UNIDAD 5

SESION 1

VALIDACIÓN DE METODOS ANALITICOS:

DEFINICIÓN: “La validación de un método analítico es el proceso por el cual se establece, mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño del método cumplen con los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas.”

Objetivo: Asegurar que el método analítico evalúa correctamente la identidad, potencia y/o calidad de un fármaco a granel, un excipiente o un producto farmacéutico terminado.

Fundamentos legales:

Avalada y estandarizada por organismos internacionales como: como federaciones farmacéuticas y de salud de Europa, Japón y Estados Unidos (International Conference of Harmonitation, 1990, 1997)

Proceso de validación:

1. Contar con estándares y métodos de calibración certificados.2. Calificación de los instrumentos analíticos. (instalación y operación)3. Contar con un método analítico normalizado.4. Contar con personal entrenado para su operación.5. Validar el método.6. Emitir un reporte de validación.

1. Los estándares, permiten toma un punto de referencia, una concentración o pureza real. Los reactivos deben tener una calidad homogénea y deben estar certificados por su proveedor y por la empresa que los use.

2. Los equipos requieren de: descripción de la marca y modelo, sus modificaciones, un manual de operación en español, sistemas de calibración y mantenimiento, bitácoras de calibración y uso, instalaciones adecuadas para su operación (conexiones eléctricas, espacio, soporte,

ambiente). El equipo debe estar calificado, es decir, debe haberse evaluado la linealidad de su respuesta, el límite de cuantificación, el limite de detección y la relación entre señal y ruido.

3. El método es un documento escrito que debe incluir: el propósito y el alcance, las responsabilidades y competencias del equipo de trabajo, la serie de pasos a seguir, el tamaño de la muestra, su manipulación, el manejo de los reactivos, la disposición de los desechos, las herramientas matemáticas para convertir los resultados en valores numéricos, los criterios de aceptación.

Los ensayos analíticos tienen 4 clases:

Clase A: Para establecer identidad.

Clase B: Para detectar y cuantificar impurezas.

Clase C: Para determinar cuantitativamente la concentración.

Clase D: Para evaluar las características de un producto, disolución y uniformidad de contenido.

Parámetros requeridos para la Validación OMS

CLASE DE ENSAYOCARACTERISTICA A B C DExactitud X X XPrecisión X X XRobustez X X X XLinealidad X X XEspecificidad X X X XLímite de detección XLímite de cuantificación

X

CUANDO SE APLICA LA VALIDACIÓN:

A. Cuando el método analítico es nuevo.B. Los métodos Farmacopéicos no requieren validación.C. Cuando al método Farmacopéico se le hacen modificaciones menores

como:a. Cambio de equipo analítico.b. Cambio en la formulación del medicamento.c. Cambio de proveedores de reactivos críticos.

Características de la validación:

1. ESPECIFICIDAD Y SELECTIVIDAD:

ICH Q2A y USP 31 (United States Pharmacopeia):“La capacidad de evaluar en forma inequívoca al analito en presencia de los

componentes cuya presencia cabría esperar, tales como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. La falta de especificidad de un procedimiento analítico individual puede compensarse mediante otros procedimientos analíticos de apoyo”.

En un procedimiento analítico para impurezas, la especificidad se puede establecer:

Se agregan cantidades conocidas (del fármaco o producto farmacéutico) con niveles adecuados de impurezas y/o excipientesComparación con muestras sin agregado de cantidades conocidasEl resultado de la valoración no se ve afectado por la presencia de estos materiales: “un resultado exacto que permite la declaración exacta del contenido o la potencia del analito en una muestra”

(Método compendial 1225 USP 31)

Si no se dispone de impurezas o de los productos de degradación puede demostrarse la especificidad:Comparando los resultados de las pruebas de muestras que contengan impurezas o productos de degradación con los de un segundo procedimiento bien caracterizado.

(Método compendial 1225 USP 31)

Degradaciones forzadas relevantes

calorluzhumedad (85%)Hidrólisis ácida y alcalinaOxidación

En algunos casos, pueden ser válidas otras condicionesEl tiempo de exposición, la temperatura y la concentración pueden ajustarse para obtener una degradación adecuada de la muestra.Método compendial 1225 USP 31

LINEALIDAD

La linealidad de un método analítico es su capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras en un intervalo dado.USP 31

Debe utilizarse un mínimo de 5 puntos de datos para una evaluación adecuada

Inspección visual del gráfico y método estadístico (línea de regresión, mínimos cuadrados)

Los criterios de aceptación deben equilibrar el rigor científico con las limitaciones prácticas

Linealidad: Valor r2 mínimo: ≥0,99 hasta ≥0,9999Intersección-y: estadísticamente no significativa, dentro del n % de la

respuesta de la solución estándarApto para la valoración mediante un estándar de un solo puntoIntervalo: necesario para resultados exactos y precisos

Estadística de la regresión:

Todo análisis estadístico considera los posibles errores al analizar los datos. En la tabla 1 se muestran los tipos de errores.

TABLA 1: Tipos de erroresFACTOR 1

FACTOR 2

VERDADERO FALSO

VERDADEROVV VF

FALSO VF FF

VF = Probabilidad de considerar un valor verdadero como falso ().

FV = Probabilidad de considerar un valor falso como verdadero ().

Hipótesis de la regresión:

y=b0+b1×x

Hipótesis de la pendiente (b1): H0 : μb1=1 .0

Ha : μb1≠1 . 0

Hipótesis del intercepto (b0): H0 : μb0=0

Ha : μb0≠0

Hipótesis de la correlación ( r ): H0 : μr=0 .9

Ha : μr≠0 .9

Cálculos previos:

SPxx=∑ xi2−

(∑ x i )2

n

SPyy=∑ y i2−

(∑ y i )2

n

SPxy=∑ xy−(∑ x ) (∑ y )

n

Pendiente: b=SPxySPxx

Intercepto: a= y−b x

Coeficiente de correlación: r= SPxy

√ (SPxx ) (Spyy )

Coeficiente de determinación: r2=(r )2

LINEALIDAD DEL MÉTODO

Evalúa la capacidad del método analítico para dar respuestas coherentes a diferentes concentraciones de una sustancia a analizar en un medicamento.

Procedimiento:

1. Preparar un placebo (todos los componentes de la formulación a excepción del principio activo).

2. Tomar 5 muestras del placebo. Marcarlas A, B, C, D y E. Adicionar y disolver 80 %, 90 %, 100 %, 110 % y 120 % del fármaco puro en cada muestra respectivamente.

3. A cada muestra realizar el método analítico completo.4. Calcular la concentración real de cada muestra.5. Graficar los mg adicionados VS los mg recuperados (calculados).6. El método se considera lineal si el coeficiente de correlación “r” es cercano

a 1.0 y el intercepto de la ordenada al origen “a” es cercano a 0. O se puede aplicar los criterios de la tabla 2.

TABLA 2: Criterios de linealidadSISTEMA MÉTODO

a = 0 a = 0

b = ( ) b = 1

r 9.0 r 0.85

Puntos (n) 5 n 5

Repeticiones 3 Repeticiones 5

DETERMINACION DE LA SIGNIFICANCIA DE LA REGRESION:

Hipótesis:

H0: = 0 (la regresión no es significativa, es decir no hay relación lineal entre “x” y “y”) (“x” no explica la variabilidad de “y”)

Ha: ≠ 0 (“x” explica la variabilidad de “y”

TABLA DE ANALISIS DE VARIANZA (ANADEVA)

FUENTE DE VARIACION

SUMA DE CUADRADOS

GRADOS DE LIBERTAD

CUADRADO MEDIO

F

Regresión (SPXY )2

SPXX

1 SCREGglREG

CM REG

CM ERR

Error SCTOT - SCREG n - 2 SCERRglERR

Total SPyy n - 1

CONCLUSION:

Rechazo H0: La regresión es significativa.

No rechazo H0: no hay evidencia de que la regresión sea significativa.

EJEMPLO 1:

Se realizó la determinación de la respuesta de linealidad para el equipo A de donde se obtuvieron las siguientes respuestas. Determinar si el método es lineal y la regresión es significativa.

X Y X2 Y2 XY1 4.3 1 18.49 4.32 5.7 4 32.49 11.43 7.2 9 51.84 21.64 4.8 16 23.04 19.25 7.0 25 49.00 35.06 8.8 36 77.44 52.87 8.0 49 64.00 56.08 8.8 64 77.44 70.49 10.8 81 116.64 97.210 7.6 100 57.76 76.0

55.00 73.00 385 568.14 443.90x= 5.5 y= 7.3

SPxx=385−552

10=82.5

SP yy=568.14−732

10=35.24

SPxy=443.9−(55 ) (73 )

10=42.4

b=SP xySP xx

=42.482.5

=0.5139

a= y−b x=7.3−(0.5139 ) (5.5 )=4.47

r=SP xy

√ (SPxx ) (SP yy )= 42.4

√ (82.5 ) (35.24 )=0.7863

r2=0.78632=0.6183

0.6183 significa que el 61.83 % de la variación de “y” es explicada por “x”.

ANDEVA

F. V. S. C. g. l. C. M. FRegresión 21.791 1 21.791 12.96Error 13.449 8 1.681Total 35.24 9

Buscar en tablas de F para p 0.05, 1/8 (columna horizontal 1, columna vertical 8)

F = 5.32

El valor de 12.96 cae en la parte de rechazo de H0, es decir se acepta Ha, la regresión es significativa.

Ejercicio 2

Se determinó la intensidad de fluorescencia de riboflavina y se obtuvieron los siguientes resultados. Determinar si el método es lineal y si la regresión es significativa.

Riboflavina (mcg/mL)

Fluorescencia (unidades arbitrarias)

0.0 0.000.10 5.800.20 12.200.40 22.300.80 43.30

CONCENTRACION X

LECTURA y X2 y2 xy

0.00 0.00 0.00 0.00 0.000.10 5.80 0.01 33.64 0.580.20 12.20 0.04 148.84 2.440.40 22.30 0.16 497.29 8.920.80 43.30 0.64 1874.89 34.64

∑ 1.50 83.60 0.85 2,554.66 46.58PROMEDIO 0.3 16.72

SPxx=∑xi2 - (∑xi)2 /n

SPyy=∑yi2 - (∑yi)2 /n

SPxy=∑xy - [(∑x)(∑(y)]

/n

b=SPxy/SPxx a=¯y-b¯x

r=SPxy/ RAIZ(SPxx)

(SPyy)r2

0.40 1156.87 21.50 53.75 0.60 1.00 1.00

Tabla de Analisis de Varianza

Fuente de variacion SC gl CM F Fα1/3

Regresion 1155.63 1.00 1155.63 2789.12 10.13Error 1.24 3.00 0.41Total 1156.87 4.00

ROBUSTEZ

La USP 31 la define como “una medida de la capacidad del método analítico, y demuestra que no resulta afectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y proporciona una indicación de su confiabilidad durante su uso normal”.

En la práctica de manera sencilla consiste en repetir por duplicado el análisis de la muestra, por dos analistas diferentes, en dos días diferentes.

2 repeticiones X 2 analistas X 2 días = 8 análisis

Estos se agrupan en una tabla de contingencia de la siguiente manera:

ANALISTA (A)

DÍA (D)

1 2 yj

1 y111

y112

y211

y212

yj1

2 y121

y122

y221

y222

yj2

yi yi1 yi2 y

Posteriormente realizar un análisis de varianza, para lo cual se calculan las sumas de cuadrados:a= analistad= díar= repetición

SCANALISTA:

∑i=1

a

( y i⋅¿)2

dr−

( y¿⋅¿ )2

adr=

( y i⋅1)2+( y i⋅2)2

2×2−

( y¿⋅¿)2

2×2×2

SCDÍA: ∑i=1

d

¿¿¿¿¿

SCANALISTAXDÍA:

∑i=1

a

∑i=1

d

¿¿¿¿¿

SCERROR: SCTOT – SCA – SCD - SCAXD

SCTOTAL: ∑i=1

a

∑i=1

d

∑i=1

r

( y ijr )2−( y¿⋅¿ )2

adr

Cálculo de los grados de libertad:

Para Analista: a-1 ó i-1

Para Día: d-1 ó j-1Para AXD: (a-1)(d-1) ó (i-1)(j-1)Para error: ad(r-1) ó ad(k-1)Para total: adr-1 ó ijk-1

Realizar un análisis de varianza:

TABLA DE ANADEVA

F.V. S.C. gl C. M. F calculada F tablasANALISTA A (a-1) SCA/glA CMA/CMERROR

DÍA D (d-1) SCD/glD CMD/CMERROR

ANALISITA X DÍA

AXD (a-1)(d-1)

SCAD/glad CMAD/CMERROR

ERROR E ad(r-1) SCERROR/glERROR

TOTAL TOTAL adr-1

F.V. = Factor de variaciónS.C. = Suma de cuadrados (varianza)C.M. = Cuadrado medioF = Cuadrado medio esperado (valor para una distribución F)

HIPÓTESIS

ANALISTAS: H0: a1 = a2

Ha: a1 ≠ a2

DIAS: H0: d1 = d2

Ha: d1 ≠ d2

ANALISTA POR DIA: H0: d1 = d2

Ha: d1 ≠ d2

INTERPRETACION:

Encontrar el valor de a en las tablas correspondientes considerando los grados de libertad de analista/gl error, gl dia/gl error; gl analistaXdía/gl error.

Aceptar y rechazar las hipótesis.

Concluir.

EXACTITUD Y PRECISION

Exactitud: Capacidad de un método analítico para dar la misma respuesta del mismo medicamento con la misma cantidad de fármaco y estas respuestas son comparables a las de un estándar o referencia.

Precisión: Capacidad de un método analítico para dar la misma respuesta del mismo medicamento con la misma cantidad de fármaco.

Procedimiento:

1. Realizar de 3 a 5 análisis de placebo cargado.2. aplicar una prueb de t de student.

a. Hipótesis: H0 : μ=100 %H0 : μ≠100 %

b. Establecer el nivel de riesgo: = 0 0.05c. Calcular los grados de libertad : datos - parámetrosd. Calcular el estadístico:

t= y−μ

√ s2

n

EJEMPLO:Agregado (mg) Recuperado (mg) % Recuperado

10 9.8 (9.8/10)X100 = 98.0012 11.6 (11.6/12)X100 = 96.6714 13.4 (13.4/14)X100 = 95.7118 18.2 (18.2/18)X100 = 101.1120 20.1 (20.1/20)X100 = 100.50

y= 98.40Sy = 2.10

Grados de libertad (gl):gl = 5 datos – 1 parámetro (%recuperación) = 5 – 1 = 4

Cálculos:

t= y−μ

√ s2

n =

98 . 40−100

√ (2 .10 )2

5

= −1.6√0 .882

= −1 .60 . 939

t = -1.70

Se busca el valor de t en tablas para un valor de = 0.05 y 4 grados de libertad:t(0.005,4) = 2.776

Se compara con la gráfica de distribución de t para un intervalo entre –2.776 y +2.776

Conclusión: No se rechaza la hipótesis nula H0

El método es exacto

PRECISIÓN Y EXACTITUD:El método debe ser:

Repetible.Reproducible