Universidad Andrés Bello EFECTO DE LA MANIPULACIÓN DEL ...

Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela de Ingeniería en Biotecnología

EFECTO DE LA MANIPULACIÓN DEL EQUILIBRIO FUENTE-SUMIDERO EN

EL PERFIL DE METABOLITOS ASOCIADOS A CALIDAD EN FRUTOS DE

Prunus persica (L.) BATSCH VAR `BUEN LINDO´

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar

al Grado de Magíster en Biotecnología

Profesor patrocinante: Dra. Andréa Miyasaka de Almeida


Universidad Andrés Bello

Profesor co-patrocinante: Dra. Romina Pedreschi

Escuela de Agronomía

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

María Victoria Lillo Carmona

Santiago, Chile

Julio, 2017

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UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO


Ingeniería en Biotecnología

" EFECTO DE LA MANIPULACIÓN DEL EQUILIBRIO FUENTE-SUMIDERO

EN EL PERFIL DE METABOLITOS ASOCIADOS A CALIDAD EN FRUTOS DE

Prunus persica (L.) BATSCH VAR `BUEN LINDO´ ”

María Victoria Lillo Carmona

Este trabajo fue elaborado bajo la supervisión del Director de Tesis Dra. Andréa Miyasaka

de Almeida, en el laboratorio de Fisiología Vegetal y Genómica de frutales del Centro de

Biotecnología Vegetal, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Andrés Bello,

aprobado por los miembros de la Comisión de evaluación.

SANTIAGO-CHILE

2017

Dra. Andréa Miyasaka de Almeida

Directora de Tesis

Dr. Reinaldo Campos

Comisión de Tesis

Dra. Romina Pedreschi

Co-Directora de Tesis

Dra. María Alejandra Moya

Comisión de Tesis

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A mi estrellita en el cielo, Benny…

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AGRADECIMIENTOS

A los primeros que quiero agradecer, además de dedicar todo este trabajo, son a mis padres,

María Elena y José. Creo que faltan palabras para agradecer todo lo que han hecho por mi

durante todos estos años, por sus palabras, motivación y enseñanzas, además de la

paciencia que tuvieron conmigo. Gracias papis.

También agradecer a la Dra. Andréa, gracias por darme la oportunidad de estar en su

laboratorio y confiar en mi trabajo, además de toda la ayuda que me brindó durante este

proceso. A la Dra. Romina, gracias por recibirme en Quillota y por sus enseñanzas. A

Claudia quien tuvo mucha paciencia en enseñarme, gracias por tu buena voluntad y

disposición, además de hacerme sentir como en casa. A Viveros El Tambo por el acceso al

material vegetal. A la Dra. María Luisa Valenzuela por su aporte al análisis de mis

resultados. A todo el grupo AM, en especial al grupo durazno y a Carlos, Lore, Esteban y

Luciano, gracias por las risas, la paciencia y la buena disposición. A la Maca, quien

escuchó todas mis tonteras y soportó el estrés mientras escribía. Agradecer a mis hermanas,

Nena, Eu y Kika por su apoyo y por escucharme siempre. A mis pequeños Fernanda y

Martín, que llegaron sólo a darme alegrías en momentos de estrés. A mi tía Margarita, por

su apoyo incondicional. A mi amigo del alma, mi BFF, Miguel. Sin ti definitivamente ésto

no habría sido igual. Gracias por enseñarme, apoyarme, escucharme, soportarme y tu

amistad incondicional. Agradezco a los amigos que conocí durante mis años en la

universidad. Camilo, gracias por tu amistad y apoyarme en cada momento. Kuky, mi

gemela perdida, gracias por escucharme y soportarme. Lily y Jossy, gracias por compartir

conmigo, aprendí tanto de ustedes, es bueno saber que aún puedo contar con su amistad.

Muri, Nico y Dany, con ustedes empezó toda esta aventura, gracias por todos los momentos

vividos, me alegra tanto saber que aún están. A Poleto y Sandri, gracias por escucharme y

contener todo mi estrés, además del cariño recibido siempre independiente del tiempo que

pase. A Mama Ru y Katy, “Show 'em what you're worth” y “Don´t f*uck it up” nunca me

hicieron mas sentido que ahora. Por último y no menos importante, mi Benny, quien me

acompañó las noches de estudio incondicionalmente, esperándome hasta la madrugada.

Gracias por tu amor, mi hermosurita.

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FINANCIAMIENTO

Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Fisiología Vegetal y Genómica de Frutales del

Centro de Biotecnología Vegetal de la Universidad Andrés Bello, financiado por el

proyecto FONDECYT 1130197 y FONDEQUIP EQM140074.

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INDICE

INDICE ................................................................................................................................... 6

ABREVIATURAS ................................................................................................................. 7

RESUMEN ............................................................................................................................. 8

ABSTRACT ........................................................................................................................... 9

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 10

1. Importancia económica y exportación de duraznos y nectarines ................................. 10

2. Características bioquímicas y morfológicas de Prunus persica .................................... 10

3. Desarrollo de Prunus persica ........................................................................................ 11

4. Metabolitos asociados a calidad ................................................................................... 12

5. Equilibrio fuente-sumidero ........................................................................................... 16

HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 20

OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 20

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 20

MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 21

1. Material vegetal ............................................................................................................ 21

2. Diseño experimental ..................................................................................................... 21

3. Fenotipificación de frutos de Prunus persica (L.) var `Buen Lindo´. ........................... 22

4. Tinción de lignina ......................................................................................................... 23

5. Elección de los puntos de muestreo para los análisis metabolómicos .......................... 23

6. Extracción de azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos ........ 23

7. Condiciones cromatográficas ....................................................................................... 24

8. Análisis de datos metabolitos polares (GC-MS) .......................................................... 25

8.1 PLS-DA .................................................................................................................. 25

8.2 Variables importantes en la proyección (VIP) ....................................................... 25

8.3 Heat map ................................................................................................................. 26

9. Cuantificación de carotenoides totales ......................................................................... 26

RESULTADOS .................................................................................................................... 28

1. Desarrollo de los frutos de `Buen Lindo´ ..................................................................... 28

2. Fenotipificación de frutos de `Buen Lindo´ ................................................................. 30

3. Cuantificación de clorofila a, b y carotenoides totales ................................................. 32

4. Composición metabólica de los frutos.......................................................................... 34

4.1 Heat map de composición metabólica .................................................................... 34

4.2 Análisis discriminante de regresión de mínimos parciales (PLS-DA) ................... 36

4.3 Variables importantes en la proyección (VIP) ....................................................... 38

4.4 PLS- DA aplicando el VIP ..................................................................................... 41

4.5 Metabolitos correlacionados con los tratamientos de raleo .................................... 41

DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 47

CONCLUSIONES ................................................................................................................ 53

REFERENCIAS ................................................................................................................... 54

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ABREVIATURAS

DAB: días post-floración

HPF: hojas por fruto

PLS-DA: regresión de mínimos cuadrados parciales con análisis discriminante

S1: Etapa 1 del desarrollo del fruto



QC: control de calidad

GC-MS: Cromatógrafo de gases acoplado a detector de masa

VIP: variables importantes en la proyección

PF: peso fresco

SS: sólidos solubles

SSM: sólidos solubles maduros

OAA: oxaloacetato

PEP: fosfoenolpiruvato

SDH: sorbitol deshidrogenasa

SOX: sorbitol oxigenasa

CO2: dióxido de carbono

PEPC: fosfoenolpiruvato carboxilasa

TCA: ciclo de los ácidos tricarboxílicos

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RESUMEN

Prunus persica (L.) Batsch, durazno y nectarinas, pertenece a la familia Rosaceae y es

originario de China. Es uno de los frutos más populares que se cultivan en zonas templadas

alrededor del mundo. Chile es su principal exportador del hemisferio sur en contra-estación

y Es necesario el incremento de la calidad de los frutos, atribuibles al tamaño, color,

firmeza, frescura, aroma, dulzor, acidez, jugosidad y textura para que el país se mantenga

en esa posición de liderazgo en el mercado. Metabolitos tales como azúcares, ácidos

orgánicos y aminoácidos entre otros, los cuales van cambiando dependiendo de la variedad

y el estado del desarrollo en el cual se encuentre el fruto, están directamente relacionados a

algunos de esos parámetros de calidad. Una manera de modificar el metabolismo es

cambiando el equilibrio fuente-sumidero del árbol, utilizando técnicas como el raleo. En

este trabajo se evaluó el perfil metabolómico de frutos de la variedad temprana de durazno

`Buen Lindo´ de árboles sometidos a dos tratamientos: con raleo y sin raleo. Para ello, se

realizó una extracción de metabolitos de frutos en distintos estados de desarrollo y se

analizaron mediante cromatografía de gases acoplado a un detector de masas. Los datos se

analizaron mediante análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales con análisis

discriminante (PLS-DA), evaluando los principales metabolitos asociados a cada estado de

desarrollo del fruto, y además relacionándolos a un tratamiento de raleo. Se identificaron

los principales metabolitos involucrados en la calidad final del fruto siendo la mayor parte

azúcares y ácidos orgánicos. El efecto del raleo se observó a nivel fenotípico, incidiendo en

la producción de frutos de mayor tamaño y con mayor cantidad de sólidos solubles.

Además, el raleo modificó el perfil metabólico, encontrándose mayor cantidad relativa de

azúcares y ácidos orgánicos en el tratamiento sin raleo en madurez de consumo.

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ABSTRACT

Prunus persica (L.) Batsch, peach and nectarines, belongs to the Rosaceae family and it is

originated from China. It is one of the most popular fruit that is grown in temperate zones

around the world. Chile is the main exporter from the Southern hemisphere in counter

season. It is necessary to increase the quality of the fruits regarding size, color, firmness,

freshness, aroma, sweetness, acidity, juiciness and texture to keep the country in this

leadership. Metabolites such as sugars, organic acids and amino acids are important, which

change depending on the variety and fruit developmental stage are directly related to some

of these quality traits. One way to modify the metabolism is changing tree source-sink

balance, using techniques such as thinning. In this researchwork the fruit metabolic profile

of the early peach variety `Buen Lindo´ from thinned and unthinned trees were evaluated.

Metabolite extraction of peach fruits at different stages of development was performed and

gas chromatography coupled to a mass spectrometry was used for the analysis. The data

were analyzed by least squares regression analysis with discriminant analysis (PLS-DA),

evaluating the main metabolites associated with each stage of development and those

related to a thinning treatment. The main metabolites involved in the final quality of the

fruit were identified and most of them were sugars and organic acids. The effect of thinning

was observed at the phenotypic level, promoting bigger size fruits and with an improved

amount of soluble solids. Indeed, thinning had a effect on the metabolic profile, with the

highest relative amount of sugars and organic acid associated with a non-thinning

treatment.

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INTRODUCCIÓN

1. Importancia económica y exportación de duraznos y nectarines

Los duraznos y nectarines [Prunus persica (L.) Batsch] pertenecientes a la familia

de las Rosaceae son drupas de buen sabor, dulces y jugosas. La diversidad genética de

Prunus persica es muy amplia en China, existiendo alrededor de 495 cultivares

reconocidos, indicando que tiene una larga historia que se remonta desde los 1100 AC

(Huang et al., 2008). Prunus persica crece en todos los continentes, excepto la Antártica, y

la producción mundial ha incrementado continuamente en los últimos años (Jiang y Song,

2009). Es el cuarto fruto más importante en el mundo y el segundo en Europa (FAOstat,

2013). Chile aporta el 8% de las ventas mundiales de durazno, además supera el 80% de las

exportaciones del hemisferio sur, abasteciendo a los países del hemisferio norte, EE.UU.

principalmente. Sólo en el año 2015, la exportación de este fruto en Chile alcanzó las 35

mil toneladas (ODEPA, 2015).

2. Características bioquímicas y morfológicas de Prunus persica

Los frutos de Prunus persica tienen carozo, poseen un endocarpo lignificado en

donde se encierra la semilla, un mesocarpo carnoso y un exocarpo (piel) delgado (Figura 1).

Una característica que diferencia a duraznos de nectarines es la presencia de tricomas en los

duraznos. Estos frutos también se diferencian si poseen o no carozo adherido a la pulpa,

además de cómo es el proceso de ablandamiento de la pulpa: fundente o no fundente

(Colaric et al., 2005; Infante et al., 2008)

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Figura 1: Estructura de Prunus persica (L.) Batsch, donde se observan sus distintos tejidos. Fuente:

http://www.euita.upv.es/varios/biologia/web_frutos/Estructura.htm.

3. Desarrollo de Prunus persica

El desarrollo y maduración del fruto son procesos dinámicos que involucran una

serie de cambios moleculares y bioquímicos. El desarrollo de frutos con carozo puede ser

descrito generalmente como un proceso de 4 estados observándose una curva doble

sigmoide (Chalmers y van den Ende, 1975; Tonutti et al., 1997; el-Sharkawt et al., 2007).

El primer estado (S1), corresponde a la primera fase de crecimiento exponencial, y se

caracteriza por un rápido incremento en la división y elongación celular. Durante la

segunda fase (S2), el endocarpo se endurece para formar el cuesco, proceso conocido como

endurecimiento del carozo. Además, durante esta fase no hay incremento en el tamaño del

fruto y las vías metabólicas relacionadas con la síntesis de lignina están muy activas

(Dardick et al., 2010). Posteriormente, en el tercer estado (S3), también conocido como la

segunda fase exponencial, existe un rápido incremento en el tamaño del fruto, dado por una

rápida elongación celular y entrada de agua. Finalmente, en el cuarto estado (S4) el fruto

http://www.euita.upv.es/varios/biologia/web_frutos/Estructura.htm

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llega a su tamaño final y entra a la maduración o a su estado climatérico (Figura 2). Cabe

mencionar que la fase S4 puede ser subdividida en dos fases: S4-1, en la cual el fruto llega

a su tamaño final, y S4-2, donde el fruto continua su madurez en un modo dependiente de

etileno (Trainotti et al., 2003). La fase S4-2 puede llevarse a cabo fuera del árbol y

usualmente ocurre antes del consumo humano (Borsani et al., 2009).

Figura 2: Curva de crecimiento de Prunus persica (L.) Batsch. Se observa como una curva doble sigmoidea.

Fuente: https://fisiohorticola.files.wordpress.com/2008/11/estructura-y-morfogenesis-del-fruto1.pdf.

4. Metabolitos asociados a calidad

Los atributos de calidad sensorial y valor nutritivo del fruto juegan un rol

importante en la satisfacción del consumidor e influencia futuros consumos. La calidad de

frutos de Prunus persica puede ser determinada por análisis químicos y depende

principalmente de sus componentes mayores tales como la sacarosa, ácido cítrico y málico,

carotenoides, lactonas y polifenoles (Aubert et al., 2003; Bassi y Selli, 1990; Brovelli et

al.,1999; Versari et al., 2002).

El sabor, aroma, textura y apariencia son generalmente considerados como los

atributos sensoriales más importantes dentro de los parámetros de calidad del fruto. El

sabor está relacionado con los compuestos solubles en agua, específicamente, el dulzor es

mayormente atribuible a algunos mono y disacáridos, mientras que el sabor ácido es

https://fisiohorticola.files.wordpress.com/2008/11/estructura-y-morfogenesis-del-fruto1.pdf

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relacionado a ácidos orgánicos y pH (Colaric et al., 2005). Por otro lado, el aroma es

atribuido a compuestos que exhiben cierta volatilidad (Shepherd et al., 1993).

Prunus persica representa un modelo particular de fruta en términos de fisiología,

anatomía y metabolismo, diferente de otros modelos de frutas como el tomate, frambuesas

o uvas; y con redes metabólicas particulares durante su desarrollo, el cual está relacionado a

su morfología (una drupa con semillas cubierta por un endocarpo lignificado y un

mesocarpo jugoso) (Lombardo et al., 2011). Con esta morfología en general, hay una

extensa variabilidad en sabores, texturas y tasas de dulzor/acidez, en los cientos de

variedades que existen alrededor del mundo (Byrne, 2005; Sansavini et al., 2006).

El sabor de la pulpa de las frutas, como Prunus persica, dependen mayormente del

contenido de azúcares y ácidos, y la razón entre ellos (Esti et al., 1997; Robertson et al.,

1990; Souty y André, 1975). La sacarosa es el azúcar predominante en estos frutos

encontrándose entre un 40 y un 85% del contenido de azúcares totales, mientras que los

azúcares reductores como glucosa y fructosa están en cantidades equimolares alcanzando

hasta un 25% del contenido de azúcares totales. Sin embargo, el contenido de sorbitol es

siempre bajo (Wrolstad y Shallenberger, 1981), lo que sugiere que el sorbitol es

metabolizado a azúcares reductores (Brooks et al., 1993). Por otro lado, los ácidos

orgánicos predominantes son el ácido málico y cítrico con concentraciones en la pulpa en la

cosecha de entre 14 y 12 meq/100 g respectivamente (Souty y André, 1975). Autores

señalan que el contenido de sacarosa y ácido málico incrementan durante la maduración del

fruto cuando los azúcares reductores y el ácido cítrico disminuyen (Chapman et al., 1991;

Ishida et al., 1971).

Existe una analogía entre los azúcares reductores, sacarosa y los ácidos málico y

cítrico, en donde los azúcares reductores y el ácido cítrico son utilizados como sustratos

para el crecimiento y la respiración (Génard et al., 1994). Ambos tienen distintas

concentraciones, en donde el malato probablemente tiene una alta prioridad metabólica,

explicando la relación positiva con la tasa de crecimiento. Muchos autores han mostrado

que la concentración de sacarosa y el ácido málico incrementan durante la maduración del

14

fruto, mientras el ácido cítrico disminuye (Chapman et al., 1991; Liverani y Cangini, 1991).

Por otro lado, frutos cosechados inmaduros fisiológicamente tendrán bajas cantidades de

sacarosa y ácido málico, y alto contenido de ácido cítrico (Génard et al., 1994).

Sacarosa, glucosa, fructosa, y sorbitol son las mayores azúcares o alcoholes de

azúcares encontrados en las frutas de las mayoría de las especies de Rosaceae. La Figura 3,

simula la división de flujo de carbono desde el floema de los cuatro azúcares mencionados,

los otros compuestos de la fruta y el CO2 producido por la respiración (Génard y Souty

1996). El modelo tiene siete puntos principales: 1) la distribución de carbono que entra

como sacarosa y sorbitol es constante; 2) el carbono presente en la fruta como sorbitol es

continuamente convertido en glucosa y fructosa; 3) la transformación de carbono desde la

sacarosa en glucosa y fructosa disminuye a medida que se acumulan días post-floración; 4)

glucosa y fructosa pueden ser interconvertidas; 5) la cantidad de carbono utilizada para

sintetizar otros compuestos (no azúcares) disminuye a medida que se acumulan grados-día

y proviene de glucosa y fructosa a través de vías respiratorias; 6) el carbono utilizado para

la respiración viene desde la glucosa y la fructosa, proporcional a su cantidad en la fruta; y

7) excepto por la respiración, el flujo de carbono entre dos compuestos es proporcional a la

cantidad de carbono en la fuente (Génard y Souty, 1996).

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Figura 3: Representación de la división del flujo de carbono desde el floema. Las flechas representan el flujo

de carbono, los círculos representan la fuente de carbono, y los rectángulos representan los carbohidratos.

Fuente: Modificado de Génard y Souty, 1996.

En frutos inmaduros de Prunus persica se guardan altos niveles de proteínas las

cuales son utilizadas en procesos que ocurren en S1 y S2. El perfil metabólico también

indica altos niveles de aminoácidos, tales como prolina, fenilalanina, tirosina y glutamina,

los cuales van disminuyendo a medida que el fruto va madurando. Una alza importante en

aminoácidos como prolina, fenilalanina, tirosina, alanina, valina ocurre en el estado S2/S3.

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En este escenario, es probable que estos aminoácidos en estadios tempranos de desarrollo,

se conviertan en sustratos para vías de fenilpropanoides, lignina y flavonoides (Lombardo

et al., 2011).

En aspectos de sabor, el dulzor está correlacionado con el ácido cítrico, el ácido

shikímico y la razón entre azúcares/ácidos orgánicos. Aunque el ácido cítrico usualmente

está presente en bajas concentraciones en los frutos, añade más acidez a los que el ácido

málico (Génard et al., 1994). En el estudio de Collaric et al., (2005), los azúcares como la

sacarosa, fructosa y glucosa los cuales son responsables del dulzor del fruto, no se

correlacionaron con el dulzor, en cambio, la razón entre azúcares/ácidos orgánicos si lo

hicieron. Por otro lado, el azúcar más abundante, la sacarosa fue la más relacionada al

aroma. Según Collaric et al., (2005), la sacarosa y el sorbitol fueron los que tuvieron más

relación al sabor. La sacarosa como el mayor azúcar presente en frutos de Prunus persica

es importante en el dulzor, como fuente de energía y antioxidante (Huberlant y Anderson,

2003). Sorbitol, siendo alcohol de azúcar es más beneficioso que otros azúcares, aportando

en el sabor y en la textura del fruto (Rapaille et al., 2003). El ácido málico y cítrico son los

que contribuyen en mayor grado a la acidez.

Otro parámetro de calidad atractiva para el consumidor y además con múltiples

beneficios para la salud son los carotenoides. Son considerados nutrientes esenciales y no

pueden ser sintetizados por el cuerpo humano. Además son los pigmentos responsables del

color del fruto (Mayne, 1996).

5. Equilibrio fuente-sumidero

Para entender la fisiología de los frutos y la influencia de los factores limitantes de

la cosecha en la producción, es necesario el estudio de la relación fuente-sumidero y la

regulación del flujo del carbono. Las hojas son regiones de producción de asimilados

conocidas como órganos fuentes. Una hoja en desarrollo, sin embargo, puede representar

tanto como órgano fuente produciendo asimilados para exportación, así como también

puede ser sumidero, importando asimilados desde otras partes de la planta. Los sumideros

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importan y usan asimilados durante la respiración, crecimiento y almacenaje (Guardiola y

García-Luis, 2000). Dentro del árbol, los órganos reproductivos como los frutos, compiten

por los asimilados con otros frutos, especialmente en árboles con alta carga frutal como

duraznos y manzanas (Dann et al., 1984; DeJong et al., 1987; Hansen, 1971; Maggs, 1963;

Weinberger, 1931). Es por esto, que en campos productivos es necesario reducir la carga

frutal del árbol, mediante la técnica llamada raleo para obtener frutos de mayor tamaño

(Guardiola y García-Luis, 2000; Link, 2000; Ojer y Reginato, 2002)

En árboles en plena producción el raleo debe ser llevado a cabo cada año. Las

ventajas de esta técnica han sido ampliamente descritas: la reducción del número de flores o

frutos incrementa el tamaño del fruto, mejora la calidad, y balancea la razón fruto/brote, lo

que lleva a un incremento de los asimilados hacia la fruta (Costa et al., 1978; Farley 1923;

Giulivo, 1974; Giulivo et al., 1981; Havis, 1962). La fecha de raleo es crítica para obtener

buenos resultados. Ha sido descrito que el raleo manual de frutos usualmente se debe

realizar hacia el final del estado S2 o a comienzos del estado S3. Después de la abscisión

natural, sólo el exceso de frutos en el árbol necesita ser raleado. Durante el estado S2, los

frutos incrementan en tamaño lentamente y su demanda de asimilados permanece alta

durante el endurecimiento del endocarpo (Weinberger, 1941).

El raleo de frutos afecta el tamaño del fruto y el rendimiento. La cantidad adecuada

de frutos que se van a remover depende de la genética y de la capacidad de carga. Esta

última se asocia con la edad y el tamaño del árbol, y también está influenciada por factores

externos como la poda (Guardiola y García-Luis, 2000). Independiente de la especie, un

incremento de la carga frutal, reduce el tamaño final de la fruta y el rendimiento de la

cosecha (Dennis et al., 1983). La relación fuente-sumidero y la asignación de asimilados a

los diferentes órganos juegan un rol fundamental en la determinación del rendimiento del

cultivo (Dennis et al., 1983). El tamaño del fruto depende de la razón entre el número de

hojas y el número de frutos. Reduciendo en número de frutos por árbol mediante raleo, se

incrementa la razón hoja-fruto, incrementando el tamaño del fruto (Dorsey y McMunn,

1927; Weinberger, 1931). Se ha reportado que el raleo temprano a la floración o después de

la polinización, resulta en frutos más grandes (Weinberger, 1941), indicando que el

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crecimiento de Prunus persica es fuente-limitada durante periodos tempranos y tardíos del

desarrollo (Grossman y DeJong, 1995; Pavel y DeJong, 1993). Durante los periodos medios

del crecimiento, las limitaciones del sumidero pueden estar presentes (al menos en

cultivares que maduran tardíamente) (DeJong y Grossman, 1995). Sin embargo, el periodo

en el cual las limitaciones del crecimiento se llevan a cabo dependen de la floración y de la

fecha de cosecha del cultivar. La competencia entre frutos puede ser más evidente en frutos

de cosecha temprana y puede estar presente a través de todo el desarrollo del fruto, a pesar

de que otros factores como condiciones medioambientales (agua y disponibilidad de

carbono, nutrición de la planta, etc) pueden reprimir el crecimiento del fruto con respecto a

su potencial genético (Pavel y DeJong, 1993).

La literatura muestra que el equilibrio fuente-sumidero, la fertilización mineral, la

disponibilidad de agua y la temperatura son factores agro-medioambientales que tienen

mayor impacto en la acidez de la fruta (Etienne et al., 2013). Las prácticas de manejo en los

huertos como el raleo de frutos, la poda, o la defoliación afectan el equilibrio fuente-

sumidero de la planta. Estas prácticas también afectan la acidez de la fruta. En Prunus

persica se ha observado que un incremento en la razón fuente-sumidero incrementa el

contenido de citrato en estadios tempranos del desarrollo, y disminuye en la madurez

(Souty et al., 1999; Wu et al., 2002; Léchaudel et al., 2005). El efecto contrario ha sido

reportado para malato, con una disminución en estadios tempranos, seguido por un

incremento hacia la madurez (Wu et al., 2002; Léchaudel et al., 2005).

Se ha hipotetizado que durante los estados tempranos, grandes cantidades de

azúcares importadas desde las hojas están disponibles para la producción de malato vía

glicólisis y su conversión a citrato vía ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Está descrito que

frutos que crecen con una alta disponibilidad de azúcares, debido a una alta razón fuente-

sumidero, son más grandes y consecuentemente poseen una tasa respiratoria más alta. En

estos estadíos, un incremento en la respiración dado por una alta disponibilidad de azúcares

puede estimular la glicólisis y la conversión de malato a citrato (Etienne et al., 2013). En

contraste, durante la maduración, las azúcares ya no están disponibles para la respiración

pues están almacenadas en la vacuola (Coombe, 1976), causando un cambio desde los

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azúcares hasta los ácidos orgánicos (en particular el citrato) como sustrato respiratorio.

Durante esta etapa, un incremento en la respiración (dado por la gran cantidad de frutos en

respuesta a una alta razón fuente-sumidero) puede estimular la conversión de citrato a

malato para mantener el pool de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos

constantes (Lobit et al., 2003, Wu et al., 2007).

Un trabajo previo de nuestro laboratorio utilizando la variedad de frutos de Prunus

persica, “Magique” (nectarin), en la etapa S3 de desarrollo mostró las primeras diferencias

en el tamaño de frutos bajo distintos tipos de raleo, y luego se incrementaron en la etapa de

postcosecha (S4), donde los frutos de árboles sin raleo tuvieron un menor diámetro respecto

de los árboles raleados. El análisis de metabolitos mediante HPAEC-PAD y HPLC

demostró que los frutos de árboles sin raleo mostraron diferencias con los frutos de árboles

raleados. Mediante análisis de componentes principales, los frutos de árboles sin raleo se

separaron de los raleados mediante el componente principal 1, con un 49,3% de

explicación. Las variables que contribuyeron a esta separación fueron glucosa, sacarosa,

trehalosa, inositol, malato, succinato y valina en la etapa final de S1; sacarosa, galactosa y

citrato durante la mitad de la S2; glucosa y fructosa al momento de la cosecha. En el

momento de la cosecha, los frutos de los árboles con raleo poseían un mayor contenido de

sólidos solubles y eran más grandes respecto a diámetro y peso (Covarrubias et al.,

manuscrito en preparación).

Con todos los datos recopilados, se podría concluir que el raleo desde estados

tempranos modifica el perfil de metabolitos asociados a calidad, por lo que es necesario

realizar un estudio más preciso durante todas las etapas del desarrollo de Prunus persica,

comparando frutos de árboles con y sin raleo.

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HIPÓTESIS

Alteraciones en el equilibrio fuente-sumidero modifican el perfil de metabolitos de frutos

de cosecha temprana de Prunus persica (L.) Batsch.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto de la modificación del equilibrio fuente-sumidero sobre el perfil

metabólico polar asociado a la calidad en frutos de Prunus persica (L.) Batsch var `Buen

Lindo´.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Realizar una fenotipificación de frutos de Prunus persica (L.) Batsch var `Buen

Lindo´ sometidos a dos tratamientos: con raleo y sin raleo.

2) Identificar y cuantificar azúcares, alcoholes de azúcares, aminoácidos y ácidos

orgánicos en frutos de Prunus persica (L.) Batsch var `Buen Lindo´, sometidos a

dos tratamientos (con raleo y sin raleo) durante distintos estados de desarrollo.

3) Evaluar el perfil de los metabolitos identificados, asociándolos a un estado de

desarrollo en particular y/o calidad.

21

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Material vegetal

El material vegetal corresponde a frutos de Prunus persica (L.) Batsch var `Buen

Lindo´ correspondiente a la temporada 2015-2016. Este fruto es un durazno, de pulpa

amarilla, de sabor dulce y cosecha temprana. El material se recolectó desde viveros El

Tambo Limitada, ubicado en la localidad de Malloa (en las coordenadas latitud -34,474581,

longitud -70,985219), en la VI Región del Libertador Bernardo O´Higgins. El portainjerto

corresponde a patrón Nemaguard y la densidad de plantación es de 4,5 x 2,2 m.

2. Diseño experimental

Se utilizaron dos árboles: uno con raleo manual con una razón de 19 hojas por fruto;

y un árbol sin raleo con una razón de 2 hojas por fruto. El raleo de frutos se realizó a los 38

días post- floración (38 DAFB). Los frutos fueron recolectados durante todo el desarrollo

desde ramillas distintas de un mismo árbol. Durante los primeros estados del desarrollo (S1,

S2 y S3), se tomaron 6 frutos desde 3 ramillas distintas en cada punto de muestreo. Estas

ramillas no volvieron a utilizarse para muestreos futuros. Para la cosecha, se recolectaron

todos los frutos del árbol. Se seleccionaron 18 frutos para el punto de madurez de cosecha y

adicionalmente 18 frutos para someterlos a 5 días a 21°C (madurez de consumo).

Para la fenotipificación, se ocuparon todos los frutos recolectados tanto para los estados

tempranos del desarrollo como para la post-cosecha. Para el análisis metabolómico se

realizaron pooles independientes. Para los estados tempranos del desarrollo, cada pool

estaba compuesto por 3 frutos de una misma ramilla, siendo que en total se analizaron 3

pooles de ramillas distintas para cada tratamiento de raleo. Para la post-cosecha, se tomaron

5 frutos individuales, en donde cada fruto era una muestra independiente. Los pooles

estaban compuestos por el mesocarpo y el exocarpo del fruto.

22

3. Fenotipificación de frutos de Prunus persica (L.) var `Buen Lindo´.

La fenotipificación de los frutos se realizó midiendo los siguientes parámetros:

- Calibre: se medió el diámetro ecuatorial en milímetros de cada fruto a través de un

medidor de calibre.

- Peso: a través de una balanza granataria se pesaron los frutos en gramos,

correspondientes a los distintos tratamientos y a los distintos estados de desarrollo.

Estos parámetros fueron medidos para todos los estados del desarrollo.

- Firmeza: fue medida a través de un penetrómetro (FT-327, EFFEGI, Italia)

expresada en libras-fuerza. Se utilizaron ambas mejillas del fruto.

- Acidez titulable: a partir de 5 mL de jugo de fruta extraído, se tituló con NaOH

0,1N hasta alcanzar un pH de 8,2. Se registró el volumen utilizado y se calculó el

porcentaje de ácido málico mediante la siguiente fórmula:

% acidez = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑢𝑡𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜 𝑥 0,1 𝑥 0,067 𝑥 100

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑗𝑢𝑔𝑜

- Sólidos solubles: se evaluó mediante la utilización de un refractómetro thermo

compensado digital (HANNA instruments inc. Woonsoket-RI-USA, Modelo HI

96811, serie 08255834). Los valores entregados corresponden a °Brix (sólidos

solubles totales)

Estos parámetros sólo fueron medidos para frutos en madurez de cosecha y

consumo.

- Porcentaje de jugo: a frutos con madurez de consumo se les midió el porcentaje de

jugo, mediante la técnica de absorción en papel descrita por Infante et al., 2008.

Este parámetro sólo fue medido para consumo.

Luego de la fenotipificación, los frutos utilizados fueron fraccionados, congelados en

nitrógeno líquido y almacenados a -80°C.

23

4. Tinción de lignina

El momento en el cual ocurre el endurecimiento se determinó mediante la tinción

específica de lignina mediante fluoroglucinol, según el protocolo descrito por Dean (1997).

Se tomaron frutos provenientes del árbol con raleo comercial y del árbol sin raleo, se les

realizó un corte transversal y al carozo se le añadió una solución de fluoroglucinol 5% en

etanol 85%. Luego se eliminó el exceso y se colocó HCl fumante hasta evidenciar un

cambio de color a rojizo, finalmente se lavó con etanol 90%.

5. Elección de los puntos de muestreo para los análisis metabolómicos

A partir de los datos entregados por la fenotipificación, se procedió a elegir los

puntos del desarrollo que mostraron diferencias significativas entre los árboles con raleo y

sin raleo. Para ello se graficó en el programa GraphPad PRISM® versión 5.0a, y luego se

realizó análisis de los datos con el programa estadístico Infostat, mediante análisis de la

varianza Tukey (p < 0.05). Los puntos de trabajo fueron los siguientes:

- 46 DAB para ambos árboles, este punto corresponde a la etapa 1 del desarrollo (S1).

- 58 DAB para raleo comercial y 64 DAB para sin raleo, correspondiente a la etapa 2

del desarrollo (S2).

- 86 DAB para raleo comercial y 93 DAB para sin raleo, correspondiente a la etapa 3

del desarrollo (S3).

- 101 DAB para raleo comercial y 110 para sin raleo, correspondiente a la cosecha de

los frutos.

- 101 DAB + 5 días a temperatura ambiente para raleo comercial y 110 DAB + 5 días

a temperatura ambiente para sin raleo, correspondiente a madurez de consumo.

6. Extracción de azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos

El protocolo de extracción de metabolitos polares se llevó a cabo según Hatoum et

al., 2014. Los frutos almacenados previamente se molieron con mortero y nitrógeno

líquido. Se liofilizaron y de este polvo se pesaron 20 mg para la extracción. A los 20 mg se

24

les adicionó 500 µL de metanol frío y 20 µL de fenil β-D-glucopiranósido 2910 ng/µL el

cual corresponde al estándar interno. Luego se incubó a 70°C por 15 min con agitación. Se

centrifugó a máxima velocidad por 20 min. Del sobrenadante se tomaron 100 µL y se

colocaron en un tubo nuevo. Se secaron con nitrógeno gaseoso y se re-disolvieron en 120

µL de clorhidrato metoxiamina de una concentración de 20 mg/mL en piridina. Se incubó a

30°C por 90 min con agitación. Se agregaron 120 µL de N,O-

bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) y se incubaron a 37°C por 30 minutos con

agitación.

Finalmente, se inyectó 1 µL en GC-MS de cada muestra junto a un solvente

(metanol) y un control de calidad (QC). Los metabolitos detectados fueron los siguientes,

para ácidos orgánicos: oxálico, ascórbico, cítrico, quínico, succínico y málico; para

aminoácidos: arginina, alanina, leucina, valina, prolina, serina, treonina, ácido aspártico,

fenilalanina, asparagina; para azúcares y alcoholes de azúcares: glucosa, fructosa,

glucosa/manosa, sacarosa, sorbitol y mio-inositol.

7. Condiciones cromatográficas

Se utilizó un cromatógrafo de gases serie 7890B con detector selectivo de masa

serie 5977, marca Agilent Technologies, con las siguientes condiciones: el inyector estaba a

220°C, la interfase a 280°C, el flujo de helio a 1 mL/min, la fuente a 230°C, el cuadrupolo

a 150 °C, rango de scaneo 50-600 m/z y 2,66 ciclos scan/s.

Para ácidos y aminoácidos: se trabajó en modo splitless, 50°C por 1 minuto, 310°C a

10°C/min y se mantuvo por 13 minutos. Para azúcares y alcoholes de azúcares se trabajó en

modo split: 1:150, 120°C por 1 minuto, 300 °C a 10°C/min y se mantuvo por 6 minutos.

25

8. Análisis de datos metabolitos polares (GC-MS)

Al obtener los datos entregados por el cromatograma, se integraron con el algoritmo

de deconvolución. Los espectros de masa de los compuestos encontrados por la integración,

se buscaron en la librería NIST 2014 mediante el software Mass Hunter de Agilent

Technologies. La confirmación de los datos se realizó mediante comparación con

estándares externos. Se realizó la normalización de los datos utilizando el estándar interno,

el control de calidad (QC) y el peso inicial de la muestra.

8.1 PLS-DA

Una vez identificados los compuestos, se realizó un análisis discriminante de

regresión de mínimos parciales (PLS-DA) para comparar los compuestos identificados en

los distintos tratamientos y estados de desarrollo. El software que se utilizó para la

estadística fue el Unscrambler® X. Luego de esto, se graficaron los datos de cada

metabolito individualmente con el programa GraphPad PRISM® versión 5.0a, obteniendo

cantidades relativas. El análisis estadístico se realizó mediante Infostat, utilizando análisis

de la varianza Tukey (p < 0.05).

8.2 Variables importantes en la proyección (VIP)

Para ordenar los metabolitos identificados y su importancia , se calculó el VIP (variables

importantes en proyección), el cual ordena los metabolitos según su valor de correlación.

Este cálculo se realizó manualmente y a través del software Unscrambler X®.

8.2.1 Cálculo del VIP manual

Este valor se calculó mediante la siguiente fórmula:

√𝑥2 + 𝑦2

en donde “x” representa el factor 1 e “y” representa el factor 2.

26

8.2.2 VIP a través de Unscrambler X®

Este método analiza los VIP mediante observación, es decir, los metabolitos se

agrupan en clusters según su importancia, y los discrimina por factor, a diferencia del

método anterior.

8.3 Heat map

Utilizando los datos obtenidos se realizó un heat map en un ambiente de R 3.3.2 en

adición al paquete ggplot2 disponible en (www.ggplot2.org). Los datos fueron agrupados

utilizando la función hclustfun con parámetros por defecto y reorganizados considerando

las medias de cada fila.

9. Cuantificación de carotenoides totales

La cuantificación de carotenoides totales se llevó a cabo basado en el método de

Wellburn (1994). Se colocaron 0,5 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) en un tubo Eppendorf

de 1,5 mL previamente cubierto con papel aluminio para proteger el pigmento de la luz. Se

agregaron 80 mg de polvo congelado en nitrógeno líquido de fruta, se homogenizó en

vórtex y se agregó nuevamente 0,5 mL de DMSO para dejarlo en incubación a 65°C por 2

h. Luego los tubos se dejaron durante 20 min a temperatura ambiente. Finalizado este

tiempo, el contenido del tubo se pasó por filtro miracloth, para luego depositarlo en placas

de 96 pocillos y medir en Espectrofotómetro para Microplacas Epoch a las absorbancias

descritas por Wellburn (1994) en sus fórmulas para equipos con sensibilidad entre 0,1-0,5

nm.

Las fórmulas utilizadas fueron las siguientes:

Ca= 12,47A665,1 – 3,62A649,1

Cb= 25,06A649,1 – 6,5A665,1

Cx= (100A480 – 1,29Ca – 53,78Cb)/220

http://www.ggplot2.org/

27

A: Absorbancia a la longitud de onda indicada en el subíndice

Ca: Clorofila a

Cb: Clorofila b

Cx: Carotenoides totales, expresados en (μg/mL)

Estos datos se normalizaron por peso fresco de la muestra y se graficaron en

GraphPad PRISM® versión 5.0a. El análisis estadístico se realizó mediante Infostat,

utilizando análisis de la varianza Tukey (p < 0.05).

28

RESULTADOS

1. Desarrollo de los frutos de `Buen Lindo´

El desarrollo de los frutos de `Buen Lindo´ fue monitoreado a través de tinción de

lignina para definir el comienzo de la segunda etapa del desarrollo, la cual corresponde al

endurecimiento del carozo (Figura 4A y 4B). Otra forma de evidenciar el desarrollo de los

frutos fue a través de la medición de peso y diámetro (Figura 4C y 4D, respectivamente).

En la Figura 4A y 4B, se observa el desarrollo de los frutos del árbol con raleo comercial y

sin raleo respectivamente, en donde se observa que la coloración roja correspondiente a la

tinción de lignina comienza alrededor de los 58 DAB para ambos tratamientos. En la Figura

4C se observa el desarrollo de los frutos a través de todo su crecimiento, en donde los frutos

de árboles con raleo comercial muestran mayor peso con respecto a los frutos de árboles sin

raleo, llegando a obtener un mayor peso en la época de cosecha inclusive. En la Figura 4D

se observa el tamaño del fruto a través de su desarrollo, evidenciando también que los

frutos de árboles con raleo comercial son más grandes durante todas las etapas del

desarrollo que aquellos frutos de árbol sin raleo. Cabe destacar que los frutos de árbol con

raleo comercial fueron cosechados antes que los frutos de árbol sin raleo (ambos alrededor

de 12 libras-fuerza). Los frutos del árbol con raleo comercial se cosecharon a los 101 días

post-floración, y los frutos del árbol sin raleo se cosecharon a los 110 días post-floración

(DAB).

29

Figura 4: Desarrollo de frutos de árboles de `Buen Lindo´. A: Tinción de lignina durante el desarrollo del

fruto del árbol con raleo comercial, B: Tinción de lignina durante el desarrollo del fruto del árbol sin raleo, C:

Desarrollo del fruto en relación a su peso en gramos, D: Desarrollo del fruto en relación a su diámetro en

milímetros. El raleo se realizó a los 38 días post-floración (DAB), indicado en ambas imágenes con una flecha

negra. Las etapas del desarrollo fueron definidas como S1: primera etapa de desarrollo exponencial; S2:

endurecimiento del carozo; S3: segunda etapa de desarrollo exponencial; Cosecha: etapa S4 o momento

donde ocurre la cosecha del fruto; Consumo: etapa a la que corresponde la madurez de consumo del fruto (5

días posterior a su cosecha). Las líneas naranjas representan a los frutos del árbol con raleo comercial, las

líneas verdes representan a los frutos del árbol sin raleo. Se trabajó con un n= 3-5. Los asteriscos (*)

representan diferencias significativas entre los tratamientos de raleo con test Tukey (p<0.05).

30

2. Fenotipificación de frutos de `Buen Lindo´

La Figura 5A muestra la cantidad de sólidos solubles a cosecha (madurez

fisiológica) y consumo, donde se observa que ambos tratamientos no muestran diferencias a

cosecha, pero si en la madurez de consumo, donde los frutos de árbol con raleo comercial

tienen mayor cantidad de sólidos solubles que aquellos frutos de árbol sin raleo.

La Figura 5B muestra la firmeza entre frutos con los distintos tratamientos a

cosecha y madurez de consumo. Se observa la diferencia entre ambos tratamientos a

cosecha, en donde los frutos del árbol sin raleo son menos firmes que los frutos de árbol

con raleo comercial, no así a madurez de consumo, en donde no existen diferencias

significativas.

En el caso del porcentaje de acidez entre ambos tratamientos (Figura 5C), se

observa que los frutos de árbol sin raleo contienen un porcentaje de acidez titulable

expresado como ácido málico menor que los frutos de árbol con raleo comercial a cosecha.

Sin embargo, esta diferencia no es significativa en madurez de consumo.

Al comparar los porcentajes de jugo (Figura 5D), no se observan diferencias

significativas entre los tratamientos

31

Figura 5: Fenotipificación de frutos de árboles de `Buen Lindo´ . A: Cantidad de sólidos solubles a cosecha y

madurez de consumo expresados como ºBrix, B: Firmeza de los frutos a cosecha y madurez de consumo

expresados como libras-fuerza, C: Porcentaje de acidez de los frutos a cosecha y madurez de consumo

expresados como porcentaje de ácido málico, D: Porcentaje de jugo a madurez de consumo expresados como

porcentaje de jugo. Las barras naranjas representan a los frutos del árbol con raleo comercial, y las barras

verdes representan los frutos del árbol sin raleo. Las letras distintas representan diferencias significativas entre

los tratamientos de raleo con test Tukey (p<0.05).

32

3. Cuantificación de clorofila a, b y carotenoides totales

Para determinar la coloración de los frutos durante todo el desarrollo, se determinó

la concentración de clorofila a y clorofila b (Figura 6A y B respectivamente), para luego

determinar los carotenoides totales en los frutos (Figura 6C). En relación a la clorofila a

(Figura 6A), se observa que durante el desarrollo existen diferencias significativas entre los

primeros estados del desarrollo (S1 y S2) con respecto a la tercera etapa del desarrollo y la

post-cosecha, evidenciando una disminución de la concentración de clorofila a, a medida

que avanza el desarrollo, ocurriendo la misma situación para ambos tratamientos. Con

respecto a la concentración entre los tratamientos, no existen diferencias significativas en

ningún estado de desarrollo. En la clorofila b (Figura 6B), la única diferencia significativa

que existe durante el estado del desarrollo ocurre en la segunda etapa del crecimiento (S2),

donde se observa que en ambos tratamientos existe una alza en la concentración de clorofila

b. Con respecto a la concentración de clorofila b entre los tratamientos de raleo, no existen

diferencias significativas entre tratamientos para ningún estado del desarrollo. En el caso de

la cuantificación de carotenoides totales (Figura 6C), no se observaron diferencias

significativas entre los tratamientos de raleo durante ningún estado del desarrollo, sin

embargo, al comparar los estados del desarrollo durante un mismo tratamiento de raleo, se

observa que la primera fase del desarrollo (S1) para ambos tratamientos, contiene mayor

cantidad de carotenoides que desde la tercera fase del desarrollo (S3) hasta la post-cosecha.

Para la segunda etapa del desarrollo (S2) no existen diferencias significativas.

33

Figura 6: Cuantificación de Clorofila a, Clorofila b y carotenoides totales. A: Cuantificación de “clorofila a”,

a través del desarrollo del fruto de `Buen Lindo´ expresada en μg por gramo de peso fresco (PF), B:

Cuantificación de “clorofila b”, a través del desarrollo del fruto de `Buen Lindo´ expresada en μg por gramo

de peso fresco (PF), C: Cuantificación de carotenoides totales a través del desarrollo del fruto de `Buen

Lindo´ expresados como μg por gramo de peso fresco (PF). Las barras naranjas representan a los frutos del

árbol con raleo comercial, y las barras verdes representan los frutos del árbol sin raleo. Las letras mayúsculas

distintas representan diferencias significativas entre los estados del desarrollo en un mismo tratamiento, y las

letras distintas minúsculas representan diferencias significativas entre los tratamientos de raleo con test Tukey

(p<0.05).

34

4. Composición metabólica de los frutos

4.1 Heat map de composición metabólica

Para la visualización general de los metabolitos identificados y el análisis de su

comportamiento durante todos los estados de desarrollo y en los distintos tratamientos se

realizó un heat map (Figura 7). Cada corchete representa los metabolitos que se relacionan

entre sí. En el caso de la glucosa y glucosa/manosa tienen un comportamiento similar

durante todo el desarrollo en ambos tratamientos de raleo, y estos azúcares además tienen

un comportamiento similar a fructosa, principalmente en el desarrollo de frutos en el

tratamiento sin raleo. Se observa también que el ácido málico y arginina tienden a

comportarse de igual forma durante todo el estado de desarrollo, observándose mayores

cantidades relativas de estos metabolitos hacia la post-cosecha en el tratamiento sin raleo.

Ácido cítrico y sacarosa también presentan un comportamiento similar, sin embargo, se

observa que existen mayores cantidades durante la post-cosecha en el tratamiento sin raleo.

35

Figura 7: Heatmap con las cantidades relativas de los metabolitos encontrados por GC-MS. RC: Raleo

comercial, SR: Sin raleo. S1: primera etapa del desarrollo, S2: segunda etapa del desarrollo, S3: tercera etapa

del desarrollo, Cosecha: cosecha de los frutos, Consumo: frutos sometidos 5 días a 21°C.

36

4.2 Análisis discriminante de regresión de mínimos parciales (PLS-DA)

A través del análisis PLS-DA se extrajeron dos factores (Figura 8), los cuales

explican el 45% de la variabilidad de los metabolitos, y 31% de la variabilidad de las

categorías de tratamiento y estado de desarrollo. Mientras más lejos se encuentren las

variables del origen del eje, mayor variabilidad existe entre las observaciones. Por ejemplo,

el aminoácido prolina no contribuye a la discriminación del tratamiento ni del estado de

desarrollo. Por otro lado, los metabolitos fructosa, glucosa y glucosa/manosa son los que

presentan una alta variabilidad y se correlacionan positivamente con el tratamiento sin raleo

y negativamente con el raleo comercial, debido a que se encuentran en lados opuestos. Los

estados de desarrollo S1, S2 y S3 presentan contenido significativamente bajo de los

aminoácidos serina, alanina y ácido aspártico, por el contrario, estos aminoácidos se

correlacionan positivamente con la etapa de consumo. El tratamiento sin raleo en

combinación con la etapa de consumo se correlacionan positivamente con ácido aspártico,

alanina, serina y treonina.

37

Figura 8: Bi-gráfico de proyecciones latentes con análisis discriminante (PLS-DA, Partial Least Square Regression- Discriminant Analysis). Las variables

categóricas se muestran en color rojo y representan los tratamientos de raleo (raleo comercial y sin raleo), y los estados de desarrollo (S1, S2, S3, Cosecha y

Consumo). Las variables predictoras se muestran en color azul y representan a metabolitos polares como azúcares, aminoácidos y ácidos orgánicos.

38

4.3 Variables importantes en la proyección (VIP)

Para poder identificar cual de todos los metabolitos identificados tiene más

importancia en cada tratamiento, se calculó el VIP (variables importantes en proyección),

el cual ordena los metabolitos según su correlación con el tratamiento (valor de VIP

cercano a 1 está más correlacionado). En amarillo se muestran los valores de VIP más

altos, los cuales ayudan a la discriminación de las variables más importantes en la

predicción de los tratamientos (VIP más alto mayor correlación). Estos metabolitos son

ácido succínico, glucosa/manosa, ácido málico, fructosa, glucosa, ácido ascórbico, ácido

cítrico y sacarosa. Otra forma de representar el VIP se muestra en la Figura 9, en donde se

observa los metabolitos ordenados por factor. Para el factor 1 (Figura 9A), los metabolitos

más importantes se muestran al lado izquierdo, los cuales son ácido málico, ácido

succínico, ácido ascórbico, sacarosa, mioinositol y ácido cítrico. Para el factor 2 (Figura

9B) los metabolitos más importantes están en ambos costados los cuales son fenilalanina,

glucosa/manosa, fructosa, sorbitol, ácido aspártico, ácido cítrico, valina, ácido succínico y

sacarosa.

39

Tabla 1: Variables importantes en la proyección (VIP)

Metabolito Factor-1 Factor-2 VIP

Ácido succínico -0,7841022 0,3804631 0,871532231

Glucosa/manosa -0,484767 -0,7171354 0,865610898

Ácido Málico -0,8459454 0,1693879 0,862737434

Fructosa -0,5854556 -0,6129984 0,847658716

Glucosa -0,5378073 -0,6499076 0,843573696

Ácido Ascórbico -0,7908604 0,2412087 0,826826348

Ácido Cítrico -0,7843405 0,2576932 0,825588157

Sacarosa -0,7899809 0,1447987 0,803141635

Mioinositol -0,732725 0,004579464 0,73273931

Ácido L-aspártico -0,4469828 0,4843448 0,659077771

Fenilalanina -0,2721435 -0,5954436 0,654687074

Ácido oxálico -0,6095425 0,06023116 0,612511104

Asparagina -0,5740687 -0,1858971 0,603417438

L-alanina -0,3524185 0,4552709 0,575734654

Serina -0,4456698 0,3474957 0,565132579

Sorbitol -0,2403564 -0,4553068 0,514854816

L-treonina -0,4767985 0,1549843 0,501355107

L-leucina -0,4764067 -0,07881965 0,482882885

L-valina -0,03506187 0,3623419 0,364034321

Ácido Quínico 0,06633172 0,1722393 0,184570511

L-prolina -0,03200621 -0,1258789 0,12988416

40

Figura 9: Importancia de cada metabolito en la predicción del tratamiento. A: Importancia de metabolitos en el factor 1, B: Importancia de metabolitos en el factor

2.

41

4.4 PLS- DA aplicando el VIP

Para tener una mejor modelo de predicción, se consideraron sólo los VIP más

altos (más cercanos a 1) tomando en consideración ambos criterios de discriminación y se

volvió a realizar un PLS-DA con estos datos (Figura 10). A través de este análisis se

extrajeron dos factores, los cuales explican el 82% de la variabilidad de los metabolitos, y

21% de la variabilidad de las categorías de tratamiento y estado de desarrollo. Los

metabolitos fructosa, glucosa y glucosa/manosa se correlacionan positivamente con el

tratamiento sin raleo y negativamente con el raleo comercial, debido a que se encuentran en

lados opuestos. El tratamiento sin raleo en combinación con la etapa de consumo se

correlacionan positivamente con ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido

cítrico, sacarosa y mioinositol.

4.5 Metabolitos correlacionados con los tratamientos de raleo

Teniendo en consideración el criterio del VIP para discriminar los metabolitos

correlacionados con los tratamiento de raleo, se graficaron estos metabolitos:

42

Figura 10: Bi-gráfico de proyecciones latentes con análisis discriminante (PLS-DA, Partial Least Square Regression- Discriminant Analysis). Las variables

categóricas se muestran en color rojo y representan los tratamientos de raleo (raleo comercial y sin raleo), y los estados de desarrollo (S1, S2, S3, Cosecha y

Consumo). Las variables predictoras se muestran en color azul y representan a metabolitos polares como azúcares, aminoácidos y ácidos orgánicos.

43

4.5.1 Azúcares

La cantidad de glucosa durante el desarrollo mostró diferencias significativas

durante la etapa S1 y la madurez de consumo, donde los frutos del árbol sin raleo tienen

mayor cantidad de glucosa que los frutos del árbol con raleo comercial (Figura 11A). No

existen diferencias significativas en los frutos del árbol sin raleo a lo largo del desarrollo,

sin embargo, para los frutos del árbol con raleo comercial, existen diferencias entre el

estado S2 con respecto a todos los otros estados del desarrollo. En relación a la cantidad de

fructosa (Figura 11B), se observaron diferencias significativas entre los frutos del árbol sin

raleo y los frutos del árbol con raleo comercial en la etapas S2 y la madurez de consumo, en

donde se observa que hay una mayor cantidad de fructosa en los frutos del árbol sin raleo.

No existen diferencias significativas entre los estados de desarrollo en un mismo

tratamiento. La cantidad relativa de glucosa/manosa (Figura 11C) fue similar durante todo

el desarrollo, sin embargo, existen diferencias significativas durante la madurez de

consumo, en donde los frutos del árbol sin raleo contienen mayor cantidad de

glucosa/manosa que los frutos del árbol sin raleo. No existen diferencias significativas entre

los estados del desarrollo en un mismo tratamiento. Se observa que la cantidad de sacarosa

(Figura 11D) aumenta a medida que avanza el desarrollo del fruto, en donde la cantidad

relativa de este metabolito es significativamente mayor durante la madurez de consumo en

los frutos del árbol sin raleo que en los frutos del árbol con raleo comercial. En los frutos en

estado de madurez de consumo del árbol con raleo comercial existen diferencias

significativas con respecto a los otros estados de desarrollo. Por otro lado, la cantidad

relativa de mioinositol (Figura 11E) también se mantiene constante durante las primeras

etapas del desarrollo, sin embargo, durante la cosecha y la madurez de consumo existen

diferencias significativas entre los tratamientos, observándose mayor cantidad de este

metabolito en los frutos del árbol sin raleo que en los frutos del árbol con raleo comercial.

44

Figura 11: Composición de azúcares en frutos de `Buen Lindo´ medida a través de cromatografía gaseosa

acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) expresados en cantidad relativa de metabolito durante todo el

estado de desarrollo A: glucosa, B: fructosa, C: glucosa/manosa, D: sacarosa, E: mioinositol. Las barras

naranjas representan a los frutos del árbol con raleo comercial, y las barras verdes representan a los frutos del

árbol sin raleo. n= 3-5 frutos. Las letras distintas mayúsculas distintas representan diferencias significativas

entre los estados del desarrollo en un mismo tratamiento, y las letras distintas minúsculas distintas representan

diferencias significativas entre los tratamientos de raleo con test Tukey (p<0.05).

45

4.5.2 Ácidos orgánicos

La cantidad relativa de ácidos orgánicos fue medida a través de GC-MS,

normalizado por el peso inicial de la muestra. En el caso del ácido málico (Figura 12A), la

cantidad relativa se mantiene constante entre los tratamientos durante los primeros estados

del desarrollo, sin embargo, durante la cosecha y la madurez de consumo existe una

diferencia significativa entre los tratamientos de raleo, en donde los frutos del árbol sin

raleo contiene mayor cantidad relativa de ácido málico que los frutos del árbol con raleo

comercial. La diferencia también es significativa a cosecha y a madurez de consumo para

los frutos del árbol sin raleo con respecto a los primeros estados del desarrollo. La cantidad

relativa de ácido cítrico va aumentando a medida que avanza el desarrollo (Figura 12B), en

donde la segunda etapa del desarrollo (S2) y la cosecha muestran diferencias significativas

entre los tratamientos de raleo, evidenciando una mayor cantidad relativa de ácido cítrico

en los frutos del árbol sin raleo que en los frutos del árbol con raleo comercial. La

diferencia es significativa entre los estados del desarrollo para ambos tratamientos, en

donde la etapa S1 y S2 contiene menor cantidad relativa de ácido cítrico en los frutos del

árbol con raleo comercial. Para los frutos del árbol sin raleo, esta diferencia es significativa

sólo a madurez de consumo. La cantidad relativa de ácido ascórbico (Figura 12C) se

mantiene constante durante el desarrollo, sin embargo, existen diferencias significativas

entre los tratamientos durante la cosecha y la madurez de consumo, donde los frutos del

árbol sin raleo contienen mayor cantidad relativa de ácido ascórbico que los frutos del árbol

con raleo comercial. No existen diferencias significativas durante el desarrollo para un

mismo tratamiento. En el caso del ácido succínico (Figura 12D), existen diferencias

significativas entre los tratamientos de raleo durante la cosecha y la madurez de consumo,

donde los frutos del árbol sin raleo contienen mayor cantidad relativa de este metabolito

que los frutos del árbol con raleo comercial. Además existe una tendencia al aumento a

medida que avanza el estado del desarrollo en los frutos del árbol sin raleo.

46

Figura 12: Composición de ácidos orgánicos en frutos de `Buen Lindo´ medida a través de cromatografía

gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) expresados en cantidad relativa de metabolito durante

todo el estado de desarrollo A: ácido málico, B: ácido cítrico, C: ácido ascórbico, D: ácido succínico. Las

barras naranjas representan a los frutos del árbol con raleo comercial, y las barras verdes representan a los

frutos del árbol sin raleo. n= 3-5 frutos. Las letras distintas mayúsculas representan diferencias significativas

entre los estados del desarrollo en un mismo tratamiento, y las letras distintas minúsculas representan

diferencias significativas entre los tratamientos de raleo con test Tukey (p<0.05).

47

DISCUSIÓN

El raleo de frutos en los árboles de durazno es una práctica agrícola que se realiza

con el propósito de obtener frutos con tamaño y calidad apropiados para el mercado

(Childers, 1983). En ese trabajo se utilizó la variedad temprana de durazno `Buen

Lindo´que fue sometida a un nivel de raleo.

La cinética de crecimiento de la variedad `Buen Lindo´ presentó una tendencia a ser

una curva doble sigmoide (Figura 1) como la reportada para otras variedades de durazno

(Chalmers y van den Ende, 1975; Tonutti et al., 1997; el-Sharkawt et al., 2007). Sin

embargo, los tiempos de desarrollo para variedades tempranas como `Buen Lindo´ son más

breves que aquellos de las variedades tardías, por lo que la curva no está bien definida.

El objetivo principal del raleo es obtener frutos con mayor tamaño y calidad. Esto

concuerda con los datos obtenidos para la variedad en estudio, ya que los frutos del árbol

con raleo comercial fueron más grandes durante todo el desarrollo en comparación a los

frutos del árbol sin raleo. Inclusive la fecha de cosecha se adelantó 9 días para los frutos del

árbol con raleo comercial. Este comportamiento se debe a que la eliminación de frutos

tempranamente promueve una menor competencia por los asimilados de los frutos restantes

en el árbol (Bussi et al., 2005).

Una de las características fundamentales para que el fruto sea apetecible para el

mercado es su dulzor y su acidez, además de cómo éstos se relacionan entre sí. En el caso

de la cosecha ambos tratamientos mostraron la misma cantidad de sólidos solubles. Sin

embargo, en la madurez de consumo los frutos del árbol sin raleo fueron los que obtuvieron

menor cantidad de sólidos solubles. Se ha descrito que una vez realizado el raleo, los

fotoasimilados son destinados a los frutos que permanecen en el árbol, los cuales al tener

menor competencia entre ellos, resulta en un incremento en el contenido de sólidos solubles

en los frutos (Caruso et al., 2001; Crisosto et al., 1997). Una serie de estudios asocian los

niveles de sólidos solubles (SS) con una mayor aceptación (Bassi y Selli, 1990; Karakurt et

al., 2000). El nivel de agrado por los duraznos depende ampliamente de la concentración de

sólidos solubles maduros (SSM), que son los sólidos solubles del durazno que está listo

48

para el consumo (Crisosto et al., 2005; Crisosto et al., 2006). La Unión Europea ha

establecido un mínimo de 8°Brix para el mercado del durazno a pesar de que muchos

autores sugieren la introducción de valores más altos de SS, dependiendo de los niveles de

acidez (Kader, 1994; Testoni, 1995). Dicho esto, los frutos del árbol con raleo comercial sí

tuvieron mayor contenido de SSM, por lo tanto, serían superiores en calidad que los frutos

del árbol sin raleo.

En el caso de la acidez, la diferencia entre los tratamientos sólo ocurrió durante la

cosecha, en donde los frutos del árbol con raleo comercial tuvieron mayor porcentaje de

acidez que los frutos del árbol sin raleo.

El durazno es uno de los frutos más populares alrededor del mundo durante el

verano, debido a su alto contenido en minerales y agua, además de la presencia de

carotenoides y moléculas antioxidantes, los cuales determinan el valor nutritivo junto a los

azúcares y ácidos orgánicos (Loizzo et al., 2015). En el caso de los carotenoides, los cuales

también determinan el color del fruto, se mantuvieron sin diferencias significativas entre

los tratamientos de raleo, lo que sugiere que estos no están influenciados por la relación

fuente-sumidero.

El sabor es una combinación de atributos como el gusto, aroma y la sensación en la

boca, los cuales definen un perfil sensorial que afectan el juicio del consumidor con

respecto a la calidad del fruto. En el durazno en particular, el sabor depende principalmente

de los compuestos solubles en agua, como los azúcares y ácidos orgánicos, otorgando la

sensación de dulzor o acidez (Orazem et al., 2011).

Durante el desarrollo del fruto y su maduración existe una red de metabolitos que

actúan en conjunto y que van cambiando a medida que avanza el desarrollo. Por esta razón,

el análisis metabólico permitió identificar cuáles de ellos son los que predominan en cada

etapa de desarrollo. El azúcar glucosa/manosa, se expresó así ya que no fue posible

identificar a cuál de los dos azúcares correspondía. Estos dos azúcares son hexosas

epímeras que sólo se diferencian en un grupo hidroxilo en el carbono 2. Los azúcares

49

glucosa, glucosa/manosa y fructosa poseen un comportamiento similar durante todo el

desarrollo del fruto en ambos tratamientos. No obstante, son más abundantes hacia la post-

cosecha de frutos del árbol sin raleo.

Como ya se ha mencionado anteriormente, los azúcares representan un componente

fundamental de la calidad. Confieren el dulzor, uno de los principales atributos que

influyen en la satisfacción del consumidor. La intensidad del dulzor depende de la cantidad

global de azúcar, así como también el contenido relativo de cada azúcar individual. Dicho

esto, la fructosa, la glucosa y el sorbitol son los azúcares que predominan en el dulzor,

mucho más que la sacarosa (Kroger et al., 2006). Se ha descrito que duraznos de baja

calidad son aquellos que contienen menor fructosa y mayor sorbitol y glucosa en

comparación con los de alta calidad (Robertson y Meredith, 1988).

En el fruto investigado, altas concentraciones de hexosas han sido reportadas

durante las primeras etapas del desarrollo, cuando existe un alto requerimiento de energía

para la división celular (Moriguchi, 1990). Este es el caso de los azúcares glucosa,

glucos/manosa y fructosa; no así sacarosa.

La cantidad de azúcares es bastante baja durante los primeros estados de desarrollo,

aumentando su cantidad relativa hacia la etapa S3 para ambos tratamientos de raleo. El

aumento de sacarosa puede deberse a la translocación fotosintética desde las hojas donde

son cargadas en el floema ya sea mediante simplasto o apoplasto (Moing et al., 1997; Lo

Bianco et al., 1999; Nadwodnik y Lohaus, 2008). La baja cantidad de sacarosa durante las

etapas tempranas del desarrollo para ambos tratamientos puede deberse a que este azúcar se

esté hidrolizando a glucosa y fructosa, lo cual provee la energía necesaria para el

crecimiento del fruto y la formación del endocarpo (Lombardo et al., 2011).

La acumulación de sacarosa desde la etapa S3 del desarrollo se puede atribuir a una

síntesis de novo en el mesocarpo del fruto como resultado de la actividad de la enzima

sacarosa sintasa (Morandi et al., 2008). Sorbitol, junto a sacarosa y almidón, es el producto

final fotosintético primario y el fotoasimilado más importante que es translocado desde los

50

órganos fuente (hojas) en Prunus persica (Loescher, 1987; Layne y Flore, 1995; Zhou et

al., 2001). Este metabolito se mantiene constante durante todo el desarrollo en ambos

tratamientos. Una vez que el sorbitol es descargado a los órganos sumidero, éste es

convertido en fructosa y glucosa por la enzimas sorbitol deshidrogenasa (SDH) y sorbitol

oxigenasa (SOX) respectivamente (Morandi et al., 2008).

Los azúcares manosa y mioinositol también son de gran relevancia durante la post-

cosecha para ambos tratamientos. No obstante, la cantidad relativa es mayor para los frutos

del árbol sin raleo. Se ha descrito que manosa es un componente primario de la pared

celular asociada con el ablandamiento durante la maduración en donde sus niveles

aumentan a lo largo de este proceso y la pérdida de la firmeza (Carrari et al., 2006). Por

otro lado, mioinositol es un precursor importante en la biosíntesis de polisacáridos de pared

celular (Oms-Oliuet et al., 2011). Esto explicaría los niveles constantes de este metabolito

durante el desarrollo.

En el caso de los aminoácidos, durante la etapa S2 se ve un aumento de los

aminoácidos prolina y fenilalanina, principalmente en los frutos del árbol sin raleo. Estos

aminoácidos se utilizan como sustratos para vías de fenilpropanoides, flavonoides y lignina

(Dardick et al., 2010), lo que concuerda con la deposición de lignina durante la etapa S2.

Los aminoácidos, más que una correlación con la calidad del fruto, poseen relevancia por

ser sustratos para la síntesis de ácidos orgánicos y compuestos del metabolismo secundario

durante las etapas tempranas del desarrollo y en la post-cosecha (Lombardo et al., 2011).

En la post-cosecha, el fruto es transformado en un producto sabroso para el

consumo. Todas estas modificaciones afectan la calidad nutricional, sabor y aroma, en

donde la relación entre los azúcares y los ácidos orgánicos contribuyen al sabor final del

fruto (Borsani et al., 2009). Contrario a los estados tempranos del desarrollo, en donde

existen altas cantidades de aminoácidos - como valina, serina, alanina, fenilalanina y

prolina - éstos van disminuyendo hacia la post-cosecha del fruto, particularmente para los

frutos del árbol sin raleo. Estos aminoácidos participarían en el catabolismo de ácidos

orgánicos y como sustrato respiratorio (Lombardo et al., 2011).

51

Como se ha mencionado anteriormente, los ácidos orgánicos son importantes en el

sabor de los frutos y, como tales, contribuyen junto con los azúcares y aromas a la calidad

organoléptica de los duraznos (Sweeney et al., 1970). Los ácidos orgánicos predominantes

en la fruta madura del durazno son ácidos málico y cítrico, mientras que el ácido quínico se

acumula en cantidades más bajas (Moing et al., 1998). En el caso de los frutos del árbol sin

raleo ocurre de esta forma: existe una acumulación de ácido málico y ácido cítrico

principalmente en la madurez de consumo. El ácido málico se acumula principalmente

durante la primera fase de crecimiento rápido, la cual se produce al final de la fase de

división celular, mientras que el ácido cítrico se acumula durante la tercera fase del

desarrollo, antes del inicio de la maduración (Masia et al., 1992). En el caso de esta

investigación, la cantidad relativa de ácido cítrico aumenta durante la tercera fase del

desarrollo para ambos tratamientos. A pesar de ello, el ácido málico aumenta hacia la post-

cosecha del fruto.

La formación de acidez implica la síntesis de ácidos orgánicos, principalmente

malato, citrato y succinato que pueden almacenarse en la vacuola en grandes cantidades.

Como el citrato se produce a partir de dicarboxilatos, principalmente malato, el primer paso

en el desarrollo de la acidez es la síntesis de dicarboxilatos, como malato y oxaloacetato

(OAA). Éstos requieren la fijación de CO2 sobre un esqueleto de carbono derivado del

catabolismo de hexosas como la glucosa (Hardy, 1968; Young y Biale, 1968), que se

consigue mediante la carboxilación de fosfoenolpiruvato (PEP), catalizada por la

fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC). Esta reacción tiene lugar en el citosol, ya que la PEP

es un intermedio de la vía de la glicólisis y produce OAA, que puede reducirse a malato

mediante la malato deshidrogenasa (Givan, 1999) o suministrada al ciclo de ácidos

tricarboxílicos (TCA) si la reposición es necesaria (Leegood y Walker, 2003). Estos tres

ácidos orgánicos se ven aumentados durante la post-cosecha, principalmente en los frutos

del árbol sin raleo, lo que concuerda también con la cantidad elevada de hexosas en el

mismo tratamiento.

Se ha descrito en algunos frutos que el incremento en la tasa fuente-sumidero

incrementa la cantidad de citrato en los estados tempranos del desarrollo y disminuye hacia

52

la madurez (Souty et al., 1999; Wu et al., 2002; Léchaudel et al., 2005). El efecto contrario

ha sido reportado para malato, el cual decrece en los estados tempranos del desarrollo e

incrementa hacia la madurez (Wu et al., 2002 ; Léchaudel et al., 2005). Durante los estados

tempranos, grandes cantidades de azúcares importadas desde las hojas están disponibles

para la conversión de citrato vía ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Durante estos

estados también ocurre un aumento de la respiración en donde una alta disponibilidad de

azúcares puede estimular la glicólisis y la conversión de malato a citrato. Durante la

maduración, en contraste, los azúcares ya no están disponibles para la respiración ya que se

almacenan en la vacuola (Coombe, 1976), causando un cambio de azúcares a ácidos

orgánicos, especialmente citrato como sustrato respiratorio. Durante este estado, un

incremento en la respiración dado por la alta tasa fuente-sumidero puede estimular la

conversión de citrato a malato para mantener el pool de intermediarios del TCA constantes

(Lobit et al., 2003 ; Wu et al., 2007).

Por otro lado, el ácido ascórbico posee niveles similares durante las primeras etapas

del desarrollo, pero se ve aumentado durante la post-cosecha esencialmente en los frutos

del árbol sin raleo. Se ha descrito que el ascorbato es un antioxidante presente en

concentraciones milimolares en las hojas de las plantas y en los órganos de almacenamiento

como los frutos, lo que contribuye significativamente al estado redox celular (Noctor y

Foyer, 1998; Smirnoff, 2000; Smirnoff et al., 2001, Ishikawa et al., 2006). También se ha

informado que el ascorbato está implicado en una serie de otros procesos celulares tales

como la fotoprotección (Kiddle et al., 2003), el establecimiento de la morfología de toda la

planta, la arquitectura de las raíces y el desarrollo (Olmos et al., 2006; Horemans et al.,

2003).

53

CONCLUSIONES

El raleo promueve la obtención de frutos de mayor tamaño.

La fecha de cosecha se adelanta para los frutos provenientes del árbol con

raleo comercial.

Los metabolitos que separan los tratamientos de raleo fueron glucosa,

glucosa/manosa, sacarosa, mioinositol, fructosa, ácido málico, cítrico,

ascórbico y succínico.

Los metabolitos ácido succínico, málico, cítrico, ascórbico, sacarosa y

mioinositol además se acumulan principalmente en la etapa de madurez de

consumo.

54

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