del glicerol, reemplazando el glicerol por cadenas cortas de
alcoholes lineales. En 1970 la crisis energética hizo que los estudios relacionados al biodiesel
aumentaran y tuvieran relevancia rápidamente. En el período entre 2001 y 2009, la producción
de biodiesel en el mundo se incrementó mas de 16 veces [6].
1.1.5. Demanda de Biodiesel en el Ecuador. En el tercer trimestre del año 2013 la demanda
de derivados del petróleo en el país llegó a 22,5 millones de barriles; de esto, el 35,3%
corresponde a la demanda de diésel, es decir, que 7,94 millones de barriles de diésel fueron
necesarios para cubrir la demanda nacional [7]. Según el Decreto Oficial número 1303 firmado
el 17 de septiembre del 2012, el Presidente de la República, estableció que a partir de esa fecha
el diésel de petróleo comercializado en el país deberá contener un 5% de biodiesel y esta mezcla
aumentará en porcentaje hasta llegar al 10% en función de la oferta nacional. Se puede afirmar
entonces que la demanda de biodiesel en una mezcla al 5% con diésel de petróleo al tercer
trimestre del año 2013 fue de aproximadamente 1,13 millones de barriles.
1.1.6. Producción de Biodiesel. En los últimos años la producción de biodiesel se ha
incrementado aceleradamente. Para el año 2011, la U.S Energy Information Administration
informó que la producción mundial de éste combustible llegó a ser de 403,74 mil barriles por
día. En el Ecuador, la empresa La Fabril desde el año 2005 ha exportado a Estados Unidos,
Alemania y Perú 16,6 millones de galones de biodiesel, perfilándose como el principal
proveedor del país. Esta empresa instaló dos plantas de producción, una en Guayaquil y otra
Montecristi con una capacidad de producción de 12000 toneladas métricas de combustible al
mes. Solo en el año 2012, La Fabril exportó 20000 toneladas de biodiesel, siendo su principal
comprador PetroPerú [8].
1.1.7. Materias primas utilizadas para la elaboración de biodiesel. Tradicionalmente el
biodiesel es producido a partir de aceite vegetal. En países desarrollados, más del 95% de
materia prima es aceite comestible ya que el biodiesel producido a partir de estos aceites tiene
propiedades más similares al diésel [9]. Sin embargo, la producción de biodiesel a partir de
6
materias primas alternativas ha ido haciéndose más notoria. Estos materiales incluyen residuos
grasos animales y aceite de fritura, siendo más utilizadas en Canadá, México e Irlanda. Este
tipo de materia prima es ideal ya que tiene la ventaja de ser más barata, considerando que
solamente el aceite vegetal representa cerca del 85% del valor total de producción de biodiesel.
Las grasas animales por naturaleza son más viscosas y la mayoría sólidas a temperatura
ambiente. Con la transesterificación se obtiene biodiesel con un número de cetano más alto y
contenido calórico cercano al del diésel, el contenido de oxígeno mejora la combustión y la
relación aire/combustible es menor. Esta materia prima resuelve muchos conflictos relacionados
con la seguridad alimentaria, ya que al ser un desecho, ésta no se vería vulnerada [10]. La
síntesis de biodiesel a partir de aceite de algas se ha vuelto un tema de investigación muy
difundido al ser materia prima barata con una tasa de crecimiento y productividad elevadas. El
contenido de aceite en las algas oscila entre 20 y 40 %. Toleran la baja calidad del agua y
necesitan un espacio reducido para crecer. Aún así, la inversión tecnológica que se debe hacer
para la optimización del cultivo y extracción del aceite aún es elevada [11].
En el Ecuador, para la producción de biodiesel se utiliza principalmente aceite de palma. Existe
un excedente de producción de palma que sirve para la elaboración de este combustible. Según
la Fundación de Fomento de Exportaciones de Aceite de Palma y sus Derivados de Origen
Nacional (Fedepal), en el 2012 se produjeron 480 000 toneladas métricas, con un excedente de
270 000 toneladas; casi 100 000 más que el 2010, lo que da una tendencia al alza [12]. La
mayoría de materias primas para la producción de biodiesel pueden dividirse en las siguientes
categorías:
a) Aceites vegetales comestibles: girasol, soya, colza, palma, canola, coco, maní, mostaza,
salvado de arroz, etc.
b) Aceites vegetales no comestibles: piñón, micro algas, cártamo y linaza, etc.
c) Aceites residuales reciclados: aceite residual de fritura y aceite residual acidificado.
d) Grasas animales: grasa de matadero de animales, sebo de res, manteca de cerdo, grasa de
cordero, grasa de animales de corral, grasa de pollo, sebo de pato, etc. [13]
e) Aceites de microorganismos: Chlorela vulgaris, Botryococcus braunii, Chlorela
pyrenoidosa, etc [14].
7
1.2. Grasa de Res
La grasa de res se emplea ampliamente en margarinas y aceite de fritura, para aportar energía en
alimento para animales y en la industria oleoquímica como fuente de ácidos, ésteres, alcoholes,
jabones, para la producción de cosméticos, productos de cuidado personal, etc.
En el Distrito Metropolitano de Quito, en el año 2013 se faenaron 71476 reses. Se considera que
en promedio una res pesa 750 kg y que entre el 6 y el 12 % del peso del animal esta constituido
por grasa, cada año se puede disponer de aproximadamente 4,8 toneladas de grasa, lo que hace
que esta sea una gran fuente de materia prima que puede ser aprovechada. El uso que se le dé
dependerá principalmente de la calidad de la grasa. La grasa de res se encuentra dividida en
diferentes categorías de acuerdo con el punto de fusión de los ácidos grasos que la componen,
su color, contenido de ácidos grasos libres y contenidos de humedad, impurezas y material
insaponificable [15].
1.2.1. Características. La gran cantidad de ésteres de glicerol saturado que tiene la grasa
hace que el punto de fusión sea mayor, lo que es una cualidad importante para aplicaciones
donde la estructura y el cuerpo del producto son importantes. La grasa de res, por su contenido
de ácidos grasos saturados muestra una estabilidad oxidativa alta, pero por tener poco o ningún
contenido antioxidante puede deteriorarse más rápidamente que materiales derivados de aceites
vegetales con puntos de fusión parecidos. La grasa de res puede ser sometida a un extenso rango
de técnicas para desarrollar su uso como producto alimenticio. Esto incluye mezcla,
hidrogenación, fraccionamiento e interesterificación. Para propósitos oleoquímicos, es
comúnmente transformada en ácidos grasos libres que pueden ser fraccionados para producir
fracciones palmíticas, esteáricas y oleicas a varios niveles de pureza [16].
1.2.2. Composición teórica. Típicamente la grasa de res contiene ácido palmítico, esteárico
y oléico. Los componentes que principalmente se encuentran en menor proporción incluyen al
ácido mirístico y ácido linoléico.
Los ácidos de cadena impar, ramificados y con insaturaciones tipo trans están también
presentes. La grasa de res contiene cantidades pequeñas de fosfolípidos (<0,07%) y tocoferoles
(0,001%), esteroles; de 94 a 140 mg/100g de grasa, son casi enteramente colesterol [17].
En la Tabla 2 se detallan las proporciones de los ácidos grasos presentes en la grasa de res.
8
Tabla 2. Composición teórica de la grasa de res
Fuente: Norma Del Codex Para Grasas Animales Especificadas, CODEX STAN 211 (1999).
Disponible en: http://www.codexalimentarius.org/standards/list-standards/es/?no_cache=1
1.2.3. Fundamentos del análisis físico químico de la grasa de res. Por medio del análisis
fisicoquímico es posible conocer las propiedades de la materia prima que se va a utilizar. La
aplicación de ensayos como la determinación de la densidad, el punto de fusión y el índice de
refracción son propiedades físicas.
El índice de acidez y saponificación indican la cantidad de ácidos grasos libres, el índice de
yodo permite conocer el grado de instauración de la muestra y el índice de peróxido el
contenido de compuestos oxigenados en ésta, los cuales son una medida de la rancidez de la
muestra. En la Tabla 3 se encuentra la definición de cada parámetro del análisis fisicoquímico.
Ácido Graso %
Caproico C 6:0
< 0,5 en total Caprílico C 8:0
Cáprico C 10:0
Láurico C 12:0
Mirístico C 14:0 2-6
Miristoléico C 14:1 0,5-1,5
Pentadecanoico C 15:0 0,2-1,0
Palmítico C 16:0 20-30
Palmitoléico C 16:1 1-5
Margárico C 17:0 0,5-2,0
Esteárico C 18:0 15-30
Oléico C 18:1 30-45
Linoléico C 18:2 1-6
Otros C 18:1-C22:0 < 1,5
9
Tabla 3. Fundamentos del análisis físico químico
1.3. Combustibles de primera, segunda y tercera generación.
Los biocombustibles que inicialmente se produjeron fueron aquellos provenientes de materia
prima alimenticia como maíz y caña de azúcar en la producción de etanol, soya y aceite de
Parámetro Definición Ref.
Densidad
Es la relación entre la masa de un volumen dado de una
sustancia a 25⁰C y la masa de un volumen igual de agua
a 25⁰C.
[18]
Punto de fusión
Es la temperatura mínima a la cual una muestra de grasa
o aceite previamente solidificada dentro de un tubo
capilar se vuelve líquida o transparente en el capilar
cerrado y se desliza en el tubo capilar abierto.
[19]
Índice de
refracción
Es la relación entre la velocidad de una luz
monocromática en el aire y su velocidad en la sustancia
considerada y es la relación entre los senos de los
ángulos de incidencia y de refracción, cuando la luz pasa
del aire a la sustancia.
[20]
Índice de
acidez
Es, en una grasa o aceite, el contenido de ácidos grasos
libres, expresado convencionalmente como gramos de
ácido oléico, laúrico o erúcico por cada 100 g de
sustancia.
[21]
Índice de yodo
Es la medida del grado medio de insaturación de ciertas
sustancias orgánicas, expresando como centigramos de
yodo absorbidos, bajo condiciones determinadas, por
cada gramo de sustancia
[22]
Índice de
peróxido
Es el número de miliequivalentes de oxígeno por
kilogramo de muestra [23]
Índice de
saponificación
Es el número de miligramos de hidróxido de potasio
requeridos para saponificar 1 gramo de grasa o aceite [24]
10
palma para la producción de biodiesel. A estos combustibles de los denominó de primera
generación. A través del impulso a la producción de biocombustibles los gobiernos pretenden
conseguir una reducción de las importaciones de derivados de petróleo, desarrollo rural,
mitigación del cambio climático y sobretodo una mayor seguridad energética. En la producción
de biocombustibles de primera generación surgieron algunos problemas como la seguridad
alimentaria e impacto en el medio ambiente.
De esto ha nacido la necesidad de producir carburantes a partir de biomasa que no esté
destinada a la alimentación y sean menos intensivos en el uso de recursos como agua y suelo,
sino que provengan de residuos agrícolas. A estos combustibles se les conoce como de segunda
generación. La materia prima para estos biocombustibles incluye residuos como cáscara de
arroz o de maíz y plantas no comestibles. Con los primeros es posible producir etanol, mientras
que de las plantas que no compiten por el suelo, como el piñón y las micro algas, se puede
obtener aceites para la producción de biodiesel [25].
Los combustibles de tercera generación son producidos a partir de materia prima modificada
genéticamente de modo que facilita los procesos subsecuentes. Los agentes de conversión
(microorganismos, algas) también son modificados genéticamente para que le proceso sea más
eficiente [26].
1.4. Tecnologías para obtención de biodiesel
1.4.1. Micro emulsiones. Una micro emulsión es una dispersión coloidal de microestructuras
de un fluido isotrópico, con un tamaño alrededor de 1 a 150 nm, que se origina
espontáneamente por dos líquidos inmiscibles entre sí. Regularmente este tipo de biodiesel es
una mezcla de aceite y un solvente orgánico como el alcohol con la ayuda de un surfactante, con
esto se logra la disminución de la viscosidad del aceite [27].
1.4.2. Pirólisis. Consiste en modificar una sustancia orgánica por medio del calor, en ocasiones
se utiliza un catalizador para este fin. La pirólisis de triglicéridos y ácidos grasos es un proceso
parecido a la obtención del diésel de petróleo y produce sustancias con características similares.
Sin embargo, los equipos y el costo energético son muy elevados [28].
11
1.4.3. Transesterificación. En la producción de biodiesel la reacción de transesterificación se
lleva a cabo entre el aceite (triglicérido) y el alcohol en presencia de un catalizador. Es una
secuencia de tres reacciones reversibles en las que el triglicérido es convertido en diglicérido y
luego el diglicérido es transformado en un monoglicérido el cual finalmente se transforma en
glicerol, tal como se muestra en las ecuaciones 1, 2 y 3. Comúnmente se utilizan alcoholes de
cadena corta como metanol o etanol [29].
1
2
3
Normalmente la transesterificación se produce utilizando un catalizador básico o ácido, el cual
está limitado por impurezas como agua y ácidos grasos libres. Otro método para la producción
de biodiesel es a través de reacciones en condiciones supercríticas, a elevadas presiones y
temperaturas que implican el uso de una gran cantidad de energía y altos costos de operación.
Un último método es la utilización de lipasas, éstas pueden realizar la esterificación de ácidos
grasos libres y la transesterificación de triglicéridos sin la formación de jabones. La principal
barrera en el uso de lipasas es su costo, pero éste puede ser reducido con la inmovilización de
las mismas para poder ser reutilizadas [30]. A continuación se muestra en la Figura 1 la reacción
global de transesterificación y la Figura 2 una gráfica del tiempo versus la composición de
ésteres, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos y glicerol durante la reacción de
transesterificación.
Figura 1. Reacción de transesterificación de un aceite con alcohol.
Fuente: Guomin Xiao and Lijing Gao (2011). First Generation Biodiesel, Biofuel Production-
Recent Developments and Prospects, Dr. Marco Aurelio Dos Santos Bernardes (Ed.), ISBN:978-
953-307-47-8-8, InTech, Disponible en: http://www.intechopen.com/books/biofuel-production-
recent-developments-and-prospects/first-generation- biodiesel. p. 47
12
Figura 2. Esquema ilustrativo de la concentración de componentes durante la
transesterificación.
Fuente: FEDDERN Vivian, et al. (2011). Animal Fat Wastes for Biodiesel Production, Biodiesel - Feedstocks and
Processing Technologies, Dr. Margarita Stoytcheva (Ed.), ISBN: 978-953-307-713-0, InTech, DOI: 10.5772/26691.
Disponible en: http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-and-processing-technologies/animal-fat-
wastes-for-biodiesel-production. p.56
1.4.3.1. Transesterificación química. Por medio de la transesterificación química se obtienen
altas conversiones de producto en tiempos de reacción cortos. Este método tiene varias
desventajas, utiliza gran cantidad de energía por realizarse la reacción a altas temperaturas,
además demanda una gran cantidad de agua ya que el catalizador debe ser retirado del producto,
el glicerol obtenido contiene impurezas de catalizador y las reacciones no deseadas como la
saponificación de aceites con un contenido elevado de ácidos grasos libres en presencia de una
base [31]. Se pueden utilizar diferentes tipos de catalizadores:
a) Catalizadores básicos homogéneos: hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio
(KOH).
b) Catalizadores ácidos homogéneos: ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl).
c) Catalizadores básicos heterogéneos: zeolitas básicas, óxidos metálicos como el óxido de
calcio (CaO) e hidrotalcitas.
d) Catalizadores ácidos heterogéneos: óxido de zirconio (ZrO2), óxido de titanio (TiO2),
óxido de estaño (SnO2), zeolitas, resinas sulfónicas de intercambio iónico [32].
13
1.4.3.2. Transesterificación enzimática. La transesterificación enzimática es un proceso que
soluciona los principales problemas que se presentan en la transesterificación química como el
desperdicio de agua en el proceso de separación del catalizador y la dificultad al separar la
glicerina. Esto hace que el costo del biodiesel aumente, así como su impacto en el medio
ambiente. La transesterificación enzimática no genera productos secundarios, la separación de
los productos es fácil, la reacción se lleva a cabo a temperaturas bajas y trabaja muy bien a
elevadas concentraciones de ácidos grasos libres e incluso si la enzima está inmovilizada puede
reutilizarse. Todas estas ventajas hacen de la transesterificación enzimática una alternativa
amigable con el ambiente y una alternativa a la transesterificación química; sin embargo, se
presentan algunos problemas al llevar este proceso a escala industrial como el alto costo de la
enzima, los tiempos largos de reacción y la desactivación de la enzima [33].
1.4.3.3. Uso de co-solvente. La reacción de transesterificación requiere entre 30 minutos y
algunas horas, dependiendo del catalizador que se use, ya que los reactivos no son miscibles
entre sí, ocasionando una limitada transferencia de masa, particularmente al inicio de la
transesterificación. Para agilitar este proceso se emplean solventes como tetrahidrofurano,
hexano y dietiléter en la mezcla con el objetivo de incrementar la solubilidad y mejorar la
transferencia de masa entre el alcohol y el aceite. Una de las desventajas de este sistema es que
el co-solvente debe ser separado del producto final por destilación, este proceso es fácil si el
punto de ebullición del alcohol y el co-solvente son bastante lejanos, dificultándose cuando los
puntos de ebullición son muy cercanos entre sí [34].
1.4.3.4. Condiciones de operación supercríticas. En condiciones supercríticas, la mezcla de
reactivos se transforma en una sola fase homogénea, lo que acelera la reacción por la ausencia
de interface de transferencia de masa que limite la reacción. La transesterificación supercrítica
es realizada en un reactor a alta presión, con calentamiento externo. La reacción ocurre durante
el período de calentamiento. La síntesis de biodiesel en condiciones supercríticas tiene la
desventaja del alto costo de los aparatos a causa de las altas temperaturas y presiones que deben
soportar, lo cual no los hace viables a escala industrial [35].
1.4.3.5. Método de reacción ultrasónica. Las ondas ultrasónicas causan que la mezcla aceite y
alcohol produzca burbujas constantemente. Esta cavitación proporciona la mezcla y el calor
necesarios para que la reacción de transesterificación se produzca. De esta manera al usar un
reactor ultrasónico para la síntesis de biodiesel, se reduce significativamente el tiempo,
separación, temperatura y energía necesaria para la reacción. Mediante esta técnica el proceso
14
de transesterificación puede realizarse en línea en lugar de utilizar el lento método de
procesamiento por lotes. Los dispositivos ultrasónicos de escala industrial permiten el
procesamiento de varios miles de barriles por día. Sin embargo, es una tecnología sumamente
costosa en la actualidad [36].
1.4.3.6. Método de microondas. A través de las microondas se reducen los tiempos de reacción
y se aumentan los rendimientos. Las microondas trabajan al mínimo nivel de las moléculas e
iones del alcohol, generando incrementos de temperatura muy rápidos que ayudan al trabajo del
catalizador. Sin embargo, la síntesis por microondas es difícil de llevar a escala industrial,
además que la penetración de las microondas en materiales absorbentes no es muy profunda y la
seguridad de los reactores es muy difícil de manejar [37].
1.5. Variables que afectan la transesterificación
1.5.1. Relación molar alcohol – grasa. La reacción de transesterificación por estequiometría se
produce bajo una relación molar alcohol:grasa de 3:1 para convertir los triglicéridos a
alquilésteres. Pero esta reacción es reversible, así que se debe adicionar un exceso de alcohol
para favorecer la formación de ésteres.
En biocatálisis se emplean relaciones menores a 4:1, porque el alcohol insoluble en el aceite
puede inactivar las enzimas [38]. Aun con la cantidad estequiométrica de alcohol, la enzima se
inhibe aunque esté inmovilizada.
Hay enzimas que soportan mayor concentración de alcohol que otras como la P fluorescens, que
mantiene su actividad hasta una relación 4,5:1. Para evitar la desactivación de las lipasas por el
alcohol, éste se adiciona a diversos tiempos durante la reacción, como es el caso donde se
realizan tres adiciones sucesivas de 1/3 del equivalente molar del alcohol [39]. La inactivación
de las lipasas ocurre por contacto con el alcohol insoluble debido a que es altamente
hidrofóbico, éste elimina la capa esencial de agua de la enzima, así la adición poco a poco del
alcohol es una aproximación potencial para optimizar la relación molar en sistemas libres de
solvente. Mientras que una velocidad de reacción más alta puede ser obtenida con un ligero
exceso de alcohol en sistemas con solventes orgánicos [40].
1.5.2. Temperatura. La transesterificación enzimática se realiza generalmente a bajas
15
temperaturas para prevenir la disminución de la actividad de la enzima. La temperatura óptima
para varias lipasas usadas para síntesis de biodiesel está en el rango de 30 a 55°C. La
temperatura óptima de transesterificación dependerá de la interacción entre la estabilidad
operacional de la lipasa y el grado de transesterificación de la reacción [41]. Por lo general, al
inicio la velocidad de reacción aumenta con la temperatura, debido a un incremento en las
constantes cinéticas y una menor limitación en la transferencia de masa, sin embargo, el
aumento de la temperatura luego del óptimo, provoca la desnaturalización, desactivación por
altas temperaturas de la enzima y disminución de la actividad enzimática [42].
1.5.3. pH. Los iones hidronio juegan un papel importante en las reacciones catalizadas por
enzimas, generando un equilibrio entre aspectos como la desnaturalización de la enzima a pH
alto o bajo. Muchas moléculas proteicas solo retienen su actividad biológica en un rango
limitado de temperatura y pH. Al exponer las proteínas globulares a pH y temperaturas extremas
fuera de este rango, se da la desnaturalización, siendo el efecto más visible un descenso en la
solubilidad, y la consecuencia más significativa es la pérdida de su actividad biológica
característica [43].
1.5.4.Tipo de alcohol. Distintos tipos de alcoholes pueden ser utilizados en la transesterificación
enzimática. Alcoholes primarios, secundarios y de cadena ramificada pueden participar de este
tipo de reacción, pero por su costo y disponibilidad, el metanol y etanol han sido los alcoholes
más usados en la industria de producción de biodiesel, pero estos dos alcoholes tienen una
fuerte acción desnaturalizante comparada con alcoholes alifáticos más largos [44]. Entre el
metanol y el etanol, el segundo es el alcohol con el que se han obtenido mayores conversiones
debido a la mejor tolerancia de las enzimas a este alcohol, siendo notorio que las enzimas actúan
de mejor manera en sistemas con alcoholes de cadena larga, además, desde el etanol puede
producirse de fuentes renovables y es menos peligroso que el metanol [45].
1.5.5. Uso de solvente. En la catálisis enzimática se presentan dificultades como la baja
solubilidad del alcohol con los demás componentes de la reacción, inhibición de la enzima por
el alcohol y el recubrimiento de la enzima por la glicerina. Para evitar estos inconvenientes se
utilizan solventes como hexano, terbutanol, octano, acetona y éter de petróleo [46]. Solventes
orgánicos hidrofílicos pueden interactuar con la molécula de agua en la enzima y esto puede
afectar la actividad catalítica de la enzima [47].
1.5.6. Contenido de agua. El agua tiene una fuerte influencia en la actividad catalítica y en la
estabilidad de la lipasa. La activación de la lipasa con agua involucra cambios conformacionales
16
de la enzima que dependen de la disponibilidad de una interface entre el aceite y el agua.
Además la conversión de la transesterificación depende del tamaño del área interfacial la cual
puede incrementarse por la adición de cierta cantidad de agua. Pero las lipasas son hidrolasas en
medios acuosos y un exceso de agua podría dar lugar a un aumento en la reacción de hidrólisis
causando un decrecimiento de la reacción de transesterificación [48].
La cantidad de agua en el medio de reacción garantiza que la lipasa tenga su conformación
tridimensional y la capacidad de abrir su sitio catalítico, por tanto se conserva su actividad
enzimática predeterminada naturalmente para llevar a cabo su acción catalítica. Sin embargo, un
exceso de fase acuosa genera un aislamiento de la enzima con los sustratos (alcohol y aceite),
por lo tanto se reduce su capacidad de catálisis la reacción [49]. El contenido óptimo de agua se
encuentra entre maximizar la actividad enzimática por el incremento del área interfacial,
minimizando la reacción de hidrólisis y debe ser evaluada para cada lipasa [50].
1.5.7. Desactivación enzimática por alcohol. La desactivación de la enzima se produce por
metanol principalmente, esto es causado por la cadena corta del alcohol. Para resolver este
problema, se han planteado el adicionar poco a poco el alcohol e ingeniería de solventes [51].
Los alcoholes forman gotas que se insolubilizan en el medio de reacción y al entrar en contacto
con la enzima la inactivan [52].
1.6. Enzimas
Las enzimas son proteínas de estructura tridimensional globular que se activan cuando su
conformación espacial permite la exposición de su sitio catalítico. Se componen de dos partes:
apoenzima y cofactor. Para poder actuar las enzimas requieren de ciertas condiciones de
temperatura, pH, concentración del sustrato y de enzima, y el agua disponible en el medio,
etcétera; bajo las cuales la estructura tridimensional es la adecuada para actuar con el sustrato.
Las enzimas son catalizadores biológicos que no se consumen durante la reacción y presentan
un elevado grado de espeficidad. Su estudio es indispensable dentro del campo de los alimentos
ya que son las responsables de cambios en éstos, provocando procesos como maduración,
oxidación, transesterificación, fermentación, etc. Existen varios modelos que explican el
funcionamiento de las enzimas como catalizador, siendo uno de los mas aceptados el
desarrollado por Michaelis y Menten en 1913. [53]
17
1.7. Lipasas
Las lipasas (Ec 3.1.1.3) son hidrolasas que poseen actividad hidrolítica y de síntesis, la reacción
se produce en la interface aceite-agua [54]. Son activadas en presencia de interfaces y
frecuentemente poseen una estructura en el sitio activo, ya que disponen de una cadena
polipeptídica (tapadera o lid) que puede replegarse sobre el sitio activo, bloqueándolo. Esta
característica condiciona la funcionalidad de la enzima a la existencia de un microambiente
hidrofóbico que permita el desplegado de la tapadera dejando accesible el sitio activo. Puede
considerarse que la enzima existe en un equilibrio configuracional entre una forma cerrada
inactiva y una forma abierta. Tal equilibrio puede ser desplazado hacia la forma activa por la
presencia de un micro ambiente hidrofóbico que puede ser una interfaz aceite-agua o una
superficie hidrofóbica activa [55].
Estos catalizadores son muy apreciados por sus propiedades catalíticas, pueden ser aplicadas en
varias reacciones como alcohólisis, acidólisis, aminólisis e hidrólisis [56]. A estas enzimas se
las puede encontrar en todos los organismos vivos y se clasifican según la fuente de las que son
obtenidas. De origen animal como las lipasas pancreáticas, lipasas vegetales como látex de
papaya, lipasa de semilla de avena, microorganismos, etc. La propiedad más apreciada es la
habilidad de catalizar tanto mono, di y triglicéridos, como ácidos grasos libres en la producción
de biodiesel con alta actividad enzimática y conversiones satisfactorias [57].
En medios no acuosos, las lipasas tiene una muy buena estabilidad catalítica. Su especificidad
hace que puedan ser utilizadas en muchas aplicaciones en síntesis orgánica. Las condiciones de
operación en que las enzimas trabajan son menos agresivas, catalizan una gran variedad de
sustratos incluyendo aquellos que tienen alto contenido de ácidos grasos. Además la separación
de biodiesel es más fácil, resultando en un proceso más amistoso con el medioambiente [58].
Durante los últimos años el interés por las lipasas se ha incrementado a causa de sus
propiedades catalíticas, siendo posible su aplicación en industrias como: aditivos, detergentes,
elaboración de productos alimenticios bajos en grasa y colesterol, para eliminar la cera de la
pulpa del papel, obtención de moléculas bioactivas, modificación de grasas y otros lípidos por
hidrólisis y esterificación [59].
1.7.1. Lipasas vegetales. Las lipasas de origen vegetal pueden ser usadas como catalizadores
para la síntesis de biodiesel. Estas enzimas pueden ser extraídas de diferentes partes de la planta.
Los métodos para preparar y procesar cada lipasa dependerá de la fuente que proviene, habiendo
18
sido estudiadas sus reacciones de esterificación y transesterificación. Las lipasas vegetales
pueden ser usadas en forma cruda o como extractos parcial o totalmente purificados. El grado
de purificación dependerá de la parte de la planta de donde se obtiene la lipasa y el grado de
pureza buscado [60]
1.7.2. Lipasas de microorganismos. Las lipasas de microorganismos son las más utilizadas
debido a su corto tiempo de producción y alta conversión a productos. Las condiciones de
cultivo son bastante simples y estas lipasas tienen un gran potencial para la aplicación en otras
industrias distintas del biodiesel como alimentos, farmacéutica, detergentes, textiles,
cosméticos, etc. Este tipo de lipasa son estables en sistemas con solventes orgánicos, posee
especificidad por el sustrato y una alta enantioselectividad [61]. Existen dos categorías de
enzimas biocatalizadoras: lipasas extracelulares y lipasas intracelulares.
1.7.2.1. Lipasa Extracelular. La producción de estas enzimas consiste en la recuperación
de la enzima directamente del caldo de cultivo del microorganismo, para luego proceder a la
purificación de las mismas.Los microorganismos que más producen lipasa extracelular son
Mucor miehei, Rhizopus oryzae, Candida antárctica y Pseudomonas cepacia [62].
1.7.2.2. Lipasa Intracelular. Las lipasas intracelulares se encuentran dentro de la célula
formando membranas, lo que constituye una desventaja por el complejo proceso que se necesita
para purificar este tipo de enzima, incrementando su costo de producción. Como alternativa se
pueden utilizar células completas de los microorganismos que están produciendo lipasas como
catalizador, obteniéndose conversiones aceptables y a menor costo. Hongos filamentosos han
sido identificados como buenos biocatalizadores para la producción de biodiesel, entre estos
están: Rhizopus y Aspergillus [63].
1.7.3.Selectividad de las lipasas. Las lipasas pueden ser divididas basándose en su especificidad
o selectividad:
a) Regio especificidad o posicional: especificidad sn-1,3, hidroliza enlaces éster en la
posición R1 o R3, especificidad sn-2, hidroliza enlaces éster en la posición R2 y sin
especificidad, no distingue entre enlaces éster para actuar [64]. Como ejemplo de las
lipasas especificas sn-1,3 tenemos: Aspergillus niger, Rhizopus oryzae y Mucor miehei
[65].
19
b) La especificidad de sustrato en las lipasas es crucial en la producción de biodiesel, lo que
actúa en la elección de la enzima apropiada para cada materia prima, considerando la
capacidad de distinguir las propiedades estructurales. Las lipasas de Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas cepacia, Candida rugosa, Candida antarctica y Candida
cylindracea actúan de esta manera [66].
1.7.4. La lipasa de Rhizopus oryzae. Rhizopus oryzae es un hongo filamentoso y lipolítico, que
crece en los frutos de la palmera. La lipasa producida por este hongo de forma extracelular
(ROL) posee un elevado interés en biotecnología y en investigación académica debido a su
elevada regioespecificidad. Esta enzima actúa hidrolizando de manera preferente las posiciones
sn-1 y sn-3 de los triglicéridos, ya que pertenece a un grupo de lipasas que son activas frente a
ésteres de alcoholes primarios. La estructura nativa de esta enzima se compone de 392
aminoácidos [67]. En la Figura 3 se observa a la lipasa tridimensionalmente y en color morado
los aminoácidos del centro activo.
Figura 3. Representación tridimensional de la lipasa de Rhizopus oryzae.
Fuente: GUILLÉN, Marina. Caracterización, inmovilización y aplicación en biocatálisis de la lipasa Rhizopus
oryzae expresada en Pichia pastoris, Trabajo de Grado, Grado de Doctor, Universidad Autónoma de Barcelona,
Departamento de Ingeniería Química, Bellaterra, 2012, 205p. p. 16
20
1.8. Reactores para la transesterificación enzimática.
A partir de la industrialización de la producción enzimática de biodiesel es necesario
demostrar la aplicabilidad de las enzimas en sistemas con reactores. Varios reactores
incluyendo reactores batch, de lecho empacado y reactores supercríticos han sido
investigados. La mayoría de investigaciones se han hecho en reactores tipo batch y de
lecho empacado.
Los reactores batch son de diseño simple y se usan en laboratorios. En éstos el metanol muestra
una buena dispersión en la fase del aceite. Pero la agitación puede causar una disminución en la
vida útil de la enzima, también hay que considerar que los reactores batch necesitan mucho
trabajo y no son una buena opción para la automatización. Los reactores de lecho empacado son
una alternativa a los reactores batch, es un reactor continuo, sustancialmente rápido y
económico. La principal ventaja es que se obtiene una mayor estabilidad de la enzima al evitar
los efectos de la agitación, además la adición del alcohol por etapas puede realizarse para
reducir la inactivación de las enzimas causado por un exceso de alcohol. Uno de los problemas
es la inhibición de la enzima por acumulación de glicerol en el fondo der reactor, esto se puede
solucionar adicionando una columna al sistema. En consecuencia, los reactores de lecho
empacado parecen ser una solución práctica con altas conversiones. Estos sistemas brindarán
una forma económica de producir industrialmente biodiesel por vía enzimática [68].
1.9. Glicerol
El glicerol es un alcohol polihídrico, líquido viscoso, claro, inodoro, con sabor dulce y
altamente higroscópico. Se encuentra en la estructura de las triglicéridos de grasas y aceites
entre 9 a 13%. El glicerol se obtiene como subproducto de la fabricación de ácidos grasos,
ésteres grasos o jabones, como una mezcla de glicerol y agua, que recibe el nombre de aguas
dulces. En el proceso de hidrólisis de los aceites para la obtención de ácidos grasos, las aguas
dulces tienen entre 10 y 20% de glicerol, las cuales pueden purificarse hasta glicerol del 99,5%,
por destilación o intercambio iónico. En la saponificación del aceite para formar el jabón, las
aguas dulces contienen entre 4 y 20% de glicerol. Se usa como solvente o vehículo de productos
farmacéuticos, es un humectante en cosméticos, se usa como ingrediente en la fabricación de
explosivos, se emplea en la producción de mono y diglicéridos, como plastificante, como
lubricante en la producción de poliésteres, polioles y poliuretanos, anticongelante o agente
transmisor de calor o como fluido hidráulico [69].
21
1.10. Espectroscopia infrarroja
El espectro infrarrojo esta comprendido en longitudes de onda desde 1 a 100μm, este espectro
se subdivide en tres áreas más pequeñas: el infrarrojo cercano (1 a 25μm), infrarrojo medio (2,5
a 50μm) y el infrarrojo lejano (m s all de 25μm). in embargo, el infrarrojo cercano es pobre
en absorciones específicas, es muy importante en ensayos cualitativos en laboratorios y para
aplicaciones cuantitativas. El infrarrojo medio brinda mayor información acera de la estructura
de las moléculas, por lo que es ampliamente utilizado en la identificación de sustancias. El
infrarrojo lejano necesita de equipos especializados para el desarrollo de los análisis, existe un
amplio rango de instrumentos que incluso permiten un análisis en líneas continuas de
producción [70].
Se emplea para analizar las características vibracionales de las moléculas, estructuras cristalinas
y cristales. Los espectros se muestran en varias bandas características en el espectro infrarrojo,
estas bandas individuales se pueden relacionar con grupos químicos específicos. La energía a
las cuales aparecen las bandas dependen de las propiedades de las moléculas, mientras que se
pueden utilizar las magnitudes de las bandas para determinar las concentraciones. El espectro
infrarrojo se utiliza para análisis cuantitativos de sólidos, líquidos y gases, con excepción de
enantiómeros. Se puede identificar una sustancia desconocida partiendo del hecho que dos
sustancias no tienen el mismo espectro, entonces, se compara el espectro de la sustancia de la
cual queremos saber su identidad con una colección de espectros e identificar de qué se trata.
También se puede obtener información estructural. Los grupos funcionales se pueden identificar
debido a que sus bandas de absorción se encuentran en zonas relativamente estrechas, en
regiones características en la región infrarroja [71]. La Figura 4 ilustra el diagrama de bloques
de un especrtofotómetro.
22
Figura 4. Diagrama de bloques de un espectrómetro infrarrojo de transformadas de
Fourier de haz simple.
Fuente: ROUESSAC, Francis, ROUESSAC, Annick. Chemical Analysis Modern Instrumentation Methods and
Techniques, Segunda Edición, Wiley, Inglaterra, 2007. p. 216
1.11. Cromatografía de gases
En la cromatografía de gases, los componentes de la muestra vaporizada se separan como
consecuencia de que se reparten entre una fase gaseosa y una fase estacionaria contenida en la
columna. Al realizar la separación, la muestra se vaporiza y se inyecta en la cabeza de una
columna cromatográfica. Esto se realiza a través del flujo de una fase móvil de gas inerte. En la
Figura 5 se encuentra representado un diagrama de flujo del proceso de funcionamiento de un
cromatógrafo de gases. La ventaja de este tipo de cromatografía, es que la fase móvil no
interactúa con el analito, su única función es transportarlo a través de la columna [72].
23
Figura 5. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de gases típico
Fuente: SKOOG, Douglas, HOLLER, James, CROUCH, Stanley. Principios de Análisis Instrumental, Sexta
Edición, Cengage Learning Editores, México, 2008. p. 790
1.12. Diseño factorial
El diseño experimental se utiliza para estudiar el efecto individual y de interacción de varios
factores sobre una o varias respuestas. Los factores puede ser de carácter cualitativo o
cuantitativo, es indispensable escoger al menos dos niveles de prueba para cada factor para
estudiar la forma en que influye cada factor sobre la variable de respuesta. Un arreglo factorial
es el conjunto de datos experimentales que pueden formarse tomando en cuanta todas las
posibles combinaciones de los niveles de los factores. Así los diseños factoriales 2k se compone
de k factores con dos niveles de prueba [73].
1.12.1. Diseño factorial 2k. Es el diseño que se encarga de estudiar k número de factores, cada
uno con dos niveles y donde se corren 2k tratamientos , este diseño es útil siempre que 2 ≤ k ≤ 5.
Existen seis maneras de notación: notación de signos +, - útil para escribir matrices de diseño, la
notación +1, -1 para hacer cálculos de ajuste por mínimos cuadrados, esta notación se usa en los
paquetes Statgraphics y Minitab. La notación de Yates [(1), a, b, ab] permite representar y
calcular los efectos de interés, la notación con letras A+, A
- se usa para escribir al final del
análisis el mejor punto o tratamiento.
El diseño factorial 22 representado en la Figura 6, es un modelo que estudia el efecto de dos
24
factores considerando dos niveles cada uno. Este diseño se representa mediante los vértices de
un cuadrado, donde cada punto representa un punto de diseño o tratamiento. El área limitada por
los vértices se conocen como región experimental, las conclusiones obtenidas tienen validez en
esta zona [74].
Figura 6. Representación del diseño factorial 22
Fuente: GUTIÉRREZ, Humberto, DE LA VARA, Román. Análisis y
diseño de experimentos, Segunda edición, McGraw-Hill, México, 2008.
p. 169
1.12.2. Metodología de superficie de respuesta. La metodología de superficie de respuesta es
una estrategia experimental de análisis que permite encontrar las condiciones de operación
óptimas del proceso [75], usando un conjunto de técnicas matemáticas y estadísticas que ajustan
lo datos experimentales en una ecuación polinómica, la cual deberá describir el comportamiento
del conjunto de datos con el objetivo de hacer predicciones estadísticas. Para aproximar
funciones de respuesta a datos experimentales que no pueden ser descritos por funciones
lineales, se debe utilizar diseños experimentales para superficies de respuesta cuadráticas como
el factorial de tres niveles, Box-Behnken, compuesto central y diseño Doehlert. Estos diseños se
diferencian respecto a la elección de puntos experimentales, número de niveles para las
variables y el número de corridas y bloques [76]. La forma de construir un diagrama de bloques
de diseño de composición central se muestra en la Figura 7. Los diseños de superficie de
respuesta de segundo orden permiten estudiar tanto los efectos lineales y de interacción, como
los de segundo orden o de curvatura pura. Se usan cuando se cree que el punto óptimo se
encuentra en la región experimental o se espera que ésta sea compleja. Dentro de este tipo de
diseño se contempla el de composición central como el que se ilustra en la Figura 6 que se
construye a parir de un diseño factorial 2k agregando puntos sobre los ejes y al centro del diseño
[77].
25
Figura 7. Representación y construcción del diseño de composición central para k=2
factores
Fuente: GUTIÉRREZ, Humberto, DE LA VARA, Román. Análisis y diseño de experimentos, Segunda edición,
McGraw-Hill, México, 2008. p. 418
26
2. MARCO EXPERIMENTAL
El modelo que se usó para la obtención de biodiesel consistió en un diseño factorial 22,
considerando como factores la cantidad de enzima y la temperatura de reacción, se mantuvieron
constantes las cantidades de grasa, alcohol, solvente y el pH. A través del modelo estadístico se
obtuvieron las condiciones óptimas de operación y con éstas se hicieron ensayos variando la
concentración de agua con el fin de estudiar el efecto de ésta en el rendimiento de la reacción.
Una vez obtenido el biodiesel se realizaron análisis de espectrografía infrarroja y cromatografía
de gases para verificar la existencia de ésteres en el producto obtenido.
2.1. Materiales y equipos
Cinta de teflón
Gradilla
Jeringa R: 0 a 60mL Ap ± 1mL
Jeringa R: 0 a 10mL Ap ± 0,1mL
Papel aluminio
Pera de caucho
Pipeta R: 0 a 2mL Ap ± 0,02mL
Pipeta R: 0 a 10mL Ap ± 0,1mL
Recipiente de vidrio
Termómetro R:-10 a 110°C Ap ±1°C
Tubos de ensayo simples y con tapa
Vaso de precipitación 100mL Ap ± 10mL
Vaso de precipitación 50mL Ap ± 10mL
Vaso de precipitación 25mL Ap± 2,5mL
Matraz Erlenmeyer 100mL Ap± 25mL
Matraz Erlenmeyer 50mL Ap± 10mL
Vidrio de reloj
Balanza Analítica R: (0-220g) Ap± 0,1mg
Cromatógrafo de gases PAC Agilent Technologies 7890 A
27
Agitador magnético con calefacción AGIMATIC-N R: Motor (60-1600)rpm Ap: ± 200 rpm
R: Calefactor (0-100)% Ap: ± 8%
Espectrofotómetro infrarrojo Perkin Elmer modelo Spectrum Two 97575
Estufa Memert R: (0-300)°C Ap: ± 0,5°C
2.2. Sustancias y reactivos
Acido cítrico (C6H8O7) 0,01M
Agua destilada (H2O)
Alcohol etílico (C2H5OH)
Alcohol metílico (CH3OH)
Bromuro de potasio (KBr)
Grasa de res
Hexano (C6H14)
Lipasa (Rhizopus Oryzae)
Sulfuro de Carbono (CS2)
2.3. Diagrama de Flujo
En la Figura 8 se representa el diagrama de flujo del proceso de obtención de biodiesel a partir
de grasa de res por vía enzimática.
28
Fig
ura
8.
Dia
gra
ma d
e F
lujo
del
pro
ceso
de
tran
sest
erif
ica
ció
n e
nzi
máti
ca
29
2.4. Caracterización de la grasa de res
La grasa de res, fue obtenida en la sección de cárnicos del mercado Iñaquito, de color
blanquecino, textura fibrosa y olor característico. La grasa obtenida principalmente fue aquella
asociada a órganos internos del animal. Se realizó una cromatografía de gases para conocer el
contenido de ácidos grasos que componen la grasa, análisis fisicoquímicos tales como densidad,
índice de refracción, punto de fusión, índice de acidez, índice de peróxidos, índice de
saponificación e índice de yodo, de acuerdo con normas nacionales INEN.
2.5. Extracción de la grasa de res
La extracción se realizó de manera artesanal, sometiendo la grasa a calentamiento en un
recipiente metálico hasta que se observó que la grasa líquida se separaba del tejido circundante,
posterior a esto se filtró para separar el líquido de las partículas de tejido remanentes y se
reservó la grasa tapada y en refrigeración hasta su posterior uso.
2.6. Preparación de la solución de enzima
En un vaso de precipitación se calentaron aproximadamente 6mL de agua hasta 37°C, luego se
agregó la enzima en las cantidades definidas según el diseño experimental y la mezcla se agitó a
200 rpm durante 15 minutos.
2.7. Obtención del biodiesel
En la balanza se pesó la grasa de res. Con el recipiente de vidrio se adecuó un baño María que
se fijó a 37°C, en él se introdujo el vaso de precipitación que contenía la grasa y se añadió el
alcohol, el hexano, la solución de enzima y el ácido. La mezcla se agitó hasta que la grasa se
diluya y todo el sistema esté homogéneo. Este líquido se colocó en un tubo de ensayo con tapa
sellando bien con cinta de teflón y papel aluminio para evitar que el solvente se evapore. A los
tubos de ensayo se los colocó horizontalmente en la estufa a la temperatura fijada para cada
ensayo durante 72 horas.
2.8. Separación del biodiesel
Una vez que transcurrió el tiempo de reacción, el contenido del tubo se colocó en una jeringa
con capacidad de 60mL para retirar la fase acuosa del sistema. El biodiesel obtenido se
introdujo en un tubo de ensayo y se calentó a baño maría hasta 60°C para eliminar el solvente,
una vez hecho esto se dejó enfriar el tubo sin taparlo. Usando la jeringa con capacidad de 10mL
30
se separó el biodiesel de los restos de grasa que precipitaron.
2.9. Diseño experimental
Se utilizó un diseño factorial 2
2, como factores la cantidad de enzima y la temperatura de
reacción, se mantuvieron constantes las cantidades de grasa, alcohol, solvente y el pH. Según el
modelo basado en bibliografía, la temperatura varia desde 32,76°C hasta 41,2°C y la cantidad
de enzima desde 1,95% hasta 10%. Se empleó 7,5 g de grasa para cada ensayo, la relación
molar alcohol grasa de 6:1 y solvente grasa 5:1, el contenido de agua inicialmente fue fijado en
30%, como se detalla en la Tabla 4, luego, con las condiciones óptimas obtenidas a través del
modelo estadístico se hicieron ensayos variando la concentración de agua a 0%, 30%, 50% y
70% con el fin de estudiar el efecto de ésta en el rendimiento de la reacción de
transesterificación. Una vez obtenido el biodiesel se realizaron análisis de espectrografía
infrarroja y cromatografía de gases para verificar la existencia de ésteres en el producto
obtenido. Para encontrar los puntos óptimos con los datos proporcionados por el programa se
construye el diagrama de bloque correspondiente al diseño usado como se muestra en la Figura
9, usando los datos de la Tabla 5.
Figura 9. Diagrama de Bloque
31
Tabla 4. Factores constantes del proceso
Tabla 5. Datos Experimentales generados en Statgraphics
Los datos obtenidos a través del software se utilizaron para hacer los ensayos con los dos
solventes, etanol y metanol. Una vez realizados los ensayos con los datos obtenidos a través del
programa, se calculó el porcentaje de rendimiento de biodiesel y luego se ingresó éstos
resultados al libro de datos del programa Statgraphics para continuar con la búsqueda de las
mejores condiciones de operación para la obtención de biodiesel. El siguiente paso es elegir el
modelo para el ajuste de los datos y los resultados experimentales, para este estudio se eligió el
modelo cuadrático.
2.10. Influencia de la cantidad de agua en la reacción de transesterificación
Una vez obtenidas las mejores condiciones de temperatura, cantidad de enzima y alcohol, se
realizaron las pruebas pertinentes para estudiar de qué manera influye la cantidad de agua en el
rendimiento de la reacción de transesterificación bajo las mejores condiciones de operación.
Para esto se consideró la dosificación entre 0% y 70% en peso de agua.
Factor Valor
Cantidad de grasa 7,5 g
pH 6
Relación molar alcohol grasa 6:1
Relación molar solvente grasa 5:1
Tiempo de reacción 72 h
N Temperatura, °C Cantidad de enzima, g
1 32,75 0,5
2 34,0 0,25
3 34,0 0,75
4 37,0 0,146
5 37,0 0,5
6 37,0 0,5
7 37,0 0,853
8 40,0 0,25
9 40,0 0,75
10 41,24 0,5
32
2.11. Espectroscopía infrarroja
Para determinar la presencia de ésteres en la muestra de biodiesel, se realizó en una
espectrografía infrarroja usando un equipo modelo Perkin Elmer Spectrum. Para esto se elaboró
una pastilla de bromuro de potasio, ésta se colocó en el soporte correspondiente para el análisis,
se le agregó una gota del biodiesel obtenido y se receptó los datos de los ensayos.
2.12. Cromatografía de gases
Para evidenciar la presencia de mono, di y triglicéridos en la grasa de res y el biodiesel, se
realizó una cromatografía de gases en un equipo modelo SIMDIS HT750. Se empezó por diluir
la muestra a ser analizada en sulfuro de carbono, se colocó un vial y éste se ingresó al
cromatógrafo para obtener la gráfica correspondiente a cada una de las sustancias estudiadas.
33
3. DATOS
3.1. Extracción de la grasa de res
En la Tabla 6 se muestra el peso de tejido sometido al calentamiento para extraer la grasa y el
peso de grasa extraída.
Tabla 6. Datos experimentales de la extracción de la grasa de res
Literal Peso de tejido adiposo,
g
Peso de grasa extraída,
g
A 184 113
B 126 60
C 53 22
D 36 12
E 74 31
F 101 63
3.2. Rendimiento de biodiesel
En la Tabla 7 se detalla el peso de biodiesel obtenido en cada uno de los ensayos realizados
usando etanol y metanol.
34
Tabla 7. Peso de biodiesel obtenido
En la Tabla 8 se encuentran los pesos moleculares de la grasa de res y de los ésteres de los
ácidos palmítico, esteárico y oleico.
Tabla 8. Pesos moleculares
La Tabla 9 se compone del peso de biodiesel obtenido con las diferentes dosificaciones de agua.
N Temperatura
°C
Enzima
g
Peso de biodiesel
usando Metanol
g
Peso de biodiesel
usando Etanol
g
1 32,75 0,5 3,3004 2,2735
2 34 0,25 0,8391 2,1860
3 34 0,75 2,9430 3,2824
4 37 0,1464 1,6695 3,3261
5 37 0,5 4,9514 3,9881
6 37 0,5 4,7501 4,1887
7 37 0,8535 5,3565 4,2446
8 40 0,25 4,4435 0,0000
9 40 0,75 4,9448 2,3142
10 41,24 0,5 4,5019 1,1617
Sustancia Peso molecular
g/mol
Grasa de res 862,16
Palmitato de etilo 284,40
Palmitato de metilo 270,40
Estearato de etilo 312,48
Estearato de metilo 298,48
Oleato de etilo 310,00
Oleato de metilo 296,00
35
Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de biodiesel usando diferentes proporciones de agua
% de Agua Ensayo 1
Peso de Biodiesel, g
Ensayo 2
Peso de Biodiesel, g
0 0 0
30 4,15 4,24
50 4,27 4,34
70 4,52 2,89
36
4. CALCULOS
4.1. Extracción de la grasa de res
Para el cálculo del porcentaje de rendimiento de proceso de extracción de la grasa de res se
dividió el peso de grasa extraída para el peso de tejido adiposo y todo esto se multiplicó por
cien, como se muestra en la ecuación (1). Finalmente se calculó el promedio de todos los
porcentajes de rendimiento utilizando la ecuación (2).
Cálculo modelo para el literal A.
(1)
Rendimiento promedio de la extracción de grasa
(2)
4.2. Rendimiento de biodiesel
Para el cálculo del rendimiento de biodiesel se realizaron las siguientes consideraciones:
- La grasa de res esta constituida por los ácidos palmítico, esteárico y oleico en proporciones
iguales.
- El producto final del proceso de transesterificación esta constituido única y equitativamente
por los ésteres de los ácidos grasos mencionados en el inciso anterior.
- El cálculo es el mismo para obtener el rendimiento de biodiesel usando distintas
dosificaciones de agua.
37
4.2.1. Cálculo modelo para N=1 usando metanol. El porcentaje de rendimiento de la reacción
se realiza utilizando las ecuaciones (3) y (4).
(3)
Cantidad teórica de la fracción Palmitato de metilo obtenida
Cantidad teórica de la fracción Estearato de metilo obtenida
Cantidad teórica de la fracción Oleato de metilo obtenida
Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel
(4)
38
5. RESULTADOS
5.1. Extracción de la grasa de res
En la Tabla 10 se observa que el rendimiento de la extracción de la grasa fue en promedio del
47,47 %, este valor es representativo de 6 réplicas en las que se realizó la extracción, siendo los
porcentajes de rendimiento más altos aquellos en los que la grasa se cortó en pequeños pedazos,
en ese caso se alcanzó un rendimiento del 62,38%, mientras que cuando se realizó la extracción
con pedazos grandes se obtuvo un rendimiento del 30% .
Tabla 10. Porcentaje de Rendimiento de la extracción de la grasa de res
5.2. Caracterización de la grasa de res
En la Tabla 11 se encuentran los resultados de la determinación de cada una de las propiedades
fisicoquímicas de la grasa que fueron realizadas siguiendo los procedimientos de las normas
INEN, en el Laboratorio de Alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
Central de Ecuador, en el Laboratorio Labolab y en el laboratorio LASA (Ver Anexo B y C),
obteniéndose los siguientes resultados:
Literal % Rendimiento
A 61,41
B 47,62
C 41,51
D 30,00
E 41,89
F 62,38
Promedio 47,47
39
Tabla 11. Propiedades Fisicoquímicas de la Grasa de Res
De acuerdo a la Tabla 12, La grasa de res usada en esta investigación esta constituida
principalmente por tres ácidos grasos: ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. Esto
también se puede evidenciar en la Figura 10. Cada uno en una proporción algo menor al 30% en
peso de la grasa. El resto de ácidos característicos de la grasa de res, se encuentran en
proporciones menores al 6%. Así también es notorio que más de la mitad de los ácidos grasos
son saturados.
Figura: 10. Cromatograma correspondiente al perfil lipídico de la grasa de res
Parámetro Resultado Unidad Método
Densidad 0,8863 g/mL INEN 35:1973
Índice de refracción a 20 °C 1,688 INEN 42:1973
Punto de Fusión 46,50 °C INEN 474
Acidez (ácido oleico) 2,89 % INEN 38
Índice de Peróxido 0,00 meq O2/Kg INEN 227
Índice de Saponificación 0,204 mgKOH/100g INEN 40
Índice de yodo 38,50 cg I2/g INEN 37
40
Tabla 12. Perfil Lipídico de la Grasa de Res
5.3. Rendimiento de biodiesel
Las siguientes tablas proporcionan los porcentajes de rendimiento de biodiesel para cada uno de
los principales ácidos grasos y promedio de éstos tres. La Tablas 13 y Figura 11 brindan los
resultados de usar alcoholes diferentes para la reacción de transesterificación.
Ácido Graso Abreviatura Resultado Unidad Método de
Ensayo
Caprílico C8:0 0 %
PEE-LASA-FQ-47
AOAC 996.06
AOAC 963.22
CROMATOGRAFIA
DE GASES
Cáprico C10:0 0,09 %
Láurico C12:0 0,15 %
Tridecanoico C13:0 0 %
Mirístico C14:0 3,77 %
Miristoléico C14:1 (cis n5) 0,25 %
Pentadecanoico C15:0 1,06 %
Palmítico C16:0 24,59 %
Palmitoléico C16:1 (cis n7) 1,18 %
Heptadecanoico C17:0 1,44 %
Esteárico C18:0 27,65 %
Eláidico C18:1 (trans n9) 3,81 %
Oléico C18:1(cis n9) 29,47 %
Linoléico C18:2(cis n6) 0,34 %
Araquídico C20:0 0,26 %
α-Linolénico C18:3 (cis n3) 0,65 %
Eicosenoico C20:1 (cis n9) 5,24 %
Behénico C22:0 0,07 %
Erúcico C22:1(cis n9) 0 %
Ac. Grasos Saturados 59,08 %
Ac. Grasos mono insaturados 36,21 %
Ac. Grasos poli insaturados 0,99 %
Ac. Grasos trans 3,81 %
Grasa 99,9 % AOAC 989.85
41
Tabla 13. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel
N
Alcohol usado Metanol Etanol Metanol Etanol
Éster Peso Peso % R %R
Biodiesel % R
%R
Biodiesel
1
Palmitato 1,65 1,33 70,17
65,94
53,73
50,64
Estearato 1,65 1,33 63,57 48,91
Oleato 1,65 1,33 64,10 49,30
2
Palmitato 1,58 1,40 67,31
63,26
56,44
53,19
Estearato 1,58 1,40 60,98 51,36
Oleato 1,58 1,40 61,49 51,78
3
Palmitato 0,28 0,73 11,89
11,18
29,45
27,76
Estearato 0,28 0,73 10,77 26,81
Oleato 0,28 0,73 10,86 27,02
4
Palmitato 0,98 1,09 41,71
39,20
44,23
41,68
Estearato 0,98 1,09 37,78 40,25
Oleato 0,98 1,09 38,10 40,57
5
Palmitato 1,48 0 62,97
59,18
0
0
Estearato 1,48 0 57,05 0
Oleato 1,48 0 57,52 0
6
Palmitato 1,65 0,77 70,07
65,86
31,18
29,39
Estearato 1,65 0,77 63,48 28,38
Oleato 1,65 0,77 64,01 28,61
7
Palmitato 0,56 1,11 23,66
22,23
44,81
42,24
Estearato 0,56 1,11 21,43 40,79
Oleato 0,56 1,11 21,61 41,11
8
Palmitato 1,79 1,41 75,91
71,34
57,19
53,90
Estearato 1,79 1,41 68,77 52,05
Oleato 1,79 1,41 69,34 52,47
9
Palmitato 1,10 0,76 46,77
43,96
30,63
28,87
Estearato 1,10 0,76 42,37 27,88
Oleato 1,10 0,76 42,73 28,10
10
Palmitato 1,50 0,39 63,80
59,96
15,65
14,75
Estearato 1,50 0,39 57,79 14,25
Oleato 1,50 0,39 58,28 14,36
42
Figura 11. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de Biodiesel
La Tabla 14 y Figura 12 muestra los resultados de la influencia del agua en la reacción bajo las
condiciones optimas de operación.
Tabla 14. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel variando la proporción de agua
Ensayo % de Agua Éster Peso, g % R % R prom.
1 30%
Palmitato 1,38 58,75 55,22
Estearato 1,38 53,23
Oleato 1,38 53,67
2 30%
Palmitato 1,41 60,10 56,48
Estearato 1,41 54,45
Oleato 1,41 54,90
1 50%
Palmitato 1,42 60,47 56,83
Estearato 1,42 54,78
Oleato 1,42 55,24
2 50%
Palmitato 1,45 61,49 57,79
Estearato 1,45 55,70
Oleato 1,45 56,17
1 70%
Palmitato 1,51 64,04 60,18
Estearato 1,51 58,01
Oleato 1,51 58,50
2 70%
Palmitato 0,96 41,01 59,96
Estearato 0,96 37,15
Oleato 0,96 37,46
43
Figura 12. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de biodiesel usando
diferentes proporciones de agua
5.4. Caracterización del Biodiesel
5.4.1 Espectroscopía infrarroja. Luego de someter a la grasa de res a la reacción de
transesterificación, es necesario verificar la presencia de ésteres en el biodiesel obtenido, para
esto se utilizó la espectroscopía infrarroja, la cual nos brinda una gráfica del porcentaje de
transmitancia versus la longitud de onda, a través de la cual, mediante los picos encontrados a
cada longitud de onda se puede identificar la presencia de los compuestos de interés. En la
Figura 13 se puede observar picos de longitud de onda de 1739,49 cm-1
y con una transmitancia
del 9,90%, típicos de la presencia de ésteres en el biodiesel que se obtuvo. Este resultado nos
indica de manera positiva que el uso de enzimas para llevar a cabo la reacción de
transesterificación tuvo éxito. También se puede notar picos importantes de longitud de onda
2925,64 cm-1
, 2856,21 cm-1
y 1175,53 cm-1
.
44
Figura 13. Espectrograma del Biodiesel obtenido
En la Figura 14 se puede observar la ausencia del pico a 1739,49 cm-1
presente en la grafica IR
del biodiesel obtenido, esto es porque el diesel de petróleo esta compuesto por hidrocarburos
saturados, mayormente parafinas y otros hidrocarburos aromáticos. Las similitudes que se
evidencian son los picos cercanos a 2925 cm-1
, 1458 cm-1
, 1375 cm-1
.
Figura 14. Espectrograma del Diesel de petróleo
5.4.2. Cromatografía de gases. Las siguientes cromatografías se realizaron basándose en una
técnica cromatográfica que separa una mezcla de múltiples componentes a través de la
diferencia de sus puntos de ebullición. Este ensayo se realizó a la grasa de res y al biodiesel
obtenido.
45
Version 8,4,1,0
SI M DI S HT750 ASTM D 7169 3
Sample name : Grasa ResAcquired on : 12/19/2014 12:51:42 PM Vial : 103Processed on : 12/19/2014 2:04:15 PM Injection : 1Data File : MUESTRAS 2014-12-19\103F0301.D\
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Retention Time (min)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
Sig
na
l
6 12 18 24 30 36 42 48 5460667278849096 120
Carbon Number
En
d t
ime 2
2.6
10
0
IBP
31
4
FB
P 6
15
Signal: Hydrocarbon - FID1 A, Front Signal
Figura 15. Cromatografía de gases de la grasa de res
En la Figura 15 se encuentra un pico en un tiempo de retención entre 15 y 20 minutos, este pico
corresponde a compuestos que contienen entre 42 y 60 carbonos. De acuerdo a la naturaleza de
la sustancia que se sometió a este análisis el pico representado en la cromatografía corresponde
a los triglicéridos presentes en la grasa de res.
En la Figura 16 se observan tres picos: de derecha a izquierda el primero se ubica antes de 20
minutos de tiempo de retención correspondiente a compuestos que tienen entre 48 y 60
carbonos. El siguiente pico se localiza en 15 minutos de tiempo de retención, que pertenece a
los compuestos entre 42 y 36 carbonos. Por último el pico final que se sitúa entre los 5 y 10
minutos de tiempo de retención que concierne a compuestos que poseen entre 12 y 30 carbonos.
Para el biodiesel los picos presentes en la cromatografía corresponden, de izquierda a derecha;
a triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos. Esto es concordante al número de carbonos que
Triglicéridos
46
cada uno de los picos representa.
Version 8,4,1,0
SI M DI S HT750 ASTM D 7169 3
Sample name : BiodieselAcquired on : 12/19/2014 2:00:45 PM Vial : 104Processed on : 12/19/2014 2:37:24 PM Injection : 1Data File : MUESTRAS 2014-12-19\104F0401.D\
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Retention Time (min)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
Sig
na
l
6 12 18 24 30 36 42 48 5460667278849096 120Carbon Number
En
d t
ime
24
.08
00
IBP
270
Signal: Hydrocarbon - FID1 A, Front Signal
Figura 16. Cromatografía de Gases del Biodiesel
5.5 Análisis Estadístico
5.5.1. Regresión múltiple de los datos obtenidos. Usando el software Statgraphics se realizó
la regresión múltiple de los datos experimentales obtenidos con el fin de llegar a una expresión
que relacione la temperatura y la cantidad de enzima con el porcentaje de rendimiento de la
reacción.
Triglicéridos
Diglicéridos
Monoglicéridos
47
5.5.1.1. Regresión múltiple para la reacción usando metanol.
Variable dependiente: % Rendimiento de la reacción (%)
Variables independientes: Cantidad de enzima (g)
Temperatura (°C)
Número de observaciones: 10
En la Tabla 15 se muestran los valores referentes al cálculo de la regresión múltiple.
Tabla 15. Regresión múltiple para la reacción usando metanol
R-cuadrada = 93,0286 porciento
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 92,1571 porciento
La salida muestra los resultados de ajustar un modelo de regresión lineal múltiple para describir
la relación entre % Rendimiento de la reacción y 2 variables independientes. La ecuación del
modelo ajustado es:
% Rendimiento de la reacción = 45,6616*Cantidad de enzima + 0,757342*Temperatura
El estadístico R-Cuadrada indica que el modelo así ajustado explica 93,0286% de la
variabilidad en % Rendimiento de la reacción. El estadístico R-Cuadrada ajustada, que es más
apropiada para comparar modelos con diferente número de variables independientes, es
92,1571%.
Error Estadístico
Parámetro Estimación Estándar T Valor-P
Cantidad de enzima 45,6616 22,1791 2,05877 0,0735
Temperatura 0,757342 0,327464 2,31275 0,0495
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Modelo 26943,5 2 13471,7 53,38 0,0000
Residuo 2019,11 8 252,389
Total 28962,6 10
48
5.5.1.2. Regresión múltiple para la reacción usando etanol.
Variable dependiente: % Rendimiento de la reacción (%)
Variables independientes: Cantidad de enzima (g)
Temperatura (°C)
Número de observaciones: 10
En la Tabla 16 se muestran los valores referentes al cálculo de la regresión múltiple.
Tabla 16. Regresión múltiple para la reacción usando etanol
R-cuadrada = 82,6224 porciento
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 80,4502 porciento
La salida muestra los resultados de ajustar un modelo de regresión lineal múltiple para describir
la relación entre % Rendimiento de la reacción y 2 variables independientes. La ecuación del
modelo ajustado es:
% Rendimiento de la reacción = 35,601*Cantidad de enzima + 0,428957*Temperatura
El estadístico R-Cuadrada indica que el modelo así ajustado explica 82,6224% de la
variabilidad en % Rendimiento de la reacción. El estadístico R-Cuadrada ajustada, que es más
apropiada para comparar modelos con diferente número de variables independientes, es
80,4502%.
Error Estadístico
Parámetro Estimación Estándar T Valor-P
Cantidad de enzima 35,601 24,7815 1,4366 0,1888
Temperatura 0,428957 0,365887 1,17238 0,2748
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Modelo 11984,9 2 5992,46 19,02 0,0009
Residuo 2520,74 8 315,092
Total 14505,7 10
49
5.6. Optimización del método
Al igual que en la sección anterior se utilizó el software Statgraphics para realizar los cálculos
deseados, en este caso, la optimización de los resultados se encuentran detallados en las Tablas
17, 18, 19, y 20. Y así encontrar la mejor condición de operación en cuanto a la cantidad de
enzima y temperatura para lograr el mayor porcentaje de rendimiento. Para iniciar se debe
definir las variables de respuesta a ser medidas y a continuación los factores que van a variar. Se
selecciona el diseño experimental y finalmente el modelo para el ajuste de los datos
experimentales.
Tabla 17. Variables respuesta a ser medidas
Tabla 18. Factores experimentales que van a variar
Tabla 19. Selección del diseño experimental
Tabla 20. Modelo a ajustar a los resultados del experimento
5.6.1. Optimización del método para la reacción con metanol. Para la optimización del
proceso se especificó 1 variable respuesta y 2 factores experimentales. El diseño seleccionado
Nombre Unidades Analizar Objetivo Destino Impacto Sensibilidad Bajo Alto
% Rendimiento de
la reacción % Media Maximizar 3,0 Medio
Nombre Unidades Tipo Papel Bajo Alto Niveles
A: Cantidad de enzima g Continuo Controlable 0,25 0,75
B: Temperatura °C Continuo Controlable 34,0 40,0
Tipo de Diseño Puntos Centrales Punto Central Diseño es
Factores Tipo Por Bloque Colocación Aleatorizado
Proceso Diseño de compuesto central:2^2+est 2 Primero No
Factores Modelo Coeficientes Efectos excluidos
Proceso cuadrático 6
50
tiene 10 ensayos, con 1 una muestra para ser tomada en cada ejecución. El modelo por defecto
es cuadrático con 6 coeficientes. En la Tabla 21 se muestran los resultados de la optimización.
Tabla 21. Factores establecidos y óptimo para la reacción con metanol
Mediante el uso de programa Statgraphics se obtuvieron las gráficas de efectos, de superficie de
respuesta y de contorno para el porcentaje de rendimiento de la reacción con metanol, con el
propósito de analizar los datos experimentales obtenidos, relacionando las variables
dependientes e independientes para interpretar de mejor manera la influencia de la cantidad de
enzima y temperatura en el porcentaje de rendimiento de la reacción. Por medio de estas
gráficas es posible identificar el mayor rendimiento de la reacción obtenido usando las
condiciones experimentales proporcionadas por este mismo programa estadístico.
En la Figura 17 se representan los efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la
reacción con metanol.
Figura 17. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con
metanol
Factor Establecimiento
Cantidad de enzima 0,603589
Temperatura 39,0096
51
La Figura 18 es una representación en tres dimensiones de la relación entre la variable
dependiente y las variables dependientes. Está trazada en un prisma rectangular cuyos ejes X, Y
y Z son la cantidad de enzima, el porcentaje de rendimiento de la reacción y la temperatura
respectivamente, dentro de los límites de operación que son: para la cantidad de enzima de 0,25
a 0,75 y para la temperatura de 37 a 40°C. En esta grafica es visible que el punto de mayor
conversión esta entre el 60% y el 75% según el código de color, este punto es mas notorio en la
gráfica de contornos que se presenta a continuación, esta es un complemento a la gráfica de
superficie de respuesta ya que se deriva de la misma.
Figura 18. Superficie de respuesta estimada de la reacción con metanol
La Figura 19 está representada en dos dimensiones, en ésta se dibujan las áreas correspondientes
a los rendimientos de cada ensayo que refleja el área de superficie de respuesta haciéndose más
evidente la manera en que se distribuyen los resultados experimentales en el área de superficie
de respuesta. En ésta representación se encuentra un punto central que simboliza el mayor
rendimiento alcanzado.
52
Figura 19. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con metanol
5.6.2. Optimización del método para la reacción con etanol. Para la optimización del proceso
se especificó 1 variable respuesta y 2 factores experimentales. El diseño seleccionado tiene 10
ejecuciones, con 1 una muestra para ser tomada en cada ejecución. El modelo por defecto es
cuadrático con 6 coeficientes. En la Tabla 22 se muestran los resultados de la optimización.
R-cuadrado, el cual muestra el porcentaje de variación en la respuesta que ha sido explicado por
el modelo ajustado. Para % Rendimiento de la reacción, R-cuadrado igual as 87,31%.
Tabla 22. Factores establecidos y óptimo para la reacción con etanol
Mediante el uso de programa Statgraphics se obtuvieron las gráficas de efectos, de superficie de
respuesta y de contorno para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol, con el
propósito de analizar los datos experimentales obtenidos, relacionando las variables
dependientes e independientes para interpretar de mejor manera la influencia de la cantidad de
enzima y temperatura en el porcentaje de rendimiento de la reacción. Por medio de estas
gráficas es posible identificar el mayor rendimiento de la reacción obtenido usando las
condiciones experimentales proporcionadas por este mismo programa estadístico. En la Figura
20 se representan los efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con
etanol.
Factor Establecimiento
Cantidad de enzima 0,83324
Temperatura 36,775
53
Figura 20. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol
La Figura 21 es una representación en tres dimensiones de la relación entre la variable
dependiente y las variables dependientes. Está trazada en un prisma rectangular cuyos ejes X, Y
y Z son la cantidad de enzima, el porcentaje de rendimiento de la reacción y la temperatura
respectivamente, dentro de los límites de operación que son: para la cantidad de enzima de 0,25
a 0,75 y para la temperatura de 37 a 40°C. En esta gráfica es visible que el punto de mayor
conversión esta entre el 45% y el 60% según el código de color, este punto es mas notorio en la
gráfica de contornos que se presenta a continuación, esta es un complemento a la gráfica de
superficie de respuesta ya que se deriva de la misma.
Figura 21. Superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol
54
En la Figura 22 están representadas en dos dimensiones, en ésta se dibujan las áreas
correspondientes a los rendimientos de cada ensayo que refleja el área de superficie de respuesta
haciéndose más notoria la manera en que se distribuyen los resultados experimentales en el área
de superficie de respuesta. En esta representación se encuentra un punto central que simboliza el
mayor rendimiento alcanzado.
Figura 22. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol
55
6. DISCUSION
6.1. Extracción de grasa de res
El tamaño de los pedazos, de tejido adiposo usado para extraer la grasa de res, influyó en el
rendimiento del proceso. De los pedazos más pequeños se extrajo mayor cantidad de grasa
que de los pedazos grandes, además, en los pedazos de mayor dimensión se podía apreciar
que la grasa se quedaba retenida en el centro y ésta no podía ser removida.
6.2. Caracterización de la grasa de res
El valor del índice de peróxido igual a cero puede deberse a que el 59% de la grasa está
compuesta por ácidos grasos saturados, haciendo que ésta sea menos susceptible a la
oxidación. El índice de peróxido es una medida de la cantidad de compuestos oxigenados
que contiene la grasa, en otras palabras es una medida de la rancidez, en la muestra que se
analizó el índice de peróxido es igual a 0 meq O2/Kg, esto significa que la grasa no estuvo
expuesta al oxígeno que la deteriora. A pesar de contener ácidos grasos insaturados, que
hacen que la grasa sea mas susceptible a la oxidación, no se hallaron compuestos
oxigenados.
La grasa de res utilizada tiene un índice de acidez de 2,89%, este valor es indicativo de un
bajo contenido de ácidos grasos libres. Lo que la hace ideal para usarla en sistemas con
cualquier tipo de catalizador ya que la formación de jabón como producto secundario de la
reacción de transesterificación es reducida
El índice de saponificación de la grasa de res que se empleó es de 0,204 mg KOH/100g,
este valor implica que los ácidos grasos que la componen son de cadena larga. Lo cual
concuerda con el perfil lipídico, donde se determinó que los ácidos grasos tienen más de 16
carbonos.
El índice de yodo es igual a 38,50 cg I2/g, este valor es una medida del grado de
insaturación de la grasa, el cual no es tan elevado en comparación con el aceite de palma
(50 a 55 cgI2/g) que es la principal materia prima para elaboración de biodiesel en el país.
56
Al igual que en el índice de saponificación, confirma los resultados del perfil lipídico
donde se puede observar que el contenido de ácidos grasos insaturados es del 41%.
Además, un alto índice de yodo implica que son grasas suaves.
A través de la espectroscopía infrarroja es posible identificar grupos funcionales presentes
en una sustancia. Al realizar este análisis al biodiesel obtenido se encontró en el
espectrograma un pico de 1739,49 cm-1con una transmitancia del 9,90%, característico del
grupo éster.
Considerando que el agua favorece la reacción de transesterificación por vía enzimática, no
se evaluó el contenido de agua en la grasa de res. Se prefirió estudiar la influencia que ésta
tienen en el rendimiento de la reacción.
Mediante de la cromatografía de gases se determinó la composición de la grasa de res.
Los ácidos grasos detectados y sus proporciones coinciden con los valores encontrados en
la bibliografía consultada Por ejemplo, el contenido de ácidos saturados es del 59,08%,
ácidos grasos monoinsaturados de 36,21%, ácidos grasos trans de 3,81.
6.3. Obtención de Biodiesel
A pesar de no disponer del reactor adecuado, se logró la conversión de ácidos grasos a
ésteres metílicos y etílicos. El escenario ideal sería el realizar la reacción de
transesterificación en un reactor que mientras mantiene la temperatura constante, agite la
preparación ya que de esta manera las enzimas están más en contacto con el sustrato. Al no
disponer de estas condiciones, se optó por colocar la preparación en tubos de ensayo en
posición horizontal, para aumentar la superficie de contacto entre la grasa y la fase acuosa
que es donde se lleva a cabo la reacción y aumentar el tiempo de reacción.
La cantidad de lipasa a la cual se tuvo acceso fue muy limitada, razón por la cual se debió
hacer los ensayos con una pequeña cantidad de grasa y así administrar la enzima de manera
que sea posible realizar todos los ensayos necesarios para este trabajo.
Se utilizó lipasa en su configuración libre y no inmovilizada, como la gran mayoría de
investigaciones sobre obtención de biodiesel por vía enzimática. Esto se debe a que esta
enzima no es comercializada ordinariamente en el país, es necesario importarla,
aumentando los costos de producción del biodiesel. Sin embargo, con la enzima libre
57
también se obtienen resultados prometedores en cuanto al estudio de la transesterificación
enzimática en el Ecuador. El inconveniente radica en que solo se la puede utilizar una vez y
que pueden quedar trazas de ésta en el producto final, haciendo que no cumpla las
especificaciones requeridas para el biodiesel.
Luego de separar el biodiesel del solvente, se observaron restos de color blanco en las
paredes del tubo de ensayo. Estos remanentes pueden ser de grasa que no reaccionó, siendo
necesario separarlos del producto final.
6.4. Rendimiento de Biodiesel
La grasa de res está constituida principalmente por los ácidos palmítico, esteárico y
oléico, por ello se optó por calcular el porcentaje de rendimiento individual de cada ácido
graso a éster y luego se procedió a realizar un promedio de estos tres porcentajes de
rendimiento para lograr tener un valor representativo del porcentaje de rendimiento de la
grasa a biodiesel y así calcular las condiciones óptimas de operación mediante el método
de superficie de respuesta usando el software Statgraphics.
En el ensayo de la influencia del agua sobre el porcentaje de rendimiento de la reacción,
en la prueba que no se adicionó agua el rendimiento fue igual a cero. Al no haber agitación
durante la reacción la enzima se depositó en el fondo del envase sin poder actuar sobre la
grasa. En los ensayos donde se adicionó agua en diferentes proporciones, los porcentajes de
rendimiento fueron cercanos unos de otros, demostrando que para las condiciones de
operación estudiadas, adicionar más agua no tiene un efecto importante.
6.5. Análisis estadístico
Puesto que el valor-P en la Tabla 15 y 16 es menor que 0,05, existe una relación
estadísticamente significativa entre las variables con un nivel de confianza del 95,0%,
quiere decir que, por ejemplo, la cantidad de enzima no determina la cantidad a la cual se
debe hacer el ensayo y viceversa. El valor-P también indica la probabilidad de que los
resultados obtenidos sean debidos al azar.
Las parejas experimentales escogidas para este estudio proporcionaron resultados que al
realizar la regresión múltiple, el R- cuadrado para la reacción con metanol es de 93,03% y
para la reacción con etanol es de 82,62% lo que indica un buen ajuste.
58
6.6. Optimización del método
Las Figuras 17 y 20 indican que bajo las condiciones de operación investigadas, se puede
tener una máxima conversión, después de la cual a pesar de aumentar la cantidad de
enzima o la temperatura; el rendimiento baja. Lo que coincide con el esquema de
comportamiento de las enzimas. Al mirar la curva cantidad de enzima versus el porcentaje
de rendimiento de la reacción, ésta llega a un punto máximo y luego desciende. Lo mismo
ocurre con curva temperatura versus porcentaje de rendimiento de la reacción, al elevar la
temperatura la conversión aumenta hasta el punto donde alcanza su punto máximo y luego
a pesar de elevar la temperatura, el rendimiento disminuye, sin tomar en cuenta que a altas
temperaturas la enzima empieza a desnaturalizarse volviéndose mucho menos efectiva. 7.
59
7. CONCLUSIONES
7.1. Extracción de grasa de res
La extracción de la grasa de res de forma artesanal no es un método efectivo de separación
ya el rendimiento fue solamente del 48,02%. El tamaño de los pedazos que se sometieron a
calentamiento influyó en la cantidad de grasa que se obtuvo, siendo los cortes más
pequeños los que ofrecieron mejores resultados.
7.2. Caracterización de la grasa de res
El bajo índice de saponificación de la grasa de res usada hace posible la transesterificación
usando diferentes catalizadores, minimizando la formación de jabones como producto
secundario de la reacción a causa de un alto contenido de ácidos grasos libres.
Mediante el análisis fisicoquímico de la grasa se conoce que la misma está compuesta
principalmente de ácidos grasos saturados de cadena larga, en ausencia de compuestos
oxigenados y que se trata de una grasa suave.
7.3. Obtención de Biodiesel
Las temperaturas de cada uno de los puntos óptimos de operación obtenidos no distan
significativamente de la temperatura a la cual la enzima es más eficaz indicada por el
fabricante que es de 37°C, sobre todo la temperatura de la reacción con etanol. Esto es que
al variar las condiciones de operación, las enzimas lograran mayor conversión a
temperaturas cercanas a su óptima.
La reacción que se realiza usando etanol, necesita mayor cantidad de enzima y menor
temperatura para lograr un alto grado de conversión, siendo necesario suministrar menor
cantidad de energía en comparación con la reacción con metanol la cual, para obtener una
alta conversión se realiza a una temperatura más elevada que en el caso anterior, pero con
menor cantidad de enzima.
60
Tanto para la reacción con metanol como para la reacción con etanol, la relación del
porcentaje de rendimiento frente a la cantidad de enzima tienen una tendencia a llegar a un
punto máximo después del cual el porcentaje de rendimiento disminuye, a pesar de
aumentar la cantidad de enzima utilizada. Esto también ocurre con la temperatura para los
dos casos, sin importar si se aumenta la temperatura el porcentaje de rendimiento llega a un
punto máximo después del cual tiende a disminuir. Esto demuestra que se logra un máximo
rendimiento bajo ciertas condiciones, luego de las cuales este empieza a decaer a causa del
comportamiento natural de las enzimas.
7.4. Caracterización del biodiesel
Las enzimas en efecto tuvieron éxito como catalizadores para la reacción de
transesterificación de la grasa de res. Esto se confirma con la cromatografía realizada al
biodiesel en la cual se observan tres picos en diferentes tiempos de retención, los cuales
corresponden a triglicéridos (48 a 60 carbonos), diglicéridos (36 a 42 carbonos) y
monoglicéridos (12 a 30 carbonos) evidenciando la conversión de los triglicéridos en
diglicéridos y monoglicéridos.
7.5 Rendimiento de Biodiesel
El mejor porcentaje de rendimiento fue del 71,34%, este valor se logró utilizando alcohol
metílico a 37°C y 0,8535 g de enzima. El rendimiento más bajo fue de 0%, usando alcohol
etílico a 40°C y 0,25 g de enzima.
El mayor porcentaje de conversión con metanol fue del 71,34%, se obtuvo con 0,8535 g de
enzima a 37°C y el más bajo de 11,18% se alcanzó con 0,25 g de enzima a 34°C. Para la
reacción usando etanol la mayor conversión fue de 53,90%, con 0,8535 g de enzima a
37°C y el mas bajo de 0% se realizó con 0,25 g de enzima a 40°C.
7.6. Análisis estadístico
R-cuadrado, muestra el porcentaje de variación en la respuesta que ha sido explicado por
el modelo ajustado. Para el porcentaje de rendimiento de la reacción con metanol el R-
cuadrado es igual a 93,03% y para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol,
R-cuadrado igual a 82,62, lo que significa un buen ajuste y selección del rango de
variables.
61
7.7. Optimización del método
Las mejores condiciones de operación obtenidas luego de utilizar el método de superficie
de respuesta, fueron: para la reacción usando metanol, 0,6036 g de enzima y 39°C. Para la
reacción usando etanol, 0,8332 g de enzima y 36,8°C.
62
8. RECOMENDACIONES
8.1. Extracción de grasa de res
Para obtener mejores resultados en la extracción de la grasa se debería cortar el tejido
adiposo en pedazos pequeños lo más uniformes posible y probar otros métodos de
extracción como el uso de solventes o realizar la extracción a temperatura constante para
que el sebo se separe del tejido lentamente sin que éste pierda sus propiedades.
8.2. Obtención de Biodiesel
Con la enzima de Rhizopus oryzae se obtuvo muy buenos resultados, sin embargo se podría
investigar la conversión que se puede conseguir con otros tipos de enzimas como enzimas
vegetales o de otro microorganismo, así como también con enzimas inmovilizadas.
La reacción de transesterificación enzimática necesita ciertas condiciones que de ser
proporcionadas, incrementan el porcentaje de rendimiento de la reacción. El diseño de un
reactor con agitación y calefacción es de suma importancia para seguir avanzando en este
campo de investigación, ya que de esta manera es posible maximizar la cantidad de
biodiesel por gramo de sustrato que se ingresa.
El hexano se usó como solvente para agilizar la reacción de transesterificación, por lo que
sería recomendable realizar ensayos sin la presencia de este reactivo y determinar su
influencia en la velocidad y efectividad de la reacción.
Un capítulo interesante por investigar es la inmovilización de enzimas para su aplicación
en la transesterificación enzimática de ácidos grasos. Las lipasas inmovilizadas no se
comercializan en el país y además pueden ser reutilizadas varias veces antes de que pierdan
su efectividad, reduciendo de esta manera el costo por este insumo en la obtención de
biodiesel.
La reacción de transesterificación es un proceso que aún necesita resolver varios problemas
63
antes de ser llevado a escala industrial, el primero de estos es el tiempo que se necesita para
obtener el biodiesel, el cual es mucho mayor al necesario para una reacción con
catalizadores tradicionales como el hidróxido de sodio. Otro inconveniente es que la
enzima libre, al no tener certeza de qué cantidad permanece en el biodiesel, deja una huella
de proteína que afecta al desempeño del combustible y solamente se la puede utilizar una
sola vez.
8.3. Rendimiento de Biodiesel
En vista de que los mejores rendimientos fueron obtenidos con el alcohol metílico, seria
recomendable el uso de este alcohol para otras investigaciones usando lipasa de Rhizopus
oryzae y además ampliar las variables a ser analizadas.
64
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70
ANEXOS
71
ANEXO A. Hoja Técnica de la Enzima de Rhizopus Oryzae
72
Continuación ANEXO A
73
ANEXO B. Resultados del Análisis Fisicoquímico de la grasa de res
74
ANEXO C. Resultados del índice de yodo de la grasa de res
75
ANEXO D. Resultados del perfil lipídico de la grasa de res
76
Continuación ANEXO D
77
ANEXO E. Reporte fotográfico de la experimentación
78
Continuación ANEXO E