UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · así con buenos valores lo cual me ha ayudado a salir...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS CARRERA QUIMICA DE ALIMENTOS ESTUDIO DE LA ADULTERACIÓN DE LECHE CRUDA CON SUERO DE QUESERÍA, MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIENCIA (UPLC). Autor: Diana Carolina Jiménez Orejuela e-mail: [email protected] Tesis para optar por el Título Profesional de: QUÍMICA DE ALIMENTOS Tutor: Químico Raúl Bahamonde Msc. e-mail: [email protected] Quito, febrero, 2015
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA QUIMICA DE ALIMENTOS
ESTUDIO DE LA ADULTERACIÓN DE LECHE CRUDA CON SUERO DE QUESERÍA,
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIENCIA (UPLC).
Autor: Diana Carolina Jiménez Orejuela
e-mail: [email protected]
Tesis para optar por el Título Profesional de:
QUÍMICA DE ALIMENTOS
Tutor: Químico Raúl Bahamonde Msc.
e-mail: [email protected]
Quito, febrero, 2015
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Jiménez Orejuela, Diana Carolina (2015). Estudio de la
adulteración de leche cruda con suero de quesería, mediante
Cromatografía Líquida de Ultra Eficiencia (UPLC). Trabajo de
investigación para optar por el grado de Química de
Alimentos. Carrera de Química de Alimentos. Quito: UCE. 90
p.
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Dedicatoria
A:
Dedico esta tesis a Dios por darme fortaleza y perseverancia en estos años de estudio, a mi mamá
Mercedes Orejuela por inculcarme que “Cuando uno quiere uno puede”, frase que la aplicado
todos los días de mi vida, a ti te debo todo lo que soy, eres la mejor madre del mundo; a mi
familia por su apoyo incondicional, quiero que sepan que son mi inspiración y mis ganas de salir
adelante.
A mis profesores por transmitirme sus conocimientos, y hacer amar mi profesión.
A todos aquellos que me ofrecieron su mano amiga en los buenos y malos momentos, esas
personas son mis amigos a quienes les tengo mucha gratitud.
A Sebastián Barrera, que me brindo su amistad sincera y siempre estuvo a mi lado dándome una
palabra de aliento, muchas gracias.
“La dicha de la vida consiste en tener siempre algo que hacer, alguien a quien amar y
alguna cosa que esperar”. Thomas Chalmers
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AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias Químicas por todos los conocimientos
impartidos por los docentes ya que creyeron en mi para la culminación de mis estudios.
A mi director de tesis, el Químico Raúl Bahamonde Msc. Por su valiosa guía y asesoramiento
para la realización de esta investigación; él ha inculcado en mí, conocimientos, seriedad,
responsabilidad y rigor académico que han sido fundamentales para mi formación como
investigador.
A mis maestros, por ser los estímulos permanentes para superarme, que por su dedicación y fue
posible que haya culminado con éxito esta etapa de estudios.
A los miembros del tribunal: Dra. Lorena Goetschel y Dr. Wilson Parra, por el tiempo dedicado a
la revisión de esta tesis, y por aportarme su ayuda y experiencia.
A MI MADRE, por todo el sacrificio, esfuerzo y amor brindados en todos estos años, formándome
así con buenos valores lo cual me ha ayudado a salir adelante en los momentos más difíciles,
gracias a ella he podido culminar esta etapa de mi vida y convertirme en la persona que soy
actualmente, muchos de mis logros se los debo a ella.
A mi Tía Carmen y a mis hermanas Silvia y Belén cómplices que siempre han estado junto a mí,
aconsejándome , extendiéndome su mano amiga y siempre dispuestas a ayudarme a seguir con mis
proyectos.
A mis amigos:
Sebastián, Paul, Gabriela, Daniel, Rodrigo, por hacer de este tiempo de estudio el más corto y
divertido, gracias por estar a mi lado en los buenos y malos momentos, por sus palabras de
aliento, han sido muy importantes en mi vida sin ustedes no habría podido llegar a esta meta.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA
Quito, a 30 noviembre del 2015
Yo, Diana Carolina Jiménez Orejuela en calidad de autora del trabajo de investigación o tesis
realizada sobre “Estudio de la adulteración de leche cruda con suero de quesería, mediante
Cromatografía Líquida de Ultra Eficiencia (UPLC).”, por la presente autorizo a la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me
pertenecen o de parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás
pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
______________________________
Diana Jiménez O.
C.I. 172190493-4
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA DE ALIMENTOS
ACEPTACIÓN DEL TUTOR PARA LA ELABORACIÓN DE LA
TESIS
Por la presente, dejo constancia que he leído la Tesis presentada por la señorita Diana Carolina
Jiménez Orejuela para optar por el título profesional de Químico de Alimentos, cuyo tema es:
“ESTUDIO DE LA ADULTERACIÓN DE LECHE CRUDA CON SUERO DE QUESERÍA,
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIENCIA (UPLC).”; la misma
que reúne los requerimientos y méritos suficientes para ser sometido a evaluación por el Tribunal
Calificador.
En la ciudad de Quito a los 30 días del mes de noviembre de 2015
Firma del Tutor
______________________
Quim. Raúl Bahamonde Msc.
CI: 1717676389
vii
INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR DE TESIS
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CONTENIDO
CAPITULO I ........................................................................................................... 19
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 19
1.1. Planteamiento del Problema .................................................................. 19
1.2. Formulación del Problema .................................................................... 19
1.3. Objetivos de la Investigación ................................................................ 20
1.3.1. Objetivo general .................................................................................... 20
1.3.2. Objetivos Específicos ............................................................................ 20
1.4. Importancia y Justificación de la Investigación .................................... 20
CAPITULO II .......................................................................................................... 22
2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................... 22
2.1. Antecedentes ......................................................................................... 22
2.2. Fundamento Teórico ............................................................................. 24
2.2.1. Leche ..................................................................................................... 24
2.2.1.1. Características generales ....................................................................... 24
2.2.1.2. Composición proteica de la leche .......................................................... 25
2.2.1.3. La Caseína ............................................................................................. 25
2.2.2. Queso .................................................................................................... 26
2.2.3. Suero ..................................................................................................... 27
2.2.3.1. Características generales ....................................................................... 27
2.2.3.2. Clases de suero ...................................................................................... 27
2.2.3.3. Composición de los sueros del queso .................................................... 28
2.2.3.4. Composición química del suero ............................................................ 29
2.2.3.5. Proteínas del suero lácteo ...................................................................... 29
2.2.4. Glicomacropéptido ................................................................................ 30
2.2.4.1. Origen del Glicomacropeptido .............................................................. 30
2.2.4.2. Estructura del Glicomacropeptido ......................................................... 30
2.2.4.3. Peso Molecular ...................................................................................... 31
2.2.4.5. Efecto de los Glicomacropéptidos en la salud ....................................... 32
2.2.5. Proteólisis en la leche .......................................................................... 32
2.2.6. ...... Método para la determinación de suero en leches……………….33
2.2.7. Cromatografía........................................................................................ 34
2.2.8. Cromatografía liquida de ultra eficiencia .............................................. 35
2.2.8.1. Columna ACQUIALITY UPLC BEH200 ............................................ 37
2.2.8.2. Detector ................................................................................................. 37
ix
CAPITULO III ........................................................................................................ 39
3. METODOLOGIA ............................................................................................... 39
3.1. Tipo de Investigación ............................................................................ 39
3.2. Población y Muestra .............................................................................. 39
3.3. Diseño Experimental ............................................................................. 39
3.3.1. Diseño Metodológico ............................................................................ 39
3.3.2. Materiales y Reactivos .......................................................................... 41
3.3.3. Equipos .................................................................................................. 42
3.3.4. Preparación de patrones a partir de leche líquida. ................................. 42
3.3.4.1. Elaboración de la curva de estándar de calibración para detectar suero 43
3.3.5. Condiciones Cromatográficas ............................................................... 44
3.4. Materiales y Métodos ............................................................................ 45
3.4.1. Métodos y Técnicas ............................................................................... 45
3.4.2. Metodología .......................................................................................... 45
3.4.2.1. Preparación de muestras ........................................................................ 45
3.4.2.2. Leche líquida. ........................................................................................ 45
3.4.3. Evaluación del método .......................................................................... 46
3.4.3.1. Porcentaje de Recobro ........................................................................... 46
3.4.3.2. Linealidad y Precisión del método ........................................................ 46
3.4.3.3. Límite de Detección y Cuantificación ................................................... 47
3.4.4. Aplicación del método .......................................................................... 47
3.4.5. Procedimiento........................................................................................ 48
3.4.5.1. Análisis Cromatografía. ........................................................................ 48
3.4.6. Lectura e interpretación de los resultados ............................................. 48
3.4.7. Cálculos ................................................................................................. 48
CAPITULO IV ........................................................................................................ 51
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................. 51
4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................. 51
4.1. Desarrollo del método analítico. ............................................................. 51
4.1.1. Condiciones cromatográficas. ................................................................... 51
4.1.1.1. Condiciones para la detección UV del porcentaje de suero de quesería
adicionado a leche cruda. .......................................................................................... 51
4.2. Evaluación del método ............................................................................ 52
4.2.1. Estabilidad del Glicomacropéptido expresado como porcentaje de suero de
quesería en la leche cruda .......................................................................................... 52
4.2.2. Linealidad de sistema UPLC ..................................................................... 53
x
4.2.3. Linealidad del método. .............................................................................. 56
4.2.4. Precisión y recobro promedio en análisis replicados. ............................... 57
4.2.5. Límites de detección del método. .............................................................. 59
4.2.6. Límites de cuantificación .......................................................................... 59
4.3. Aplicación del método analítico en muestras reales de Leche Cruda ....... 60
4.3.1. Análisis Cuantitativo de las muestras de leche cruda ................................ 60
4.3.2. Cálculo de la concentración de suero ........................................................ 64
4.3.3. Análisis de varianza .................................................................................. 66
CAPITULO V .......................................................................................................... 69
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................ 69
5.1. CONCLUSIONES ........................................................................................ 69
5.2. RECOMENDACIONES ............................................................................... 69
5.3. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 70
Referencia Bibliografía ............................................................................................. 70
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla N.- 1 Concentración de las proteínas en la leche ............................................ 26
Tabla N.- 2. Clasificación de suero según su acidez .............................................. 28
Tabla N.- 3 Composición química del suero ............................................................ 29
Tabla N.- 4. Técnicas cromatográficas para determinar suero en leche ................... 34
Tabla N.- 5. Concentración de suero de quesería adicionado leche cruda .............. 42
Tabla N.- 6. Condiciones cromatográficas para determinar suero en leche UPLC .. 44
Tabla N.- 7. Estudio de la respuesta del Glicomacropeptido (GMP) en función de la
. de detección ........................................................................................................... 51
Tabla N.- 8 Preparación de soluciones para determinar estabilidad ......................... 53
Tabla N.- 9 Linealidad del sistema UPLC ............................................................. 54
Tabla N.-10 Linealidad del método ........................................................................ 56
Tabla N.-11 Estudio de precisión (repetibilidad) del método. Análisis de muestras de
leche cruda adicionadas 3% de suero de quesería n = 11, =0.05. 𝒕𝒏 − 𝟏, 𝟏 − 𝜶 =
𝟎, 𝟗𝟗=3,169…………………………………………………………………………58
Tabla N.- 12 Límites de detección del método ......................................................... 59
Tabla N.- 13 Límites de cuantificación .................................................................... 59
Tabla N.-14 Áreas de picos que identifican el pico de (GMP) en muestras de leche
cruda….. .................................................................................................................... 62
Tabla N.-15 Áreas de pico del blanco como de la leche adicionada suero de quesería
al 5%.... ...................................................................................................................... 63
Tabla N.- 16 lectura promedio de áreas de picos de cada una de las muestras
analizadas mediante cromatografía UPLC .............................. …………………….64
Tabla N.-17 Área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico de la
muestra ...................................................................................................................... 64
Tabla N.-18 Porcentaje de suero de quesería presente en las muestras de leche
cruda…. ..................................................................................................................... 65
Tabla N.-19 Análisis de varianza correspondiente a la variable contenido de suero
de quesería en leche cruda ......................................................................................... 66
TablaN.-20 Contenido de suero de quesería promedio en leche cruda ................... 66
Tabla N.-21 Comparación de tratamiento y diferencia entre medias para realizar la
prueba de Tukey al 5% de la variable de contenido de suero de quesería en leche
cruda….. .................................................................................................................... 67
Tabla N.-22 Determinación de diferencias significativas ......................................... 67
Tabla N.-23 Valores a utilizados en la prueba de Tukey .......................................... 67
Tabla N.-24 Representación de Rangos en unidades de Porcentaje ........................ 68
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura N.- 1 Estructura tridimensional del aCMP variante genética A y el gCMP (si
se une al tetrasacárido) a pH 7 y fuerza iónica nula. Se indican las zonas C- y N–
terminal y los dominios hidrofóbicos libres (Kreuȕ et al., β009) ............................. 31
Figura N.- 2 UPLC ................................................................................................... 35
Figura N.-3 filtros Milipore 0.22 µm tamaño de poro ............................................. 43
Figura N.-4 Muestras patrón ................................................................................... 44
Figura N.-5 Preparación de la muestra con ácido tricloroacético ............................ 45
Figura N.-6 Muestra lista para centrifugar .............................................................. 46
Figura N.-7. Glicomacropeptido (10 µL, 5%) inyectado directamente en el sistema
cromatográfico UPLC y eluído en modo isocrático a la longitud de onda de
201nm…………………………………………………………….. ......................... .52
Figura N.-8 Estabilidad de muestras de leche cruda adulteradas con 3 y 5 % de
suero de quesería, durante un periodo de prueba de 9 días. ...................................... 53
Figura N.- 9 Primera Curva De Calibración ............................................................ 54
Figura N.- 10 Segunda Curva De Calibración ......................................................... 55
Figura N.- 11 Segunda Curva De Calibración ......................................................... 55
Figura N.- 12 Primera Curva De Calibración ........................................................... 56
Figura N.- 13 Segunda Curva De Calibración .......................................................... 57
Figura N.- 14 Tercera Curva De Calibración ........................................................... 57
Figura N.-15 Cromatograma de muestra blanco corrida a 201 nm .......................... 61
Figura N.-16 Cromatograma de muestra de leche cruda adicionada ........................ 62
Figura N.-17 Cromatograma muestra de leche cruda adulterada con de suero de
quesería proveniente de la hacienda H7, corrida a 201 nm. [1] GMP, [2] proteínas de
la leche,(Interferencias) ............................................................................................. 63
Figura N.- 18 Promedio total de la concentración de suero de quesería detectado en
muestras de leche cruda proveniente de 3 haciendas de la asociación copla del cantón
Mejía las mismas que luego serían distribuidas en los centros de acopio de la ciudad
de Quito ..................................................................................................................... 65
xiii
LISTA DE ILUSTRACIONES
Ilustración N.- 1Sample manager del UPLC ........................................................... 17
Ilustración N.- 2 sistema cuaternario de solventes del UPLC ................................. 36
Ilustración N.- 3 Sistema rotatorio mecánico UPLC ............................................... 37
Ilustración N.-4 Funcionamiento del detector .......................................................... 38
xiv
LISTA DE ECUACIONES
1) Ecuación del Porcentaje de Recobro ............................................................. 46
2) Ecuación Límite de Detección ...................................................................... 47
3) Ecuación prueba Tukey ................................................................................. 48
4) Cálculo del coeficiente de respuesta ............................................................. 49
5) Cálculo del área relativa del pico III obtenido del análisis cromatográfico de
la muestra........................................................................................................ 49
6) Cálculo del área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico
del patrón de leche cruda exenta de suero de quesería. ............................................. 49
7) Cálculo del tiempo de retención relativo del pico III en la muestra. ............. 50
8) Cálculo del porcentaje de suero de quesería presente en la muestra. ............ 50
xv
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. Preparación de soluciones ...................................................................... 73
ANEXO 2. Tabla Militar estándar ........................................................................... 74
ANEXO 3 Resultados del análisis de las muestras recolectadas de las 8 haciendas
de la Asociación COPLA .......................................................................................... 77
ANEXO 4. Norma técnica ecuatoriana INEN -2401 Determinación de suero de
quesería en la leche fluida y en polvo. Método de cromatografía líquida de alta
eficacia. ...................................................................................................................... 78
ANEXO 5. Norma técnica ecuatoriana INEN -9:2012 quinta revisión para leche
cruda. 85
ANEXO 6. Certificado traducción del resumen documental .................................... 90
xvi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El trabajo de investigación “ESTUDIO DE LA ADULTERACIÓN DE LECHE CRUDA CON
SUERO DE QUESERÍA, MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ULTRA
EFICIENCIA (UPLC)” se llevó a cabo el muestreo en la ASOCIACIÓN COPLA
(CORPORACIÓN PRODUCTORA DE LECHE DE ALOAG) DE LA PARROQUIA DE ALOAG
DEL CANTON MEJÍA, de la provincia de Pichincha, y el análisis de las muestras se realizó en el
laboratorio de Control de Calidad de Leche de AGROCALIDAD, ubicada en el valle de Tumbaco
al norte de la ciudad de Quito.
xvii
RESUMEN DOCUMENTAL
La adulteración de leche cruda adicionando suero de quesería se ha vuelto un fraude común hoy en
día en nuestro país, lo que incide en un pago injusto por una leche adulterada como si se tratase de
leche de primera calidad.
Este tipo de adulteración es detectable debido a que en el proceso de elaboración de quesos se
rompe la principal proteína de la leche (caseína), dejando un residuo denominado
Glicomacropeptido (GMP). El objetivo de este trabajo fue estudiar la adulteración de leche cruda
con suero de quesería, mediante cromatografía líquida de ultra eficiencia, la misma que nos permite
cuantificar el GMP. El método fue estandarizado evaluando el límite de detección, límite de
cuantificación, linealidad y precisión (expresada como repetibilidad) mediante la adición de suero
en concentraciones entre 0%–15% a leche cruda. La investigación se realizó en el laboratorio de
Control de Calidad de Leche de Agrocalidad, mediante un muestreo compuesto en 8 haciendas
ubicadas en la parroquia Alóag del Cantón Mejía con el propósito de detectar GMP; encontrándose
37.5% de muestras positivas. Se tomaron 100 ml de leche cruda de cada una de las 8 haciendas
durante una semana, para luego ser analizados por triplicado por cromatografía líquida de ultra
eficiencia (UPLC). Tres muestras presentan porcentajes de suero de quesería de 7,85%, 2,01% y
0,63% respectivamente. Con base en los resultados obtenidos en las muestras de leche cruda se
concluye que estas muestras de leche no cumplen con los parámetros establecidos en la Norma
INEN 9:2012.
PALABRAS CLAVE: GLICOMACROPEPTIDO, LECHE CRUDA, SUERO DE
QUESERÍA, CROMATOGRAFÍA UPLC.
xviii
ABSTRACT
The adulteration of raw milk by adding cheese whey has become a common fraud
nowadays in our country, what inside in an unfair pay for an adulterated milk as if it was a
first quality milk.
This type of adulteration is detectable due to the fact that the cheese making process breaks
down the major protein of milk (casein), leaving a residue called glycomacropeptide
(GPM). The objective of this work was to study the adulteration of milk raw with cheese,
using ultra performance liquid chromatography, which allows us to quantify the GPM. The
method was standardized to evaluate the detection, quantification, linearity and precision
limits (expressed as repeatability) by the addition of serum concentrations between 0% -
15% to raw milk. This research was carried out in the quality control laboratory of milk of
Agrocalidad, through a composed sampling made in 8 farms located in Aloag parish,
Canton Mejia with the purpose of detecting GMP; it was found a 37.5% of positive
samples. It took 100 ml of raw milk from each of the 8 farms for a week, to be analyzed in
triplicate by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). Three samples show
percentages of 7.85% cheese whey, 2.01% and 0.63% respectively. Based on the results of
samples of raw milk has concluded that these milk samples do not comply with the
parameters established in the standard INEN 9:2012.
KEY WORDS: GLYCOMACROPEPTIDE, RAW MILK, CHEESE WHEY,
CHROMATOGRAPHY UPCL.
19
CAPITULO I
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Planteamiento del Problema
El Glicomacropéptido (GMP), es una proteína que se produce por degradación de las caseínas
presentes en la leche por efecto de enzimas o bacterias, la mayor parte se produce en la
fabricación de quesos (para el que se emplean proteasas que rompen específicamente la
caseína produciendo el GMP), un incremento de su concentración en la leche suele ser
indicativo de adulteración de esta, con suero de quesería. Actualmente en nuestro país se han
suscitado casos de la probable adulteración de leche cruda con suero de quesería, lo que
ocasiona un problema de engaño hacia los pequeños y grandes consumidores lo que resulta en
el pago del mismo valor por una leche cruda de mejor calidad que por leche cruda adicionada
suero de quesería.
El país cuenta con métodos cualitativos para la detección de adulteración de leche cruda con
suero de quesería como el test StickcGMP1. Para la determinación del porcentaje de suero
añadido, la norma INEN 2401:2008 propone un método utilizando un HPLC2.
En comparación con HPLC que puede ser utilizado como un método cuantitativo para la
determinación de GMP, el UPLC3 genera análisis en tiempos cortos, debido a que los tiempos
de retención de los analitos son menores, provocando un ahorro en cuanto a los tiempos de
análisis, y reactivos utilizados para cada muestra, lo cual la convierte en una técnica eficiente,
sensible y rápida, para la determinación de la adulteración de leche cruda con suero de
quesería.
1.2. Formulación del Problema
La deficiente número de metodologías que permitan determinar el porcentaje de suero de
quesería añadido a la leche cruda incide en un pago injusto por leche adulterada como si se
tratase de leche de primera calidad regida bajo norma INEN 9:2012 quinta revisión.
Es posible el uso de metodologías como las que utilizan HPLC que genera un tiempo de
análisis relativamente largo en comparación con el tiempo de análisis del UPLC.
A pesar de que estas dos técnicas arrojan datos cuantitativos, la utilización del UPLC
posibilita un mayor número de análisis por día, dando resultados confiables.
1StickcGMP: Kit rápido de detección Glicomacropéptido 2 HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Eficacia o High Performance Liquid Chromatography 3UPLC: Cromatografía Líquida de Ultra Eficacia o Ultra Performance Liquid Chromatography
20
1.3. Objetivos de la Investigación
1.3.1. Objetivo general
Estudiar la adulteración de leche cruda con suero de quesería, mediante Cromatografía Líquida de
Ultra Eficiencia (UPLC) en la asociación COPLA (Corporación Productora de leche de Alóag) de
la parroquia Alóag, cantón Mejía”.
1.3.2. Objetivos Específicos
Desarrollar y evaluar la metodología para la determinación de GMP presente
en suero de quesería en leche adulterada, mediante el uso del equipo UPLC.
Determinar el número de muestras a ser analizadas por la técnica desarrollada,
mediante la tabla militar estándar.
Cuantificar mediante el método UPLC el porcentaje de suero de quesería
presente en leche cruda adulterada de los diferentes proveedores ubicados en
la Asociación COPLA (Corporación Productora De Leche De Alóag)
parroquia de Alóag del Cantón Mejía provincia de Pichincha.
Comparar los datos obtenidos con la Norma INEN 9:2012 de LECHE
CRUDA. REQUISITOS.
1.4. Importancia y Justificación de la Investigación
Importancia y Justificación
La importancia de la presente investigación radica en que el país contará con un método eficiente
sensible y rápido para la determinación de GMP por cromatografía UPLC en leche adulterada con
suero de quesería.
Actualmente en Ecuador adicionar a la leche suero lácteo se ha vuelto una práctica común, los
motivos son principalmente el elevado costo de la eliminación de residuos generados en la
producción quesera ( suero de quesería), que al ser desechado dicho suero de forma inadecuada o
irresponsable provoca una contaminación ambiental; por otra parte, el suero por proceder de la
leche no altera significativamente su composición, lo que lo convierte en un producto muy
atractivo para ser añadido a la misma. Esta práctica provoca grandes pérdidas para el sector lechero
y más aún a las industrias, debido a que los grandes volúmenes de producción, hacen imposible
controlar la adulteración de leche cruda con suero de quesería, parámetro que debe ser controlado a
diario en las plantas de procesamiento y centros de acopio.
Por este motivo esta investigación pretende obtener datos estadísticos sobre índices de adulteración
de leche cruda por parte de los productores, mediante un método de análisis sensible y rápido,
21
generando así una herramienta de control de la adulteración de leche cruda. Y contribuyendo a un
pago justo por productos de buena calidad y que cumpla los requisitos de la Norma INEN 9:2012
LECHE CRUDA. REQUISITOS, quinta revisión.
Los “beneficiarios” de los resultados de este estudio serán la Agencia Ecuatoriana de
Aseguramiento de la Calidad – Agrocalidad, Laboratorio Control de Calidad de Leche.
22
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes
En esta investigación se utilizó la Cromatografía Líquida de Ultra Eficiencia para lograr la
cuantificación de suero de quesería adicionado a la leche cruda,
En Ecuador se produce alrededor de 5’100.000 litros de leche diarios que abastecen la demanda
local. (FAO, 2014). Es de gran relevancia, conocer la calidad de la leche comercializada en el país.
El Glicomacropéptido (GMP), es producto de la separación de kappa caseína por la acción de la
quimosina durante la precipitación de las caseínas en el proceso de elaboración del queso. (R & M,
1993). Razón por la cual este péptido es el indicativo de la adición de suero de quesería que es un
componente lácteo natural de mucho menor valor económico, generando así una mayor
rentabilidad pero a su vez constituye un fraude para los consumidores.
El problema radica en que la venta de leche cruda adicionada suero de quesería genera el
incumpliendo de la norma INEN 2401:2008, en el año 2006 el INEN mediante la norma técnica
NTE 2401:2006 estableció en el numeral 6.1.2 que a las leches pueden agregarse suero lácteo y
concentrados de suero. Pero dos años después en el 2008 tras una revisión de esta norma se
establece al suero de quesería como un adulterante y no consta entre los productos que pueden
agregarse a la leche.; por lo que ahora en tiendas y supermercados se expendería libremente leche
mezclada con suero pese a la restricción. (La Hora, 2010).
Investigaciones anteriores plantearon la “Adulteración de leche pasteurizada con suero de quesería
en la ciudad de Aguascalientes” y “Detección de glucomacropéptido(GMP) como indicador de
adulteración con suero de quesería en leche deshidratada” para lo cual determinan la adulteración
en leche pasteurizada y deshidratada, mediante cuantificación de GMP por electroforesis en gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE), espectrofotometría de luz visible cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC) en ambos casos se trabajó con leches comerciales y su nivel de detección fue de
1.85%. (Reyes, Bon, Moreno, Rubio, & Valdivia, 2007). (Claudia, Jorge, Carlos, & Silvia, 2000).
(Alcazar, 2003)
En la investigación denominada “Detección de suero de quesería en leche en polvo por HPLC de
filtración por gel (GFC-HPLC)”, sobre la detección de GMP, se afirma que se usó leche en polvo
reconstituida para el filtrado, usaron una columna de Gel de alta resolución (GFC-HPLC), un
Cromatógrafo KNAUER. Las muestras analizadas fueron 13 de las cuales 3 contenían
concentraciones detectables de suero de quesería y el límite de detección calculado fue de 0,8%. (E,
P, & M, 2001)
23
“Detección de adulteración de leche con suero de quesería por medio de un sistema tipo Elisa”
detalla el desarrollo de un sistema de anticuerpos para una detección más rápida, sencilla, con alta
sensibilidad y precisión que les permitan a los compradores de leche tener un método que detecte la
adulteración hasta una concentración hasta de 0.5% (p/v) de GMP. La investigación se realizó en la
Universidad Autónoma de Aguascalientes área de Ciencias Químicas (Chavez Vela, 2009).
En la investigación “Detección de adulteración de leche con suero mediante la relación proteica
sérica/caseinato” en este caso para determinar este tipo de adulteración utilizaron el método
kjeldahl para obtener los porcentajes de proteína total, sérica y caseína y lo compararon con un
PROMILK MKLL que se usa para determinar proteína total siendo este un método más rápido para
cuantificar proteína total, aquí no se analiza GMP como indicador de adición fraudulenta de suero
de quesería en la leche el cual fue detectable por encima del 10% de suero añadido. (José & Luis,
1992)
“Determinación de los componentes y adulteración de la leche empleando la espectroscopia de
FTIR” (Instituto Politécnico Nacional CIBA, TLAXCALA). En este trabajo se presenta una
metodología alternativa, basada en la espectroscopia de infrarrojo, para identificar los principales
componente de la leche así como para determinar la presencia de suero de quería en leche (suero de
queso tipo panela y OXACA. (Ortiz Ramirez, 2009)
“Aislamiento y rendimiento del GMP mediante precipitación de lactosuero con ácido
tricloroacético”. Que fue desarrollado en la Facultad de Ciencias Veterinarias de Universidad del
Zulia. Se evaluó uno de los métodos menos laboriosos y costoso para el aislamiento de este
péptido, para que se establezcan las condiciones experimentales que permitan producirlo de la
manera más pura a escala industrial (Rojas & et, 2009).
Detección de suero de queso en leche en polvo por isoelectro enfoque; en esta investigación se
desarrolló un método para la detección de Glicomacropéptidos, presente en suero de queso en leche
en polvo, por isoeléctrico enfoque en gel de poliacrilamida ANMAT (2009).
El test de StickcGMP es un test inmunocromatográfico para la detección cualitativa de
Glicomacropéptido de caseína de leche. Es muy sensible puede indicar adulteraciones del 4% de
suero de queso en leche y de un 2- 1% si las condiciones de ordeño conservación y traslado son las
óptima. La desventaja de este método es su elevado costo.
Se han realizado varias investigaciones para la determinación de suero de quesería en leche, pero la
mayor parte de estas investigaciones se realizaron en leche pasteurizada, ninguna de ellas en leche
cruda, por lo que esta investigación pretende implementar un método de cuantificación de suero de
quesería en leches crudas adulteradas mediante Cromatografía Líquida de Ultra Eficiencia (UPLC)
y al mismo tiempo obtener un estudio de la adulteración de leche cruda con suero de quesería en la
24
Asociación COPLA (Corporación Productora de Leche de Alóag) de La Parroquia Alóag Cantón
Mejía”.
2.2. Fundamento Teórico
2.2.1. Leche
La leche es un alimento cuya composición es equilibrada en cuanto a nutrientes, como son
azúcares, grasa, y proteína, a más de ello micronutrientes minerales, vitamínicos y aminoácidos
esenciales. El consumo mundial de leche es masivo, cerca de 500 millones de toneladas/año, por
ello se ha visto un gran avance en la ganadería. (Primo Yúfera, 1998)
2.2.1.1. Características generales
La leche es un alimento es perecedero que puede descomponerse rápidamente, debida a la carga
microbiana, por ello lo primero que se debe hacer es refrigerar una vez extraída del animal.
Está constituida de tres fases: una acuosa en la cual están disueltos los azucares, sales proteínas,
vitaminas y aminoácidos. Otra fase sólida en estado coloidal la cual contiene proteínas
principalmente caseína, fosfatos y otras sales insolubles de calcio. La tercera fase es lipídica
emulsionada formada por grasa esteroles como el colesterol, y vitaminas liposolubles A y D.
“El color de la leche es blanco debido a que las partículas coloidales que dispersan la luz y
ligeramente amarillenta por la presencia de carotenoides, vitamina A y lactoflavina”. (Primo
Yúfera, 1998)
Su densidad es aproximadamente de 1.035g/ml según su contenido de grasa y pH=6.6.
La composición de la leche varía de acuerdo a las razas ganaderas, estación, pastos. Su valor
biológico es muy alto aproximadamente 90% respecto a la pauta de la FAO.
Actualmente la forma de consumirla es luego de un tratamiento térmico y cuidando la inocuidad
del producto en el mercado podemos encontrar la leche pasteurizada que es de vida corta y
requiere refrigeración, esterilizada por tiempos cortos y a altas temperaturas UHT4 y no requiere
refrigeración hasta que se abre el envase. Con esto lo que logramos es reducir la carga microbiana y
alargar los tiempos de vida útil. (Primo Yúfera, 1998)
4 UHT: Ultra HighTemperature ( Temperatura Ultra Alta)
25
2.2.1.2. Composición proteica de la leche
La composición de la leche es la que nos permite determinar su calidad nutritiva, su valor como
materia prima para la elaboración de alimentos. A más de carbohidratos, lípidos, agua, vitaminas y
sales minerales, la leche contiene proteínas en una proporción de 30 a 36g de proteínas/litro de un
alto valor biológico, constituyendo ésta la fracción más compleja.
Las proteínas son de dos tipos: la caseínas, en suspensión coloidal que son un grupo de proteínas
específicas de la leche, que contienen fosfato y son insolubles a pH 4.6 y 20º C y representan el
80% de las proteínas de la leche, y las proteínas de suero principalmente lactoglobulina y
lactoalbúmina, que permanecen en disolución al citado pH y son el 20% restante de las proteínas de
la leche. Además, existen las denominadas proteínas menores y las enzimas, que aunque son
despreciables en peso, tienen una actividad importante.
Respecto a la fuente de la FAO5 las proteínas de la leche son deficientes en aminoácidos esenciales
como son la metionina y cisteína y ligeramente deficientes en triptófano.
2.2.1.3. La caseína
La caseína es un complejo de fosfoproteínas y glicoproteínas en suspensión coloidal formando
micelas estables, que son complejos esféricos con un 92% de proteína y un 8% de sales
inorgánicas, principalmente fosfato cálcico. La caseína se separa por electroforesis en 4 tipos de
cadenas polipeptídicas: αs1-caseína (αs1-CN), αs2-caseína (αs2-CN), β-caseína (β-CN) y κ-caseína
(κ-CN). Las diferentes caseínas tienen variantes por cambio de algún aminoácido y por diferencias
de azúcares, estas diferencias se dan según la raza de ganado. Como se muestra en la Tabla n.-1.
Las moléculas de alfa-, beta- y κ-caseína se agrupan de tal manera que forman un núcleo hidrófobo
y una superficie polar e hidrófila debido a que en esta parte quedan los grupos fosfato y los
azúcares, de esta manera se estabiliza la suspensión coloidal.
La unidad estructural de la caseína en la leche es una submicela formada por 25-30 unidades de
alfa-, beta- y κ-caseína, esta unión es através de puentes de Ca2+.
La coagulación de la caseína da lugar a la leche cuajada que encontramos en el queso y en el yogur
a pH=7 las micelas de caseínas son estables incluso si la temperatura es de 125°C, pero si el pH
disminuye se produce esta coagulación. La cual puede inhibirse añadiendo secuestrantes de Ca2+.
Otra manera de coagular la caseína es añadiendo la denominada renina que es una proteasa de la
pared estomacal de los mamíferos, esta enzima actúa directamente en la κ-caseína, hidrolizando
5 FAO: La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura.
26
dos enlaces peptídicos. Se separa un glicopéptido corto constituido por 64 AA6 que queda en el
suero y un péptido más largo de 105 AA que queda en la micela y no contiene azúcares, con ello la
micela pierde estabilidad y se cuaja la leche. Algunas proteínas de plantas y microbianas ejercen la
misma acción. (Primo Yúfera, 1998).
Tabla N.- 1 Concentración de las proteínas en la leche
Proteína Concentración en la leche
(g/kg) % de la Proteína total (p/p)
Proteína 33.0 100.0
Caseínas 26.0 79.5
:αs1-caseína αs1-CN)
αs2-caseína (αs2-CN)
β-caseína (β-CN)
κ-caseína (κ-CN)
γ-caseína (γ-CN)
10.0
2.6
9.3
3.3
0.8
30.6
8.0
28.4
10.1
2.4
Proteína de suero 6.3 19.3
β-lactoglobulina
α-lactoalbumina
Inmunoglobulinas
Seroalbumina
varias
3.2
1.2
0.7
0.4
0.8
9.8
3.7
2.1
1.2
2.4
Proteína de la membrana del
glóbulo graso 0.4 1.2
Nota. Fuente: Walstra, P., Jenness, R., & Badings, H. T. (1984). Dairy chemistry and physics. New
York: John Wiley.
2.2.2. Queso
Los quesos son producto de la coagulación de la caseína, en ellos se retienen grasa, proteínas,
sales y ciertos compuestos del suero; durante la fermentación del queso se producen aromas típicos.
El proceso para la obtener queso es: pasterización de la leche, inoculación con la flora microbiana
específica, coagulación de la caseína, separación del suero, salado, maduración.
6 AA: aminoácido
27
Para lograr la coagulación de la caseína se emplean dos métodos: el primero es la adición de renina
o cuajo o proteasas análogas, las cuales disminuyen el pH produciendo ácido láctico y el segundo
es acidificar en el punto isoeléctrico de las caseínas (pH= 4.6). (Primo Yúfera, 1998)
La separación del suero de quesería se produce mediante la exudación de la masa una vez que ha
sido cortada agitada y prensada. El suero extraído en nuestro país no es bien aprovechado por lo
que en la mayoría de las industrias queseras se lo desecha. Este suero contiene el péptido GMP el
cual se forma de la ruptura de la k-caseína, por ende este analito es el indicativo de una
adulteración ya que la leche cruda no posee este analito.
2.2.3. Suero
A partir de 10 litros de leche se obtienen de 1 a 2 kg de queso y de 8 a 9 kg de suero de quesería.
Como subproducto de la fabricación de quesos se obtiene el suero de quesería o suero dulce, es la
fracción de la leche, que no precipita por la acción del cuajo o por los ácidos, durante el proceso de
elaboración de quesos constituye el 90% de la leche y contiene compuestos hidrosolubles. En esta
solución se encuentran proteínas solubles, lactosa, vitaminas y sales minerales. El suero es una de
las mayores reservas de proteínas alimentarias que aún permanecen fuera de los canales de
consumo humano.
2.2.3.1. Características generales
El lactosuero es una sustancia de alto valor nutritivo, pero muy contaminante al contacto con el
agua y su proceso es costoso. La inadecuada eliminación del suero trae asociado un alto impacto
medioambiental por su alto poder contaminante.
El suero corresponde a un líquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de sabor fresco,
débilmente dulce, de carácter ácido, con un contenido de nutrientes o extracto seco del 5,5% al 7%
proveniente de la leche. (Primo Yúfera, 1998)
2.2.3.2. Clases de suero
Existen dos tipos que se diferencian por su forma de obtención:
a) El llamado suero dulce, proveniente de los quesos fabricados con renina. a mayoría de este
suero se compone de nitrógeno no proteico (22% del total) y tiene una gran concentración de
lactosa (cerca del 51 % de todo el suero); es el más rico en proteínas (7%) pero muy pobre en
cuestión de ácido láctico (0%). El resto del suero es un conjunto de sales, minerales y grasas que
varían de especie a especie. El pH oscila entre 6,4 y 6,6.
b) El suero ácido que utiliza ácido acético para la precipitación este es un subproducto de los
quesos blanco y cottage, y debido a su pH 4.6 es muy corrosivo para los metales. Contiene una
28
mayor proporción de nitrógeno no proteico (27% del total) y posee menos lactosa en concentración
(42%) ya que, por provenir de leches ácidas, parte de la lactosa se convierte en ácido láctico por la
fermentación. Por ello, tiene más cantidad de ácido láctico (10%) y debido a la desnaturalización es
más pobre en proteínas (6,0%).La fabricación de caseína precipitada por ácidos minerales da lugar
a un suero ácido con un pH de 4.3-4.6. (Badui, 2006).
2.2.3.3. Composición de los sueros del queso
La composición química de suero puede variar de acuerdo a la manufacturación, tipo de queso y
leche usada.
El suero contiene la mayor parte de los componentes insolubles de la leche de la cual procede, es
rico en lactosa, se puede decir que contiene la mitad de las cenizas y hasta una cuarta parte de las
proteínas de la leche, contiene alrededor del 50% de los nutrientes de la leche original; proteínas
solubles, lactosa, vitaminas y sales minerales. (Pintado, 2012)
Dependiendo del origen de la leche, el tipo de queso que se produce, y las variaciones del proceso,
el tipo de suero será diferente. Una clasificación de suero viene en función de su acidez como se
indica en la Tabla N.- 2.
Tabla N.- 2. Clasificación de suero según su acidez
TIPOS DE SUERO ACIDEZ (%) pH
Suero dulce 0.10-020% 5.8-6.6
Suero medio ácido 0.20-0.40% 5.0-5.8
Suero ácido 0.40-0.60% 4.0-5.0
Nota. Fuente: Loaiza, 2011
29
2.2.3.4. Composición química del suero
El suero considerado como más valioso es el obtenido luego de la coagulación de la caseína por
enzimas del tipo renina que es un suero dulce, el suero ácido es de baja calidad nutricionalmente
hablando. Ver Tabla N.-3 la composición de ambos sueros.
Tabla N.- 3 Composición química del suero
Composición de los sueros del queso
PROPIEDAD Suero Dulce
(%)
Suero Ácido
(%)
Sólidos totales 6.5 5.2
Lactosa 4.9 4.3
Proteína 0.8 0.6
Nitrógeno no
protéico (% del
total)
22.0 27.0
Ácido láctico 0.15 0.75
Cenizas 0.56 0.46
pH 6.2 4.6
Nota. Fuente: Badui, S. (2006). Química de los Alimentos (cuarta ed.). Pearson Educación.
2.2.3.5. Proteínas del suero lácteo
Las proteínas presentes en el suero lácteo representan el 20% de las proteínas de la leche de vaca.
Entre estas proteínas se incluyen α-lactoalbúmina,β-lactoglobulina, lactoferrina, inmunoglobulinas,
una gran variedad de factores de crecimiento y Glicomacropéptidos este componente es específico
del suero y por lo tanto debería estar ausente en la leche, por medio del GMP se puede detectar si
una leche ha sido adulterada por adición de suero de quesería. La lactoglobulina y lactoalbúmina
precipitan a 100°C y pH=4.5, son más equilibradas en cuanto a AA y de mayor valor biológico que
la caseína.
Las inmunoglobulinas proceden de la sangre de la madre y otras son sintetizadas en la glándula
mamaria,
La lactoferrina tiene la capacidad de fijar y transportar hierro y a más de ello es la encargada de la
absorción de este micronutriente. (Miranda, Ponce, Fonseca, Cutiño, Díaz, & Cedeño, 2009)
30
2.2.4. Glicomacropéptido
El glicomacropéptido (GMP) es un péptido que presenta numerosas propiedades bioactivas en esta
investigación lo estudiaremos debido a que es el analito por el cual se puede detectar la
adulteración de leche cruda por adición de suero de quesería, lo cual conlleva a un fraude para los
consumidores.
“El GMP representa la secuencia C-terminal de la k-caseína desde el residuo 106Met al 169 Val.
Por lo cual es definido como un péptido soluble en ácido tricloroacético del 2 al 12%, dializable a
través de membranas de celulosa, que contienen menos fosforo que la caseína de la cual se parte y
no posee aminoácidos aromáticos. Contiene un 74% de los glúcidos de la caseína origina”l. (R &
M, 1993)
2.2.4.1. Origen del Glicomacropeptido
Cuando la k-caseína es tratada con la quimosina durante la obtención de quesos, la proteína es
hidrolizada entre los aminoácidos 105 y 106 de la k-caseína, que son fenilalanina y metionina
respectivamente, dando como resultado dos fracciones que son: para k-caseína (residuo 1 – 105) y
GMP (residuo 106 – 169) el cual es removido con el suero de quesería. El GMP queda soluble en el
suero después de separar la cuajada, pero no está presente en la leche ni el “suero ácido” descrito
en el punto 2.2.3.2, por lo tanto la detección de GMP puede utilizarse como indicador de presencia
de suero de quesería.
2.2.4.2. Estructura del Glicomacropeptido
El GMP está formado por 64 aminoácidos, la solubilidad es debida al gran número de grupos
hidroxilos de los glúcidos y de los hidroxiaminoácidos presentes. (Alais, 2003). El GMP posee
alrededor de 11 variaciones estructurales, pero de las 11, 2 son las variaciones dominantes, y están
distribuidas de la siguiente manera en la posición 136 la variante A posee treonina y la variante B
isoleucina, mientras que en la posición 148, la variante A posee un residuo de aspártico y la
variante B un residuo de alanina.
Nota. Fuente: (López Fandiño, 1992)
31
El GMP no tiene aminoácidos aromáticos (Phe, Trp, Tyr) en su estructura. Contiene solo un
residuo de metionina, rico en aminoácidos de cadena ramificada como son la valina e
isoleucina, pobre en aminoácidos esenciales como por ejemplo arginina, cisteína e histidina. Y se
puede decir que tiene alto contenido de treonina.
Figura N.- 1 Estructura tridimensional del aCMP variante genética A y el gCMP (si se une al
tetrasacárido) a pH 7 y fuerza iónica nula. Se indican las zonas C- y N–terminal y los dominios
hidrofóbicos libres (Kreuȕ et al., β009)
2.2.4.3. Peso Molecular
“Las formas A y B del GMP no glicolisado tienen una masa molecular teórica de 6787 y 6755 Da,
respectivamente y el GMP altamente glicosilado de la variante A tiene una masa molecular de
9631 Da. La masa molecular promedio es aproximadamente 7500 Da”. (Farías, 2012)
2.2.4.4. Punto Isoeléctrico
Las proteínas son caracterizadas por su punto isoeléctrico, que es el pH en el cual su carga neta es
cero. El valor preciso del punto isoelectrico del GMP depende de su origen, contenido de cadenas
de carbohidratos, y grado de fosforilación, de acuerdo con esto el punto isoeléctrico es 3,15 y 4,15
para gGMP y aGMP, respectivamente. Cabe mencionar que el pI7 del GMP es menor al de otras
proteínas del suero de quesería. (Farías, 2012)
7 pI: Punto Isoeléctrico
32
“La α-lactoalbunima, β-lactoglobulina y la seroalbúmina son proteínas del suero de quesería y
tienen un pI de 4,8, 5,3 y 5,1, respectivamente. Las inmunoglobulinas tienen un alto pI: la Ig1
tiene un pI de 5,5-6,8 y la Ig2 entre 7,7 y 8,3”. (Farías, 2012)
2.2.4.5. Efecto de los Glicomacropéptidos en la salud
Efecto en la motilidad gastrointestinal
Quiere decir que reduce la secreción gástrica, de esta manera previene diferentes tipos de diarreas.
Efecto sobre la actividad inmunomodulante
Fortalece al organismo humano y lo ayuda a prevenir enfermedades causadas por diversos
microorganismos. (López Fandiño, 1992)
Efecto sobre la actividad antitrombótica
Posiblemente uno de los papeles fisiológicos más importantes asociados con este péptido es su
actividad antitrombótica, pues evita la formación de coágulos responsables de la obstrucción del
flujo sanguíneo, lo que ocasiona graves riesgos a la salud. Estos padecimientos constituyen una de
las causas más frecuentes de mortalidad en los países industrializados. (López Fandiño, 1992)
Efecto sobre el control del apetito
Otra actividad biológica que, según se ha descubierto, lleva a cabo es la supresión del apetito. Por
lo tanto, el uso de este ingrediente posibilitará el desarrollo futuro de alimentos que prevengan la
obesidad y que ayuden a controlar el apetito.
Efecto contra la fenilcetonuria
Este péptido carece de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptofano), por lo que se ha
propuesto su uso como complemento alimenticio en pacientes que padecen de fenilcetonuria, que
es una enfermedad genética en la que hay dificultad para metabolizar la fenilalanina, aumentando
sus niveles sanguíneos y ocasionando retraso mental.
Otros efectos
Hay estudios que describen al glicomacropéptido como un alimento hipoalergénico; del mismo
modo, se ha puesto en evidencia que tiene un sabor agradable y que es de fácil absorción y
digestión. Por ende, su uso en los complementos alimenticios podría mejorarlos sensorialmente y
optimizar la absorción de las proteínas que hay en dichos productos.
Por lo mencionado anteriormente anterior, será necesario no pasar por alto los avances que se
logren en este campo, así como apoyar los proyectos de investigación que proporcionen mayor
información acerca de los beneficios que brinda el glicomacropéptido presente en el suero de
queso.
(Barí, Jiménez, Martínez-Férez, & Bauza, 2001)
2.2.5. Proteólisis en la leche
La proteólisis puede ser debido a la acción de una de las proteasas naturales de la leche, la proteasa
alcalina o plasmina; sin embargo, las consecuencias tecnológicas más graves se deben a la acción
33
de las proteasas de las bacterias psicrótrofas, cuyos efectos se manifiestan en las leches
refrigeradas, incluso con niveles de población relativamente moderados. Las proteasas producidas
por bacterias psicrotróficas actúan en forma de caseína similar a la quimosina, liberación de
caseinomacropéptido (CMP o GMP). (Pereira Da Silva & Alonso, 2009)
Las proteasas atacan preferentemente a ciertas fracciones caseínicas de la leche, degradándolas en
el orden κ-CN >β-CN >α-CN. Las modificaciones más importantes en las caseínas de la leche UHT
son producidas por las proteasas termorresistentes de las bacterias psicrótrofas. La degradación de
las proteínas de suero se ha observado menos frecuentemente y, normalmente, no se degradan por
los microorganismos presentes en la leche.
Algunas proteasas de Pseudomonas degradan la κ-CN dando lugar a la para-κ-CN y, por tanto, se
pierde la capacidad de estabilizar las micelas de caseínas, pudiendo llegar a coagular la leche de
forma similar a lo que ocurre por acción del cuajo. Se considera que la proteólisis en la que se
observa un incremento del NNP y la formación de para-κ-CN, se debe a la acción de las proteasas
bacterianas, mientras que la plasmina, enzima nativa de la leche, produce un aumento del nitrógeno
no caseínico (NNC) y la formación de γ-CN. Por una parte, la degradación de las caseínas
anteriormente citada afectaría a la relación GMP/suero.
A pesar de la existencia de otros procesos degradativos como los relacionados con la actividad de
bacterias presentes en la misma leche, la concentración de GMP producido por estas bacterias no es
considerable. (Pereira Da Silva & Alonso, 2009)
2.2.6. Método para la determinación de suero en leches
Se han desarrollado diversos métodos para detectar leche adulterada con suero de quesería,
diferenciándose estos por la sensibilidad y complejidad de los análisis. Muchos de ellos
proporcionan sólo ligeras indicaciones, pero nunca pruebas definitivas; sin embargo, los métodos
basados en la determinación del glicomacropéptido (GMP) del suero de quesería son los más
confiables, por ser éste un componente específico del suero, y por tanto debería estar ausente en la
leche.
Métodos de cuantificación de los GMP
Un método utilizado para cuantificar la presencia GMP. Es el método (HPLC) este método permite
la cuantificación, en una longitud de onda de 205 nm. (Miralles., 2004)
El glicomacropéptido se cuantifica por métodos cromatográficos, particularmente cromatografía de
exclusión molecular, HPLC en fase inversa y cromatografía de intercambio iónico ya sea catiónicos
o aniónicos como se muestra en la Tabla N.- 4. (Alcazar, 2003)
34
Tabla N.- 4. Técnicas cromatográficas para determinar suero en leche
Nota. Fuente: Mirralles. 2009. Detección de caseinato y suero en leche y productos lácteos
mediante técnicas electroforéticas, cromatográficas y espectroscópicas.
las técnicas cromatográficas para la determinación de GMP ha dado muy buenos resultados;
Olieman y van de Bedem (1983) desarrollaron un método cromatográfico capaz de detectar la
presencia del GMP, este método tiene el inconveniente de dar resultados falsos positivos en el caso
de leches en las que se haya desarrollado una población relativamente alta de bacterias psicrótrofas
como Pseudomonas spp ya que durante el almacenamiento refrigerado antes de su procesado, se
generan péptidos de peso molecular similar al del GMP. Galindo et al. (2006) mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) detectaron GMP, sin embargo este método
también presenta el inconveniente de dar falsos positivos. (Rojas É. V., 2009)
2.2.7. Cromatografía
La cromatografía en una técnica que nos permite separar los componentes de una mezcla mediante:
Retención, la cual es el efecto producido sobre los compuestos de la mezcla por una fase
estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
Desplazamiento, es el efecto ejercido por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.
La migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria en la cual se
depositan, impulsados por la fase móvil la cual permite su desplazamiento a distinta velocidad
dependiendo da la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases, se denomina elución.
Las dos fases se eligen de modo que los componentes de la mezcla se distribuyan de modo distinto
entre la fase móvil y fase estacionaria.
Técnica
Cromatográfica Muestra Preparación de muestra Objetivo
Exclusión
molecular Leche Cruda
Precipitación de
proteínas RC con un 8% Determinar proteólisis
Exclusión
molecular
k-caseína tratado
con cuajo
Precipitación de
proteínas RC con un 3-7
y 12 %
Determinación cinético
de reacción
Fase inversa Leche caseinatos y
tratados con cuajo
Precipitación de
proteínas RC con un 8% Caracterización GMP
35
“Cuando uno de los componentes es fuertemente retenido por la fase estacionaria se mueve
lentamente con el flujo de la fase móvil, en cambio cuando se une débilmente a la fase estacionaria
se mueven con rapidez.Como consecuencia de la distinta movilidad de los componentes, se obtiene
su separación en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o
cuantitativamente”. (Skoog, Holler, & Nieman, 2001)
2.2.8. Cromatografía liquida de ultra eficiencia
Ultra Performance Sistem ACQUITYLC este sistema ofrece simultáneamente la flexibilidad y
simplicidad de la mezcla cuaternaria de eluyentes y un inyector en el que el flujo va a través de la
aguja (flow-through-needle) para proporcionar las prestaciones avanzadas que se espera en el
sistema UPLC8, alta resolución, sensibilidad y rendimiento optimizado. Al trabajar con un sistema
UPLC se puede seguir ejecutando los métodos HPLC actuales, se puede realizar esta transición a
UPLC sin esfuerzo utilizando las herramientas integradas y los kits de columnas para la
transferencia y el desarrollo de métodos especialmente diseñados.
El sistema ACQUITY UPLC reduce de manera significativa el tiempo y el gasto por muestra
desde el proceso de análisis, a la vez que mejora la calidad de los resultados. El sistema permite
trabajar de forma eficaz, con una gama mayor de velocidades lineales. Caudales y contrapresiones,
superando a cualquier sistema HPLC9, tradicional u optimizado. La tecnología UPLC, adoptada
con resultados satisfactorios por laboratorios de todo el mundo para llevar a cabo las separaciones
más exigentes. Es un sistema robusto, confiable y reproducible. (Copy, 2013)
Figura N.- 2 UPLC
Fuente: laboratorio de Control de Calidad de Leche (Agrocalidad)
8 UPLC: Cromatografía Líquida de Ultra Eficiencia 9 HPLC: cromatografía Líquida de Alta Eficiencia
36
Ilustración N.- 1 Sample manager del UPLC. Fuente: Software del equipo UPLC
Ilustración N.-2 Sistema cuaternario de solventes del UPLC. Fuente:Software de equipo
37
Ilustración N.- 3Sistema rotatorio mecánico UPLC. Fuente: Software del equipo
2.2.8.1. Columna ACQUIALITY UPLC BEH200
La columna BEH200 sec 1.7 µm 4.4x150mm soporta la velocidad, sensibilidad y resolución de las
separaciones UPLC. La columna está diseñada para caracterizar proteínas de peso molecular entre
10.000-450.000 Daltons. Para el manejo de esta columna se recomienda usar una fase móvil
compatible, se recomienda usar una solución buffer de fosfato de sodio a pH=6.8. El volumen de
inyección es de 2µL. el flujo es de 0.3ml/min. Esta columna debe estar a una temperatura de
30°C.Su detección es de 280nm en el espectro UV. (Corporation, 2010)
2.2.8.2. Detector
Un detector de absorbancia ultravioleta/luz visible de doble longitud de onda, optimizado para
Ultra Performance LC (UPLC). Ofrece linealidad, resolución y sensibilidad óptimas para las
separaciones de UPLC/UV.
El detector utilizado es un ACQUITY PDA e DETECTOR, diseñado específicamente para el
sistema UPLC innovado en su celda de detección para flujo bajo, disminución de ruido electrónico
tan bajo como 10µAU, soporte de adquisición de datos a 80 puntos por segundo (80 Hz). Al ser
controlado por el Software provee flexibilidad para operación simultánea en 2D y 3D. (Copy,
2013)
38
Ilustración N.- 4 Funcionamiento del detector. Fuente: Software del equipo UPLC
Capacidad del detector
Intervalo de Longitud de Onda: 190 a 800nm
Exactitud de la Longitud de Onda: ±1nm
Intervalo de Linealidad: ≤5% de 2UA, con rango dinámico extendido a2.0AU
Operación de la lámpara garantizada por 2000 horas
Capacidad dispositivos de seguridad Acquity UPLC:
Las líneas de disolvente y tuberías de interconexión del detector se administran a través del chasis
del sistema permitiendo la minimización de volúmenes y disposición física. (Copy, 2013)
39
CAPITULO III
3. METODOLOGIA
3.1. Tipo de Investigación
El presente trabajo fue de tipo experimental y aplicado en el cual se determinó cuantitativamente la
concentración de GMP como porcentaje de suero de quesería añadido a la leche cruda.
Este análisis se realizó en el laboratorio de Control de Calidad de Leche de AGROCALIDAD.
Los datos obtenidos experimentalmente fuerón comparados con la Norma INEN 9:2012 quinta
revisión para Leche Cruda, para obtener estadísticas de adulteración de la leche cruda en el Cantón
Mejía, Provincia de Pichincha.
3.1.1. Variables de la investigación
3.1.1.1. Variable Independiente
La variable independiente: la leche producida en las haciendas productoras ubicadas en la
Parroquia Alóag del Cantón Mejía Provincia de Pichincha.
3.1.1.2. Variable Dependiente
Concentración de Glicomacropéptido GMP como porcentaje de suero de quesería.
3.2. Población y Muestra
Población: está definida como las 28 haciendas ubicadas en la Parroquia Alóag del Cantón
Mejía Provincia de Pichincha.
Muestra: leche Cruda de las 8 haciendas seleccionadas de acuerdo al plan de muestreo de
la tabla militar estándar, cuya recolección fue en frascos estériles de 500 ml, mediante un
muestreo compuesto.
Se tomarón 500 ml de leche fresca por cada hacienda de la Asociación COPLA, el
muestreo es compuesto para asegurar la homogeneidad de las mismas.
3.3. Diseño Experimental
3.3.1. Diseño Metodológico
40
PREPARACION DE LA MUESTRA LECHE LIQUIDA
TCA 10 LECHE
RMP 11
HOMOGENIZAR
ALICUOTA
CALENTAR
MEZCLAR
CALENTAR
CENTRIFUGAR
10ml/EN 2mIN. AGITANDO
FILTRAR
NUEVA FILTRADA
20 ml LECHE
25°C
25°C/60 min.
10min. A 2500rpm
Eliminar primer filtrado
FILTRO DE MEMBRANA
0.22um O menos
500ml 40°C
Analizar filtrado
Comparación con la Norma 9:2012Obtención de resultados
Elaborado por: Diana Jiménez
10TCA: Ácido tricloroacético
10 RMP: recepción materia prima (leche cruda)
41
3.3.2. Materiales y Reactivos
Materiales
Frascos para soluciones 1000 mL
Frascos para soluciones 500 mL
Matraz Erlenmeyer 250 mL
Pipeta volumétrica de 20 mL
Pipeta volumétrica de 10 mL
Vasos de precipitación de 500mL
Recipientes con cierre hermético
Envases para centrifuga 50mL
Cronómetro
Papel filtro N°1
Membrana filtrante 0.45µm
Membrana filtrante 0.2µm
Frascos recolectores estériles de 50ml
filtros 0.45µm
Crioviales
Embudos
Probeta 100mL
Jeringas de 5 ml
Gradillas para frascos recolectores
Cucharon o bastón para la toma de muestra de acero inoxidable esterilizado,
tamaño acorde al recipiente de muestreo.
Papel absorbente desechable.
Cooler
Reactivos
Acetonitrilo grado HPLC
Ácido Tricloroacético PA-ACS
Agua tipo I PA-ACS
Di- potasio hidrógeno fosfato anhidro PA
Potasio di-hidrógeno fosfato PA
Potasio Hidróxido lentejas PA
Sodio sulfato PA
42
3.3.3. Equipos
En su totalidad el trabajo se llevó a cabo en un Cromatógrafo de Líquidos de Ultra
Eficiencia constituido por:
Una bomba cuaternaria: Quaternary Solvent Manager AcQuity UPLC Class
Detector PDA: UV (TUV) A Waters AcQuity UPLC de longitud de onda
variable
Columna Acquity UPLC BEH 200 sec 1.7µm x 4.4x150mm
Sistema de adquisición y tratamiento de datos conformado por: Empower 3
Methode Validation Manager Software
Centrífuga 2500rpm
Plancha de agitación magnética T=25ºC
Balanza analítica ±0.0001
Potenciómetro (medición pH)
Equipo de filtración al vacío
Membranas de filtración Milipore, modelo miller-6v hidrofilic PVDF 22
µm de diámetro de poro
3.3.4. Preparación de patrones a partir de leche líquida.
Leche fresca líquida añadida diferentes % de suero de quesería: Agregar a la leche fresca % m/m
de suero de quesería suero obtenido de la fabricación del queso fresco que cumpla con la NTE
INEN 1 528
Tabla N.- 5. Concentración de suero de quesería adicionado leche cruda
N° % Leche
%Suero
de
quesería
Concentración
(%)
1 100 0 0
2 99 1 1
3 97 3 3
4 95 5 5
5 93 7 7
6 90 10 10
7 85 15 15
8 80 20 20
9 75 25 25
43
3.3.4.1. Elaboración de la curva de estándar de calibración para detectar
suero
- Una vez preparadas las soluciones patrón se tomaron 20ml de cada una en diferentes matraces
Erlenmeyer.
- Con la ayuda de una bureta se añadió a cada uno de los patrones 10 ml de Acido tricloroacético
por dos minutos con agitación constante.
- Se trasladaron cada patrón a tubos para centrífuga debidamente rotulados con la concentración
correspondiente.
- Se dejó reposar esta mezcla por aproximadamente una hora.
- Luego se centrifugó a 2500 rpm. Por 10 minutos a una temperatura de 25 ºC.
- Se realizó una primera filtración en papel cualitativo.
- El primer filtrado lo colocamos en una jeringuilla de 10 ml provista de filtros Milipore de 0.22
µm tamaño de poro.
Figura N.-3 filtros Milipore 0.22 µm tamaño de poro
- Una vez filtrados los estándares se los coloca en viales.
- Con la ayuda del software del equipo se procede a inyectar 10µL con la solución de menor
concentración, es decir, la del primer punto de la curva.
- Inyectar la solución en el Sistema de Inyección del Cromatógrafo Líquido de Ultra Resolución
(UPLC) marca Acquity para la obtención de los respectivos cromatogramas.
- Proseguir la técnica inyectando las soluciones patrón en orden creciente de concentración. Si
dicho orden no se cumpliera, cargar la misma jeringa con una mezcla de metanol: agua (10:90)
grado UPLC e inyectar en el sistema; con el objetivo de remover cualquier residuo de la
solución anteriormente inyectada.
44
- La curva se realizó por triplicado, es decir, que se inyectarón tres veces cada una de las
soluciones patrón independientemente.
Figura N.-4 Muestras
patrón
3.3.5. Condiciones Cromatográficas
Las condiciones cromatográficas que se muestran en la Tabla N.- 6 fueron optimizadas a partir de
la inyección de estándares de leche cruda adulterada con suero de quesería a diferentes
concentraciones en el sistema UPLC. Se probaron diferentes concentraciones de la fase en modo de
elución isocrático.
La composición de la fase móvil que permitió obtener picos simétricos y con resoluciones óptimas
entre ellos, fue buffer compuesto de 0,174 g de di-Potasio hidrógeno fosfato anhidro PA, 1,237 g
de Potasio di-hidrógeno fosfato PA y 2,141 g de sodio sulfato PA en, aproximadamente, 1000 ml
de agua (25.16 mM, pH 6).En estas condiciones se trabajó a una velocidad de flujo de 0.4 mL/min.
Tabla N.- 6. Condiciones cromatográficas para determinar suero en leche UPLC
Temperatura de la
columna 35 ºC
Longitud de
onda 210nm
Temperatura de la
muestra 25 ºC
Tiempo (min.) Velocidad de
flujo (ml/min) Líneas de reactivos
11 0.4 A
(Acetonitrilo)
B
(Metanol)
C
(Agua)
D (Buffer de
fosfatos)
11 0.40 0 0 0 100
45
3.4. Materiales y Métodos
3.4.1. Métodos y Técnicas
El método usado para el estudio es el descrito en la norma INEN 2401:2008, mismo que fue
modificado de acuerdo a las condiciones del laboratorio y mediante el uso de UPLC del
Laboratorio de control de Calidad de Leche de la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la
Calidad- Agrocalidad.
3.4.2. Metodología
3.4.2.1. Preparación de muestras
3.4.2.2. Leche líquida.
Las muestras fueron transportadas en refrigeración (4-5ºC).
Previo al análisis se homogenizó los 500ml de leche fresca a 40°C. Se trasvasó la leche a
un recipiente aproximadamente el doble del volumen de ésta, provisto de un cierre
hermético, se cerró el recipiente e inmediatamente se mezcló bien.
Se tomó 20 ml de leche.
Se llevó a 25 °C y Añadió en 2 minutos 10,0 ml de la solución de ácido tricloroacético
(TCA) agitando constantemente con la ayuda de un agitador. (ver Anexo 1 parte a)).
Figura N.-5 Preparación de la muestra con ácido tricloroacético
Se mantuvo a 25°C durante 60 minutos.
46
Se centrifugó por 10 min a 2500 rpm y filtró sobre papel cualitativo. Se pasó el filtrado
por un una membrana de poro 0,22 µm. v Analizar filtrado.
Figura N.-6 Muestra lista para centrifugar
3.4.3. Evaluación del método
3.4.3.1. Porcentaje de Recobro
Para determinar el recobro se fortificaron muestras de leche cruda con suero de quesería
Las ecuaciones empleadas para el análisis de recobro son:
1) Ecuación del Porcentaje de Recobro
𝟏) %𝑹𝒆𝒄𝒐𝒃𝒓𝒐 =𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒓𝒆𝒄𝒖𝒑𝒆𝒓𝒂𝒅𝒂
𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝑨𝒅𝒊𝒄𝒊𝒐𝒏𝒂𝒅𝒅𝒂 × 𝟏𝟎𝟎
Tanto la cantidad recuperada como la cantidad adicionada están en unidades de porcentaje de
suero de quesería.
3.4.3.2. Linealidad y Precisión del método
Se analizaron por triplicado muestras de leche cruda fortificada con suero de quesería a diferentes
concentraciones en el intervalo de 0% a 25 % y tratadas según método (sección 3.4.2.2). Los datos
experimentales fueron tratados estadísticamente para comprobar la linealidad del método en el
intervalo de concentraciones analizadas y de esta manera obtener las ecuaciones de regresión lineal
correspondientes.
Para la precisión, expresada como repetibilidad se estimó a partir del coeficiente de variación de la
concentración del análisis de 11 muestras independientes de leche cruda adicionada suero de
quesería al 3%cada una.
47
3.4.3.3. Límite de Detección y Cuantificación
El límite de detección del método (LDM) fue determinado por el criterio establecido por la EPA
se calcula mediante la siguiente ecuación:
2) Ecuación Límite de Detección
𝟐) 𝑳𝑫𝑴 = 𝑡(𝑛−1,1−𝛼=0.99) × 𝑆
𝑡 = "t" 𝑠𝑡𝑢𝑑𝑒𝑛𝑡 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑢𝑛 𝑛𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑓𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑑𝑒𝑙 99%
𝑛 − 1 = 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 (𝑝𝑟𝑢𝑒𝑏𝑎 1 𝑐𝑜𝑙𝑎)
𝑆 = 𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 ( 𝑒𝑛 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛)
La desviación estándar (S) se obtuvo al analizar como mínimo 11 muestras de leche cruda
adicionada suero de quesería a una concentración mayor a 10 veces el LDM esperado.
Para la presente investigación el LDM se estimará a partir del cálculo de la desviación estándar
obtenida en el análisis de las once muestras descritas en el punto 3.4.3.2.
Para el límite de cuantificación se decidió tomar el valor correspondiente a 10 veces la desviación
estándar mencionada en el punto 3.4.3.3 y en unidades de concentración.
De acuerdo a la IUPAC otra forma de calcular el límite de cuantificación es multiplicando el límite
de detección por 3.104 (Currie. 1995).
3.4.4. Aplicación del método
Las muestras fueron tomadas durante 5 días al azar (ver sección 3.2) de 8 haciendas de las 28 que
conforman ASOCIACIÓN COPLA (CORPORACIÓN PRODUCTORA DE LECHE DE ALOAG)
DE LA PARROQUIA DE ALOAG DEL CANTON MEJÍA, de la provincia de Pichincha, se
recolectaron 100 mL por día durante una semana en envases herméticos debidamente rotulados, al
finalizar la semana recolectamos 500 mililitros de cada hacienda los cuales se procedieron a
mezclar.
La rotulación consta la siguiente información.
Fecha
Hora del muestreo (mañana o tarde)
Nombre de la hacienda: Código interno del Laboratorio de control de calidad de Leche
48
Cantidad de muestra en ml.
Los datos obtenidos para el análisis del porcentaje de suero de quería añadido a muestras de leche
cruda se procesaron estadísticamente aplicando un diseño completamente al azar con tres
repeticiones, la herramienta estadística usada para este estudio fue un ANOVA el mismo que
permitió evidenciar diferencias significativas entre las ocho haciendas muestreadas.
Prueba de Tukey al 5%.
La prueba Tukey permitió comparar entre haciendas para determinar aquellas que son
significativamente diferentes unas de otras.
3) Ecuación prueba Tukey
3) 𝑉𝑇𝑈𝐾𝐸𝑌 = [(𝑃
𝑓) 𝛼] 𝑆𝑥
3.4.5. Procedimiento
3.4.5.1. Análisis Cromatografía.
Antes de proceder al análisis cromatográfico de las muestras, inyectar patrones estándares de leche
adulterada con suero de quesería para calibrar el equipo en diferentes concentraciones de acuerdo
con 6.4.1.3 o 6.4.1.4, las veces que sean necesarias hasta que el área (o cualquier respuesta que se
use para relacionar con la concentración) y el tiempo de retención del pico correspondiente a los
Glicomacropéptido (GMP) sea constante.
Para la inyección de estándares y muestras nos basaremos en el método sugerido por la norma
INEN 2401:2008, mismo que será modificado de acuerdo a las condiciones del laboratorio y
mediante el uso de UPLC del Laboratorio de control de Calidad de Leche de la Agencia
ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad- Agrocalidad.
En cada interrupción lavar las columnas con agua y en toda interrupción superior a veinticuatro
horas, después del lavado con agua, se les debe pasar solución de lavado (ver Anexo 1 parte c)).
Por lo menos tres horas a un flujo de 0,2 ml por minuto o seguir las instrucciones del fabricante.
3.4.6. Lectura e interpretación de los resultados
Los resultados serán dados por el software del equipo.
3.4.7. Cálculos
Con el fin de detectar cualquier anomalía, ya sea debida al mal funcionamiento del cromatógrafo o
de las columnas, debido a la muestra a analizar, es necesario observar el aspecto de cada
49
cromatograma antes de efectuar cualquier interpretación cuantitativa. Procedimiento de cálculo
cuando se utilizan las áreas de los picos para la determinación del porcentaje de suero de quesería
añadido. El modelo de cálculos fue tomado de la norma INEN2401:2008.
4) Cálculo del coeficiente de respuesta
𝑅 =𝑃
𝐴(5) − 𝐴(0)
En donde:
R = es el coeficiente de respuesta
A (5) = es el área del pico III obtenido del análisis cromatográfico del patrón de leche cruda
adicionada cada uno de los porcentajes (m/m) de suero de quesería
A (0) = es el área del pico III, obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche cruda
exenta de suero de quesería
P = es el porcentaje de suero de quesería presente en el patrón.
5) Cálculo del área relativa del pico III obtenido del análisis cromatográfico de la
muestra.
𝑆(𝐸) = 𝑅 × 𝐴(𝐸)
En donde:
S (E) = área relativa del pico III en la muestra
A (E) = área correspondiente al pico III obtenida en el análisis cromatográfico de la muestra
R = Coeficiente de respuesta, calculado anteriormente
6) Cálculo del área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón
de leche cruda exenta de suero de quesería.
𝑆(0) = 𝑅 × 𝐴(0)
En donde:
S (0) = área relativa del pico III en el patrón de leche cruda exenta de suero de quesería
50
A (0) = área correspondiente al pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche
cruda exenta de suero de quesería
R = coeficiente de respuesta calculado
7) Cálculo del tiempo de retención relativo del pico III en la muestra.
𝑇𝑅𝑅(𝐸) =𝑇𝑅(𝐸)
𝑇𝑅(5)
En donde:
TRR (E) = tiempo de retención relativo del pico III de la muestra
TR (E) = tiempo de retención del pico III obtenido en el análisis cromatográfico de la muestra
TR (5) = tiempo de retención del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche
cruda adicionada los diferentes porcentajes (m/m) de suero de quesería
Por la experimentación está demostrado que existe relación lineal entre el tiempo relativo del pico
III en la muestra y el porcentaje de suero de quesería añadido hasta el 10 %
a) Con un contenido < 5 %, el TRR (E) es > 1 ,000
b) Con un contenido ≥5 %, el TRR (E) es = 1 ,000
La incertidumbre admitida para los valores del TRR (E) es de ± 0,002
8) Cálculo del porcentaje de suero de quesería presente en la muestra.
𝑊 = 𝑆(𝐸) − [1.3 + (𝑆(0) − 0.9)]
En donde:
W = porcentaje m/m de suero de quesería presente en la muestra
S (E) = área relativa del pico III para la muestra.
1,3 + = media experimental del área relativa del pico III expresada en gramos de suero de quesería
en 100 g de leche cruda no adulterada.
S (0) = área relativa del pico III para el patrón de leche cruda exenta de suero de quesería.
S (0)-0,9 = corrección que hay que efectuar en el área relativa media 1,3 cuando el valor S(0) no es
igual a 0,9.
51
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En este capítulo se encuentra el resumen de los cálculos realizados en el estudio de la
adulteración de leche cruda para determinar el porcentaje de suero añadido. Y la evaluación del
método para determinar si los datos obtenidos son confiables
4.1. Desarrollo del método analítico.
4.1.1. Condiciones cromatográficas.
4.1.1.1. Condiciones para la detección UV del porcentaje de suero de
quesería adicionado a leche cruda.
La longitud de onda para una detección óptima de la molécula GMP en estudio fue determinada
mediante la exploración de algunas longitudes de onda alrededor de la longitud de onda empleada
en la Norma INEN 2401:2008. En el análisis se inyectó por triplicado un estándar de
Glicomacropeptido (Caseinoglycopeptide from bovine: C7278-10MG de SIGMA), en modo
isocrático con una fase móvil compuesta de 0,174 g de di-Potasio hidrógeno fosfato anhidro PA,
1,237 g de Potasio di-hidrógeno fosfato PA y 2,141 g de sodio sulfato PA en, aproximadamente,
1000 ml de agua (25.16 mM, pH 6). En.la Tabla N.- 7 se reporta el área del pico por triplicado en
función de la longitud de onda de detección.
Tabla N.- 7. Estudio de la respuesta del Glicomacropeptido (GMP) en función de la .
de detección
GMP
λ(nm) 194 (nm) 198 (nm) 200 (nm) 201 (nm) 202 (nm) 203 (nm) 204 (nm) 205 (nm)
ÁREA PICO CROMATOGRÁFICO
1 3498812 8756432 14410418 15324711 15273661 14649344 13720542 12686245
2 3542788 8825638 14540048 15307347 15259393 14637340 13856751 12680789
3 3503072 8803461 14382459 15317420 15273587 14655521 13869363 12824940
Media 3514890,67 8795177 14444308,3 15316492,7 15268880,3 14647401,7 13815552 12730658
MAX 15316492,7
En la tabla anterior se muestra en sombreado la respuesta para la longitud de onda de 201 nm, que
junto con la de 200 nm fueron las que dieron un área promedio de pico mayor que las demás. Se
decidió escoger 201 nm como la longitud óptima debido a que, mientras mayor sea ésta, el pico
correspondiente al GMP se define mejor Figura N.-7.
52
Figura N.-7. Glicomacropeptido (10 µL, 5%) inyectado directamente en el sistema cromatográfico
UPLC y eluído en modo isocrático a la longitud de onda de 201nm.
4.2. Evaluación del método
Definidas todas las condiciones del método analítico, desde el paso inicial que es tratamiento de la
muestra hasta la separación y análisis cromatográfico del GMP, se procedió a su evaluación
estadística. Los experimentos de esta sección fueron realizados con muestras de leche cruda
adicionadas suero de quesería diferentes concentraciones en unidades de % y adicionadas los
reactivos establecidos en el método desarrollado.
4.2.1. Estabilidad del Glicomacropéptido expresado como porcentaje de suero
de quesería en la leche cruda
La estabilidad de las muestras adulteradas con suero de quesería se analizó con estándares de leche
cruda adicionadas 3 y 5 porciento (%) de suero de quesería, durante varios días. Estas soluciones se
prepararon como se muestra en la Tabla N.-8, luego se procedió a tomar 20 ml de cada una de las
53
muestras y se las trató como se describe en el punto 3.4.2.2. Durante el período de prueba (9 días)
las muestras fueron almacenadas en refrigeración (4°C) cuando no estaba en uso.
Tabla N.- 8 Preparación de soluciones para determinar estabilidad
Patrones Leche Cruda ( g) Suero de Quesería (g) Porcentaje (%p/p)
1 97 3 3
2 95 5 5
La Figura N.- 8 muestra las áreas de pico determinadas para cada concentración durante el período
de prueba.
Figura N.-8 Estabilidad de muestras de leche cruda adulteradas con 3 y 5 % de suero de quesería,
durante un periodo de prueba de 9 días.
Como se puede notar en la figura N-8 las muestras dan resultados similares durante un período de
5 días aproximadamente lo que quiere decir que es seguro utilizar estas muestras durante ese
peróodo de tiempo pasado los 5 días comienzan a disminuir las áreas de picos, y por ende a decaer
la concentración de las muestras, el día nueve no se observa en esta gráfica ya que a partir de ese
día la molécula de GMP no se visualiza y a más de ellos no es posible cuantificar, ya que hay picos
de interferencias mucho más grandes que la molécula que impiden su visualización.
4.2.2. Linealidad de sistema UPLC
En la Tabla N.- 9 se reportan las ecuaciones de las rectas de regresión Área Vs Concentración y los
coeficientes de determinación (r2) obtenidos en el análisis por triplicado de estándares de GMP en
0,00000
1,00000
2,00000
3,00000
4,00000
5,00000
6,00000
7,00000
8,00000
9,00000
1 2 3 4 5 6 7 8
CO
NC
ENTR
AC
IÓN
DÍAS
ESTABILIDAD LECHE CRUDA ADULTERADA CON SUERO DE QUESERÍA
ESTABILIDAD 3%
ESTABILIDAD 5%
54
intervalos de concentración de 1%, 3%, 5%, 7%, 9%, 11% , 13%, 15%. Las correspondientes
gráficas se muestran en las Figura.N.-9,N.-10,N.-11.
Tabla N.- 9 Linealidad del sistema UPLC
Curva Ordenada al origen (b) Pendiente de la recta (m) Coeficiente de correlación (r2)
1 22785±440000 922186±48000 0.9980
2 110176±610000 936289±66000 0.9962
3 10624±4500000 922511±49000 0.9979
El valor de los coeficientes de determinación, r2 > 0.9973, indica que existe una relación lineal
entre áreas de pico y concentración de GMP en las disoluciones analizadas, por lo cual se deduce
que la respuesta del detector es lineal en el intervalo estudiado.
Figura N.- 9 Primera Curva De Calibración
-2000000
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 5 10 15 20
ÁR
EA D
E P
ICO
CONCENTRACIÓN (% P/P)
LINEALIDAD DEL SISTEMA UPLC
55
Figura N.- 10 Segunda Curva De Calibración
Figura N.- 11 Tercera Curva De Calibración
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 5 10 15 20
ÁR
EA D
E P
ICO
CONCENTRACIÓN (% P/P)
-2000000
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 5 10 15 20
ÁR
EA D
E P
ICO
CONCENTRACIÓN (% P/P)
LINEALIDAD DEL SISTEMA UPLC
56
4.2.3. Linealidad del método.
En la Tabla N.- 10 se reportan las ecuaciones de las rectas de regresión Área Vs Concentración y
los coeficientes de determinación (r2) obtenidos en el análisis por triplicado de muestras
adulteradas con suero de quesería en concentración de porcentaje 1%, 3%, 5%, 7%, 10%, 15% ,
20%, 25% (preparadas según metodología 3.4.3.2). Se prepararon y se analizaron por triplicado.
Todas las muestras fueron preparadas según el procedimiento optimizado (especificado en la parte
experimental, secciones 3.4.2.2) luego de ellas fueros eluidas a la columna para su separación,
detección y cuantificación.
Las correspondientes gráficas se muestran en la Figuras N.-12, N.- 13, N.-14,
Tabla N.-10 Linealidad del método
Curva Ordenada al origen
(b)
Pendiente de la
recta (m)
Coeficiente de
correlación (r2)
1 732205±660000 739777±49000 0.99790
2 704620±760000 740803±57000 0.99718
3 762350±800000 743536±6000 099691
El valor de los coeficientes de determinación, r2 > 0.997, indica que existe una relación lineal entre
áreas de pico y concentración de las muestras de leche cruda adulteradas con suero de quesería
analizadas, por lo cual se deduce que la respuesta del detector es lineal en el intervalo estudiado.
Figura N.- 12 Primera Curva De Calibración
-5000000
0
5000000
10000000
15000000
20000000
0 5 10 15 20 25 30
ÁR
EA D
E P
ICO
CONCENTRACIÓN (% P/P)
LINEALIDAD DEL MÉTODO R1
57
Figura N.- 13 Segunda Curva De Calibración
Figura N.- 14 Tercera Curva De Calibración
4.2.4. Precisión y recobro promedio en análisis replicados.
La precisión del método está relacionada con la dispersión que tienen las medidas alrededor del
valor promedio y está expresada mediante la desviación estándar (D.E) y el coeficiente de
variación (%CV). Estos parámetros permiten evaluar la incertidumbre de los resultados debido a
-5000000
0
5000000
10000000
15000000
20000000
0 10 20 30
ÁR
EA D
E P
ICO
CONCENTRACIÓN (% P/P)
LINEALIDAD DEL MÉTODO R2
-5000000
0
5000000
10000000
15000000
20000000
0 10 20 30
ÁR
EA D
E P
ICO
CONCENTRACIÓN (% P/P)
LINEALIDAD DEL MÉTODO R3
3
Lineal (3)
58
errores aleatorios que se manifiestan en la dispersión de los datos alrededor de la media. Para hacer
un estudio más detallado de la precisión del método medida como repetibilidad, se analizaron once
muestras independientes de leche cruda adulterada con suero de quesería en una concentración del
3%.
En la Tabla N.-11 se reportan las réplicas de las muestras de leche cruda adulteradas con suero de
quesería. En esta tabla se incluyen también los resultados del análisis estadístico de los datos. Los
intervalos de confianza para la concentración promedio determinada y para el % de recobro fueron
calculados con un nivel de significancia del 5%.
Tabla N.-11 Estudio de precisión (repetibilidad) del método. Análisis de muestras de leche
cruda adicionadas 3% de suero de quesería n = 11, =0.05. 𝒕(𝒏−𝟏,𝟏−𝜶=𝟎,𝟗𝟗) = 3,169
.
NÚMERO DE MUESTRAS REPLICADAS
CONCENTRACIÓN DETERMINADA
EN %
1 2,74
2 2,76
3 2,76
4 2,74
5 2,76
6 2,68
7 2,71
8 2,77
9 2,73
10 2,55
11 2,76
MEDIA 2,72
NÚMERO DE DATOS 11
INCERTIDUMBRE ± 0,04
DESVIACIÓN ESTÁNDAR %
0,063
COEFICIENTE DE VARIACIÓN
2,34
RECUPERACIÓN 90,78
INCERTIDUMBRE ± 0,04
Como se puede observar en esta Tabla N.-11, el coeficientes de variación obtenidos fue inferior al
3%, corroborando la buena precisión del método para la determinación de la adulteración de leche
59
cruda con suero de quesería expresado en porcentaje %P/P. Las 11 réplicas fueron analizadas en
diferentes días y que los resultados reportados en la tabla están expuestos en orden cronológico,
según fueron realizadas las determinaciones.
Los resultados de la Tabla N.-11 muestran que la recuperación del método del 90% lo cual es muy
aceptable ya que el intervalo de recobro debe ser del 80 al 180% para decir que un método es
bueno, por lo que cumple con los criterios establecidos. Además, es importante resaltar que el
coeficiente de variación para una concentración de tan solo 3 porciento es inferior al 3%, lo que
puede considerarse excelente.
4.2.5. Límites de detección del método.
El límite de detección es la menor cantidad de analito que puede detectarse, más no cuantificarse
con la precisión y exactitud requeridas. En este trabajo se utilizó el criterio recomendado por la
EPA para determinar el límite de detección del método (LDM) desarrollado (ecuación 2)).
Para la estimación del LDM del GMP se utilizó la desviación estándar obtenida en el estudio de
repetibilidad del método (Tabla N.-11). El valor de LDM calculado se muestra en la Tabla N.-12.
Tabla N.- 12 Límites de detección del método
ANALITO 𝒕(𝒏−𝟏,𝟏−𝜶=𝟎,𝟗𝟗) DESVIACIÓN
ESTANDAR (%) LDM (%)
GMP 3.169 0,064 0,20
4.2.6. Límites de cuantificación
El término límite de cuantificación corresponde a la menor concentración del analito que puede ser
determinada con una precisión y exactitud establecidas. En esta investigación se decidió considerar
como límite de cuantificación del método (LCM) la concentración equivalente a 10 veces la
desviación estándar obtenida en el estudio de repetibilidad. Por otra parte, la IUPAC recomienda
tomar como límite de cuantificación el valor obtenido al multiplicar el límite de detección por
3.104 (Currie. 1995). En la Tabla N.-13 se muestran los límites de cuantificación del método
calculados según los dos criterios mencionados, utilizando los resultados reportados en la sección
anterior (Tabla N.- 12). Como puede observarse, los valores obtenidos son bastante semejantes por
lo que puede considerarse que los dos criterios son más o menos equivalentes. De acuerdo con
estos resultados, la adulteración de la leche cruda con suero de quesería pueden ser cuantificada
confiablemente a niveles de concentración alrededor del 0.63% P/P.
Tabla N.- 13 Límites de cuantificación
60
GMP
LCM (%) IUPAC* 0,6269
LCM (%) S10** 0,6373
Nota: * LCM calculados según recomendación de la IUPAC: LDM * 3.104.
** LCM calculados como: 10 * desviación estándar (del estudio de repetitividad).
En resumen, se puede decir que el método desarrollado cumple con los criterios de calidad
estipulados en la norma INEN2401:2008.
4.3. Aplicación del método analítico en muestras reales de Leche cruda
Se analizaron 8 muestras de leche cruda provenientes de las haciendas de la Asociación Copla esta
asociación cuenta con 24 haciendas de las cuales se tomó al azar 8 haciendas para hacer el
muestreo de acuerdo al criterio de la tabla militar estándar. Cada una de las muestras fue
recolectada en frascos herméticos estériles
Durante una semana se tomaron 100 ml de leche cruda de cada hacienda se transportaron al
laboratorio de Control de Calidad de Leches de Agrocalidad en un cooler provisto de geles
congelados para que el trayecto la leche no se acidifique, al finalizar la semana se mezclaron las 5
muestras recolectadas de cada hacienda por separado, de esta manera se obtuvó 8 muestras de 500
ml cada una, de estos 500 ml se tomaron tres muestras de 100 ml cada una.
Para proceder al análisis de las muestras se tomaron 20 ml de cada una; en total se analizaron 24
muestras las mismas que se procesaron y analizaron según lo descrito en la parte experimental.
(Sección 3.4.2.2.).
4.3.1. Análisis Cuantitativo de las muestras de leche cruda
Previo al análisis de las muestras se corre una muestra de leche cruda sin suero de quesería la
misma que será denominada como blanco, esta muestra fue tratada de la misma forma se trataron
las muestras de cada una de las haciendas, de esta manera se logró visualizar si hay algún tipo de
interferencia el tiempo de retención del analito de interés, y vemos que no existe ninguna
interferencia, ya que el tiempo de retención de nuestro analito de estudio es de aproximadamente
3.45 min (Figura N.-15) y en ese tiempo no existe ninguna interferencia.
61
Figura N.-15 Cromatograma de muestra blanco corrida a 201 nm
Luego de obtener el cromatograma del blanco, procedemos a preparar una muestra de leche cruda
adicionada 5% suero de quesería, esta muestra fue denominada como muestra testigo y nos sirvió
para determinar el tiempo de corrida de cada de una de las muestras y se estableció como tiempo de
corrida de cada una de las muestras de 13 min, de esta manera asegurarnos que no queden
interferencias dentro de la columna. La Figura N.- 16 es el cromatograma de una muestra de leche
cruda adulterada con suero de quesería al 5%.
62
Figura N.-16 Cromatograma de muestra de leche cruda adicionada 5% de suero de quesería, corrida a 201 nm. [1] GMP, [2] proteínas de la leche,
(Interferencias)
Las cuales muestras fueron sometidas a pruebas de adulteración , los resultados se encuentran el en
Anexo 3, según este análisis se comprobó que 5 haciendas no presentaron suero de quesería. A
continuación en la Tabla N.-14 se muestra el análisis de tres de las haciendas que presentaron
adulteración de la leche cruda con suero de quesería, se muestra las lecturas de las áreas de picos
que identifican los picos de glicomacropéptidos (GMP) de las muestras de leche cruda.
Tabla N.-14 Áreas de picos que identifican el pico de (GMP) en muestras de leche cruda.
Matriz de Recolección de Datos
T
R
A
T
A
M
I
E
N
T
O
B
SUJETO A HACIENDA 3 HACIENDA 6 HACIENDA 7
MUESTRA 1 2 3 1 2 3 1 2 3
LECTURA
945269 1292797 1036926 313736 426480 624792 3374938 3702365 3922504
937848 1066884 1064917 327917 419670 624356 3361160 3678870 3920505
933463 1262236 1066433 331772 417057 626407 3342561 3651972 3889962
TOTAL 2816580 3621917 3168276 973425 1263207 1875555 10078659 11033207 11732971
MEDIA 938860 1207305,67 1056092 324475 421069 625185 3359553 3677735,67 3910990,33
1
2
63
Se realizaron tres repeticiones de cada una de las muestras. En la tabla N.- 15 se muestran las
lecturas de las áreas de los picos del blanco y de la muestra testigo (leche cruda adicionada 5% de
suero de quesería) de cada una por triplicado.
Figura N.-17 Cromatograma muestra de leche cruda adulterada con de suero de quesería
proveniente de la hacienda H7, corrida a 201 nm. [1] GMP, [2] proteínas de la
leche,(Interferencias)
Tabla N.-15 Áreas de pico del blanco como de la leche adicionada suero de quesería al 5%
LECTURAS
BLANCO
LECHE ADICIONADA
5% SUERO DE QUESERIA
0 1739557,762
0 2448805,387
0 2444590,997
MEDIA 0 2210984,715
1
2
64
Tabla N.- 16 lectura promedio de áreas de picos de cada una de las muestras analizadas
mediante cromatografía UPLC
X1 X2 X3
HACIENDA 3 HACIENDA 6 HACIENDA 7
938860 324475 3359553
1207305,667 421069 3677735,667
1056092 625185 3910990,333
MEDIA 1067419,222 456909,6667 3649426,333 ∑
TC 3202257,667 1370729 10948279 15521265,7
nc 3 3 3 9
4.3.2. Cálculo de la concentración de suero
Cálculo del coeficiente de respuesta
R= 2,26E-06
Cálculo del área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico de la muestra
Tabla N.-17 Área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico de la muestra
HACIENDA 3 HACIENDA 6 HACIENDA 7
2,12 0,73 7,59
2,73 0,95 8,32
2,39 1,41 8,84
Cálculo del área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de
leche cruda exenta de suero de quesería
S(0)= 0
𝑅 =𝑃
𝐴(5) − 𝐴(0)
𝑆(𝐸) = 𝑅 × 𝐴(𝐸)
𝑆(0) = 𝑅 × 𝐴(0)
𝑅 =5
2210984.715 − 0
𝑆(𝐸) = 2,26−06 × 938860 = 2,12
𝑆(0) = 2.26−06 × 0 =
65
Cálculo del porcentaje de suero de quesería presente en la muestra
Tabla N.-18 Porcentaje de suero de quesería presente en las muestras de leche cruda
HACIENDA 3 HACIENDA 6 HACIENDA 7
1,72 0,33 7,19
2,33 0,55 7,92
1,99 1,01 8,44
Media 2,01 0,63 7,85
Como se observa en la tabla N.-18 y en la Figura N.-18, la evaluación de la adulteración de la
leche UH cruda con suero mediante la identificación del compuesto Glicomacropéptido expresó
que en las muestras de las haciendas 3, 6 y 7 se identificó el pico de GMP , obteniendo un
porcentaje de suero de quesería (2.01 W%, 0.63 W%, 7.85 W%), en las demás tratamientos
analizados hacienda 1, 2, 4, 5,8 no fue detectado el GMP, expresando valores de cero, a lo largo
del período de muestreo.
Figura N.- 18 Promedio total de la concentración de suero de quesería detectado en muestras de
leche cruda proveniente de 3 haciendas de la asociación copla del cantón Mejía las mismas que
luego serían distribuidas en los centros de acopio de la ciudad de Quito.
2,01
0,63
7,85
0
2
4
6
8
10
HACIENDA 3 HACIENDA 6 HACIENDA 7
SUER
O D
ETEC
TAD
O w
%
HACIENDAS QUE PRESENTAN w% DE SUERO AÑADIDO A LECHE CRUDA
Promedio total de la concentración de suero detectado en leche cruda
𝑊 = 𝑆(𝐸) − [1,3 + (𝑆(0) − 0,9)] 𝑊 = 2,12 − [1,3 + (0 − 0,9)]=1.72
66
Para determinar si las diferencias son significativas entre las muestras se a aplicó el análisis
estadístico, de varianza de un factor (ANOVA). En el análisis se optó por afirmar que existe
influencia estadísticamente significativa de una variable (factor) sobre las valoraciones obtenidas
en las leches cuando la probabilidad de error en dicha afirmación sea inferior al 5% (p<5%), esto
es, cuando el intervalo de confianza sea del 95%.
4.3.3. Análisis de varianza
El análisis de varianza que corresponde a la variable contenido de suero de quesería en leche cruda,
se muestra en la tabla N.-19.
Tabla N.-19 Análisis de varianza correspondiente a la variable contenido de suero de
quesería en leche cruda
FUENTE DE VARIACIÓN
SUMA DE CUADRADOS
GRADOS DE LIBERTAD
CUADRADO MEDIO
F CALCULADA F TABULADA
ENTRE TRATAMIENTOS
88,12 2 44,06 218,48* 5,14
ENTRE LOS TRATAMIENTOS
1,21 6 0,20
TOTAL 89,33 8
*Significativo al 5%
TablaN.-20 Contenido de suero de quesería promedio en leche cruda los cuales son de:
Promedio Varianza
2,014 0,093
0,63 0,12
7,85 0,39
El valor 218,48 de F calculada muestra diferencia significativa entre tratamientos, mientras que el
coeficiente de variación (CV) indica que el contenido de suero detectado en leches crudas varía
aproximadamente en un 0,2 % independientemente del período de muestreo.
67
Tabla N.-21 Comparación de tratamiento y diferencia entre medias para realizar la prueba
de Tukey al 5% de la variable de contenido de suero de quesería en leche cruda.
HACIENDA 3 HACIENDA 6 HACIENDA 7
HACIENDA 3
1,38 -5,84
HACIENDA 6
-7,22
HACIENDA 7
Tabla N.-22 Determinación de diferencias significativas
MEDIA ARITMETICA
VALOR TUKEY SIG
H 3vs H 6 1.38
4.34 ns
H 3vs H 7 5.83 4.34 *
H 6vs H 7 7.22 4.34 *
Ante la existencia de estas diferencias significativas entre tratamientos, se procedió a realizar un
análisis de comparaciones múltiples de las medias a través del test de Tukey con el objetivo de
ahondar aún más en las diferencias existentes. En este sentido, y respecto a la variable grupo,
observamos que existe diferencias significativas entre los grupos H3vsH7 y H6vsH7 tal como se
indica en la siguiente Tablan.-22.
Tabla N.-23 Valores a utilizados en la prueba de Tukey
PRUEBA DE TUKEY
DIFERENCIA HONESTAMENTE SIGNIFICATIVA HSD= 1,12
MULTIPLICADOR 4,34
MSE= 0,20
n= 3
68
Tabla N.-24 Representación de Rangos en unidades de Porcentaje
Muestras TRAT % SUERO RANGOS %
H7 T3 7,85 A
H3 T1 2,01
B
H6 T2 0,63
B
Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas
La tabla N.- 24 demuestra que el tratamiento H7 proporcionan una leche cruda con un
contenido de suero de 7.85 %, este hacienda posee un rango estadístico “A” según la prueba de
Tukey, en relación con las demás haciendas H3 y H6 que tienen un rango de “B”. Haciendo el
análisis estadístico respectivo se evidencia que la hacienda con un valor más alto de adulteración.
Las haciendas H3 y H6 manifiestan valores de 2.01 y 0.63 % que estadísticamente no son
diferentes significativamente entre ellos. La norma INEN 9: 2012 establece que el contenido de
suero en leche cruda debe ser nulo, por ende estas tres haciendas, incumplen con los parámetros
establecidos por dicha noma, sin embargo en los centros de acopio se acepta leche con hasta un 3%
de suero de quesería, en ese caso las muestras de las haciendas H3 y H6 serían aptas para entrar en
un proceso de producción, mientras que la muestra de la hacienda H7 deberán ser rechazadas de
seguir presentando estos índices de adulteración.
69
CAPITULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. CONCLUSIONES
5.1.1. Se ha desarrollado y evaluado un método simple para la determinación de
GMP expresado en porcentaje de suero de quesería en leche adulterada,
mediante el uso del equipo UPLC.
5.1.2. El límite de detección, límite de cuantificación, la precisión y % de recobro del
método del método desarrollado fueron; 0,20, 0.63, 2.7% con una desviación
estándar de 0,063, 90.77%(p/p). Respectivamente.
5.1.3. En la determinación del número de muestras a ser analizadas por la técnica
desarrollada, mediante la tabla militar estándar, se estableció en 8 el número de
haciendas muestreadas, tres de las 8 haciendas evaluadas adulteran su
producto con suero de quesería (lo que representa un 37,5%), se puede
evidenciar que la muestra de la hacienda 7 (H7), posee un valor mayor al 3%
de adulteración, que es un parámetro de aceptación de centros de acopio, pero
que de acuerdo con los lineamientos de la norma INEN 9:2012 las tres
muestras de las haciendas no cumplen con esta norma.
5.2. RECOMENDACIONES
5.2.1. Se recomienda que Agrocalidad implemente esta metodología para el control
de adulteración de leche cruda con suero de quesería a nivel nacional, para
frenar el fraude hacia los consumidores.
5.2.2. Realizar un control periódico de la totalidad de las haciendas productoras de
leche ubicadas en el cantón Mejía para contar con datos periódicos para el
control y pago justo de leche cruda.
5.2.3. Se recomienda que en el laboratorio de Control de Calidad de Leche de
Agrocalidad con el fin de obtener resultados confiables, se tenga mucha
precaución al momento de preparar los reactivos, para lo cual se sugiere filtrar
a través de una membrana de 0.45 µm de poro y desgasificar por
aproximadamente 10min: el agua tipo I, reactivos grados UPLC, la fase móvil.
70
5.3. BIBLIOGRAFÍA
Referencia Bibliografía
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Standardization), I. (. (2002). Guide to the use of repeatability, reproducibility and trueness
estimates in measurement uncertainty estimation.
Walstra, P., Jenness, R., & Badings, H. T. (1984). Dairy chemistry and physics. New York: John
Wiley.
73
Anexos
ANEXO 1. Preparación de soluciones
a) Solución de ácido tricloroacético. Disolver 240 g de ácido Tricloroacético PA-
ACS en Agua PA-ACS hasta 1000 ml.
b) Solución eluyente pH 6,0.
• Disolver 0,174 g de di-Potasio hidrógeno fosfato anhidro PA, 1,237 g de Potasio
di-hidrógeno fosfato PA y 2,141 g de sodio sulfato PA en, aproximadamente, 700 ml de
agua.
• Ajustar, si es necesario, a pH 6,0 con ayuda de una solución de ácido fosfórico o de
hidróxido potásico. Completar hasta 1000 ml y homogenizar.
• Filtrar y desgasificar la solución, antes de utilizar, utilizando una membrana
filtrante de 0,45 µm de diámetro de poro.
• Cuando se utiliza una columna diferente la fase móvil dependerá de fase
estacionaria usada.
c) Solución de lavado y conservación de columnas
• Mezclar un volumen de acetonitrilo en nueve volúmenes de agua.
• Filtrar la mezcla, antes de utilizar, utilizando una membrana filtrante de 0,45 µm de
diámetro de poro.
• Puede utilizarse cualquier otra solución de lavado que tenga efecto bactericida y
que no altere la eficacia de resolución de las columnas.
• Cuando se utiliza una columna diferente la solución de lavado y conservación de
columnas dependerá de fase estacionaria usada.
d) MUESTRAS PATRÓN
1. Leche fresca exenta de suero de quesería.
2. Leche fresca líquida añadida 5% de suero: Agregar a la leche fresca 5% m/m de
suero de quesería suero obtenido de la fabricación del queso fresco que cumpla con la
NTE INEN 1 528.
74
ANEXO 2. Tabla Militar estándar
Letra código de tamaño de muestra
Tamaño del Lote
Niveles generales de inspección
BAJO GENERAL ESTRICTO
I II III
2 a 9 A A B
9 a 15 A B C
16 a 25 B C D
26 a 50 C D E
51 a 90 C E F
91ª 150 D F G
151 a 280 E G H
281 a 500 F H J
501 a 1200 G J K
1201 a 3200 H K L
3201 a 10000 J L M
1001 a 35000 K M N
35001 a 150000 L N P
150000 a 500000 M P Q
75
Use el primer plan de muestreo debajo de la flecha .Si el tamaño de la muestra es igual o excede el
tamaño del lote lleve a cabo inspección 100%.
Use el plan de muestreo arriba de la muestra.
500001 o mas N Q R
Let
ra c
ódig
o d
e t
amañ
o
de
mues
tra
Tam
año
de
mu
estr
a
0.65 65 15
Ac Re Ac Re Ac Re
A
B
C
2
3
5
O 1
1 2
2 3
D
E
F
8
13
20
0 1
1 2
2 3
3 4
3 4
5 6
7 8
G
H
J
32
50
80
2
5 6
7 8
10 11
10 11
14 15
21 22
K
L
M
125
200
315
2 3
3 4
5 6
11 15
21 22
N
P
Q
500
800
1250
7 8
10 11
14 15
R 2000 21 22
76
Ac Cantidad máxima de defectos con la que puede aceptarse el lote.
ReCantidad de defectos a partir de la cual se rechaza el lote.
DEFECTO
CRITICO
Consulte la columna roja, si el efecto que encontró en la inspección, es crítico.
DEFECTO
MAYOR
Consulte la columna amarilla, si el defecto que encontró en la inspección, es mayor.
DEFECTO
MENOR
Consulte la columna gris, si el defecto que encontró en la inspección, es menor.
77
ANEXO 3 Resultados del análisis de las muestras recolectadas de las 8 haciendas de la Asociación COPLA
TRATAMIENTO B
SUJETO A HACIENDA 1 HACIENDA 2 HACIENDA 3 HACIENDA 4
MUESTRA 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
LECTURA
0 0 0 0 0 0 945269 1292797 1036926 0 0 0
0 0 0 0 0 0 937848 1066884 1064917 0 0 0
0 0 0 0 0 0 933463 1262236 1066433 0 0 0
TOTAL
0 0 0 0 0 0 2816580 3621917 3168276 0 0 0
PROMEDIO
0 0 0 0 0 0 938860 1207305,667 1056092 0 0 0
(Continuación)
TRATAMIENTO
B
SUJETO
A HACIENDA 5 HACIENDA 6 HACIENDA 7 HACIENDA 8
MUESTRA 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
LECTURA
0 0 0 313736 426480 624792 3374938 3702365 3922504 0 0 0
0 0 0 327917 419670 624356 3361160 3678870 3920505 0 0 0
0 0 0 331772 417057 626407 3342561 3651972 3889962 0 0 0
TOTAL 0 0 0 973425 1263207 1875555 10078659 11033207 11732971 0 0 0
PROMEDIO 0 0 0 324475 421069 625185 3359553 3677735,67 3910990,33 0 0 0
78
ANEXO 4. Norma técnica ecuatoriana INEN -2401 Determinación de suero de quesería
en la leche fluida y en polvo. Método de cromatografía líquida de alta eficacia.
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 2401:2008
DETERMINACIÓN DE SUERO DE QUESERÍA EN LA LECHE FLUIDA Y EN
POLVO. MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA.
Primera edición
HPLC METHOD OF DETECTING AND STIMATING WHEY TOTAL
SOLIDS IN MILK AND MILK POWDER
79
1. OBJETO
1.1 Este método permite determinar la adulteración de la leche con suero de quesería, usando el
método de cromatografía líquida de alta eficacia.
2. ALCANCE
2.1 El método se aplica a las leches líquidas, y en polvo para determinar la adulteración con suero
de quesería.
3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
3.1 Se pone de manifiesto la presencia de suero de quesería mediante la determinación de
glicomacropéptidos por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) previa la eliminación de
grasas y proteínas con ácido tricloroacético.
4. MATERIALES Y EQUIPOS
4.1 Material de uso corriente en el laboratorio
4.2 Equipo de cromatografía líquida de alta eficacia que comprende:
4.2.1 Una o dos columnas en serie, de características permeables de gel TSK 2000 SW (30 cm de
longitud, diámetro interior de 0,75 cm). Alternativamente puede utilizarse una de estas columnas
con pre-columna (3 cm x 0,3 cm) rellena de I125 o material de eficacia equivalente. Puede
utilizarse una columna de eficiencia equivalente.
4.2.2 Cuando se realiza el análisis con la columna TSK 2000 SW es recomendable trabajar con el
horno de columna con termostato regulado a 35ºC ± 1ºC. Se puede trabajar con columnas
mantenidas a temperatura ambiente, pero su poder de resolución es ligeramente menor. En este
caso las variaciones de temperatura durante una misma serie de análisis deberán ser inferiores a ±
5ºC. Cuando se utiliza una columna diferente la temperatura depende de fase estacionaria usada
4.2.3 Detector ultravioleta que permita efectuar lecturas a 205 nm.
4.2.4 Integrador que pueda integrar de valle a valle (área bajo el pico). Puede utilizase otra opción
de integración, por ejemplo las alturas de los picos, en este caso se aplicará el método de
integración adecuado.
5. REACTIVOS
- Acetonitrilo PA
- Acido orto fosfórico PA-ACS-ISO
- Acido tricloroacético PA-ACS
- Agua PA-ACS
80
- Di-potasio Hidrógeno fosfato anhidro PA
- Potasio di-hidrógeno fosfato PA
- Potasio Hidróxido lentejas PA
- Sodio Sulfato PA
PA-ACS hasta 1 000 ml.
5.2 Solución eluyente pH 6,0.
5.2.1 Disolver 1,74 g de di-Potasio hidrógeno fosfato anhidro PA, 12,37 g de Potasio di-hidrógeno
fosfato PA y 21,41 g de sodio sulfato PA en, aproximadamente, 700 ml de agua.
5.2.2 Ajustar, si es necesario, a pH 6,0 con ayuda de una solución de ácido fosfórico o de hidróxido
potásico. Completar hasta 1 000 ml y homogenizar.
5.2.3 En caso de utilizar una columna diferente a TSK 2000 SW, emplear una solución eluyente
adecuada.
5.2.4 Filtrar la solución, antes de utilizar, utilizando una membrana filtrante de 0,45 μm de
diámetro de poro.
5.2.5 Cuando se utiliza una columna diferente la fase móvil dependerá de fase estacionaria usada.
5.3 Solución de lavado y conservación de columnas
5.3.1 Mezclar un volumen de acetonitrilo en nueve volúmenes de agua.
5.3.2 Filtrar la mezcla, antes de utilizar, utilizando una membrana filtrante de 0,45 μm de diámetro
de poro.
5.3.3 Puede utilizarse cualquier otra solución de lavado que tenga efecto bactericida y que no altere
la eficacia de resolución de las columnas.
5.3.4 Cuando se utiliza una columna diferente la solución de lavado y conservación de columnas
dependerá de fase estacionaria usada.
6. MUESTRAS PATRÓN
6.1 Leche desnatada en polvo, exenta de suero de quesería.
6.2 Leche en polvo añadida 5% de suero. La misma leche anterior adicionada 5% m/m de suero
obtenido de la fabricación del queso fresco que cumpla con la NTE INEN 1 528.
6.3 Alternativamente puede usarse leche fresca exenta de suero de quesería.
6.4 Leche fresca líquida añadida 5% de suero: Agregar a la leche fresca (6.3) 5% m/m de suero de
quesería.
81
7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
7.1 Leche en polvo
7.1.1 Previo al análisis homogenizar bien la leche. Trasvasar la leche a un recipiente
aproximadamente el doble del volumen de ésta, provisto de un cierre hermético, cerrar el recipiente
inmediatamente y mezclar bien.
7.1.2 Pesar 2,000 g ± 0,001 g y añadir 20,0 g de agua a 50 ºC. Disolver agitando durante 5 minutos
con la ayuda de un agitador.
7.1.3 Llevar a 25 ºC. Añadir en 2 minutos 10,0 ml de la solución de ácido tricloroacético (5.1)
agitando constantemente con la ayuda de un agitador.
7.1.4 Mantener a 25ºC durante 60 minutos.
7.1.5 Centrifugar por 10 min a 2500 rpm o filtrar sobre papel desechando los primeros 5 ml de
filtrado. Pasar filtrado por un filtro de membrana de poro 0,45 μm o menor.
7.2 Leche líquida. Homogeneizar la muestra a 40 oC y tomar 20 ml de leche y continuar el proceso
que se detalla a partir de 7.1.3.
7.3 Preparación de patrones a partir de leche en polvo. Aplicar, exactamente, a la leche en
polvo (6.1) y a la leche en polvo adicionada (6.2) el procedimiento descrito en 7.1.
7.4 Preparación de patrones a partir de leche líquida. Aplicar, exactamente, a la leche fresca
líquida (6.3) y leche fresca adicionada suero (6.4) el procedimiento descrito en 7.2.
8. PROCEDIMIENTO
8.1 Análisis cromatográfico
8.1.1 Antes de proceder al análisis cromatográfico de las muestras, inyectar el patrón de leche en
polvo adicionada con el 5 % de suero de quesería preparado de acuerdo con 7.3 o 7.4, las veces que
sean necesarias hasta que el área (o cualquier respuesta que se use para relacionar con la
concentración) y el tiempo de retención del pico correspondiente a los glicomacropéptidos (GMP)
sea constante.
8.1.2 Inyectar en la columna un volumen de 15 a 30 μL, medidos con exactitud, del filtrado del
patrón exento de suero, del patrón con 5% de suero y de las muestra, en el aparato de cromatografía
líquida de alta eficacia con un flujo de 1,0 ml/min de la solución eluyente (5.2), o en las
condiciones adecuadas de acuerdo con la columna usada.
8.1.3 En cada interrupción lavar las columnas con agua y en toda interrupción superior a
veinticuatro horas, después del lavado con agua, se les debe pasar solución de lavado (5.3) por lo
menos tres horas a un flujo de 0,2 ml por minuto o seguir las instrucciones del fabricante.
82
9. CÁLCULOS
9.1 Análisis previo En las figuras 1 y 2 (ver nota 1) se representan los cromatogramas de una leche
en polvo exenta de suero de quesería y de la misma leche en polvo adicionada el 5 % m/m de suero
de quesería respectivamente. El pico III es el correspondiente a los glicomacropéptidos (GMP).
9.1.1 Con el fin de detectar cualquier anomalía, ya sea debida al mal funcionamiento del
cromatógrafo o de las columnas, debido a la muestra a analizar, es necesario observar el aspecto de
cada cromatograma antes de efectuar cualquier interpretación cuantitativa.
9.2 Procedimiento de cálculo cuando se utilizan las áreas de los picos para la determinación del
porcentaje de suero de quesería añadido.
9.2.1 Cálculo del coeficiente de respuesta
En donde:
R = es el coeficiente de respuesta
A(5) = es el área del pico III obtenido del análisis cromatográfico del patrón de leche en polvo
adicionada el 5% (m/m) de suero de quesería
A(0) = es el área del pico III, obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche en polvo
exenta de suero de quesería
P = es el porcentaje de suero de quesería presente en el patrón (en este caso 5 %)
9.3 Cálculo del área relativa del pico III obtenido del análisis cromatográfico de la muestra.
S(E) =RxA(E)
En donde:
S(E) = área relativa del pico III en la muestra
A(E) = área correspondiente al pico III obtenida en el análisis cromatográfico de la muestra
R = Coeficiente de respuesta, calculado según 9.2
9.4 Cálculo del área relativa del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche
en polvo exento de suero de quesería.
S(0)= R x A(0)
En donde:
83
S(0) = área relativa del pico III en el patrón de leche en polvo exenta de suero de quesería
A(0) = área correspondiente al pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche
exenta de suero de quesería
R = coeficiente de respuesta calculado según 9.2
9.5 Cálculo del tiempo de retención relativo del pico III en la muestra.
En donde:
TRR(E) = tiempo de retención relativo del pico III de la muestra
TR(E) = tiempo de retención del pico III obtenido en el análisis cromatográfico de la muestra
TR(5) = tiempo de retención del pico III obtenido en el análisis cromatográfico del patrón de leche
en polvo adicionada del 5 % (m/m) de suero de quesería
9.5.1 Por la experimentación está demostrado que existe relación lineal entre el tiempo relativo del
pico III en la muestra y el porcentaje de suero de quesería añadido hasta el 10 %
a) Con un contenido < 5 %, el TRR(E) es > 1,000
b) Con un contenido " 5 %, el TRR(E) es = 1,000
9.5.2 La incertidumbre admitida para los valores del TRR(E) es de ± 0,002
9.6 Cálculo del porcentaje de suero de quesería presente en la muestra (ver nota 2).
W =S(E) – (1,3 + (S(0) −0,9))
En donde:
W = porcentaje m/m de suero de quesería presente en la muestra
S(E) = área relativa del pico III para la muestra, obtenida según 9.3
1,3 + = media experimental del área relativa del pico III expresada en gramos de suero de quesería
en 100 g de leche no adulterada.
S(0) = área relativa del pico III para el patrón de leche exenta de suero de quesería, obtenida según
9.4
S(0)-0,9 = corrección que hay que efectuar en el área relativa media 1,3 cuando el valor S(0) no es
igual a 0,9
84
9.7 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas
simultáneamente o en un corto intervalo de tiempo por el mismo analista que utilice los mismos
aparatos, con la misma toma de muestra, no debe sobrepasar el 0,2% m/m.
9.8 Reproductibilidad. La diferencia entre dos resultados individuales e independientes obtenidos
en dos laboratorios diferentes, con la misma toma de muestra no debe sobrepasar el 0,4% m/m.
9.9 Límite de detección. Se considerará que una muestra contiene suero de quesería añadido
cuando el porcentaje cuantificado sea superior al 5 % para las leches UHT y superior a 3% en
leches pasteurizadas, esterilizadas y en polvo.
85
ANEXO 5. Norma técnica ecuatoriana INEN -9:2012 quinta revisión para leche cruda.
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN
Quito – Ecuador
LECHE CRUDA. REQUISITOS.
Primera Edición
RAW MILK. REQUIREMENTS.
First Edition
DESCRIPTORES: Tecnología de los alimentos, leche y productos lácteos, leche cruda,
requisitos
AL 03.01-401
CDU: 637.133.4
CIIU: 3112
ICS: 67.100.01
86
1. OBJETO
1.1 Esta norma establece los requisitos que debe cumplir la leche cruda de vaca, destinada al
procesamiento.
2. ALCANCE
2.1 Esta norma se aplica únicamente a la leche cruda de vaca. La denominación de leche cruda
se aplica para la leche que no ha sufrido tratamiento térmico, salvo el de enfriamiento para su
conservación, ni ha tenido modificación alguna en su composición.
3. DEFINICIONES
3.1 Para efectos de esta norma se adoptan las siguientes definiciones:
3.1.1 Leche. Producto de la secreción mamaria normal de animales bovinos lecheros sanos,
obtenida mediante uno o más ordeños diarios, higiénicos, completos e ininterrumpidos, sin
ningún tipo de adición o extracción, destinada a un tratamiento posterior previo a su consumo.
3.1.2 Leche cruda. Leche que no ha sido sometida a ningún tipo de calentamiento, es decir su
temperatura no ha superado la de la leche inmediatamente después de ser extraída de la ubre
(no más de 40°C).
4. DISPOSICIONES GENERALES
4.1 La leche cruda se considera no apta para consumo humano cuando:
4.1.1 No cumple con los requisitos establecidos en el Capítulo 5 de la presente norma.
4.1.2 Es obtenida de animales cansados, deficientemente alimentados, desnutridos, enfermos o
manipulados por personas afectadas de enfermedades infectocontagiosas.
4.1.3 Contiene sustancias extrañas ajenas a la naturaleza del producto como: conservantes
(formaldehído, peróxido de hidrógeno, hipocloritos, cloraminas, dicromato de potasio,
lactoperoxidasa adicionada), adulterantes (harinas, almidones, sacarosa, cloruros, suero de
leche, grasa vegetal), neutralizantes, colorantes y residuos de medicamentos veterinarios, en
cantidades que superen los límites indicados en la tabla 1.
4.1.4 Contiene calostro, sangre, o ha sido obtenida en el período comprendido entre los 12 días
anteriores y los 7 días posteriores al parto.
87
4.1.5 Contiene gérmenes patógenos o un contaje microbiano superior al máximo permitido por
la presente norma, toxinas microbianas o residuos de pesticidas, y metales pesados en
cantidades superiores al máximo permitido.
4.2 La leche cruda después del ordeño debe ser enfriada, almacenada y transportada hasta los
centros de acopio y/o plantas procesadoras en recipientes apropiados autorizados por la
autoridad sanitaria competente.
4.3 En los centros de acopio la leche cruda debe ser filtrada y enfriada, a una temperatura
inferior a 10ºC con agitación constante
4.4 Los límites máximos de pesticidas serán los que determine el Codex Alimentarius
CAC/MRL 1
4.5 Los límites máximos de residuos de medicamentos veterinarios para la leche serán los que
determine el Codex Alimentario CAC/MRL 2.
5. REQUISITOS
5.1 Requisitos específicos 5.1.3 Contaminantes. El límite máximo para contaminantes es el
que se indica en la tabla 2.
5.1.1 Requisitos organolépticos (ver nota 1)
5.1.1.1 Color. Debe ser blanco opalescente o ligeramente amarillento.
5.1.1.2 Olor. Debe ser suave, lácteo característico, libre de olores extraños.
5.1.1.3 Aspecto. Debe ser homogéneo, libre de materias extrañas.
5.1.2 Requisitos físicos y químicos
5.1.2.1 La leche cruda, debe cumplir con los requisitos físico-químicos que se indican en la
tabla 1
88
5.1.3 Contaminantes. El límite máximo para contaminantes es el que se indica en la tabla 2.
5.1.4 Requisitos microbiológicos. La leche cruda debe cumplir con los requisitos especificados
en la tabla 3.
89
5.2 Requisitos complementarios. El almacenamiento, envasado y transporte de la leche cruda
debe realizarse de acuerdo a lo que señala el Reglamento de leche y productos lácteos del
Ministerio de Salud Pública.
6. INSPECCIÓN
6.1 Muestreo. El muestreo debe realizarse de acuerdo con la NTE INEN 4.
6.2 Aceptación o rechazo. Se acepta el producto si cumple con los requisitos indicados en
esta norma, caso contrario se rechaza.
90
ANEXO 6. Certificado traducción del resumen documental
