Título de la conferencia - Cámara Nacional de...

Uso de la metagenómica para la caracterización de la microbiota del camarón Litopenaeus vannamei y para el diagnóstico

certero de las infecciones bacterianas.

Juan QUIMI, Jordana LÓPEZ, Jefferson INTRIAGO, Steve ACEDO, Yuliana SAAVEDRA, Luis CRUZ, Virna CEDEÑO, Eric MIALHE .

Concepto azul, Guayaquil, Ecuador.

Incabiotec, Tumbes, Perú.

Universidad Nacional de Tumbes: Maestría en biotecnología molecular CIENCIACTIVA

Fragata, Tumbes, Perú

Acuacultura en Perú

Producción Nacional 2015:La producción del langostino representa el 25%.Región de Tumbes: 18 mil toneladas de langostinosRegión de Piura: 4 mil toneladas de langostinos

Exportaciones 2015: (ADEX)Total de exportaciones $ 145.2 millones (EEUU)

Presentaciones de exportaciones 2015: (ADEX)Cola de langostino congelados 77.6%Langostino enteros 23.2%

Sistema intensivo (45 a 200 langostinos por m2)Sistema semi intensivo (12 a 35 langostinos por m2)

Problemas bacterianos

Las bacterias Gram negativas en

particular los género Vibrio sp,Pseudomonas sp y Photobacterium spcausando lesiones, erosiones o

manchas en el exoesqueletos oapéndices.

Microbiota del camaron

Hemolinfa

Técnica de diagnostico molecular dependiente de cultivo

Extracción de muestras biológicas

Siembra y purificación de colonias bacterianas

Extracción de ADN BacterianoPCR ADNr 16S y electroforesis en gel de agarosa Secuenciación y análisis bioinformático

Identificación molecular bacteriana (base de datos NCBI)

Identificación molecular de genes de toxinas AHPND-associated plasmid pVA1

Conclusiones:• Identificación del 1% de todos los

microorganismos de la microbiota.• Diagnostico no confiable.• Medios de cultivos favorecen el

desarrollo de ciertos microorganismos,cubriendo al verdadero patógeno.

Técnica de diagnostico molecular independiente de cultivo

Extracción de muestras biológicas

Extracción de ADN total Bacteriano

PCR ADNr 16S y electroforesis en gel de agarosa Secuenciación de próxima generación (NGS)

Análisis metagenómica de las secuencias bacterianas


microorganismos de la microbiota.• Diagnostico confiable.• Identificación de bacterias cultivabes,

bacterias difícil de cultivar y bacteriasno cultivable. (Metagenómica)

Técnica de diagnostico molecular mediante co-cultivo en medio liquido enriquecido

Muestras biológicas en medio liquido enriquecido

Extracción de ADN total Bacteriano

PCR ADNr 16S y electroforesis en gel de agarosa Secuenciación de próxima generación (NGS)

Análisis metagenómica de las secuencias bacterianas


microorganismos de la microbiota.• Diagnostico no confiable.• Medios de cultivos favorecen el

desarrollo de ciertos microorganismos,cubriendo al verdadero patógeno

Que es la metagenómica

Resultados: Identificación molecular de bacterias cultivables de camarones enfermos.

HEPATOPANCREAS

Pseudomonas putidaAcinetobacter johnsonii

Bacillus firmusVibrio parahamolyticus

HEMOLINFA

Vibrio harveyVibrio hispanicus

Vibrio nigripulchritudoVibrio sinaloensis

Pseudomonas hibiscicolaStaphylococcus epidermidis

Staphylococcus warneriStaphylococcus hominis

Staphylococcus haemolyticusAerococcus viridansAcinetobacter pittii

Chryseobacterium gambriniBacillus cereus

INTESTINO

Vibrio alginolyticusVibrio brasiliensisVibrio campbellii

Vibrio harveyVibrio hepatariusPhotobacterium

damselaeProvidencia rettgeriBacillus megaterium

Resultados: Identificación molecular de genes de toxinas relacionadas a AHPND.

Transferencia de genes

Concepto Azul e Incabiotec

Implementación de la técnica LAMP PCR en campo.

Concepto Azul e Incabiotec

Detección de AHPND en Perú y Ecuador (Pir AB toxinas)

Resultados: Identificación molecular de bacterias mediante análisis metagenómico

directo de hemolinfa de camarones enfermos.

Resultados: Identificación molecular de bacterias mediante análisis metagenómico

directo de hemolinfa.

32%

15%10%

6%

6%

5%3%3%2%

18%

GENEROS PREDOMINANTES EN HEMOLINFA DIRECTA DE LANGOSTINO

SANOSHalospirulina

Bradyrhizobium

Lactococcus

Maritimimonas

Burkholderia

Streptococcus

Neisseria

Hylemonella

Mycena

Otros Generos < 2%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Porcentaje de abundancia de generos en hemolinfa de camarones

Sanos Enfermos

Resultados: Identificación molecular de bacterias mediante

análisis metagenómico entre co-cultivo y directo de hemolinfa.

Comparación a nivelde especies entre

metagenómica directa (verde) y metagenómica de co-cultivo (rojo)de hemolinfa de langostino

Resultados: Identificación molecular de bacterias del hepatopáncreas

mediante análisis metagenómico entre camarones sanos y enfermos.

Comparación a nivelde géneros entre

metagenómica de sanos (verde) y metagenómica de enfermos (rojo)de hepatopáncreas de langostino

Resultados: Identificación molecular de bacterias del hepatopáncreas


18%

11%

9%

8%6%6%

4%4%

4%

4%2%

2%2%

1%1%

1%

1% 1%

1%

13%

Generos predominantes en hepatopancreas de camaron sanos lutimonas

roseobacterruegeriahalieaphaeobactertamlanapseudomonasmaribacterformosaflavobacteriummeridianimaribacterpseudoalteromonastenacibaculumhalioglobusoceaniovalibusplanctomycesvibriodesulfonatronumalgoriphagusOtros generos <1% (119)

9%

5%

5%

5%

4%

4%

3%

3%3%

3%3%3%3%

2%2%2%

2%2%

2%1%

1%

1% 1%1%

1%

1%

26%

Generos predominantes en hepatopancreas de camaron Enfermos

segetibacterconexibactersphingomonasmassiliakaistobacternocardioidesgemmatimonasmycobacteriummethylobacteriumacidisphaeraamnibacteriumburkholderiaphenylobacteriummodestobacteracidobacteriumflavobacteriumgaiellasolirubrobactermicrovirgaverrucomicrobiumphycisphaerablastococcusrhodovastumcorynebacteriuminquilinusthermobifidaOtros generos <1% (79)

020

406080

100

luti

mo

nas

rose

ob

acte

r

rue

geri

a

hal

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ph

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bac

ter

tam

lan

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pse

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om

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as

mar

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ter

form

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flavobacteriu…

meridianim

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pseudoaltero…

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mo

nas

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silia

kais

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acte

r

no

card

ioid

es

gemmatim

o…

mycobacteri…

methylobact…

Porcentaje de abundancia de generos en hepatopancreas de camarones

Sanos Enfermos

Resultados: Identificación molecular de bacterias del intestino


Comparación a nivelde especies entre

metagenómica de enfermo(verde) y metagenómica de sano (rojo)de intestino de langostino

Resultados: Identificación molecular de bacterias del intestino


66%

26%

4%1% 3%

Generos predominantes en intestino de camaron enfermos

vibrio

propionigenium

photobacterium

sphingomonas

Otros generos <1% (23)

25%

21%

19%

15%

10%

3%

2%2% 1% 1% 1%

0%

Generos predominantes en intestinos de camaron sano flavobacterium

candidatus bacilloplasma

vibrio

mangrovibacterium

photobacterium

thalassobius

meridianimaribacter

phaeobacter

tamlana

haliea

psychromonas

propionigenium

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Porcentaje de abundancia de generos en intestino de camarones

sano enfermo

Resultados: Identificación molecular de bacterias en cultivo larval con

probiotico CA (concepto azul).

NC NP ZP ZC

Alteromonas 42,769096 62,5909254 2,16730425 8,95074028

Vibrio 12,6284668 2,80680986 1,14183479 11,4397817

Nautella 9,02279162 7,40175387 30,1589841 6,07087024

Marinomonas 8,78814898 2,43609913 0,00727283 0,01226129

Flexibacter 8,47529213 4,56534945 0,0174548 0,00153266

Pseudoalteromonas 7,45068594 5,4749926 0,25745829 0,44447169

Neptuniibacter 1,40316298 3,50617592 0,31418639 2,83695552

Donghicola 0,58034946 1,52957119 12,4830907 19,1689912

Flavobacterium 0,98862765 1,13705394 0,14545666 0,23296447

Tropicibacter 0,4473853 0,83176275 5,3193501 2,38788585

Coccinimonas 0,08759992 0,10435975 1,18256266 0,1180149

Pseudoruegeria 0,49274954 0,23519883 1,16219872 0,42914508

Roseobacter 0,60381373 0,6884628 1,04437883 0,82303896

Lewinella 0 0,02336412 0,45673392 1,96946939

Skeletonema 0 0 0,34909599 1,90049965

Otros Generos 6,2618299 6,66812043 43,792637 43,2133771

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

NC NP ZP ZC

Generos predominantes en cultivo larval de camaron

Otros Generos

Skeletonema

Lewinella

Roseobacter

Pseudoruegeria

Coccinimonas

Tropicibacter

Flavobacterium

Donghicola

Neptuniibacter

Pseudoalteromonas

Flexibacter

Marinomonas

Nautella

Vibrio

Alteromonas

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Probioticos T29 Control T 31

Generos Predominantes en Larvas de Camaron

Otros Generos

Ruegeria

Phaeobacter

Thiovirga

Photobacterium

Roseobacter

Vibrio

Otras técnicas de diagnostico molecular: Proteomica a través de la Espectrometría de masas

Otras técnicas de diagnostico molecular: Espectrometría de masas MALDI TOF

Otras técnicas de diagnostico molecular: Espectrometría de masas MALDI TOF

MALDI TOF

Tabla de MALDI TOF/TOF . Microbiota del hemolinfa de camarones enfermos, según secuencias

de aminoácidos

sequence Description Accession

LKKANIAEFKR Bacillus alveayuensis WP_044895943.1

ANAEIAHGVR Bacillus megaterium WP_013060107.1

DAGMTR Citrobacter koseri ABV16087.1

AMVNLFR Corynebacterium genitalium WP_005289717.1

MAQDR Fusarium oxysporum EGU82499.1

ARNAAEAR Mycobacterium phage AKF14494.1

ADGESVSR Mycobacterium sp. WP_046301330.1

IPLPTISIPPR Photobacterium aphoticum GAL04160.1

FDALYINLR Pseudoalteromonas sp. WP_052140898.1

GTALHALAAAR Streptomyces baarnensis WP_030076096.1

AMLTSK Vibrio cholerae CSI79098.1

EREERGALLVR Vibrio cholerae KFE15748.1

ADGVRMR Vibrio cholerae WP_032480263.1

DAYKRNFDGSSQTNGMNAR Vibrio coralliilyticus WP_043010219.1

EDGKPDHCQYTKGEITEAR Vibrio harveyi WP_049535690.1

ANGGMLWK Vibrio harveyi WP_017817645.1

AGLQAMKAEMQR Vibrio navarrensis WP_039426966.1

KDCADPR Vibrio neptunius WP_045976469.1

VAMEYND Vibrio nigripulchritudo WP_038123309.1

ITDYDLKNIR Vibrio parahaemolyticus KED45415.1

SRSFDDQAR Vibrio parahaemolyticus WP_031838943.1

GANLVSTAQINNANR Vibrio phage 1 [VHS1022 protein] AEH21835.1

MLQRLQEARDAGR Vibrio phage 1 [PH108-56(+3)] AAL87214.1

GAFDNDKGTDDSGTVTGR Vibrio phage 1 [VHS1103 protein ] AEH21916.1

SSASAPSVTDRFANMLK Vibrio shilonii WP_051647211.1

GALRSKLDNWPIFSLYR Vibrio sp. GAL12096.1

AGDVIPQVVSVVLERRPESAR Vibrio sp. WP_040987623.1

ESQHIDGKSTSDQTSFLR Vibrio sp. WP_009843789.1

ATALEVFGFPR Vibrio variabilis GAL24966.1

DAFIRVVER Vibrio variabilis GAL25028.1

Otras técnicas de diagnostico molecularmediante el análisis de los antagonismos por “Mass Imaging”

Muchas Gracias

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