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Transferencia Electrónica Directa a Citocromo c Inmovilizado sobre Electrodos Modificados. Aplicación en Sensores Amperométricos Sara López Bernabeu
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Transferencia Electrónica Directa a Citocromo c Inmovilizado sobre Electrodos Modificados. Aplicación en Sensores Amperométricos
Sara López Bernabeu
Departamento de Química Física
Instituto Universitario de Materiales
Facultad de Ciencias
Transferencia Electrónica Directa a Citocromo c
Inmovilizado sobre Electrodos Modificados. Aplicación en
Sensores Amperométricos
Sara López Bernabeu
Tesis presentada para aspirar al grado de
DOCTOR con
MENCIÓN de DOCTOR INTERNACIONAL
Doctorado en Ciencia de Materiales
Dirigida por:
Emilia Morallón Núñez
Catedrática de Química Física
Universidad de Alicante
Francisco Montilla Jiménez
Profesor Titular de Química Física
Universidad de Alicante
Alicante, Septiembre 2017
Este trabajo ha sido financiado por la Generalitat Valenciana y la Universidad de
Alicante a través del proyecto PROMETEO 2013/038.
Emilia Morallón Núñez, Catedrática de Química Física y Francisco Montilla Jiménez,
Profesor Titular, ambos de la Universidad de Alicante
CERTIFICAN:
Que Dña. Sara López Bernabeu, Licenciada en Ciencias Químicas ha realizado en el
Instituto Universitario de Materiales de la Universidad de Alicante bajo nuestra
dirección el trabajo titulado: Transferencia Electrónica Directa a Citocromo c
Inmovilizado sobre Electrodos Modificados. Aplicación en Sensores
Amperométricos. Este trabajo constituye su Memoria para aspirar al grado de Doctor
por la Universidad de Alicante, en el programa de doctorado Ciencia de Materiales,
reuniendo a nuestro juicio, las condiciones necesarias para ser presentada y defendida
ante el tribunal correspondiente.
Y para que conste a efectos oportunos, en cumplimiento de la legislación vigente, se
firma el presente certificado en Alicante a 10 de julio de 2017
Emilia Morallón Núñez
Catedrática de Química Física
Universidad de Alicante
Francisco Montilla Jiménez
Profesor Titular de Química Física
Universidad de Alicante
AGRADECIMIENTOS
Éste ha sido un camino lleno de experiencias nuevas y enriquecedoras; de alegrías y
tristezas; que me ha enseñado mucho y con el que he crecido profesional y
personalmente. Quiero agradecer:
A mis directores, los profesores Dña. Emilia Morallón Núñez y D. Francisco Montilla
Jiménez, por aceptarme en su grupo de investigación y ofrecerme la oportunidad de
conseguir el máximo grado académico que puede otorgar la universidad, que es el título
de Doctora en Ciencia de Materiales. Por la confianza que he recibido durante todo este
tiempo, así como sus enseñanzas y consejos. Por darme la oportunidad de disfrutar de
una estancia de investigación en Finlandia con la que aprendí mucho en todos los
sentidos. Gracias por vuestra paciencia y apoyo en los momentos más difíciles.
A Francisco Huerta, para mí Paco Huerta, porque apareciste en un momento clave de la
Tesis; por enseñarme a manejar el IR in-situ, por tus consejos y advertencias…, porque
así da gusto trabajar.
Siempre lleva más tiempo que el esperado,
incluso si tienes en cuenta la Ley de Hofstadter.
Douglas Hofstadter
A Johan Bobacka for giving me the opportunity to be part of his research group in Åbo
Akademi, Finland, and for your warm welcome and good-bye. I am very grateful for
having this opportunity which has let me learn a lot and I’ll never forget. Kiitos!
A nuestro técnico Javier Medina, porque sin él el laboratorio no va hacia adelante.
A Toya, por ser tan efectiva y cercana.
A mis compañeros de grupo (GEPE), a los que están Mª José, Felipe, Alejandro, Fabián,
José Quintero, Javi Quilez, Asma, Atsushi, Andrés, Edwin, Camilo, Raúl, Maribel; y a
los que se fueron Sarai, Carolina, María, Ana Cristina, David Salinas, Alonso, Omar
Ornelas, Carlos Sanchís, Zakaria, Juan Manuel Sieben, Adilene, Maali, Samiha, Isabel
Piñeiro e Isa Fuentes.
A Halima, Halimita, porque como una compañera dijo “tú siempre serás la reina del
lab”.
A Ramiro por tener siempre unas palabras cercanas y cálidas.
A mis compañeros de “comidas en la UA” (Andrés, Valentín, Fran, Alejandro, Mª José,
Arantxa, Ana, Javi, Laura, Atsushi y Daniele) porque ha sido un placer vuestra
compañía durante las comidas en el club social 1; los debates; las risas y las
celebraciones que hemos pasado juntos. Nunca olvidaré esos buenos momentos.
A mis amigos de tertulia y cafés: Valentín, Fran, Alejandro y Ana.
A mis compañeros del grupo de Electroquímica de Superficies Valentín, Ana Boronat,
Carlos Busó, Fran Sarabia, Rubén Gisbert, Sara Chumillas, Miguel Ángel Montiel y de
Espectroelectroquímica, William. A éste último, gracias por tu cariño y ayuda en esta
última parte de escritura.
A Ángel Linares, porque aparte de la voluntad está el esfuerzo y la perseverancia.
A Alejandra, por facilitarme la tarea de leer desde casa.
A mis amigos y amigas que he ido conociendo durante mi etapa universitaria: Javi
Navarro, Jorge, Paco Cascales, Nacho Sanjuán, Jessica, Mayer, Beatriz Cantos,
Alejandra Terol, Fran Navarro, Pablo de Vera, Néstor Guijarro, Almudena e Isa
Fuentes.
A mis amigas finlandesas Sara Lund y Hannele Svanström por los buenos momentos
juntas durante el tiempo que estuve en Turku y por vuestro cariño y hospitalidad. A
Cristina Ocaña porque fue una suerte tenerte en el mismo laboratorio durante mi
estancia.
A mis amigas y amigos de Ibi, los de toda la vida.
A Cynthia y Alfonso, por los jueves de cerveza y de solucionar el mundo.
A Sara y Aurorita por vuestra simpatía y vuestras palabras de ánimo en los pasillos del
Departamento.
A mi Familia, lo mejor que tengo.
A mi Padre
A mis hermanos, Beatriz y Pepe, por compartir vuestra vida conmigo.
Hay una fuerza motriz más poderosa que el
vapor, la electricidad y la energía atómica:
la voluntad.
Albert Einstein
A Ti, Mamá, mi Guía y Ángel de mis Sueños.
Para Andrés mi Amor, mi compañero en el camino.
Resumen
La selección y el desarrollo de un material funcional es todo un reto para el
progreso de la sociedad actual. En los últimos 30 años, se han venido investigando
nuevos materiales funcionalizados con miras a adaptarlos en aplicaciones diagnósticas y
terapéuticas (nanotecnológicas).
Investigaciones recientes en el campo de la nanotecnología han sentado las bases
en el desarrollo de sensores electroquímicos y biosensores. La función principal de estos
dispositivos es transformar una información química en una señal analítica útil. Dentro
de los sensores electroquímicos el tipo de señal, ya sea una intensidad de corriente o un
potencial eléctrico, determinará el tipo de sensor.
En el caso de los biosensores, un elemento biológico constituye la parte receptora,
por lo que una proteína o enzima recibe la información química que debe ser
transudcida para generar una señal eléctrica mesurable.
A lo largo de los años se han desarrollado diferentes metodologías para producir
esta transducción electrónica distinguiéndose 3 generaciones de biosensores
amperométricos. Este trabajo se centra en el desarrollo de biosensores de tercera
generación, en los que la señal se transduce mediente la transferencia directa de
electrones entre el elemento biológico y la superficie del electrodo, sin necesidad de
mediadores redox.
La inmovilización de una proteína es un proceso crítico y crucial para el
desarrollo de un biosensor electroquímico. En el confinamiento de la proteína en una
región limitada en el espacio, restringe la libertad de movimiento del elemento
biológico y puede impedir su correcta función.
Resumen
La encapsulación de proteínas en este trabajo se desarrolló en matrices de sílice
mediante el método sol-gel, proceso que tiene lugar en condiciones suaves (presión y
temperatura ambiente). Éste es un procedimiento muy utilizado en inmovilización de
diferentes biomoléculas para el desarrollo de dispositivos biosensores.
La proteína redox elegida en esta tesis es el citocromo c (cyt c), hemoproteína
sencilla cuyas propiedades físicas y químicas resultan interesantes en el estudio de
electroquímica directa en diferentes electrodos.
La transferencia electrónica entre proteína y electrodo puede mejorarse
introduciendo materiales conductores en la matriz de sílice. El polímero conductor
poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT) se ha utilizado ampliamente en películas finas por
su carácter electrónico, interesantes propiedades ópticas y su fácil síntesis. En este
trabajo, se ha estudiado el mecanismo de transferencia electrónica entre el PEDOT y la
proteína cyt c, lo que nos lleva al desarrollo de nuevos materiales modificados
aplicables en el campo de los biosensores electroquímicos.
Summary
The development and selection of a functional material is a challenge for the
society’s progress. In the last 30 years new functionalized materials have been
developed in diagnostic and therapeutic applications (nanotechnology).
Recent research in nanotechnology field leads to the development of
electrochemical sensors and biosensors. The main function of these devices is to
transform chemical information into a useful analytical signal. Within the
electrochemical sensors, several factors as a type of signal, current or the potential
value, will determine the kind of sensor.
In the case of electrochemical biosensors, a biological element constitutes the
receptor part, so that a protein or an enzyme accepts the chemical information which is
produced to an electrical signal by the trasductor element.
Over the years, different methodologies have been developed in order to study the
direct electron transfer. Here it is possible to distinguish 3 generations of amperometric
biosensors. This thesis focuses on studying various devices based on the third
generation, so that, the direct electron transfer between the electrode surface and the
biological element is produced with no redox mediators.
Immobilization of a protein is a critical and a crucial process for the development
of an electrochemical biosensor. Since the protein is confined in a limited region, the
freedom of movement of the biological element is restricted in part, leading to the loss
of stability and biological function.
Protein encapsulation in silica matrices is carried out by sol-gel method which
takes place under mild conditions (pressure and ambient temperature). This is a widely
Summary
used procedure in the immobilization of different biomolecules for the development of
biosensor devices.
The model redox protein is cytochrome c (cyt c), a single hemeprotein whose
physical and chemical properties are interesting in direct electrochemistry field.
The electron transfer between a protein and the electrode surface can be improved
by introducing conductive materials into the silica matrix. The poly(3,4-
ethylenedioxythiophene) (PEDOT) has been widely used in thin films because of its
interesting electronic properties and ease of synthesis.
Understanding the electronic transfer mechanism between PEDOT and cyt c leads
to the development of new modified electrodes in the electrochemical biosensors field.
Símbolos y abreviaturas
Lista de símbolos y abreviaturas
ANI Aniline
ATP Adenosine triphosphate
Cyt c Cytochrome c
DET Direct Electron Transfer
DTGS Deuterated Triglicine Sulfate
EDOT 3,4-Ethylenedioxythiophene
ET Electron Transfer
FAD Flavin adenine dinucleotide
GC Glassy Carbon
Gly Glycine
GOx Glucose oxidase
Hb Hemoglobin
HOMO Highest Occupied Molecular Orbital
HRP Horseradish peroxidase
Hys Hystidine
ITO Indium Tin Oxide
ICP Intrinsically Conducting Polymer
LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital
Lys Lysine
Mb Myoglobin
MET Mediated Electron Transfer
Met Methionine
MPa Mercaptopropionic acid
Symbols and abbreviations
MTEOS Triethoxy(methyl)silane
NHE Normal Hydrogen Electrode
ORMOSIL Organic Modified Silica
PA Polyacetylene
PANI Polyaniline
PBS Phosphate Buffer Solution
PEDOT Poly(3,4-ethylenedioxythiophene)
PPy Polypyrrole
PSS Poly(4-styrene sulfonate)
PT Polythiophene
Py Pyrrole
QCM Quartz Crystal Microbalance
RHE Reversible Hydrogen Electrode
SAM Self-assembly monolayer
SWCNT Single-Walled Carbon Nanotubes
TEOS Tetraethyl orthosilicate
Thr Threonine
TMOS Tetramethyl orthosilicate
Índice general
Capítulo 0 ..................................................................................................................................... 3
0. Estructura de la Tesis Doctoral .............................................................................................. 3
Capítulo 1 ................................................................................................................................... 13
1. Introducción ........................................................................................................................... 13
1.1. Materiales avanzados para bioelectrónica .................................................................. 15
1.2. Sensores y Biosensores .............................................................................................. 19
1.3. Electroquímica Directa de Proteínas .......................................................................... 26
1.4. Inmovilización de Proteínas ....................................................................................... 31
1.5. Encapsulación de Proteínas: matrices sol-gel ............................................................ 36
1.6. Citocromo c: proteína redox modelo ......................................................................... 43
1.6.1. Grupo hemo .................................................................................................. 45
1.6.2. Propiedades optoelectrónicas del citocromo c. ............................................. 50
1.7. Polímeros conductores: aplicaciones a biosensores ................................................... 53
1.7.1. Síntesis de polímeros conductores ................................................................ 54
1.7.2. Poli(3,4-etilendioxitiofeno) .......................................................................... 60
1.8. Objetivos de la Tesis Doctoral ................................................................................... 65
1.9. Referencias bibliográficas .......................................................................................... 67
Capítulo 2 ................................................................................................................................... 89
2. Técnicas y Métodos Experimentales .................................................................................... 89
2.1. Técnicas Electroquímicas .......................................................................................... 91
2.1.1. Voltametría cíclica ........................................................................................ 91
2.1.2. Cronoamperometría ...................................................................................... 97
2.2. Técnicas Espectroscópicas ......................................................................................... 98
2.2.1. Espectroscopía Infrarroja .............................................................................. 98
2.2.1.1. Espectroscopía IR de reflexión-absorción in situ ............................... 100
2.2.2. Espectroscopía Ultravioleta-Visible ........................................................... 106
Table of contents
2.2.2.1. Espectroscopía Ultravioleta-Visible in situ ........................................ 113
2.2.3. Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos X (XPS) .................................... 115
2.3. Métodos Experimentales .......................................................................................... 117
2.3.1. Procedimiento de limpieza de células ......................................................... 117
2.3.2. Tratamiento de limpieza de electrodos ....................................................... 117
2.3.3. Pretratamiento de electrodos de ITO .......................................................... 118
2.3.4. Disoluciones, reactivos y electrodos ........................................................... 119
2.4. Referencias bibliográficas ........................................................................................ 123
Capítulo 3 ................................................................................................................................. 129
3. Direct electron transfer to cytochrome c induced by conducting polymer .................... 129
3.1. Introduction .............................................................................................................. 131
3.2. Experimental section ................................................................................................ 134
3.3. Results and discussion ............................................................................................. 136
3.3.1. Electrochemical synthesis of PEDOT-PSS ................................................. 136
3.3.2. Electrochemical characterization of the direct electron transfer between cyt c
and PEDOT-PSS ................................................................................................... 138
3.3.2.1. Effect of cyt c concentration. .............................................................. 139
3.3.2.2. Effect of PEDOT thickness. ............................................................... 140
3.3.3. In situ FTIR study on the direct electron transfer between cyt c and PEDOT
.............................................................................................................................. 144
3.4. Conclusions .............................................................................................................. 156
3.5. References ................................................................................................................ 157
Índice general
Capítulo 4 ................................................................................................................................. 173
4. Enhancement of the direct electron transfer to encapsulated cytochrome c by
electrochemical functionalization with a conducting polymer ............................................ 173
4.1. Introduction .............................................................................................................. 175
4.2. Experimental section ................................................................................................ 178
4.3. Results and discussion ............................................................................................. 181
4.4. Conclusions .............................................................................................................. 197
4.5. Appendix A. Supplementary data ............................................................................ 199
4.6. References ................................................................................................................ 202
Capítulo 5 ................................................................................................................................. 215
5. Hydrogen Peroxide biosensor based on Cytochrome c immobilized in a Silica-modified
electrode ................................................................................................................................... 215
5.1. Introduction .............................................................................................................. 217
5.2. Experimental section ................................................................................................ 222
5.3. Results and discussion ............................................................................................. 225
5.4. Conclusions .............................................................................................................. 231
5.5. References ................................................................................................................ 232
Capítulo 6 ................................................................................................................................. 239
6. Conclusiones generales ....................................................................................................... 239
3
Capítulo 0
0. Estructura de la Tesis Doctoral
4
Estructura de la Tesis Doctoral
5
La presente Tesis Doctoral está dividida en 6 capítulos. El capítulo 1 trata de
poner en antecedentes los temas que se abordarán en el presente trabajo. El capítulo 2
hace referencia a los materiales, métodos experimentales y técnicas instrumentales
empleados. Los capítulos 3, 4 y 5 conforman los resultados obtenidos durante la tesis.
Finalmente, en el capítulo 6 se redactan las conclusiones generales.
Además, dado que la presente Tesis Doctoral opta al grado de Doctor con
mención de Doctor Internacional, los capítulos correspondientes a la parte de resultados
se han redactado en inglés atendiendo a la normativa vigente incluida en el Real Decreto
99/2011 de 28 de enero.
La presente Tesis Doctoral ha sido realizada en el Grupo de Electrocatálisis y
Electroquímica de Polímeros (GEPE) del Instituto Universitario de Materiales (IUMA)
de la Universidad de Alicante. Además, con el objetivo de obtener la mención de Doctor
Internacional, se han complementado los estudios de investigación con la realización de
una estancia en la Universidad Åbo Akademi, Turku (Finlandia) bajo la supervisión del
profesor Johan Bobacka.
A continuación, se presenta un breve resumen de cada capítulo que compone esta
Tesis Doctoral:
Capítulo 0
6
Capítulo 1. Introducción.
El capítulo 1 comienza con una breve introducción sobre la necesidad de
desarrollar nuevos materiales funcionalizados que sean aplicables en el campo de la
bioelectrónica y la nanotecnología resaltando el desarrollo de sensores y biosensores.
Tras comentar la evolución de los biosensores electroquímicos a lo largo de la
historia, se deduce el principal objetivo de este trabajo que es desarrollar un biosensor
electroquímico de tercera generación.
Dado que se ha de producir una transferencia electrónica adecuada entre el
bioelemento y la superficie del electrodo, es importante comprender la manera de
inmovilizar la proteína sobre un electrodo soporte. De esta forma, factores como la
orientación de la biomolécula; la distancia del centro redox a la superficie electródica; y
la desnaturalización de la proteína son claves para desarrollar un sistema sensor
adecuado basado en una proteína inmovilizada.
Se justifica la elección de la proteína modelo y objeto del estudio, citocromo c
(cyt c). Se revisan las técnicas de inmovilización de proteínas sobre electrodos. Por
último, se hace un repaso de los polímeros conductores en sus aplicaciones como
dispositivos biotecnológicos.
Capítulo 2. Técnicas y Métodos Experimentales.
El capítulo 2 incluye una revisión de las principales técnicas y métodos
experimentales empleados en el desarrollo de los tres capítulos siguientes que
constituyen los resultados de esta Tesis Doctoral, tanto técnicas electroquímicas como
espectroscópicas:
Estructura de la Tesis Doctoral
7
- Voltametría cíclica
- Espectroscopía Infrarroja in situ
- Espectroscopía Ultravioleta-Visible
- Espectroscopía Ultravioleta-Visible in situ
- Espectroscopía Electrónica de Rayos X
A continuación, se describen los métodos y procedimientos necesarios para la
puesta a punto de los experimentos, como son la preparación de disoluciones; limpieza
de células electroquímicas y electrodos metálicos; así como el pretratamiento de
electrodos. Además, se presenta una tabla a modo de resumen que clarifica los
diferentes electrodos empleados en los experimentos de esta Tesis Doctoral.
Chapter 3. Direct electron transfer to cytochrome c induced by a conducting
polymer.
En el capítulo 3 se investiga la Transferencia Electrónica Directa (DET) entre la
hemoproteína citocromo c, que se encuentra disuelta en un medio acuoso a pH 7, y la
superficie de un electrodo de oro metálico. Dado que las moléculas de cyt c no
transfieren directamente sus electrones sobre el electrodo metálico, se procede a
modificar el electrodo de oro mediante un depósito electroquímico del polímero
conductor poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT) dopado con poli(4-estirensulfonato)
(PSS).
Se investiga el mecanismo de transferencia electrónica entre el polímero
conductor y la proteína redox, analizando el espesor de polímero necesario para que se
produzca una óptima transferencia electrónica, llegando a que el control del mismo
Capítulo 0
8
ofrece unos valores de cinética de transferencia electrónica dos órdenes de magnitud
mayores que los obtenidos en electrodos convencionales.
Combinando la espectroscopía vibracional FTIR con técnicas electroquímicas se
observan modificaciones en la superficie del PEDOT:PSS que inducen cambios en la
orientación de la proteína, llegando a la conclusión de que la orientación perpendicular
del grupo hemo de la proteína hacia el electrodo modificado es responsable del proceso
de transferencia electrónica.
Los resultados obtenidos en el capítulo 3 han dado lugar a una publicación
científica con la siguiente referencia:
López-Bernabeu, S.; Huerta, F.; Morallón, E.; Montilla, F. Direct Electron Transfer to
Cytochrome c Induced by a conducting polymer. The Journal of Physical Chemistry C
2017, aceptado.
Chapter 4. Enhancement of the direct electron transfer to encapsulated
cytochrome c by electrochemical functionalization with a conducting polymer.
El capítulo 4 se centra en la optimización de la Transferencia Electrónica Directa
a citocromo c, esta vez encapsulado en sílice, mediante la inserción electroquímica de
un polímero conductor, concretamente el PEDOT.
La inmovilización de la proteína en la superficie del electrodo se lleva a cabo
sobre la sílice sintetizada mediante el método sol-gel, cuyos precursores son
tetraetoxisilano (TEOS) y metil-trietoxisilano (MTES). Esta metodología permite un
contacto directo entre el centro redox de la proteína y la superficie del electrodo, sin
Estructura de la Tesis Doctoral
9
necesidad de utilizar ningún mediador redox, con lo que se desarrolla un dispositivo
conocido como biosensor electroquímico de tercera generación.
No obstante, la inserción electroquímica de polímeros conductores mejora la
transferencia electrónica entre la proteína y la superficie del electrodo. De hecho,
mediante la voltametría cíclica y la espectroscopía Ultravioleta-Visible se ha
comprobado que la inserción de PEDOT:PSS sirve para conectar las moléculas de cyt c
situadas en una posición lejana, y aisladas eléctricamente de la superficie del electrodo.
Utilizando la voltametría cíclica se estudia el efecto de la cantidad de proteína
dentro de la matriz de sílice, obteniéndose un valor óptimo de cantidad de proteína en la
que se produce una mejora en la respuesta redox. Se debe añadir que, tras la inserción
electroquímica del polímero conductor PEDOT:PSS se observa que este material es
capaz de interconectar eléctricamente las moléculas de cyt c que han quedado aisladas
de la superficie del electrodo.
Mediante la espectroscopía Ultravioleta-Visible acoplada al sistema
electroquímico se ha obtenido información del estado oxidado/reducido de la proteína
inmersa en el gel de sílice. Tras la aplicación de un potencial en el que se produce la
reducción de la proteína dentro del gel, y comparar a su vez los sistemas proteína
inmovilizada en ausencia y en presencia de PEDOT:PSS, se observa que la presencia
del polímero conductor produce una mejora de hasta 3 veces superior en la cinética de
reducción de la proteína inmovilizada.
Los resultados recogidos en el capítulo 4 han dado lugar a una publicación
científica con la siguiente referencia:
Capítulo 0
10
López-Bernabeu, S.; Gamero-Quijano, A.; Huerta, F.; Morallón, E.; Montilla, F.
Enhancement of the direct electron transfer to encapsulated cytochrome c by
electrochemical functionalization with a conducting polymer. Journal of
Electroanalytical Chemistry 2017, 793, 34-40.
Chapter 5. Hydrogen peroxide biosensor based on Cytochrome c immobilized in
a Silica-modified electrode.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el capítulo anterior se ha
desarrollado un biosensor electroquímico de tercera generación para la detección de
peróxido de hidrógeno (H2O2).
La matriz de sílice presenta buena afinidad y biocompatibilidad hacia la proteína
cyt c, la cual es capaz de promover la reducción catalítica de H2O2, oxidándose su
centro activo desde ferrocitocromo a ferricitocromo. Además, se ha probado una mejora
en la reducción de H2O2 insertando el polímero PEDOT:PSS entre los poros de la
matriz que incluye a la proteína. Se ha analizado la cantidad de material conductor
insertado demostrando que una pequeña cantidad de polímero insertada no produce
efecto alguno en la reducción catalítica del H2O2, mientras que una cantidad muy grande
ocluye los poros impidiendo el acceso del peróxido de hidrógeno a la proteína,
empeorando el proceso de reducción. Sin embargo, una cantidad moderada de
PEDOT:PSS produce un efecto de hasta 2 veces mayor en la reducción de H2O2.
Capítulo 6. Conclusiones generales.
En este capítulo se recogen las conclusiones generales obtenidas en la presente
Tesis Doctoral.
I
13
Capítulo 1
1. Introducción
14
Introducción
15
1.1. Materiales avanzados para bioelectrónica
La selección y el desarrollo de materiales funcionales avanzados es todo un reto
para el progreso de la sociedad. En los últimos 30 años el desarrollo de estos materiales
ha experimentado un avance exponencial en aplicaciones como detección molecular en
diagnóstico médico; suministro de fármacos; tratamiento de enfermedades; escaneo in
vivo; regeneración de tejidos/órganos; etc.1
Existe un tipo de materiales emergentes conocidos como materiales
biofuncionalizados cuya síntesis y funcionalización no es siempre la misma, ya que no
existe una metodología universal que incluya toda la variedad de materiales y sus
posibles aplicaciones. Por tanto, es necesario seleccionar la estrategia más adecuada
para la biofuncionalización de estos materiales.1
En 2009 el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología2 (NIST) emitió un
informe en el que indicaba que estaba emergiendo un gran número de oportunidades en
el campo de la bioelectrónica, especialmente en áreas relacionadas con la salud;
medicina, seguridad del ciudadano, medio ambiente, distribución de alimentos, etc.3
La integración de biomoléculas con elementos electrónicos lleva al desarrollo de
la bioelectrónica, disciplina que combina los conocimientos de la biología y la
biotecnología4-6
con la electrónica. Como requisito fundamental en un sistema
bioelectrónico se encuentra la necesidad de que exista un buen contacto eléctrico o
acoplamiento electrónico entre la biomolécula y el soporte.7, 8
Capítulo 1
16
Tabla 1.1. Análisis de publicaciones que contienen el término bioelectronic(s) desde 1950 hasta 2017 (11/04/2017) en Colección Principal de Web of Science.
Publicación Revista Ref. Autor(es)
Universidad /
Centro de
Investigación
Veces
citado
Promedio
de citas /
año
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9 Y. Wang; YY. Shao; DW.
Matson; JH. Li; YH. Lin
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Berkeley, USA
976 122.0
2
Probing biomolecular interactions at
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and enzyme biosensors
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10 E. Katz and I. Willner
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3
Integration of layered redox proteins and
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8 I. Willner and E. Katz
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Marquage Mol & Chim
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Introducción
17
derivatives on carbon nanotubes (5620), 775-778 C. Mioskowski Bioorgan, France
6 Nanomaterial-based electrochemical
biosensors
Analyst 2005, 130
(4), 421-426
13 J. Wang
Arizona State Univ, Dept
Chem & Mat Engn,
Tempe, USA
501 38.5
7 Electrochemical biosensors - Sensor principles
and architectures
Sensors 2008, 8 (3),
1400-1458
14
D. Grieshaber; R.
Mackenzie; J. Voros; E.
Reimhult
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Lab, Dept Mat, Wolfgang
Pauli Str 10, Switzerland.
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Ed. 1996, 35 (4),
367-385
17 I. Willner and S. Rubin
Hebrew University,
Jerusalem, Israel 321 14.6
Capítulo 1
18
Prueba de ello es analizar el número de resultados encontrados en la Web of
Science18
(WOS) de publicaciones en revistas científicas, comunicaciones en congresos
y conferencias internacionales, etc. que contengan en el título o en el resumen la palabra
“bioelectronic” o “bioelectronics”. Tras este análisis se obtuvieron 2894 resultados.
La Tabla 1.1 muestra las 10 publicaciones más citadas en el campo de la
bioelectrónica en el momento de escribir este capítulo. El 60 % de estas recientes
publicaciones tratan de materiales funcionalizados (grafeno dopado con nitrógeno,
nanomateriales, nanotubos de carbono, proteínas redox, etc.) y sus técnicas de
caracterización para el desarrollo de sensores y biosensores electroquímicos.8-10, 12-14
Asimismo, a la vista de la Tabla 1.1 los investigadores Itamar Willner19
y Evgeny
Katz20
aparecen en tres de las diez publicaciones más citadas en el campo de la
bioelectrónica. Ambos científicos han realizado una gran aportación ya que los
progresos realizados en nanotecnología y nanobiotecnología añaden nuevos conceptos
en el área de la bioelectrónica.
Diversos estudios han revelado que la integración de nanomateriales
(nanopartículas, nanofibras, nanotubos, nanohilos, etc.) con elementos biológicos
(enzimas, proteínas, etc.) forma un sistema funcional y miniaturizado que puede ser de
gran utilidad en biosensores, dispositivos mecánicos y circuitos electrónicos.21-23
Recientes publicaciones han desarrollado biosensores prestando especial atención
en la señal eléctrica24-26
generada por el bioelemento de transducción o el proceso
biocatalítico. Por otro lado, el uso de enzimas también se ha investigado en el desarrollo
de biopilas de combustible27, 28
para producir energía eléctrica a partir de un
combustible orgánico.
Introducción
19
1.2. Sensores y Biosensores
Investigaciones recientes en el campo de la nanotecnología han sentado las bases
de una gran variedad de nuevos materiales y dispositivos con unas propiedades
específicas y cuya aplicación directa se centra en el desarrollo de sensores
electroquímicos y biosensores.29
Etimológicamente, el término sensor deriva del verbo latino sentire. Resulta
sugerente decir que la capacidad de apreciar o rechazar un gusto o un olor específico no
es más que una simple ejemplificación de un sensor químico.30
Según la IUPAC31
(International Union of Pure and Applied Chemistry) un sensor
químico es un dispositivo que transforma una información química en una señal
analítica útil. La información química se origina a partir de una reacción química entre
la molécula que se está analizando (analito) o de una propiedad física del sistema que se
está investigando (definición de 1991).32, 33
Otra forma de definir un sensor químico es cualquier dispositivo miniaturizado
que sea capaz de responder de manera inequívoca a un analito concreto en el seno de
una muestra compleja.34
Un sensor químico consta de dos elementos principales:
- Receptor: se encarga de reconocer el analito y traduce este acoplamiento en una
información de tipo químico.
- Transductor: se encarga de convertir la información química procedente del
receptor en una señal analítica.
Capítulo 1
20
Los sensores químicos pueden clasificarse en varias categorías según la función
del elemento transductor.
1. Ópticos
2. Electroquímicos
3. Eléctricos
4. Piezoeléctricos
5. Calorimétricos
6. Magnéticos
7. Termométricos
8. Otros
De entre los dispositivos sensores más habituales destacamos los sensores
electroquímicos.35
Su principal ventaja frente a otro tipo de dispositivos es que el
proceso de obtención (receptor) y transformación de la información química
(transductor) en una señal analítica medible se produce en el mismo electrodo,29
pues
las reacciones catalíticas tienen lugar en la interfase electrodo-disolución. Entre las
principales características de estos dispositivos destacan su sensibilidad y selectividad;
simplicidad experimental y bajo coste.30, 34, 36
El tipo de señal determinará el tipo de sensor electroquímico; por ejemplo, una
intensidad de corriente es propia de un sensor amperométrico, mientras que un potencial
lo es de un sensor potenciométrico, así como una señal de conductividad es propia de un
sensor conductimétrico.36
Dentro del ámbito de los sensores, se encuentran los biosensores. Un biosensor
puede definirse como un dispositivo que contiene un elemento biológico, como parte
receptora, y además está en contacto con un sistema transductor adecuado que convierte
Introducción
21
la señal bioquímica en una señal eléctrica que se puede cuantificar. En la Fig. 1.1 se
observa el esquema de un biosensor. El elemento transductor es capaz de transformar o
convertir la señal bioquímica en una señal de salida.
Figura 1.1. Esquema general de un biosensor.
La elección del elemento biológico va a depender de la sustancia o analito que se
desea analizar, así como el tipo de transductor también dependerá del biocomponente.37
En general, la mayor aplicación de los biosensores se halla en el campo clínico, y
en segundo lugar en el control de procesos industriales, concretamente en la industria
alimentaria.38
La investigación actual está centrada tanto en el desarrollo de nuevos
dispositivos a escalas micro y nano, como en estrategias de inmovilización para
desarrollar biosensores completamente reversibles y regenerables, que puedan operar in
situ en muestras complejas, y que sean biocompatibles para operar in vivo. Hoy en día,
numerosos son los ejemplos de biosensores utilizados, por ejemplo, el sensor de glucosa
para las personas que padecen de diabetes; el test de embarazo o el test de alcoholemia.
Capítulo 1
22
Los biosensores, al igual que cualquier otro tipo de dispositivo, han evolucionado
a lo largo de la historia. De forma anecdótica, podríamos decir que los primeros
biosensores fueron las aves (normalmente canarios) en las minas de carbón.39
En 1956 Leland C. Clark,40
conocido como el “Padre de los Biosensores”
desarrolló un electrodo para la medida de oxígeno disuelto en agua, conocido como
“electrodo de Clark”, que hasta ahora ha tenido una enorme aplicación científica y
comercial. Algunos años más tarde, en 1962 Clark inventó el primer dispositivo41
biosensor para determinar la concentración de glucosa en sangre. Esto permitió a
millones de diabéticos registrar sus niveles de azúcar en sangre. Este dispositivo
consistía en un cátodo de platino (Pt) sensible a oxígeno. De esta forma, al añadir
glucosa al sistema que contenía la enzima glucosa oxidasa en disolución, ésta se
oxidaba a ácido glucónico y en esta reacción se consumía oxígeno el cual era detectado
en el cátodo de Pt (Fig. 1.2.a). El potencial de reacción que se aplicaba era negativo, de
unos -700 mV frente a un electrodo de plata (referencia), y a lo largo de la reacción
enzimática se observaba cómo descendía la concentración de oxígeno en el medio. A
partir de este descubrimiento comenzó el desarrollo de los biosensores amperométricos.
A lo largo de los años, se han desarrollado diferentes métodos para la
transferencia de electrones entre la enzima y el transductor, lo que permite distinguir
entre diferentes generaciones de biosensores amperométricos (Fig. 1.2).
Introducción
23
Figura 1.2. Esquema de las tres generaciones de biosensores amperométricos: a) primera generación;
b) segunda generación; c) tercera generación.
Los biosensores de primera generación (Fig. 1.2.a) son aquéllos en los que se
detecta en el electrodo algún reactivo o producto tras la oxidación o reducción
producida por la reacción enzimática. Las enzimas oxidasas son un claro ejemplo de
esta generación. En este ejemplo, en la reacción enzimática se consume oxígeno (O2).
Entre las desventajas que presenta esta generación de biosensores se encuentra el
elevado consumo de proteína y el alto sobrepotencial aplicado. Esto lleva a la
producción de reacciones interferentes e indeseadas, debido a la existencia de especies
presentes en el medio que se reducen a potenciales más positivos. Para evitar estos
inconvenientes se introduce un nuevo elemento en estos dispositivos, dando paso a la
segunda generación de biosensores (Fig. 1.2.b).
En este caso la proteína se inmoviliza sobre el electrodo y se emplea una especie
redox que presenta una mayor facilidad a oxidarse/reducirse que las especies de la
reacción enzimática.42
Esta especie redox se conoce como mediador. El mediador debe
reaccionar de manera rápida con el centro activo, minimizando la competición con el
cofactor natural de la enzima.43, 44
Por tanto, con la introducción de este nuevo elemento
reducimos el potencial de trabajo aplicado, reduciendo así las posibles
Capítulo 1
24
interferencias.42,44
Su diseño es más complicado ya que, por un lado es necesario
conseguir la inmovilización de la enzima y, por otro lado hay que conseguir la
inmovilización de la especie mediadora.45
Los mediadores más utilizados son el par ferri/ferrocianuro, 1,4-benzoquinona y
otras quinonas, derivados del ferroceno, complejos de osmio y fenotiazinas.46, 47
El
primer biosensor de segunda generación data de 1984 y fue desarrollado por Cas y
Davis, utilizando ferroceno como mediador.48
Gran parte de la investigación actual se dirige al desarrollo de biosensores de
tercera generación (Fig. 1.2.c) en los que la transferencia electrónica entre el centro
activo de la enzima/proteína y la superficie del electrodo se produce de forma directa.
Este tipo de biosensores muestra una mayor selectividad, ya que trabajan a potenciales
muy próximos a los intrínsecos de la enzima/proteína, quedando menos expuestos a
especies interferentes.49
Desde los años 80 se produjo un avance en la investigación de
estos dispositivos,45, 50
y en los últimos años, se han desarrollado diferentes trabajos
basados en este tipo de transferencia electrónica.51, 52
En principio, estas generaciones de biosensores presentan una serie de
inconvenientes relacionados con la optimización de la transferencia electrónica entre el
centro activo de la enzima y la superficie del electrodo, incluyendo:53
1) La actividad de la enzima/proteína puede verse fácilmente afectada por: pH,
temperatura, humedad, agentes químicos, etc. que llevan a una insuficiente
estabilidad y baja reproducibilidad del dispositivo.
2) La mayoría de enzimas son caras y llevan a un coste elevado del dispositivo
sensor, en cuanto a uso y mantenimiento.
Introducción
25
Además, en el caso de los biosensores de tercera generación, su diseño parece el
más simple de todos, pero el proceso de inmovilización y estabilización de la
enzima/proteína es complicado.
Capítulo 1
26
1.3. Electroquímica Directa de Proteínas
La presencia de un elemento biológico (proteína o enzima) en contacto con un
electrodo de trabajo hace posible la transferencia de carga directa entre el centro activo
de la proteína y la superficie del electrodo.7 Esta ventaja se ha empleado en el desarrollo
de dispositivos bioelectrónicos con aplicaciones en biosensores23-25, 29
o biopilas de
combustible.27, 28, 54
Figura 1.3. a) Esquema de un biosensor amperométrico formado por una enzima redox y un electrodo
modificado con un polímero; b) Configuración de una biopila de combustible basada en electrodos
formados por enzimas.
El biosensor amperométrico (Fig. 1.3.a) proporciona una corriente eléctrica que es
proporcional a la concentración del analito que se está estudiando. Éstos son los más
utilizados y versátiles.55-57
Además, dependiendo del tipo de biosensor amperométrico
la transferencia electrónica se produce de forma diferente. Por ejemplo, el
reconocimiento molecular puede estar acompañado por una conversión química del
analito en sus respectivos productos, los cuales se determinan por un sensor
biocatalítico. Mientras que cuando se emplea un anticuerpo, el sistema de
Introducción
27
bioreconocimiento y las posibles interacciones tienen lugar sin conversión del analito,
resultando un biosensor de afinidad.36
En el caso de las biopilas de combustible, el elemento biológico es el responsable
de la catálisis que se produce a través de mediadores. Aquí es necesario que se produzca
la transferencia electrónica entre el biocatalizador y el electrodo (Fig. 1.3.b). Estos
sistemas presentan dos limitaciones importantes frente a los convencionales, basados en
electrocatalizadores de Pt. Estas limitaciones son la corta estabilidad operacional del
sistema biológico y las bajas densidades de corriente medidas.58
El uso de
biocatalizadores inmovilizados en el electrodo, en lugar de en disolución, mejora tanto
la estabilidad de la enzima como la transferencia electrónica con el electrodo, siendo
posible incluso obtener corrientes sin necesidad de mediadores redox.45
Obviamente la transferencia electrónica al electrodo o desde el electrodo solo se
puede llevar a cabo por enzimas/proteínas que catalicen reacciones redox. Las
reacciones redox se clasifican en dos subgrupos: de oxidación y de reducción.52
La transferencia de carga eléctrica va a depender de la distancia de separación
entre el elemento dador de electrones, en este caso el electrodo, y el elemento aceptor de
electrones, la proteína/enzima redox. Una distancia suficientemente grande entre la
superficie del electrodo y el centro activo de la proteína supone que no exista
comunicación directa y, por tanto, se dificulta la transferencia de carga.7, 47
Aquí resulta
necesario la actuación de especies mediadoras, como ocurre con las coenzimas
nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y flavín adenin dinucleótido (FAD).
45
La mayoría de las enzimas oxidoreductasas, empleadas habitualmente en biopilas
de combustible, no presentan la habilidad de transferir electrones por ellas mismas, sino
Capítulo 1
28
que han de llevar incorporadas compuestos redox de bajo peso molecular o polímeros
que actúen de mediadores.42
En electroquímica directa de proteínas las enzimas/proteínas más estudiadas son:
- Peroxidasas
- Oxidasas
- Hidrogenasas
- Hemoproteínas
Las peroxidasas son un tipo de enzimas muy extendidas pertenecientes al grupo
de las oxidorreductasas. En general, catalizan reacciones redox utilizando peróxido de
hidrógeno (H2O2) como agente oxidante. Son de gran interés los estudios de reducción
electroquímica del peróxido a agua sobre electrodos basados en peroxidasas en
aplicaciones analíticas.52, 59
Las oxidasas son enzimas pertenecientes a la categoría de oxidorreductasas que
catalizan la reacción de oxidación/reducción empleando oxígeno molecular (O2) como
aceptor de electrones. En estas reacciones el oxígeno puede reducirse a peróxido de
hidrógeno (H2O2) o a agua (H2O). Dentro de este grupo las enzimas más destacadas son
la citocromo c oxidasa, la glucosa oxidasa y las lacasas.
La enzima citocromo c oxidasa se puede considerar uno de los descubrimientos
directos de la bioelectrocatálisis.52
De hecho, desde los años 80 ha sido estudiada para
entender el acoplamiento electrónico entre la enzima adsorbida sobre un electrodo de
oro.60
La glucosa oxidasa (GOx) es una enzima que interviene en la transferencia
electrónica mediada (MET). Aquí la especie mediadora ferroceno/ferricinio está en
Introducción
29
disolución y facilita el transporte de la GOx, que contiene el cofactor flavín adenín
dinucleótido (FAD), que es reducido a FADH2 por la oxidación de la glucosa.47
Las lacasas son enzimas que presentan cuatro átomos de cobre (Cu) en sitios
redox distintos. Por tanto, se pueden considerar metaloproteínas de cobre. Éstas
catalizan la oxidación de un sustrato orgánico/inorgánico y la reducción de oxígeno
molecular a agua mediante un mecanismo de transferencia de un electrón.61
La lacasa ha
sido estudiada con éxito en catálisis y electrocatálisis.52
Sin embargo, estudios no tan
exitosos se han realizado con otras cupoproteínas como la tirosinasa y la bilirrubina
oxidasa.52
Las hidrogenasas son enzimas que catalizan la oxidación reversible de hidrógeno
molecular (H2) e intervienen en el metabolismo microbiano. Se encuentran en
organismos unicelulares procariotas como las arqueas y bacterias. La oxidación de H2
ha sido ampliamente investigada en el desarrollo de pilas de combustible.62
En 2001,
Tsujimura y col. desarrollaron la primera celda de combustible compuesta por
hidrogenasa. Para ello, emplearon una bacteria con una alta actividad hidrogenasa como
ánodo y la enzima bilirrubina oxidasa como cátodo.63
Varios grupos de investigación
han estudiado diferentes bacterias aerobias y anaerobias para encontrar la enzima que
más se adapte al inhibidor con un centro catalítico Ni-Fe y Fe-S.62
Las hemoproteínas son metaloproteínas que presentan un grupo prostético hemo
en su estructura. Están presentes en gran cantidad de organismos y poseen multitud de
funciones, desde el transporte (hemoglobina) y almacenamiento (mioglobina) de
oxígeno, catálisis, así como el transporte intermembrana y la transferencia electrónica
(citocromo c).64
En particular, el citocromo c es una de las más estudiadas.
Capítulo 1
30
La transferencia electrónica directa (DET) del citocromo c (cyt c) fue observada
por primera vez en 1977.65
Su electroquímica directa y las medidas voltamétricas se han
analizado en numerosos estudios. Estos trabajos han llevado a un buen entendimiento de
los mecanismos de transferencia electrónica entre el citocromo c y los electrodos
modificados.
La DET del citocromo c está recibiendo especial interés gracias a su función
biológica.66, 67
Sin embargo, es complicado transferir carga entre un electrodo
convencional al citocromo c debido a la baja cinética de transferencia electrónica
electrodo/disolución y la respuesta transitoria y de corta vida en la superficie.68
Por otro lado, no resulta fácil conseguir una buena transferencia electrónica de
esta proteína sobre la superficie de los electrodos ya que el centro redox, (grupo hemo)
se encuentra en la parte interior de la cadena polipeptídica, envuelto y protegido por el
esqueleto proteico.69, 70
Introducción
31
1.4. Inmovilización de Proteínas
Un aspecto crítico en el desarrollo de un biosensor electroquímico es la
inmovilización de la proteína, ya que la disposición de la misma sobre la superficie del
electrodo es crucial en la transferencia electrónica.71
El tiempo de vida útil de un
biosensor depende de la estabilidad del material inmovilizado.36
Asimismo, al inmovilizar la enzima ésta puede desnaturalizarse al entrar en
contacto con la superficie del electrodo, y no sólo eso, sino que la gran mayoría de
enzimas poseen su centro activo en el interior de su estructura terciaria, haciendo muy
difícil el contacto directo con la superficie del electrodo.72, 73
La inmovilización de elementos biológicos es un proceso en el que se confina o
localiza la enzima/proteína en una región definida del espacio, restringiendo completa o
parcialmente los grados de libertad de movimiento debido a su unión al soporte.74
Varios son los métodos descritos para inmovilizar proteínas o enzimas sobre la
superficie del electrodo. Los procesos de inmovilización existentes se engloban dentro
de tres grandes categorías:75
1) adsorción física, 2) adsorción química y 3)
encapsulación o atrapamiento. La retención física tiene lugar gracias a las interacciones
de Van der Waals, uniones débiles, de tal manera que el elemento no está fijo, sino que
puede moverse por la interfase. La unión química se produce porque se forma un enlace
químico (iónico o covalente) entre el adsorbato y el adsorbente; éste es un enlace fuerte.
En la encapsulación o atrapamiento se produce la incorporación de (bio)moléculas en
una matriz adecuada.
Capítulo 1
32
A continuación, se resumen los principales procedimientos de inmovilización de
proteínas.76
- Adsorción física.
Es un fenómeno reversible y se produce principalmente a bajas temperaturas,
mediante uniones relativamente débiles. Se caracteriza por entalpías de adsorción
relativamente bajas (20 a 40 kJ/mol), del mismo orden de magnitud que las fuerzas de
Van der Waals entre moléculas.77
Koposova y col. emplearon un método para ensamblar nanohilos y nanopartículas
monodispersas de oro mediante interacciones aurofílicas (enlaces débiles Au-Au)
mediante una oleamina modificada con una metaloproteína (cyt c). El electrodo
formado lleva al desarrollo de dispositivos electroquímicos.78
Jin y col. inmovilizaron la proteína cyt c mediante interacciones electrostáticas
débiles sobre un electrodo de oro que fue modificado con una monocapa
autoensamblada (SAM). Con ello estudiaron el efecto del pH en la transferencia redox
proteína-electrodo empleando técnicas electroquímicas en combinación con la
microbalanza de cuarzo (QCM).79
La transferencia electrónica directa de la enzima glucosa oxidasa (GOx)
inmovilizada en un electrodo basado en una película de láminas de grafito exfoliadas y
nafion fue investigada por Evans y col. La GOx inmovilizada retiene su actividad
debido la buena biocompatibilidad con el electrodo.80
Un biosensor de tercera generación para la detección de glucosa se preparó
mediante la inmovilización de GOx sobre nanotubos de carbono dopados con nitrógeno
(CNx-MWCNTs). La enzima GOx se adsorbió al electrodo modificado mediante
Introducción
33
interacciones electrostáticas débiles. El sistema formado presentaba una excelente
actividad catalítica para la reducción de O2.81
González-Gaitán y col. realizaron la
inmovilización de GOx en diferentes nanotubos de carbono y observaron que la
estructura de éstos, así como la química superficial es de gran importancia para orientar
la enzima de forma efectiva como sensor.82
- Adsorción química o quimisorción
Es un fenómeno que implica interacciones de tipo químico entre adsorbato y
adsorbente, y por tanto le afecta la temperatura. Las entalpías de adsorción son más
elevadas (40 a 400 kJ/mol) y se suelen producir a temperaturas más altas que la
adsorción física.
Un electrodo de oro compuesto por una SAM modificada con una bipiridina se
empleó para incorporar la hemoglobina (Hb) mediante enlace covalente. El electrodo
modificado presentaba estabilidad y se utilizó para desarrollar un biosensor de peróxido
de hidrógeno.83
Un biosensor para la detección de glucosa se desarrolló a partir de la unión
covalente de la enzima GOx con el ácido poli(o-aminobenzoico).84
Rahman y col. fabricaron un biosensor mediante inmovilización covalente de la
enzima piruvato oxidasa y nanocapas de polímero conductor modificadas con el ácido
carboxílico poli(tetratiofeno) con el objetivo de detectar de forma amperométrica iones
fosfato.85
Un biosensor de tercera generación fue desarrollado empleando cyt c que fue
anclado rápidamente mediante unión covalente a una SAM, formada por cadenas cortas
de derivados de tiol (ácido mercaptopropiónico, MPA). El sistema presentaba un
Capítulo 1
34
comportamiento cuasireversible y una rápida transferencia electrónica. El biosensor
amperométrico fue probado para la detección de H2O2 en microorganismos
acuáticos.86, 87
- Encapsulación o atrapamiento en matrices sólidas
Consiste en la retención física de la proteína/enzima en las cavidades interiores de
una matriz sólida porosa. El proceso de inmovilización suele ser en geles, donde la
enzima queda atrapada; o en fibras, donde la enzima se encuentra ocluida dentro de las
microcavidades de una fibra sintética.75
Alegret y col. desarrollaron la inmovilización de enzimas liofilizadas
(acetilcolinesterasa o peroxidasa) en una resina polimérica no conductora para
conformar un material rígido y conductor al ser ensamblado con polvo de grafito.88
Un nuevo material híbrido compuesto por una matriz orgánica e inorgánica
empleando el método sol-gel fue desarrollado por Wang y col. Este material se
componía de sílice y un copolímero basado en piridina que previene su rotura. Además
se analizó la sensibilidad del dispositivo y el tiempo de respuesta mediante técnicas
electroquímicas.89
La electroquímica directa de la mioglobina inmovilizada sobre un electrodo de
pasta de carbón mediante el método sol-gel fue analizada por Wang y col. Para ello,
utilizaron tetraetoxisilano (TEOS) como reactivo precursor. Éste resultó ser un
procedimiento fácil y barato para encapsular proteínas en el desarrollo de biosensores.90
Gamero-Quijano y col. desarrollaron un método para encapsular la proteína cyt c
en matrices sol-gel a partir de diferentes precursores de sílice. Aquí analizaron el efecto
Introducción
35
de la composición estructural de la matriz de sílice con en el comportamiento
electroquímico de la biomolécula.91
Dentro del marco de los dispositivos bioelectrónicos que llevan a los biosensores,
estas técnicas de inmovilización de proteínas pretenden aumentar la densidad de
corriente; mejorar la estabilidad de la enzima e incrementar la transferencia electrónica
entre el centro activo de la proteína y la superficie del electrodo.45
Por ello, una vez inmovilizada la proteína se ha de buscar la transferencia
electrónica directa empleando elementos conductores como nanohilos metálicos,
polímeros conductores, mediadores redox, nanotubos de carbono, nanofibras, etc.
Capítulo 1
36
1.5. Encapsulación de proteínas: matrices sol-gel
El método sol-gel es un proceso basado en la formación de un sol, seguido de la
formación de un gel.92
La Figura 1.4 muestra los distintos pasos del proceso sol-gel.
Figura 1.4. Proceso sol-gel.
Un sol es una suspensión de partículas sólidas en un líquido. Su tamaño oscila
entre 1 nanómetro y 1 micrómetro. Puede ser obtenido por la hidrólisis y condensación
parcial de un precursor, que puede ser una sal inorgánica o un metal alcóxido. La
condensación completa de un sol en una red tridimensional produce un gel, que es un
sol cuyas partículas están suspendidas y organizadas de forma dispersa, pero definidas
tridimensionalmente, dando cierta rigidez y elasticidad a la mezcla.
El gel, puede tratarse como un hidrogel cuando el disolvente utilizado es el agua,
mientras que un alcogel, cuando se utiliza como disolvente un alcohol.
El secado de geles es una etapa muy importante en el proceso de producción de
diferentes tipos de geles debido a que las condiciones determinan las propiedades
texturales. Asimismo, se obtiene un xerogel cuando el secado se realiza en condiciones
Introducción
37
subcríticas, es decir, por simple evaporación del disolvente. Mientras que cuando el
secado se produce a una alta temperatura y presión, en condiciones supercríticas, el gel
formado se llama aerogel.93
Por otro lado, el criogel se produce cuando el secado se
lleva a cabo en condiciones criogénicas, esto es, cuando el disolvente se congela y se
elimina por sublimación.
El método sol-gel consiste en la producción de materiales de vidrio o de cerámica,
a través de la hidrólisis y la condensación de alcóxidos metálicos adecuados.92
Para la
preparación de materiales de sílice los precursores alcóxidos más habituales son:
tetrametoxisilano (TMOS) y tetraetoxisilano (TEOS), cuyas estructuras se observan en
la Figura 1.5.
Figura 1.5. Precursores de sílice habituales en el método sol-gel, a) tetrametoxisilano (TMOS);
b) tetraetoxisilano (TEOS).
Estos reactivos pueden ser hidrolizados y condensados bajo condiciones
relativamente suaves92, 94
(presión y temperatura ambiente en medios relativamente
ácidos o básicos). El proceso sol-gel se lleva a cabo en dos etapas:
1) Hidrólisis: se mezclan los precursores de sílice empleando un catalizador
(ácido o básico).
2) Condensación: se produce la agregación de los coloides.
Capítulo 1
38
La Figura 1.6 muestra un ejemplo de las etapas del proceso sol-gel utilizando
como precursor TEOS e hidrólisis ácida. La etapa de hidrólisis lleva a una disolución
coloidal metaestable conocida como sol. La segunda etapa consiste en la condensación
del sol mediante el aumento del pH y la agregación de coloides, produciéndose un gel.
Figura 1.6. Etapas del método sol-gel. a) Hidrólisis; b) Condensación.
El proceso sol-gel presenta las siguientes ventajas:95
i) Se obtienen materiales de alta pureza, ya que se parte de unos precursores
reactivos que son puros.
ii) Es posible modificar las propiedades físicas como distribución de tamaño y
volumen de poro variando el tipo de reactivos precursores.91
iii) Es posible conseguir un nivel alto de composición química homogénea.96
iv) El proceso se lleva a cabo a bajas temperaturas y a presión atmosférica.
Introducción
39
v) Se obtienen materiales de diferentes formas físicas (películas, monolitos,
partículas, fibras, etc.).97
vi) Los materiales de sílice poseen transparencia óptica y buena permeabilidad.94
El gel de sílice contiene poros funcionalizados por grupos silanol (Si-OH) cuyo
pKa se encuentra en torno 1.7-3.5.91
Por tanto, estos geles a pH 7 presentan cierta carga
neta negativa.92
Las etapas del proceso sol-gel (secado, estabilización, envejecimiento, etc.)
influyen en la velocidad de hidrólisis y condensación que determinarán la estructura del
gel. Por ello, es importante entender la cinética de las reacciones de hidrólisis y
condensación.96
Las variables que más influyen en el proceso sol-gel son la temperatura,
el tipo de catalizador (ácido o básico), la naturaleza del disolvente y el tipo de precursor
alcóxido.
La concentración del catalizador influye de forma importante en la etapa de
hidrólisis. La Figura 1.7 muestra de forma cualitativa la variación de las etapas
hidrólisis y condensación con el pH utilizando TEOS como precursor.98
Por un lado, la
velocidad de hidrólisis aumenta proporcionalmente con la concentración de H+ a pH
ácido y, con la concentración de OH- a pH básico.
96
Capítulo 1
40
Figura 1.7. Diagrama esquemático que presenta la variación de la velocidad de las etapas de hidrólisis y
condensación, y el efecto en la estructura del gel formado en función del pH.95
Por otro lado, la condensación no sigue una relación tan directa, pues influyen
otros factores como el tiempo de gelificación, la viscosidad o las características
texturales del gel formado.92, 99, 100
De hecho, Yamane y col. analizaron la curva tg
(tiempo de gelificación) vs pH en forma de campana, y llegaron a la conclusión de que
la gelificación ocurre de forma instantánea en pH muy ácidos o básicos, mientras que
trabajando con pH neutros se obtuvieron velocidades intermedias.101
Por otro lado,
Keeling-Tucker y col. concluyeron que el uso de un pH fisiológico (pH ~ 7) acelera el
proceso de gelificación.102
Debido a que el tiempo de gelificación es inversamente
proporcional a la velocidad de condensación,103
esto significa que un tiempo de
gelificación corto lleva a una rápida condensación de los monolitos y películas sol-gel.
La naturaleza del grupo alcóxido del precursor de sílice también influye en la
cinética del proceso. En general, un grupo alcóxido largo y voluminoso lleva a una
ralentización de la etapa de hidrólisis.92
Introducción
41
En particular, la porosidad de este material es un factor importante que puede ser
modificado cambiando las condiciones experimentales y los reactivos de la disolución
precursora.92
La introducción de grupos funcionales orgánicos (amino, fenilo, hidroxilo, etc.) en
la estructura del monómero alcóxido lleva a estructuras de sílice modificadas
orgánicamente, conocidas como ormosil (organic modified silica). La Fig.1.8 muestra
diferentes monómeros de sílice que contienen grupos ormosil.
Figura 1.8. Estructuras de monómero de sílice modificadas orgánicamente: a) Metiltrimetoxisilano;
b) Metilvinildietoxisilano; c) 3-Aminopropiltrimetoxisilano; d) Difenildietoxisilano.
La introducción de estos grupos orgánicos lleva a modificar las propiedades
físicas y químicas de la sílice obtenida.96
Entre otras, el efecto estérico controla
parcialmente la velocidad de gelación, siendo mayor a medida que el grupo alquilo
también lo es, desde tetraetoxisilano (TEOS), hasta metiltrietoxisilano (MTES) y
dimetildimetoxisilando (DMDMS).103
El empleo de precursores ormosil lleva a materiales con una porosidad modulable.
El tamaño de poro está directamente relacionado con el tamaño del sustituyente
orgánico introducido. Por tanto, es una forma versátil de obtener electrodos
Capítulo 1
42
funcionalizados.96
De hecho, diferentes biomoléculas han sido inmovilizadas
adecuadamente en una matriz compuesta por grupos ormosil y se han empleado para el
desarrollo de biosensores.103
Introducción
43
1.6. Citocromo c: proteína redox modelo
El citocromo c (cyt c) es la proteína redox elegida como proteína modelo en esta
tesis doctoral. Se trata de una hemoproteína globular, soluble en agua y de pequeño
tamaño (Mw = 12 384 Da). Presenta un color rojizo en disolución (Fig. 1.9.b). Debido a
su estructura sencilla se considera una proteína eucariota casi universal104
y se encuentra
entre las proteínas más estudiadas.105
En la Figura 1.9 se puede observar la estructura
tridimensional del citocromo c que fue resuelta por primera vez en 1970 mediante
difracción de rayos X y utilizando una resolución de 2.8 Å.106
Figura 1.9. a) Estructura tridimensional del citocromo c.107
b) Disolución de citocromo c en tampón
fosfato (pH 7).
El punto isoeléctrico informa si la proteína se encuentra cargada positiva o
negativamente en función del pH del medio en que se trabaje. Esto significa que a un
valor cercano del punto isoeléctrico las interacciones hidrofóbicas entre el adsorbato y
el adsorbente son máximas.108
El citocromo c presenta un valor de punto isoeléctrico en
torno a 10,109
por tanto, la proteína disuelta en un medio tamponado a pH 7 se encuentra
cargada positivamente.108
Capítulo 1
44
El citocromo c objeto de estudio procede de la especie equino y, por tanto, se trata
de una proteína monomérica cuya estructura primaria consta de una única cadena
polipeptídica formada por 104 aminoácidos.109
La Figura 1.10 muestra la secuencia de
aminoácidos que componen la estructura primaria del citocromo c procedente de la
especie equino. De entre los aminoácidos más abundantes de esta secuencia se
encuentran la lisina (Lys), la glicina (Gly) y la treonina (Thr) que representan un 18, 12
y 9.6 %, respectivamente. La Lys se incluye dentro de los aminoácidos que contienen el
grupo alquilo cargado positivamente, mientras que la Gly y la Thr corresponden
respectivamente, a aminoácidos no polares y cuyo grupo alquilo no se encuentra
cargado. Los aminoácidos histidina (His) 18 y metionina (Met) 80 en posición axial
sostienen el grupo hemo que se encuentra ubicado en el bolsillo proteico.110
Respecto a la estructura secundaria se puede observar que la cadena polipeptídica
consta de aproximadamente un 40 % de hélices α y el resto la forman láminas tipo β en
forma de segmentos extensos e irregulares.109
De forma más concreta, las hélices α se
presentan en forma de 5 segmentos desde el extremo N-terminal (residuos 2-14); hasta
el extremo C-terminal (residuos 87-103); y los siguientes segmentos comprendidos
entre los aminoácidos 49-55; 60-70 y 70-75.110
Introducción
45
Figura 1.10. Secuencia de aminoácidos del citocromo c procedentes de las especies equino
(PDB código 1HRC).111
El citocromo c se incluye en la familia de las hemoproteínas, que son aquéllas que
contienen en su estructura un grupo hemo, unido por enlace covalente o no covalente al
resto de la cadena polipeptídica. El grupo hemo incluye un ión hierro (Fe) que se
encuentra coordinado y cuyo estado de oxidación puede variar entre Fe2+
(reducido) y
Fe3+
(oxidado) permitiendo una transferencia electrónica.
1.6.1. Grupo hemo
El grupo hemo consiste en una estructura compuesta por cuatro anillos pirrólicos
unidos entre sí formando una estructura cíclica, conocida como protoporfirina (Fig.
1.11), en el centro de la cual se encuentra un átomo de hierro.104, 112
Los cuatro grupos
pirrólicos aportan un átomo de nitrógeno que está coordinado al hierro mediante un
enlace covalente.
Capítulo 1
46
Figura 1.11. Estructura del anillo de porfirina.
Existen diferentes tipos de grupo hemo (Figura 1.12) que se diferencian
principalmente en la naturaleza de los sustituyentes del anillo porfirínico. Asimismo, la
designación de un tipo de citocromo u otro sólo hace referencia a la identidad del grupo
hemo.104
Además, el grupo hemo es el responsable del color rojo característico de la
hemoglobina, proteína de la sangre.
Introducción
47
Figura 1.12. Tipos de grupo hemo: a) Hemo a; b) Hemo b; c) Hemo c; d) Hemo o.
Un ejemplo de metaloproteína que contiene el grupo hemo a (Fig. 1.12.a) es la
enzima citocromo c oxidasa que forma el complejo IV en la cadena de transporte de
electrones en la membrana mitocondrial. Se trata de la última enzima de la cadena de
transporte y se encarga de transferir 4 electrones procedentes de 4 citocromos c a una
molécula de oxígeno, para luego reducirse a dos moléculas de agua.104
Los grupos hemo b y c (Fig. 1.12.b y c) son los más abundantes y similares en su
estructura electrónica.113
El anillo de porfirina en estos grupos, con su disposición
particular de cuatro sustituyentes metilo, dos propionato y dos vinilo, se conoce como
protoporfirina IX.104, 109
Por tanto, se forma el complejo Fe-protoporfirina IX y la
principal diferencia es la unión no covalente del grupo hemo al resto de proteína, en el
caso del hemo b, mientras que el hemo c se une de forma covalente al resto de la cadena
proteica mediante dos enlaces tioéter formados entre las cadenas de cisteína y los
Capítulo 1
48
grupos vinílicos de las posiciones 2 y 4 (la numeración del anillo de porfirina se observa
en la Fig. 1.11).
El grupo hemo b se encuentra tanto en la hemoglobina como la mioglobina
(proteína muscular), dos hemoproteínas encargadas del transporte de oxígeno.109
Además, las proteínas de la familia de las peroxidasas también contienen este grupo.
Mientras que el grupo hemo c forma parte de importantes hemoproteínas como el
citocromo c.
El grupo hemo del citocromo c se encuentra rodeado por las cinco hélices α (Fig.
1.9.a) formando un bolsillo y esta estructura está influenciada por el entorno apolar que
proporcionan los residuos de aminoácidos apolares que se encuentran orientados hacia
el interior del bolsilo.112
Keating y col. estudiaron que el grupo hemo del cyt c puede ser
usado como sistema que adsorbe de forma estable y con una orientación determinada el
citrato sobre la superficie de partículas de oro, gracias a los aminoácidos Lys que son
abundantes en el bolsillo hemo.114
El grupo hemo o (Fig. 1.2.d) presenta una estructura idéntica al grupo hemo a,
pero difiere en un grupo metilo en la posición 8, que en el caso del hemo a se trata de un
grupo formilo. Su función es la reducción del oxígeno en agua, pero este grupo se
encuentra fundamentalmente en algunas bacterias oxidasas,113
como la Escherichia
coli.115
En cuanto a su localización, los citocromos pueden estar presentes en las
membranas de la mitocondria o en las membranas plasmáticas de las células
procariotas.112
Introducción
49
La Figura 1.13 muestra dos posiciones diferentes del grupo hemo del citocromo c,
perpendicular y paralela al plano.
Figura 1.13. Diferentes posiciones de la proteína citocromo c (PDB código 1HRC): a) grupo hemo en
posición perpendicular; b) grupo hemo en posición paralela.111
La función principal del citocromo c es la de transporte de electrones durante la
respiración aerobia, en células eucariotas, y anaerobia, en bacterias. Se encarga de
transferir los electrones del complejo III al complejo IV o llamado también citocromo c
oxidasa (Fig. 1.14). Éste último recibe el electrón a través del centro de redox116
y
mediante una serie de reacciones de transferencia electrónica intramolecular lo
transfiere al aceptor final, que es el oxígeno molecular, al mismo tiempo que actúa
como una bomba de protones desde la matriz mitocondrial hasta el espacio
intermembrana. Finalmente, los protones fluyen a través de la adenosín trifosfato (ATP)
sintetasa a favor del gradiente de concentración y se genera ATP, nucleótido
fundamental en la obtención de energía celular.
Capítulo 1
50
Figura 1.14. Cadena de transporte de electrones en la membrana mitocondrial interna.
1.6.2. Propiedades optoelectrónicas del citocromo c.
La palabra citocromo proviene del griego117
cito (célula) y cromos (coloreada)
pues el grupo hemo es un cromóforo, es decir, absorbe ciertas longitudes de onda de la
luz y transmite o refleja otras, por lo que la proteína presenta coloración.
La Fig. 1.15 muestra el espectro Ultravioleta-Visible de citocromo c en disolución
en un medio tamponado a pH 7 (línea negra), situación en la que la proteína se
encuentra en su estado nativo, mientras que la proteína disuelta en un medio ácido 0.5
M H2SO4 (línea roja), se encuentra en su estado desnaturalizado. En dicho espectro se
muestran las bandas características de absorción de la proteína en los dos medios
diferentes.91
Introducción
51
Figura 1.15. Espectro de absorción Ultravioleta-Visible del citocromo c en disolución en estado nativo
(línea negra) y desnaturalizado (línea roja).91
Por un lado, es posible distinguir 2 bandas características: la banda Soret, o
también banda γ, que se localiza en el intervalo de longitudes de onda de 370-440 nm, y
la banda Q que se encuentra en la franja 510-580 nm. La banda Soret es aquélla que
presenta mayor intensidad de absorción y está relacionada con las transiciones
electrónicas del anillo porfirínico,118
mientras que la banda Q es un sobretono
de la banda Soret y se presenta como una banda ancha y menos intensa.
Se puede apreciar en la Fig. 1.15 una diferencia clara en las bandas de absorción
entre el citocromo c nativo y desnaturalizado. De hecho, la banda Soret se desplaza unos
nanómetros hacia la zona azul del espectro (de 409 nm a 398 nm) cuando la proteína se
encuentra desnaturalizada, mientras que la banda Q tiende a desaparecer.
La Figura 1.16 muestra el espectro de absorción Ultravioleta-Visible del
citocromo c en una disolución de tampón fosfato (pH 7). Este espectro también es
sensible al estado redox de la proteína. Se observan las bandas Soret y Q características
Capítulo 1
52
del citocromo c en estado oxidado y reducido. El espectro del citocromo c en estado
oxidado coincide con el espectro correspondiente al estado nativo del citocromo c (Fig.
1.15, línea negra), es decir, se aprecia una intensa banda Soret a 409 nm y una banda Q
menos definida en torno a 500-570 nm de longitud de onda.
Figura 1.16. Espectro de absorción Ultravioleta-Visible del citocromo c oxidado (línea continua) y
reducido (línea discontinua) en disolución neutra 0.02 M KClO4.119
Por otro lado, se aprecia un desplazamiento hacia el rojo de la banda Soret del
espectro correspondiente al citocromo c reducido, así como un desdoblamiento de la
banda Q en dos bandas independientes bien definidas y puntiagudas a 520 y 549 nm,
respectivamente, que son propias del estado reducido de la hemoproteína y son
conocidas como bandas α y β, respectivamente. La longitud de onda de la banda α, que
varía en forma característica con cada especie particular de citocromo reducido (no se
presenta en los citocromos oxidados), es útil para diferenciar los distintos citocromos.104
Introducción
53
1.7. Polímeros conductores: aplicaciones a biosensores
Un polímero es un material formado por una sucesión grande y variable de unidades
iguales, llamadas monómeros. Estas unidades simples que se repiten son las que van a
determinar las propiedades y características del polímero.
Los polímeros conductores o conjugados son estructuras formadas por una cadena larga
de carbonos con alternancia de enlaces dobles (o triples) y simples, es decir, presentan
conjugación extendida. Se caracterizan por ser semiconductores en estado nativo, pero su
conductividad, propiedad intensiva e inherente del material, aumenta en varios órdenes de
magnitud cuando se les hace reaccionar con agentes oxidantes o reductores (estado dopado).
Figura 1.17. Estructura conjugada del trans-poliacetileno.
Además de su conductividad, presentan buenas propiedades ópticas y electrónicas. Son
materiales que combinan las propiedades eléctricas de los conductores metálicos con las
numerosas ventajas de los polímeros.
Desde que Heeger,120
MacDiarmid y Shirakawa comenzaran el estudio de polímeros
conductores se ha investigado una gran variedad de combinaciones de polímeros y agentes
dopantes, dando lugar a nuevos conocimientos sobre electroquímica, propiedades mecánicas y
conductividad eléctrica.121-123
Estos tres científicos recibieron el Premio Nobel en 2000 por el
descubrimiento y desarrollo de los polímeros conductores.124
Fueron descubiertos en 1974 cuando Hideki Shirakawa (Universidad de Tsukuba,
Tokio) preparaba el poliacetileno (Fig. 1.17) usando un catalizador Ziegler-Natta, y un
fortuito accidente causado por el paso del gas acetileno a través de una solución de n-heptano
Capítulo 1
54
y el catalizador Ziegler Ti(OC4H9)4/Al(C2H5)3, el cual estaba en exceso en relación con la
cantidad habitual, hizo que se formara una película policristalina. Ésta era flexible y aislante
en lugar del polvo que se obtenía usualmente.125, 126
Además presentaba un comportamiento
propio de un material semiconductor, con un valor de resistividad de 104 Ω·cm.
126, 127
Posteriormente, en 1977, H. Shirakawa, A. MacDiarmid (Universidad de Pensilvania) y
A. Heeger (Universidad de California) demostraron que dopando una película de poliacetileno
(mediante oxidación parcial con vapor de yodo, su resistividad eléctrica aumentaba de forma
considerable, presentando un valor de 2,4·108 Ω·cm.
126, 127
Las propiedades electrónicas propias de metales y semiconductores las adquiere el
polímero conductor mediante un proceso de dopado que introduce portadores de carga
(huecos y electrones) en su interior.128
La introducción de cargas positivas en el polímero o
dopado-p se consigue mediante la oxidación, mientras que la introducción de electrones o
dopado-n se produce por una reducción del material.129
Este proceso se puede realizar
mediante diversos métodos experimentales de naturaleza química, electroquímica,
fotoquímica, etc.128, 130
1.7.1. Síntesis de polímeros conductores
La metodología más habitual de síntesis de polímeros conjugados es el acoplamiento
oxidativo. Este proceso puede realizarse de forma química, disolviendo el monómero
precursor en presencie de un oxidante adecuado; o de forma electroquímica, utilizando un
electrodo polarizado que actúe de ánodo. Se trata de un método sencillo, rápido y produce
polímeros de alto peso molecular.131
Introducción
55
El mecanismo general de acoplamiento oxidativo para el monómero de tiofeno se
compone de una secuencia de reacciones de oxidación, acoplamiento de especies radical-
catión y desprotonación.
La reacción de polimerización empieza con la oxidación del monómero precursor para
formar la especie catión-radical estabilizada por resonancia. De las posibles formas
resonantes, la que presenta el radical en la posición 2 es la más estabilizada debido al
heteroátomo que tiene en la posición vecina. El mecanismo de oxidación del tiofeno y
generación de la especie radical catión se muestra en la Figura 1.18 donde puede observarse
que las formas resonantes de la especie catión-radical no mantienen la aromaticidad.
Figura 1.18. a) Oxidación del monómero de tiofeno y formación del radical-catión; b) Estructuras resonantes
del monómero radical-catión del tiofeno.
El siguiente paso es la dimerización de los monómeros radicales mediante acoplamiento
radical-radical preferentemente por las posiciones 2-2 (Fig. 1.19).
Capítulo 1
56
Figura 1.19. Acoplamiento 2-2 de radicales en la formación de dímeros de tiofeno.
Tras este acoplamiento se forman especies intermedias cargadas positivamente que van
a reaccionar inmediatamente desprotonándose y recuperando la neutralidad, como se muestra
en la Fig. 1.20. Además, en el caso del acoplamiento 2-2 se observa que el dímero de tiofeno
formado mantiene la conjugación.
Figura 1.20. Mecanismo acoplamiento 2-2, seguido de desprotonación y recuperación de la conjugación.
El acoplamiento radical-radical está explicado por la eliminación de dos protones para
dejar el dímero en su forma neutra y recuperar su aromaticidad. La propagación de la cadena
tiene lugar a través de la oxidación del dímero en su forma neutra a la forma catión-radical,
donde puede acoplarse de nuevo con otros monómeros catión-radical y formar trímeros,
tetrámeros, oligómeros, etc.132
También es posible el acoplamiento en otras posiciones menos favorecidas.131, 132
La
falta de control en el tipo de acoplamiento es uno de los inconvenientes que presenta el
método de acoplamiento oxidativo. El acoplamiento 2-3 (Fig. 1.21) conlleva a una pérdida de
la conjugación extendida del polímero formado, empeorando así las propiedades eléctricas del
material.
Introducción
57
Figura 1.21. Acoplamiento 2-3 en la reacción de formación del dímero de tiofeno; a) mecanismo de
acoplamiento y formación de especies cargadas positivamente; b) desprotonación y recuperación de la
neutralidad.
Por tanto, su control es muy importante ya que influye en las propiedades del polímero
formado. De hecho, el orden molecular de polímeros basados en tiofenos sustituidos influye
en gran medida en las propiedades eléctricas del material. Las mejores conductividades se
obtienen con polímeros regioregulares, es decir, controlando los acoplamientos de los
monómeros oxidados y favoreciendo los acoplamientos cabeza-cola frente a otros posibles.
Este tipo de ordenamiento se consigue empleando condiciones de síntesis y catalizadores
adecuados.133
Sin embargo, para tiofenos no sustituidos o monosustituidos la síntesis por
acoplamiento oxidativo no es la más adecuada para obtener estructuras poliméricas ordenadas
y sin entrecruzamientos.134
La síntesis electroquímica es una forma particular de síntesis por acoplamiento
oxidativo. Se realiza habitualmente por métodos potenciodinámicos. Para ello, se establece un
programa de barrido de potencial en el que se oxida el monómero de partida y en cada ciclo se
observa el crecimiento del polímero y el depósito del mismo sobre el electrodo.
Capítulo 1
58
El dímero formado se suele oxidar a potenciales menores que el monómero de partida y
la etapa de rearomatización es más lenta cuanto mayor sea la longitud del polímero debido a
la deslocalización de la carga de las estructuras quinoides.131
Los polímeros más clásicos sintetizados por métodos electroquímicos son la polianilina
(PANI o Pani), el polipirrol (Ppy) y el politiofeno (PT), cuyas estructuras idealizadas se
pueden observar en la Fig. 1.22. Estos polímeros proceden de los monómeros anilina, pirrol y
tiofeno, respectivamente,117
y todos ellos fueron sintetizados por primera vez durante los años
80.122
Figura 1.22. Estructuras idealizadas de polímeros conductores más comunes: a) polianilina (PANI);
b) polipirrol (Ppy); c) politiofeno (PT).
Sin embargo, pese a que es habitual que se presente la estructura de estos polímeros
como la indicada en la figura anterior (en forma de cadenas lineales con acoplamientos
cabeza-cola) las estructuras reales difieren en gran medida de éstas debido a los
acoplamientos indeseados (antes presentados) o porque los polímeros sufren reacciones de
degradación y entrecruzamiento durante la síntesis.
Introducción
59
Polímeros conductores como el polipirrol (PPy) o la polianilina (PANI) han sido
estudiados en profundidad121, 122
porque son fácilmente sintetizados por polimerización
química o electroquímica obteniéndose materiales con una alta conductividad y estabilidad.135
La PANI se conoce desde hace más de un siglo. De hecho, se encuentra entre los más
estudiados debido a su estabilidad medioambiental, así como su elevada conductividad y
síntesis directa.136
Su síntesis, tanto por métodos químicos como electroquímicos ha sido
objeto de estudio en medios acuosos y orgánicos.137-139
En medios acuosos fuertemente
ácidos, el mecanismo se produce a través de cationes radicales en las unidades de anilina
oxidadas.140-142
De esta forma, mediante el acoplamiento de monómero/dímero oxidados el
polímero va creciendo obteniéndose finalmente la polianilina.143
Sin embargo, presenta dos grandes inconvenientes que dificultan su aplicabilidad: por
un lado, es poco procesable ya que es insoluble en la mayoría de disolventes orgánicos
comunes. Por otro lado, está la dependencia de la conductividad electrónica con el pH del
medio, ya que a pH mayores de 3 la conductividad de la polianilina disminuye
bruscamente.137, 143-146
El polipirrol (Ppy) se ha estudiado ampliamente gracias a su fácil preparación;
adecuadas propiedades ópticas y electrónicas; forma oxidada estable; solubilidad en agua y su
capacidad para modular su conductividad eléctrica.147
Otra clase de polímeros conductores, que poseen unas propiedades ópticas y
electrónicas modulables son el politiofeno y derivados. Éstos son atractivos en aplicaciones
relacionadas con el desarrollo de dispositivos optoelectrónicos y luminiscentes.148-150
En el
caso de los tiofenos, la polimerización por acomplamiento 2,3 se evita si las posiciones 3 y 4
del anillo están bloqueadas.151
Capítulo 1
60
1.7.2. Poli(3,4-etilendioxitiofeno)
El polímero poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDT o PEDOT) ha sido estudiado en el
desarrollo de diversas aplicaciones tecnológicas: electrónica,152, 153
sensores,154
transistores de
efecto campo,155, 156
etc. Su estructura (Fig. 1.23) está formada por una unidad principal
constituida por un anillo de tiofeno, en el que las posiciones 3 y 4 se encuentran bloqueadas y
unidas por un sustituyente etilendioxi que forma un segundo ciclo. De esta forma, no existe la
posibilidad de acoplamientos 2,3 y por tanto, la polimerización por adición oxidativa tiene
lugar exclusivamente por las posiciones 1 y 2 del anillo del tiofeno.
Figura 1.23. Estructura del polímero conductor PEDOT.
Entre las principales ventajas del PEDOT se destacan: transparencia óptica en películas
finas; forma oxidada del polímero; alta estabilidad; valor razonable de band gap y bajo
potencial redox.147, 157
La polimerización del 3,4-etilendioxitiofeno (EDOT) se puede llevar a cabo en medio
acuoso, en presencia de un polielectrolito surfactante conocido como poli(4-estirensulfonato
de sodio) (PSSNa), que forma una dispersión con el monómero y cuyas funciones principales
son:157
S
O O
S
OO
S
O O
S
OO
n
Introducción
61
1. Actúa de contraión compensando la carga del monómero EDOT (se mantiene el
principio de electroneutralidad), que cuando se oxida se forma una especie catión-
radical.157
La oxidación es un proceso progresivo que da lugar a un polímero-
contraión de estequiometría variable.158
2. Actúa de surfactante, es decir, mantiene los segmentos de PEDOT dispersos en
medio acuoso.
La Figura 1.24 muestra la estructura idealizada del PEDOT:PSS:
Figura 1.24. Estructura idealizada del PEDOT:PSS.
El PEDOT dopado con PSS presenta un gran interés, gracias a su estabilidad térmica y
electroquímica,159
buena compatibilidad con elementos biológicos160
y procesabilidad.161
Esta
disolución está disponible comercialmente y se conoce con el nombre de Baytron P. Este
método de polimerización de EDOT emplea un polielectrolito acuoso (PSS) y el
peroxidisulfato de sodio (Na2S2O8) como agente oxidante. Tras la reacción de polimerización
a temperatura ambiente se obtiene una dispersión acuosa azul oscura PEDOT/PSS que se ha
comercializado por Bayer AG.161
Un aspecto curioso de esta dispersión es que tras secarse, la
S
O O
S
OO
S
O O
S+
OO
S+
O O
*
*
*
S
OO
-O
SO3-SO3
-
Capítulo 1
62
película resultante de PEDOT/PSS es altamente conductora, transparente, mecánicamente
dura e insoluble en cualquier disolvente común.161
Baytron P fue desarrollada inicialmente para aplicaciones antiestáticas en la industria
fotográfica. Actualmente, se emplea en aplicaciones relacionadas con la orgánica electrónica
como películas fotográficas, dispositivos electroluminiscentes, transistores, células
fotovoltaicas, etc.157, 160
Sin embargo, la adhesión de la disolución comercial PEDOT:PSS en diferentes
superficies es muy limitada en medios acuosos.162, 163
Wagner y col. obtuvieron una
disolución acuosa de PEDOT:PSS añadiendo una concentración conocida de aditivos como el
etilenglicol y sales de amonio cuaternarias con el objetivo de promover una mejora en la
adhesión y la conductividad eléctrica del material.164
Resultados basados en espectroscopía electrónica y vibracional han determinado que
ambos compuestos (PEDOT y PSS) son especies conjugadas y fácilmente oxidadas gracias a
su estructura rica en electrones. Sin embargo, datos estructurales como peso molecular,
polidispersidad y grupos terminales están todavía por esclarecer.161
En 1994, de Leeuw y col. prepararon películas finas de PEDOT que fueron estudiadas
por difracción de rayos X utilizando radiación sincrotrón y concluyeron que el material era
anisotrópico y existía un orden cristalino limitado en las finas películas.165
En 1999, Aasmundtveit y col. contribuyeron a su caracterización estructural pues fueron
los primeros que propusieron un modelo estructural para el PEDOT dopado con tosilato.166
Otra forma de sintetizar PEDOT es la polimerización electroquímica, es decir, la
oxidación electroquímica del monómero y el depósito del polímero en el ánodo.161
Llama la
Introducción
63
atención de este método que requiere poca cantidad de monómero; tiempos cortos de
polimerización; el depósito se produce sobre la superficie del electrodo y se pude llevar un
control de las capas de polímero depositadas.
Una variedad de electrolitos es compatible con la polimerización de PEDOT y sus
derivados incluyendo diversos polianiones formados por especies sulfatadas de
poli(butadieno) e hidroxiéteres.167
En los últimos años, el PEDOT:PSS ha sido utilizado como polímero conductor ya que
su dispersión coloidal proporciona películas168
en varios sustratos utilizando técnicas sencillas
como el spin coating.169
Esta técnica, que consiste en dejar caer una pequeña cantidad de
disolución sobre un sustrato que está girando a altas velocidades, se utiliza principalmente
para preparar capas finas de polímero. El spin coating lleva a que el polímero se deposite con
un espesor arbitrario que depende de las condiciones del depósito, como la viscosidad de la
disolución o el grado de giro del dispositivo rotatorio.
No obstante, es posible llegar a capas más finas de PEDOT:PSS de varias decenas de
nanómetros de espesor. De hecho, Kemerink y col. utilizaron la técnica spin coating para
depositar 200-250 nm de PEDOT:PSS, analizando la topología y la conductividad eléctrica,
informando que las partículas de PEDOT:PSS, con un diámetro aproximado de 20 nm, se
empaquetaban al azar durante la formación de las capas.169
Por otro lado, Yan y col. estudiaron la correlación entre el diámetro de las partículas
coloidales de PEDOT:PSS y el espesor de las películas depositadas por spin coating, y tras
sus resultados de STEM-EDX (Scanning Transmission Electron Microscopy-Energy
Dispersive X-ray), DLS (Dynamic Light Scattering) y XPS (X-ray Photoelectron
Spectroscopy) las películas finas consistían en un sistema de monocapas.168
Capítulo 1
64
Introducción
65
1.8. Objetivos de la Tesis Doctoral
En el marco de desarrollar un biosensor electroquímico de tercera generación, el
objetivo principal de esta Tesis Doctoral es estudiar la transferencia electrónica existente entre
el centro redox de la proteína citocromo c (cyt c) y la superficie del electrodo.
Por ello, la presente tesis se desglosa en dos partes principales cuyos objetivos
específicos son:
Analizar la transferencia redox que se produce entre la hemoproteína cyt c disuelta en
un medio tamponado a pH 7 y un electrodo metálico modificado con un polímero
conductor, el poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT).
Inmovilizar la proteína en una matriz de sílice mediante el método sol-gel, analizando
así la transferencia de electrones producida entre el centro redox y la superficie del
electrodo.
Optimizar este proceso modificando el electrodo de sílice con la proteína
inmovilizada, insertando de forma electroquímica PEDOT con el fin de enlazar los
centros activos que han quedado alejados de la superficie del electrodo.
Aplicar el dispositivo desarrollado con la proteína encapsulada sobre el electrodo
como biosensor amperométrico en la detección de peróxido de hidrógeno (H2O2) para
el desarrollo de un biosensor de tercera generación.
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II
89
Capítulo 2
2. Técnicas y Métodos Experimentales
90
Técnicas y Métodos Experimentales
91
2.1. Técnicas Electroquímicas
2.1.1. Voltametría cíclica
La voltametría o voltamperometría cíclica es una técnica de caracterización
electroquímica muy empleada por su sencillez operacional y por la cantidad de información
que se puede obtener a partir de un voltagrama o voltamperograma,1 que es la representación
de la curva intensidad-potencial. Consiste en la variación lineal del potencial con el tiempo a
la vez que se registra la intensidad de corriente que circula a través del electrodo. Se trabaja
con dos límites de potencial, superior e inferior y un punto inicial de potencial que indica el
comienzo de la variación de potencial con el tiempo. Esta técnica constituye la base de la
mayoría de métodos instrumentales electroanalíticos.2
La Figura 2.1 muestra el diagrama de bloques de la instrumentación para realizar la
voltametría cíclica. Las diferentes partes son:
Figura 2.1. Diagrama de bloques de la instrumentación necesaria para voltametría cíclica.3
Capítulo 2
92
i. Potenciostato: aplica una diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el
electrodo de referencia, y hace pasar corriente eléctrica entre el electrodo de trabajo y
el contraelectrodo.4
ii. Generador de señal: está conectado al potenciostato y al registrador y se encarga de
hacer variar el potencial del electrodo de trabajo desde un valor inicial hasta otro valor
final. Normalmente, esta variación del potencial con el tiempo es lineal y se consigue
introduciendo una señal triangular cuya pendiente en valor absoluto es la velocidad de
barrido. La ecuación es E = E0 ± υt ± 2λt (λ = 0,1) donde υ es la velocidad de barrido.2
iii. Registrador: se encarga de anotar la variación del potencial con el tiempo, así como la
corriente con el tiempo. De esta manera, envía esta información al software de
adquisición de datos que se encarga de reproducir la representación I vs E o
voltagrama.
En este trabajo se han empleado indistintamente dos tipos de potenciostato: un
potenciostato, modelo Wenking ST-72 de Bank Elektronik, y el segundo, modelo eDAQ; un
generador de señales analógico, modelo EG&G PARC de Princeton Applied Research; y un
registrador digital, modelo eDAQ-410 de eDAQ, que dispone de un software de adquisición
de datos conectado a un ordenador.
Existen dos tipos de dispositivo experimental para llevar a cabo las medidas de
voltametría cíclica: la configuración de célula de dos electrodos o la de tres electrodos.5 La
primera configuración consiste en un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia,
mientras que la configuración de tres electrodos contiene un electrodo adicional que
llamaremos contraelectrodo o electrodo auxiliar. En cualquier caso, el montaje experimental
más conveniente para el control del potencial del electrodo de trabajo es el que emplea tres
electrodos, ya que se evita el paso de corriente a través del electrodo de referencia y por tanto,
Técnicas y Métodos Experimentales
93
la polarización del mismo, lo que provocaría la modificación del potencial del electrodo de
referencia con el paso de corriente.
iv. Célula electroquímica: puede adoptar diversas formas dependiendo del estudio que se
vaya a realizar y la aplicación que se desee. La Fig. 2.2 muestra el esquema de una
célula empleada para caracterización electroquímica. Se trata de una célula fabricada
en vidrio Pyrex y se compone de 3 partes:
Figura 2.2. Esquema de la célula electroquímica con sus componentes fabricados en vidrio Pyrex.6
Cuerpo de la célula: puede presentar diferentes formas (Figura 2.3). En general, tiene
elementos comunes como son la base que contiene la disolución de trabajo que puede
tener diferentes formas de acuerdo al volumen de disolución que se necesite; y las
bocas que permiten la entrada de otros elementos. En particular, existen otros
modelos de cuerpo que no incluyen bocas para la entrada/salida del resto de
elementos, sino que incluyen una tapa de teflón que protege a la disolución del
contacto con el aire y, además posee ciertos agujeros para incluir estos elementos
externos (Fig. 2.3.c).
Capítulo 2
94
Figura 2.3. Imágenes de 3 tipos diferentes de células electroquímicas. a) Célula blanco utilizada
preferentemente para caracterización electroquímica; b) Célula de polimerización; c) Célula de aplicación del
sistema como sensor de H2O2.
Pasador de gases: dispositivo de vidrio que consta en un extremo de un tubo
sumergido en la disolución y en el otro extremo tres salidas de vidrio que conectan la
disolución y la atmósfera. Por una de estas salidas se burbujea un gas inerte (N2 o Ar)
indistintamente a la disolución/atmósfera de la célula con el fin de eliminar el
oxígeno que pueda existir en la disolución/atmósfera.
Luggin: capilar de vidrio donde se soporta el electrodo de referencia y lo mantiene en
contacto con la disolución electrolítica mediante una llave de vidrio que permite el
paso de disolución de trabajo entre un extremo del capilar y el otro. (Fig. 2.3.a).
Electrodos.
Electrodo de trabajo: en este electrodo ocurren las reacciones electroquímicas de interés.
Han de tener una superficie muy bien definida7 y conviene que sea pequeña.
8 Los más
comúnmente utilizados son electrodos de Pt, Au, grafito, carbón vítreo, etc.
Contraelectrodo: en este electrodo tiene lugar la reacción con una corriente de signo
opuesto a la reacción que ocurre en el electrodo de trabajo. Este electrodo debe ser inerte y
Técnicas y Métodos Experimentales
95
sus propiedades no han de afectar al comportamiento del electrodo de trabajo.5 Además es
recomendable que tenga un área lo suficientemente grande para disminuir su densidad de
corriente. En este caso, el contraelectrodo utilizado ha sido un hilo de Pt enrollado en
espiral.
Electrodo de referencia: está conectado al electrodo de trabajo y se encarga de medir la
diferencia de potencial con respecto a éste. Sus propiedades han de ser próximas a un
electrodo idealmente no polarizable.5 Por lo que su potencial ha de mantenerse fijo.
En la Fig. 2.3 se observan 3 tipos de electrodos de referencia distintos: un electrodo
reversible de hidrógeno (RHE) (Fig. 2.3.a); un hilo de plata (pseudo-referencia) (Fig.
2.3.b); y un electrodo Ag/AgCl (sat. 3 M KCl) (Fig. 2.3.c).
En general, los voltagramas de la parte de resultados (capítulos 3, 4 y 5) están
referidos a la escala del electrodo de referencia de hidrógeno (RHE, Reversible Hydrogen
Electrode).
Al final de este capítulo se adjunta una tabla (Tabla 2.2) a modo de esquema de los
distintos electrodos empleados para cada una de las técnicas empleadas.
Uno de los aspectos más interesantes de la voltametría cíclica es que permite
distinguir entre los procesos relacionados con especies adsorbidas en la superficie del
electrodo de trabajo y los debidos a las especies en disolución, proporcionando además
información acerca de la reversibilidad o irreversibilidad de los procesos de transferencia
electrónica, número de electrones transferidos en una reacción de oxidación o reducción,
constantes de velocidad, constantes de formación y coeficientes de difusión, entre otros
parámetros.
Capítulo 2
96
A pesar de que esta técnica proporciona una gran cantidad de información, también hay
que indicar que es una técnica muy limitada para la identificación de especies presentes en la
interfase electrodo/disolución. Esto se debe al hecho de que los métodos electroquímicos se
basan, en general, en la medida de propiedades macroscópicas cuya respuesta es proporcional
al número de especies implicadas. Asimismo, con la densidad de corriente, la impedancia o la
capacidad de la doble capa no es posible obtener la información necesaria para conocer qué
molécula está situada en el electrodo; qué especie química dará lugar esta transferencia de
carga, o incluso en qué estado de oxidación se encuentra la especie química objeto de estudio,
sobre todo si se trabaja con mecanismos complejos.3, 6, 9
Para resolver este problema, es habitual complementar la voltametría cíclica con otras
técnicas de caracterización, ya sean espectroscópicas, como la espectroscopía Ultravioleta-
Visible o la espectroscopía Infrarroja y acoplar al sistema electroquímico un sistema
espectroscópico (IR in situ o UV in situ) de tal manera que el sistema electroquímico controle
las condiciones que ocurren en la interfase electrodo-disolución y el sistema espectroscópico
recoja la información estructural.6
Técnicas y Métodos Experimentales
97
2.1.2. Cronoamperometría
La cronoamperometría o salto potenciostático es una técnica que mide el cambio de la
densidad de corriente (intensidad de corriente por unidad de área) con respecto al tiempo. Esta
densidad de corriente es la respuesta del electrodo de trabajo al ser sometido a un salto de
potencial desde un valor inicial (E1) hasta otro valor final (E2) como muestra la Fig. 2.4.
Figura 2.4. Curva E vs t para un salto potenciostático simple.
La Fig. 2.4 muestra la curva E vs tiempo clásica para un salto potenciostático simple.
Aquí se empieza aplicando un potencial inicial (E1) en el cual no se producen procesos
farádicos, mientras que en el segundo paso se aplica un segundo valor de potencial (E2) en el
cual se produce la oxidación/reducción de la especie que se está analizando.5
El equipo experimental utilizado ha sido un potenciostato modelo Autolab/PGStat100N
de Methrom Autolab.
Capítulo 2
98
2.2. Técnicas Espectroscópicas
2.2.1. Espectroscopía Infrarroja
La espectroscopía infrarroja10
(IR) es una de las técnicas espectroscópicas más eficaces
aplicadas a problemas de caracterización estructural. Cuando la radiación infrarroja incide
sobre una muestra, es capaz de provocar cambios en los estados vibracionales de las
moléculas constituyentes de la misma. La absorción de radiación por parte de una muestra es
indicativa del tipo de enlaces y grupos funcionales presentes. El principal inconveniente de su
utilización en fase líquida es la absorción de radiación por parte del disolvente.11
La región infrarroja se suele dividir en tres regiones, el infrarrojo cercano comprendido
entre 13000 y 4000 cm-1
; el infrarrojo medio, entre 4000 y 400 cm-1
, región en la que se
centra el estudio, y el infrarrojo lejano, que engloba de 400 a 10 cm-1
.
Los fotones que transporta la radiación infrarroja no tienen suficiente energía para
provocar transiciones electrónicas, pero si pueden conseguir transiciones vibracionales y
rotacionales. Los espectros de infrarrojo exhiben bandas de absorción estrechas y poco
espaciadas, que resultan de transiciones entre los distintos niveles cuánticos vibracionales. Las
variaciones en los niveles rotacionales también podrían dar lugar a una sucesión de picos para
cada estado vibracional, pero con las muestras líquidas o sólidas es común que la rotación se
obstaculice y se limite, además de que pasan desapercibidos los efectos de estas pequeñas
diferencias de energía.12
Según la estructura que presente la molécula, lineal o angular, existen varios tipos
fundamentales de vibración (Fig. 2.5):
Técnicas y Métodos Experimentales
99
Figura 2.5. Vibraciones fundamentales de moléculas lineales y no lineales.
Las vibraciones de tensión (υ) que alteran la longitud de los enlaces y existen dos
modos de tensión: simétrica (υs) y asimétrica (υas) (Fig. 2.5.a). Las vibraciones de
deformación o flexión que varían los ángulos de enlace, y entre las que destacan la flexión en
el plano (δ), distinguiendo los modos flexión simétrica (δs), y flexión asimétrica (δas); y la
flexión fuera del plano (γ) cuyos modos destacan el aleteo (ω) y la torsión (τ) (Fig. 2.5.b).
Existen diferentes configuraciones para la obtención de espectros infrarrojos, de entre
las que destacan la transmisión, la reflectancia difusa (DRIFT), la reflexión-absorción
(IRRAS) y la reflectancia total atenuada (ATR). Cada una de estas interacciones se basa en
los diferentes modos de interacción del haz de luz con la muestra, como se observa en la Fig.
2.6.
Capítulo 2
100
Figura 2.6. Diferentes configuraciones de obtención de un espectro de infrarrojo: a) transmisión,
b) reflectancia difusa, c) reflexión-absorción y d) reflectancia total atenuada.
El método de obtención de los espectros en este trabajo ha sido la reflexión externa
(configuración de reflexión-absorción) para medidas in situ.13
2.2.1.1. Espectroscopía IR de reflexión-absorción in situ
La espectroscopía infrarroja in situ proporciona información molecular de especies
neutras o iónicas adsorbidas sobre la superficie del electrodo, por ejemplo especies adsorbidas
bajo la influencia de un campo eléctrico. El espectro vibracional de especies adsorbidas
refleja el estado de los enlaces interno y externo, las interacciones laterales entre las capas, así
como el efecto del campo eléctrico en las frecuencias vibracionales y las intensidades. Esta
información supone un valor añadido para comprender las propiedades fisicoquímicas de la
interfase electrodo-disolución.13
En la Fig. 2.7 se observa el esquema de la célula empleada. Como se puede apreciar la
célula no está cerrada por abajo, es decir, carece de fondo. El cierre de la célula se consigue
utilizando una ventana prismática de CaF2 biselada a 60 º y una junta de teflón. Sobre esta
Técnicas y Métodos Experimentales
101
ventana prismática se presiona el electrodo de trabajo formando una capa fina de electrolito,
con un espesor de pocas micras, para minimizar las pérdidas de intensidad de la radiación
infrarroja (Fig. 2.7 parte inferior). Con esta ventana prismática se obtiene una mejora sensible
en la relación señal/ruido en comparación con las ventanas planas tradicionales.14
A la hora de
elegir el material de la ventana prismática, hay que tener en cuenta las propiedades corrosivas
de la mayor parte de los electrolitos utilizados (ácidos fuertes, bases, etc.) y sus propiedades
de transmisión. Entre los posibles materiales se encuentran el ZnSe con rango de utilización
entre 20 000 - 500 cm-1
; BaF2 con un rango entre 66 666 y 770 cm-1
y discontinuo, y el CaF2,
cuyo rango abarca entre 77 000 y 900 cm-1
, y es el que se ha escogido para la realización de
los experimentos en esta tesis.
Figura 2.7. Célula electroquímica empleada en las medidas de FTIR in situ y
configuración de reflexión del haz de luz.
El espectrofotómetro utilizado es un Nicolet Magna 5700 equipado con un detector de
telururo de cadmio y mercurio (MCT) enfriado con nitrógeno líquido. En la cámara de
muestras del espectrofotómetro se coloca un soporte de reflectancia especular modelo Veemax
de Spectra Techlonolies, (Figura 2.8) y se purga de manera continua mediante un equipo Peak
Capítulo 2
102
que suministra aire comprimido sin dióxido de carbono ni vapor de agua con el fin de evitar
interferencias con la señal que proviene de la muestra. Cada espectro se obtuvo mediante la
acumulación de 100 a 500 interferogramas, con una resolución de 8 cm-1
. El software
utilizado para la adquisición de espectros fue OMNIC de Thermo Fisher. La Fig. 2.9.a
muestra una imagen real de la disposición de la célula espectroelectroquímica sobre el soporte
Veemax. Además, se observa la disposición real de los elementos necesarios para llevar a
cabo un experimento de espectroscopía IR in situ.
Figura 2.8. Esquema óptico y disposición del soporte Veemax junto con la célula espectroelectroquímica en el
compartimento del espectrofotómetro
Técnicas y Métodos Experimentales
103
Figura 2.9. a) Célula electroquímica dispuesta sobre el soporte Veemax; b) todos los componentes necesarios
para la realización de experimentos de espectroscopía IR in situ.
Efecto de agua deuterada
El empleo de agua deuterada como disolvente es una buena estrategia para aclarar zonas
del espectro que pueden ser de interés. De esta manera, es posible limpiar la zona de
longitudes de onda donde absorbe el agua pues las vibraciones de tensión del enlace O-H
aparecen entre 3400-3600 cm-1
, y las vibraciones de flexión del enlace O-H, entre 1600-1700
cm-1
(Fig. 2.10). Las posibles descompensaciones debidas a este disolvente se trasladan a la
región de 2500 cm-1
, para la tensión del enlace D-O, y a 1200-1300 cm-1
, para la flexión del
enlace D-O.15
Capítulo 2
104
Figura 2.10. Espectro FTIR (single beam) obtenido para un electrodo policristalino de Au en una disolución 0.1
M HClO4 en agua (línea roja) y en agua deuterada (línea negra). Nº interferogramas: 100.
Potencial de referencia: 0.1V vs RHE.
El sistema electroquímico está formado por:
- Un potenciostato modelo Wenking ST 72, conectado a un sistema de tres electrodos: un
electrodo de trabajo (W), un contraelectrodo (C) y un electrodo de referencia (R). Como
electrodo de trabajo se ha empleado un disco de oro. Como contraelectrodo se ha utilizado un
anillo de Pt situado en la parte inferior de la célula, y como electrodo de referencia se ha
utilizado un electrodo reversible de hidrógeno (RHE) que consiste en una malla de Pd porosa
que absorbe hidrógeno molecular a partir de la reacción de electrolisis con un hilo de Pt (que
actúa de ánodo), y utilizando como electrolito soporte (0.1 M HClO4). Durante el transcurso
de esta reacción se observa la aparición de burbujas en la malla de Pd correspondiente al
desprendimiento de hidrógeno molecular.
- Un generador de señales EG&G PARC, modelo 175.
Técnicas y Métodos Experimentales
105
- Un registrador XY
La realización de un experimento de FTIR in situ comienza sumergiendo el electrodo de
trabajo en la célula espectroelectroquímica. Cabe tener en cuenta que el electrodo de trabajo
ha de someterse a un pretratamiento térmico previo y posterior enjuague con agua/agua
deuterada, dependiendo de las condiciones del experimento.
El electrodo de trabajo se sumerge a un potencial controlado que suele ser el potencial
de referencia. A continuación, y sin cambiar el valor del potencial se registra una serie de
interferogramas, que se empleará como espectro de referencia (R0). Mediante un salto de
potencial, el electrodo pasa a tener el potencial de la muestra y acto seguido, se adquiere el
mismo número de interferogramas, obteniendo así el espectro muestra (R). Este proceso se
repite varias veces para obtener una relación señal/ruido óptima.
En las experiencias de infrarrojo in situ los espectros definitivos se representan siempre
como diferencia normalizada de los espectros muestra (R) y referencia (R0): (R-R0)/R0
obtenidos con una resolución habitual de 8 cm-1
. En general, en los espectros finales aparecen
bandas positivas (hacia arriba) y negativas (hacia abajo). Las bandas positivas corresponden a
modos de absorción de especies que desaparecen aplicando el potencial muestra, mientras que
las bandas negativas corresponden a modos de vibración de especies que aparecen al potencial
muestra.
Capítulo 2
106
2.2.2. Espectroscopía Ultravioleta-Visible
Mientras que la espectroscopía Infrarroja proporciona información sobre las
transiciones vibracionales y rotacionales de las sustancias bajo estudio, la espectroscopía
Ultravioleta-Visible (UV-Vis) ofrece información sobre las transiciones electrónicas.12
Éstas
últimas se deben a que la molécula tiene diversos niveles de energía electrónicos (o estados
vibracionales) relacionados con los enlaces químicos que mantienen unida a la propia
molécula.12
La espectroscopía de absorción Ultravioleta- Visible se basa en la medida de la
atenuación que sufre un haz de luz después de atravesar una muestra (modo de transmisión) o
después de reflejarse sobre la superficie de la muestra (modo de reflexión). Esta atenuación se
debe a una absorción de radiación por parte de la muestra promoviendo el paso de un electrón
desde un orbital molecular fundamental a un orbital excitado.12
La Figura 2.11 muestra un esquema de las partes que componen un espectrofotómetro
Ultravioleta-Visible.
Figura 2.11. Esquema de un espectrofotómetro Ultravioleta-Visible.
Técnicas y Métodos Experimentales
107
El espectro ultravioleta de una molécula poliatómica está compuesto de un gran número
de subniveles próximos y sólo se observarían bandas de absorción anchas, o una banda
envolvente. En los espectros de sustancias líquidas o disoluciones, es muy apreciable la
pérdida de las estructuras vibracional y rotacional, debido a la solvatación y a las
interacciones con las moléculas vecinas.
Tras la absorción electrónica, la molécula excitada puede volver a su estado
fundamental devolviendo el exceso de energía en forma de calor, o como radiación
fluorescente a longitudes de onda más altas.
En general, hay tres tipos de electrones de valencia en moléculas:3
1) Electrones σ: son aquéllos que forman enlaces sencillos. Las funciones características
y las densidades de carga tienen simetría de rotación con respecto al eje de valencia.
2) Electrones π: son aquellos electrones que forman dobles enlaces, con funciones
características y densidades de carga con un plano nodal de oscilación en su eje de
valencia. En sistemas no saturados, estos electrones determinan fundamentalmente los
estados de energía de los recubrimientos electrónicos, excitables por la absorción de la
luz visible o ultravioleta.
3) Electrones n: son aquellos electrones no compartidos o no enlazantes en moléculas
que contienen átomos como N, O, etc.
Mientras que la interacción de los electrones σ con los electrones π se puede
despreciar, la interacción existente entre los electrones n-π y π-π es considerable. Los
electrones no enlazantes (n) están unidos más débilmente a los electrones de enlace. Entre
éstos últimos destacamos los electrones σ que forman enlaces más fuertes que los
electrones π, mientras que en los niveles antienlazantes, el nivel σ* tiene una energía
superior al nivel π*.
Capítulo 2
108
Estos electrones diferentes dan lugar a distintas transiciones que se observan en los
espectros Ultravioleta-Visible (Fig. 2.12).
La energía requerida para que se produzca una transición de un orbital molecular
ocupado de mayor energía, HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital), a un orbital
molecular no ocupado de menor energía, LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital)
es menor que la energía requerida partiendo de un orbital ocupado de menor energía.16
Por
ejemplo, la energía requerida para llevar a cabo una transición es menor que la
necesaria para realizar una transición (Fig. 2.12).
Figura 2.12. Niveles electrónicos de energía de una molécula y transiciones electrónicas posibles entre ellos.
Un primer tipo de transiciones son aquéllas en las que un electrón pasa de un estado
fundamental a un orbital antienlazante, por ejemplo, las transiciones y . En
concreto, las transiciones sólo se observan en la región del ultravioleta lejano (200 -
122 nm), mientras que las transiciones se observan principalmente en la región del
ultravioleta cercano (400 – 300 nm), desplazándose hacia longitudes de onda mayores, por
una sustitución apropiada en la molécula.
Técnicas y Métodos Experimentales
109
El segundo tipo de transición supone el paso del electrón desde un orbital deslocalizado
no enlazante a un orbital antienlazante, siendo estas transiciones más débiles que las
anteriores. Las transiciones de este tipo son las , que se encuentran normalmente en la
región del ultravioleta lejano o cercano, y las , que aparecen siempre a longitudes de
onda ligeramente superiores, en el ultravioleta cercano o visible.
Finalmente, el tercer tipo de transiciones son aquéllas que ocurren desde un estado
fundamental a otro nivel de muy alta energía, próximo o incluso superior a la energía de
ionización de la molécula. Estas transiciones ocurren en la región ultravioleta de vacío y
reciben el nombre de transiciones Rydberg.17
Estas transiciones no se muestran en la Fig. 2.12
porque no son de interés en este trabajo.
Se denominan cromóforos12, 16
a los grupos funcionales orgánicos que absorben en las
regiones ultravioleta o visible, y suelen ser a menudo grupos con dobles enlaces aislados. La
sustitución o los cambios estructurales en los compuestos orgánicos producen cambios en la
intensidad y en la longitud de onda de las bandas de absorción. Además, la conjugación entre
dos o más cromóforos tiende a causar desviaciones de los máximos a longitudes de onda
mayores.12
Los cambios de absorción hacia la zona del espectro del rojo, o hacia longitudes de
onda mayores (también energía) se denominan batocrómicos, mientras que en el sentido
opuesto, es decir, hacia la zona azul del espectro o hacia longitudes de onda menores, se
encuentran los hipsocrómicos.
Por otro lado, el incremento de intensidad de una banda se denomina efecto
hipercrómico, mientras que la disminución de la intensidad de una banda se conoce como
efecto hipocrómico. Estos efectos varían según el grupo sustituyente de la molécula.
Capítulo 2
110
También existen los grupos auxóforos que son aquéllos que no absorben por sí mismos,
pero si se encuentran conjugados con grupos cromóforos producen desplazamiento
batocrómico y un efecto hipercrómico debido a efectos inductivos o resonantes. Además,
poseen al menos un par de electrones n que interaccionan para reducir la energía del orbital π*
del cromóforo. Ejemplos de estos grupos son: -OH, -Br y -NH2.
El carácter estructural y la posición de las bandas de absorción dependen de la
naturaleza del disolvente. Varios son los criterios para la elección de un buen disolvente,16
pero principalmente está determinado por el sistema objeto de estudio y la aplicación que se
desea desarrollar.
El primer criterio que se ha de tener en cuenta es que el disolvente y la muestra que se
va a analizar no absorban en la misma región Ultravioleta-Visible del espectro.
Un segundo criterio para un buen disolvente es el efecto de la estructura fina de la banda
de absorción. La Fig. 2.13 muestra el efecto polar/apolar del disolvente sobre la banda de
absorción del fenol.18
Un disolvente apolar (como el isooctano) no forma enlace de hidrógeno
con el soluto, produciendo cambios pequeños en las bandas de absorción, por lo que el
espectro se aproxima al obtenido en estado gaseoso, en el que se puede observar la estructura
fina.16
Sin embargo, si se emplea un disolvente polar (como el etanol) se forma enlace de
hidrógeno en el complejo soluto-disolvente, y la estructura fina desaparece.
Técnicas y Métodos Experimentales
111
Figura 2.13. Espectro de absorción Ultravioleta-Visible del fenol en etanol (línea discontinua) e
isooctano (línea continua).18
Un tercer criterio para escoger un buen disolvente es la habilidad para mover la longitud
de onda dependiendo de la estabilidad del estado fundamental o excitado.16
En el caso de
disolventes polares, éstos no forman enlace de hidrógeno tan fácilmente con moléculas
polares en estado excitado que si se encontraran en estado fundamental. Por tanto, las
transiciones se producen a menores longitudes de onda (Tabla 2.1).
Por otra parte, en algunos casos los estados excitados podrían formar enlaces de
hidrógeno más fuertemente que los estados fundamentales. En este caso, un disolvente polar
desplaza la longitud de onda de absorción a valores mayores, ya que la energía de las
transiciones electrónicas disminuye. Para disolventes polares, la longitud de onda de la
transición se desplaza a valores mayores.
Capítulo 2
112
Tabla 2.1. Desplazamiento de la banda de absorción correspondiente a la transición
Transición electrónica
Disolvente H2O CH3OH C2H5OH CHCl3 C6H14
λmáx (nm) 264.5 270 272 277 279
El espectrofotómetro utilizado en las experiencias realizadas es un Jasco V-670, con un
software de análisis incorporado, Spectra Manager. El barrido de longitud de onda se realiza
desde 1300 hasta 300 nm, a una velocidad de 400 nm/min, con toma de datos a intervalos de
1.0 nm. El equipo realiza el cambio automático entre la lámpara halógena y la de deuterio, en
la región de transición del rango Visible al Ultravioleta.12
También se emplea la variante de
muestreo en tiempo real a una longitud de onda predeterminada.
Técnicas y Métodos Experimentales
113
2.2.2.1. Espectroscopía Ultravioleta-Visible in situ
Como en el caso de las técnicas espectroscópicas descritas anteriormente, es posible
acoplar al espectrofotómetro un dispositivo electroquímico con el fin de controlar las
condiciones de la interfase electrodo-disolución durante el proceso de análisis. Se ha utilizado
el mismo instrumento de espectroscopía que en la sección previa, un JASCO V-670, y a éste
se le ha acoplado un sistema electroquímico que consta de un potenciostato, un generador de
señal y un registrador, todo ello incorporado en un mismo dispositivo. Se ha empleado un
bipotenciostato/galvanostato pequeño y portátil modelo μStat 400 DropSens habilitado con un
software de adquisición de datos DropView.
Figura 2.14. Cubeta de cuarzo para espectroscopía Ultravioleta-Visible y tapa de teflón adaptada para incorporar
los electrodos de trabajo, contraelectrodo y referencia.
A la vista de la Fig. 2.14 se encuentra la cubeta de cuarzo empleada para la realización
de los experimentos Ultravioleta-Visible in situ. En su parte superior, la cubeta está provista
de una tapa de teflón con diversos orificios para incorporar de manera adecuada los diferentes
electrodos. Resulta necesario adaptar el tamaño y la forma de los electrodos a las dimensiones
Capítulo 2
114
de la cubeta. Como electrodo de trabajo (W) se utiliza un electrodo que sea transparente, por
ejemplo, los óxidos de estaño dopado con indio (ITO, Indium Tin Oxide). Los electrodos de
ITO imponen algunas restricciones debido a la labilización de la capa del óxido en
determinadas condiciones.9 Por este motivo, es conveniente no bajar de potenciales muy
negativos en la escala NHE así como evitar electrolitos que contengan cloruros. El
contraelectrodo (C) empleado es un hilo de Pt y como electrodo de referencia (R) se ha
utilizado un hilo de Ag como pseudo referencia. La disolución se ha desoxigenado
burbujeando gas Ar mediante un capilar durante 5-10 minutos y durante el transcurso del
experimento se burbujea la atmósfera con el mismo gas.
La realización de un experimento Ultravioleta-Visible in situ comienza situando el
electrodo ITO dentro de la cubeta. A continuación, se aplica un potencial inicial (E1) sobre el
electrodo de trabajo y tras unos minutos de estabilización (el valor de la intensidad no cambia
con el tiempo), se registra el espectro Ultravioleta-Visible adquirido aplicando el valor de
potencial E1. Seguidamente, mediante salto potenciostático, se aplica un segundo potencial
(E2) distinto al primero y de mayor o menor valor absoluto, y tras un tiempo de estabilización
se registra un segundo espectro UV-Visible adquirido con el valor de potencial E2. De esta
forma, se van registrando espectros a lo largo del tiempo.
Técnicas y Métodos Experimentales
115
2.2.3. Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos X (XPS)
Esta técnica se incluye en la familia de técnicas de espectroscopía fotoelectrónica. En
ella se excita la muestra mediante un haz de rayos-X hasta el punto de arrancar electrones de
niveles internos de los átomos más superficiales. La energía cinética que lleva cada electrón
es leída en el detector y está relacionada con el tipo de átomo y su entorno químico, que es lo
que determina en definitiva el nivel energético de las capas internas de las que surge dicho
electrón. Los electrones analizados son los que abandonan la muestra sin sufrir choques
inelásticos, es decir, sin pérdida de energía. Para un haz incidente con una energía de 1 keV,
que es la obtenida en esta técnica, el recorrido libre promedio de un electrón arrancado se
encuentra entre 30-50 Å.9
Esta técnica es capaz de obtener la composición química superficial hasta 3 nm de
profundidad.
La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X se utiliza de forma frecuente para el
análisis y la caracterización superficial. Es posible saber la composición química superficial
de un material y, el estado de oxidación. Para un determinado átomo se pueden encontrar
distintas energías para los diferentes electrones en capas internas o en capas de valencia. Las
energías de ligadura dependen tanto del átomo de procedencia como del estado de valencia
del átomo en cuestión, por lo que, mediante esta técnica podemos obtener tanto información
de la composición elemental como del estado químico de la superficie. Como norma general
cabe indicar que la energía de ligadura aumenta al aumentar el estado de oxidación del átomo.
El sistema experimental está formado además de por la fuente de rayos X y un
analizador de energía de electrones, por una cámara donde hacer alto vacío y su
correspondiente sistema de bombeo, un sistema de introducción y manipulación de muestras,
Capítulo 2
116
un sistema de detección de electrones y un sistema informático que se encarga de controlar el
espectrómetro y de procesar los datos adquiridos. Es necesario trabajar en alto vacío para
facilitar que los electrones alcancen el analizador sin que colisionen con moléculas gaseosas
residuales, en nuestro caso se ha trabajado a una presión de 5·10-7
N·m-2
.
Los espectros XPS han sido obtenidos con un espectrómetro de electrones VG-
Microtech Multilab 3000, equipado con una fuente de rayos X de Mg Kα de 1253,6 eV. Los
rayos X son generados bombardeando un ánodo con electrones de alta energía procedentes de
un filamento calentado. La emisión generada está compuesta por diferentes líneas, resultado
de las diferentes transiciones electrónicas que pueden sufrir los niveles electrónicos, aunque la
más intensa es la Kα1,2, aunque también existen otras como la Kα3 y Kα4 de menor energía.
A la hora de analizar los espectros se tomó como patrón la energía de ligadura del pico de
carbono 1s a 284,6 eV. La precisión de los valores de energía de ligadura es de ± 0,2 eV. Los
valores de energía de ligadura se obtuvieron mediante un ajuste de los datos experimentales,
donde los picos se deconvolucionaron con funciones mixtas lorentziana-gaussiana (pseudo-
Voigt) en una proporción 30-70 % respectivamente, después de haber eliminado la línea base
en forma de S.
El equipo utilizado para esta técnica se encuentra en los Servicios Técnicos de
Investigación de la Universidad de Alicante.
Técnicas y Métodos Experimentales
117
2.3. Métodos Experimentales
2.3.1. Procedimiento de limpieza de células
Antes de empezar a trabajar en voltametría cíclica y cronoamperometría es necesario
realizar un tratamiento de limpieza al material de vidrio que se vaya a utilizar, tanto las celdas
electroquímicas como sus complementos. De esta forma aseguraremos unos resultados
reproducibles.
Una de las formas más sencillas es introducir todo el material de vidrio en una
disolución ácida de permanganato potásico concentrado (~ 0.1 M KMnO4 + ~ 0.1 M H2SO4 ,
98 %) durante 10-12 horas. El permanganato potásico actúa de agente oxidante, eliminando la
materia orgánica que pueda existir en las paredes de la celda y sus complementos. Tras este
tiempo, se retira la disolución ácida de permanganato y se enjuaga el material de vidrio con
una disolución ácida de peróxido de hidrógeno (1 M H2O2 + 94 mM H2SO4 , 98 %), que se
encarga de reducir los restos de permanganato a Mn(II) que quedan en disolución. Tras este
proceso, se procede a enjuagar y hervir el material (4 o 5 veces) usando abundante agua
ultrapura, cuyo valor de resistividad es de 18.2 MΩ·cm, de un sistema Elga Labwater
Purelab.
2.3.2. Tratamiento de limpieza de electrodos
Tanto en las experiencias de voltametría cíclica como IR in situ, se realizó un
tratamiento térmico del electrodo de platino policristalino con el fin de obtener una superficie
limpia y reproducible. Este tratamiento, propuesto por J. Clavilier19, 20
y col. para electrodos
monocristalinos de platino consiste en calentar el electrodo de platino en una llama de
propano/aire durante unos segundos (hasta que se observe un color rojo candente del metal
Capítulo 2
118
caliente) a una temperatura cercana a los 1300 ºC, dejarlo enfriar luego hasta unos 300 ºC al
aire para luego protegerlo de la atmósfera cubriéndolo con una gota de agua ultrapura.3 Los
electrodos de oro se limpiaron de igual forma pero controlando la temperatura de la llama.
Con el fin de obtener una superficie especular de los discos metálicos,9 se ha sometido a
estos electrodos a un proceso de pulido. Primero, se llevó a cabo un pulido mecánico
utilizando una pulidora mecánica (METASERV 2000 Grinder polisher) con papel de lija. Con
este paso se lograba una superficie plana. En segundo lugar, se lleva a cabo un proceso de
pulido más fino que consiste en el uso de suspensiones de alúmina (marca comercial
BUEHLER) de tamaño de partícula progresivamente más pequeño. Es habitual comenzar con
suspensiones de tamaño de grano de 1.0 micras, y posteriormente seguir refinando con
tamaños inferiores de 0.5 y 0.3 micras, respectivamente. Finalmente, se realizó un tratamiento
térmico de los electrodos de disco con el fin de obtener una superficie limpia y ordenada. Para
el electrodo de disco de platino, se realizó el mismo procedimiento que el descrito
anteriormente para el electrodo policristalino de platino, en el que se calienta el electrodo
hasta el rojo incandescente y luego se cubre de la atmósfera protegiéndolo con una gota de
agua ultrapura.19, 20
Para el electrodo de oro, sin embargo, se procede a un calentamiento más suave sin
llegar al punto del rojo incandescente.
2.3.3. Pretratamiento de electrodos de ITO
Estos electrodos han sido previamente cortados en un tamaño determinado y
suministrados por Delta Technologies.
Técnicas y Métodos Experimentales
119
Antes de llevar a cabo estas medidas estos electrodos se han sometido a un
pretratamiento de limpieza que consta de dos etapas. En la primera, se sumergen los
electrodos de ITO durante 30 minutos en acetona con el fin de eliminar los restos orgánicos
que hayan quedado adheridos a la superficie, mientras que en la segunda etapa los electrodos
se sumergen en agua ultrapura (18.2 MΩ cm de resistividad) y se realizan varios lavados en
baño ultrasonidos (durante 30 minutos) con el objetivo de eliminar los restos de acetona.
2.3.4. Disoluciones, reactivos y electrodos
El agua empleada en la preparación de las disoluciones y durante la realización de los
experimentos se obtuvo de un sistema Elga Labwater Purelab Ultra con una resistividad de
18.2 MΩ·cm a una temperatura de 25 ºC. Como electrolitos soporte se utilizaron
combinaciones de dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4, 99.5 %) e hidrógeno fosfato de
dipotasio K2HPO4, 99.8 %) para la disolución tamponada a pH 7 (PBS), reactivos
suministrados por Merck y Sigma-Aldrich, respectivamente. La disolución de ácido perclórico
(HClO4, 60 %) suministrada por VWR Chemicals fue utilizada para cargar la malla de Pd de
H2 para su función como RHE.
Para la limpieza del material de vidrio se utilizó permanganato potásico (KMnO4, 99 %)
como agente oxidante y disolución de ácido sulfúrico (H2SO4, 98 %), ambos suministrados
por VWR Chemicals. Además, para eliminar los restos de permanganato (MnO4-) se utilizó
disolución de peróxido de hidrógeno (H2O2, 30 %) proporcionada por VWR Chemicals.
Los reactivos utilizados en la polimerización de poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT)
fueron: el monómero 3,4-etilendioxitiofeno (EDOT, 97 %) que se disolvió posteriormente en
una dispersión de poliestirensulfonato de sodio (PSSNa), ambos suministrados por Sigma-
Aldrich.
Capítulo 2
120
Los reactivos necesarios para la preparación del sol empleado en la encapsulación de la
proteína citocromo c han sido tetraetoxisilano (TEOS, 98 %), metil-trietoxisilano (MTES,
99 %), ambos suministrados por Sigma-Aldrich y la disolución de ácido clorhídrico (HCl,
37 %) suministrada por VWR Chemicals.
La Tabla 2.2 muestra un esquema-resumen de los distintos electrodos empleados en esta
tesis, especificando qué tipo de electrodo se utilizó para una determinada técnica y en qué
capítulo de resultados se incluyen.
Las disoluciones de trabajo se desoxigenaron antes del comienzo de las experiencias
burbujeando, durante aproximadamente 20 minutos con gas nitrógeno (99.999 %)
suministrado por Air Liquide. En el caso de la espectroscopía IR in situ la célula
electroquímica se burbujeó durante 20-30 minutos con gas Ar (99.999 %), suministrado
también por Air Liquide. Por otro lado, para el electrodo reversible de hidrógeno (RHE) se
burbujeó gas hidrógeno (99.999 %), suministrado por Air Liquide.
Técnicas y Métodos Experimentales
121
Tabla 2.2. Esquema-resumen de los electrodos utilizados en cada capítulo y para cada una de las técnicas experimentales empleadas.
Capítulo de Resultados
Técnica experimental Electrodos
3
Voltametría cíclica. Polimerización electroquímica de EDOT/PSS
W Electrodo esférico policristalino de Au
R Hilo de Ag (pseudo referencia)
C Hilo de Pt enrollado en espiral
Voltametría cíclica. Caracterización electroquímica en PBS (pH 7)
W Electrodo esférico policristalino de Au
R Hilo de Pt enrollado sobre el que se burbujea H2 (RHE)
C Hilo de Pt enrollado en espiral
Voltametría cíclica. Caracterización electroquímica en cyt c-
PBS (pH7)
W Electrodo esférico policristalino de Au
R Hilo de Ag
C Hilo de Pt
Espectroscopía Infrarroja in situ
W Electrodo disco policristalino de Au
R Malla de Pd enrollada absorbida con H (RHE)
C Anillo de Pt
4
Voltametría cíclica. Caracterización electroquímica en PBS (pH 7)
W Electrodo de ITO
R Hilo de Pt enrollado sobre el que se burbujea H2 (RHE)
C Hilo de Pt enrollado en espiral
Capítulo 2
122
Voltametría cíclica. Polimerización electroquímica de EDOT/PSS
W Electrodo de ITO
R Hilo de Ag (pseudo referencia)
4
C Hilo de Pt enrollado en espiral
Espectroscopía Ultravioleta-Visible in situ
W Electrodo de ITO
R Hilo de Ag
C Hilo de Pt
5
Voltametría cíclica. Caracterización electroquímica en PBS (pH 7)
W Electrodo de ITO
R Ag/AgCl saturado 3M KCl
C Hilo de Pt enrollado en espiral
Voltametría cíclica. Polimerización electroquímica de EDOT/PSS
W Electrodo de ITO
R Hilo de Ag
C Hilo de Pt enrollado en espiral
Cronoamperometría. Detección de H2O2
W Electrodo de ITO
R Ag/AgCl saturado 3M KCl
C Hilo de Pt enrollado en espiral
Anexo
Microscopía electrónica de barrido (SEM) Electrodo disco policristalino de Au
Microscopía electrónica de barrido (SEM) y de barrido de emisión de campo (FESEM)
Electrodo de ITO
Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos X (XPS) Electrodo de ITO
Técnicas y Métodos Experimentales
123
2.4. Referencias bibliográficas
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126
III
129
Capítulo 3
3. Direct electron transfer to cytochrome c
induced by a conducting polymer
130
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
131
3.1. Introduction
The direct electron transfer (DET) from conducting materials to redox proteins
has been examined extensively for years due to its fundamental interest in biochemistry
mechanistic studies.1, 2
Nowadays, this charge transfer process is a central issue in the
development of nanobiotechnological devices, such as biosensors for health monitoring
or enzymatic fuel cells.3-6
Among redox proteins, cytochrome c (cyt c) is probably one of the most
extensively explored compound due to its key role in the respiratory chain.7-13
Cyt c is a
water soluble heme protein, with spherical shape and near 3 nm in diameter, which has
the function of accepting electrons from cyt c reductase and delivering them to cyt c
oxidase in the mitochondrial inner-membrane.14
Intensive research has shown it is not
easy to achieve DET to cyt c at solid electrode surfaces, since the redox-active heme
centre is wrapped by the peptide chain and protected from the solvent.15, 16
It is known
that Cyt c adsorbs strongly on conventional metal electrodes like Pt, Hg, Au or Ag17
and
conformational changes suffered by the protein (unfolding and/or denaturation) lead to
slow electron-transfer kinetics.18, 19
This difficulty has been overcome by using
electrode modifiers such as metal oxides, advanced carbon materials, DNA or lipid
membranes.20-26
In particular, the modification of surfaces with organic thin films like
self-assembled monolayers (SAM), has been extensively used to manipulate the
electrode surface, promoting the appropriate orientation of the protein and thus
enhancing its electroactivity.27-36
Conducting polymers prepared by electrochemical methods constitute a class of
organic modifiers that offer high versatility in several biotechnological applications of
Chapter 3
132
proteins. These materials have been used as enzyme immobilizers, DNA biosensors,
electronic transducers in biosensors or drug delivery systems among others.37-39
Due to
its adaptability and ease of preparation, conducting polymers have been also used as
promoters of DET to several redox proteins and, particularly, to cyt c. Polyaniline
(PANI) is, probably, the most studied synthetic conducting material, but the lack of
electrical conductivity observed at neutral pH hampers its use in biological systems.
Self-doped polyanilines could be adopted for this application but due to their low
activity for DET reactions, they were mainly used as protein entrappers in combination
with carbon materials.40-42
Similar application can be found for pyrrole and thiophene-
based conducting polymers despite they seemed more adequate than PANI since both
are electroactive at physiological pH. In most cases, polypyrrole and polythiophene
films serve merely as the matrix to embed nanostructures (gold nanoparticles, carbon
nanotubes, graphene, etc.) that are employed for DET to proteins in sensor
applications.43-46
Little number of fundamental studies based exclusively on conducting
polymers (i.e. in the absence of other promoters) can be found in relation to the direct
electron transfer to proteins.
Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) doped with poly-styrene sulfonate (PEDOT-
PSS) is one of the most successful conducting polymers in terms of practical
applications. Its ability to form thin and homogeneous films, optical transparency in the
visible light region, high electrical conductivity and good physical and chemical
stability in air, made this polymer very common in a wide range of applications.47
PEDOT-PSS can be electrodeposited on suitable electrodes from aqueous solution
containing EDOT monomer. The solubility in water of EDOT is rather low but the
addition of PSS acting as surfactant and doping agent solves the problem.48
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
133
The present paper explores the modification of metal electrode with PEDOT-PSS
prepared by electrochemical methods from aqueous solutions and its use to the study of
the direct electron transfer of cyt c. The combination of vibrational spectroscopy and
electrochemistry experiments allow to gain information on the molecular processes
involved during the doping of PEDOT-PSS. The ability of PEDOT-PSS to induce a
proper orientation of the protein for DET was explored by the spectroelectrochemical
technique.
Chapter 3
134
3.2. Experimental section
Cytochrome c (cyt c) from horse heart (98%), 3,4-ethylendioxythiophene (EDOT)
(97%), poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) and deuterium oxide (99.9 atom % D)
were purchased from Sigma-Aldrich, whereas potassium dihydrogen phosphate and
dipotassium hydrogen phosphate were from Merck. All the reagents were of analytical
grade. The solutions were prepared with ultrapure water obtained from an Elga
Labwater Purelab system (18.2 MΩ cm).
The phosphate buffer solution (PBS, pH 7) was a mixture 0.15 M K2HPO4 + 0.10
M KH2PO4. EDOT electropolymerization was carried out in aqueous medium prepared
by dissolving 1.46 g PSS in 10.0 mL ultrapure water, 50 μL EDOT monomer were then
added and the resulting solution was stirred in an ultrasonic bath during 30 minutes. The
composition of the final mixture for electropolymerization was 0.15 % (w/w) PSS and
47 mM EDOT monomer.
Cyclic voltammetry experiments were carried out using a Wenking ST 72
Potentiostat from Bank Elektronik, a wave programmer from EG&G PARC and an
eDAQ-410 digital recorder equipped with eDAQ-EChart data acquisition software. The
electrochemical cells were purged by bubbling N2 for 20 min, and the inert atmosphere
was maintained during all the experiments. All the potentials were measured against a
reversible hydrogen electrode (RHE) immersed in the same electrolyte and are
presented in that scale. A platinum wire was used as the counter electrode and a 0.080
cm2 polycrystalline gold sphere as the working electrode.
X-ray photoelectron spectroscopy (XPS, K-ALPHA, Thermo Scientific) was used
to analyse the sample surface. All spectra were collected using Al-K radiation (1486.6
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
135
eV), monochromatized by a twin crystal monochromator, yielding a focused X-ray spot
(elliptical in shape with a major axis length of 400 µm) at 3 mA x 12 kV. The alpha
hemispherical analyser was operated in the constant energy mode with survey scan pass
energies of 200 eV to measure the whole energy band and 50 eV in a narrow scan to
selectively measure individual elements. XPS data were analysed with Avantage
software. A smart background function was used to approximate the experimental
backgrounds and surface elemental composition was calculated from background-
subtracted peak areas. Charge compensation was achieved with the system flood gun
that provides low energy electrons and low energy argon ions from a single source. The
experimental curves were adjusted using a combination of Lorentz (30 %) and Gaussian
(70 %) functions.
In situ FT-IR spectroscopy was performed in a Nicolet Thermo 5700 spectrometer
equipped with a liquid nitrogen-cooled mercury-cadmium telluride, MCT, detector. The
three-electrode spectroelectrochemical cell was equipped with a prismatic CaF2 window
bevelled at 60 °. The working solution was bubbled with Ar flow for 20 min and the
inert atmosphere was maintained during all the experiments. The counter electrode was
a gold ring and a reversible hydrogen electrode (RHE) was used as the reference one.
The working electrode was a mirror-polished gold disc. In situ FTIR spectra were
collected in the external reflection-absorption mode at 8 cm-1
resolution. Typically, 100
to 500 interferograms were processed with OMNIC data acquisition software to obtain
both the background and the sample spectrum.
Chapter 3
136
3.3. Results and discussion
3.3.1. Electrochemical synthesis of PEDOT-PSS
Fig. 3.1 shows the electrochemical oxidation of EDOT on a gold substrate in
aqueous solution containing PSS.
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0
80
160
240
320
400
j / A
cm
-2
E / V vs RHE
a
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
-100
-50
0
50
100
150
200
250
j / A
cm
-2
E / V vs RHE
b
Figure 3.1. Cyclic voltammograms recorded during the potentiodynamic growth of a PEDOT-PSS film
on a gold electrode from an aqueous solution containing 47 mM EDOT + 0.15 % PSS aqueous solution.
Scan rate: 100 mV s-1
. (a) First cycle. (b) Successive potential cycles.
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
137
The first potential cycle is presented in Fig. 3.1.a, where a featureless
voltammetric profile is recorded until a potential value above 1.45 V is reached. This
point corresponds to the onset of EDOT monomer oxidation and, consequently, to the
formation of PEDOT. The inversion potential was set at 1.6 V in order to obtain a
suitable growth rate of polymeric material. On subsequent potential scans (see Fig.
3.1.b), it is observed the presence of a current plateau in the potential region between
0.6 V and 1.4 V, showing capacitive character and increasing voltammetric charge. This
feature is assigned to the growth of PEDOT-PSS on the electrode surface. The charge of
the capacitive current can be related with the mass of PEDOT-PSS deposited on the
gold surface. This has been done by taking a double layer capacitance of 67.7 F g-1
for
this material, as it was determined by Bobacka and coworkers.49
Therefore, in this case,
cyclic scanning of the potential provides a unique tool to in situ monitor the amount of
deposited polymer.
The chemical composition of the deposited layer was determined by means of
XPS spectroscopy. Fig. 3.2 shows the photoelectronic spectrum of the S 2p region for a
PEDOT-PSS film. The presence of two major bands corresponding to different sulphur
species with different oxidation states is clearly observed. Both signals can be
deconvoluted into two contributions, showing a characteristic separation between the
2p3/2 and 2p1/2 spin-split doublets of 1.18 eV. The low energy signal, with a S 2p3/2
contribution peaking at 163.8 eV, is assigned to sulphur atoms located at thiophene
rings in EDOT monomers.50
On the other hand, the S 2p3/2 contribution to the higher
binding energy signal (167.9 eV) is attributed to sulphur in a higher oxidation state and,
consequently, corresponds to those sulfonate groups contained in the PSS dopant
Chapter 3
138
anion.51
The analysis of both S 2p signals shows that the sulfonate/thiophene ratio in
electrodeposited PEDOT-PSS films is closed to 3.5.
160162164166168170172
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000C
ounts
/a.u
.
Binding Energy / eV
Figure 3.2. High resolution XPS signal for S 2p obtained from a PEDOT-PSS film electrodeposited on a
gold substrate.
3.3.2. Electrochemical characterization of the direct
electron transfer between cyt c and PEDOT-PSS
It is known that cyt c molecules in bulk solution do not transfer charge
significantly to metal electrodes. In fact, Fig. 3.3 shows the steady state cyclic
voltammogram of a bare gold electrode immersed in 5 mg mL-1
cyt c solution, where no
redox features showing electrochemical activity of this macromolecule can be
distinguished (dotted line in Fig. 3.3). On the contrary, a PEDOT-PSS film shows a
clear-cut ability to serve as an active substrate for cyt c oxidation. The oxidation of
ferrocytochrome c to ferricytochrome c occurs under the anodic peak centred at 0.67 V
and the reduction counter process appears as a cathodic feature peaking at 0.61 V (see
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
139
solid line). If no cyt c is added to the working solution, a PEDOT-PSS film of the same
thickness shows only capacitative current in the potential region comprised between 0.4
V and 1.0 V (dashed curve).
0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
-100
-50
0
50
100
150
j /
A c
m-2
E / V vs RHE
Figure 3.3. Steady state cyclic voltammograms recorded for bare gold (dotted line) and 0.11 µm PEDOT-
PSS/gold (solid line) electrodes in PBS solution containing 5 mg mL-1
cyt c. Dashed line is de CV for a
0.11 µm layer of PEDOT-PSS on gold in PBS, pH 7, with no cyt c added. Scan rate 100 mV s-1
in all
cases.
3.3.2.1. Effect of cyt c concentration.
The redox current recorded from the electron transfer process of cyt c at PEDOT-
modified electrodes was studied using different protein concentrations. Fig. 3.4.a shows
stabilized cyclic voltammograms of PEDOT-PSS (0.04 μm) deposited on a gold
electrode at different concentrations of cyt c in PBS solution. The redox current related
to the cyt c faradaic process increases proportionally to the concentration of protein in
PBS solution. Fig. 3.4.b shows the change in current density for electrodes modified
Chapter 3
140
with increasing thickness of the PEDOT-PSS layer (0.04-0.70 μm). It is noticeable, on
the one hand, the existence of a linear trend between the cyt c redox current and the
amount of protein dissolved in PBS medium. On the other, the measured current looks
almost independent on the amount of electrodeposited polymer but highly subordinated
to the protein concentration, with a sensitivity value close to 0.16 A cm-2
M-1
.
0 2 4 6 8 100
20
40
60
80
100
120
140
j /
A c
m-2
cyt c / mg mL-1
b
Figure 3.4. (a) Stabilized cyclic voltammograms for a PEDOT (0.04 μm)-modified gold electrode in PBS
solution at increasing cyt c concentration (1, 2, 5, 10 mg mL-1
). Scan rate: 100 mV/s. (b) Plot of current
density against concentration for the redox processes of cyt c at different PEDOT-modified electrodes in
PBS solution.
3.3.2.2. Effect of PEDOT thickness.
Once the ability of PEDOT to transfer charge to cyt c has been established, the
effect of polymer thickness on the electrochemical process will be analysed in depth.
Fig. 3.5 shows steady-state cyclic voltammograms recorded in the same 5 mg mL-1
cyt c
solution for gold electrodes modified with PEDOT-PSS films of increasing thickness.
All the voltammetric curves show the characteristic pair of redox peaks accompanying
the reversible electrochemical oxidation of the protein iron centre. Such evidence opens
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
141
the question of finding out the most suitable PEDOT thickness or, in other words, the
deposit showing better electrochemical kinetics.
0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0-600
-400
-200
0
200
400e
d
cb
j/
A c
m-2
E/ V vs RHE
a
Figure 3.5. Steady state cyclic voltammograms recorded in PBS containing 5 mg mL-1
cyt c. The
electrode was a gold substrate covered with PEDOT films of increasing thickness: (a) 0.02, (b) 0.09,
(c) 0.18, (d) 0.36 and (e) 0.71 µm. Scan rate 100 mV s-1
.
To achieve this, an analysis of voltammetric peak currents and peak separations as
a function of the polymer thickness was carried out. Fig. 3.6.a shows the peak-to-peak
separation of the redox process and, as observed, there is a minor effect of polymer
thickness on cyt c electron transfer kinetics. Ep recorded at extremely thin PEDOT-
PSS films (< 40 nm) show a marked irreversibility, but peak separation stays between
60 and 65 mV in most cases, which represents a quasireversible process. Consequently,
the electrochemical reversibility of the cyt c electron transfer seems not significantly
affected when occurring at PEDOT films with thickness between 0.04 and 0.7 μm.
From the results presented in Fig. 3.6, an average heterogeneous transfer rate constant,
kº, for the electrochemical reaction can be determined by means of Nicholson’s
Chapter 3
142
method.52
The kº value amounts to 0.049 cm s-1
, as obtained from the average value of
peak separation between 0.04 and 0.7 μm (ΔEp = 62 mV, SD 2 mV). This number
indicates that the electron transfer reaction is faster through the PEDOT-PSS modified
electrode than for other widely used electrodes such as ITO, carbon materials or
chemically-modified gold substrates, for which typical values in the order of 10-3
-10-4
cm s-1
are reported.24, 53-56
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.755
60
65
70
75
80
85
90
Pe
ak s
ep
ara
tio
n (
Ep)
/ m
V
Polymer thickness / m
a
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70
20
40
60
80
j /
A c
m-2
Polymer thickness / m
b
Figure 3.6. Effect of PEDOT layer thickness on: (a) separation between redox peaks, and (b). cyt c redox
anodic peak current density. Working solution: cyt c (5 mg mL-1
) in PBS, pH 7.
The plot in Fig. 3.6.b shows how the recorded current density of the anodic redox
peak is almost zero in the absence of deposited polymer but it rises significantly in the
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
143
presence of thin PEDOT-PSS films. In fact, it seems that the current density decreases
for deposits thicker than 0.1 μm. It is believed that thicker films show a non-uniform
vertical conductivity, which could be at the origin of the observed effect. In this context,
it is worth mentioning that the existence of a vertical conductivity gradient at PEDOT-
PSS inserted within a SiO2 matrix was already suggested in previous works.48
As
expected, the redox current involved in the redox process increases proportionally to the
concentration of protein in PBS but, remarkably, the measured current does not depend
on the amount of electrodeposited polymer (see Fig.3.4).
Chapter 3
144
3.3.3. In situ FTIR study on the direct electron transfer
between cyt c and PEDOT
Several conducting polymers such as those obtained from aniline, pyrrole and
their monomer derivatives show interesting redox properties that can be characterized at
molecular level by the so-called electrochemical in situ spectroscopies. Among them, in
situ FTIR spectroscopy constitutes a unique tool to monitor the effect of the applied
potential on the vibrational features of polymer redox active centres. Chemically
reversible redox transitions in conducting polymers usually involve interconversion of
functional groups and, consequently, significant absorption changes in the infrared
region of the electromagnetic spectra. PEDOT-PSS is, nevertheless, one of the widely
used, less studied conducting polymers by in situ FTIR spectroscopy. Just a few
contributions devoted to the analysis of the effect of the applied potential on the
absorption spectrum can be found in the literature.57-59
In situ FTIR spectroscopy will be
used in the present work to gain insight on fundamental aspects of the direct electron
transfer occurring between cyt c and PEDOT-PSS. Accordingly, it is firstly required a
vibrational characterization of PEDOT-PSS redox transitions in the absence of cyt c.
Fig. 3.7.a shows a set of in situ FTIR spectra obtained in PBS for a gold electrode
covered with an electrodeposited 0.04 μm PEDOT-PSS layer. The modified electrode
was immersed in the spectroelectrochemical cell containing PBS test solution at 0.2 V
and then pressed against the CaF2 window. A set of 100 interferograms was acquired at
this potential to be used as the reference spectrum and, then, the potential was scanned
sequentially up to 1.3 V. Sets of 100 sample interferograms were collected every 100
mV step and referred to the spectrum at 0.2 V. The resulting differential spectra are
depicted in Fig. 3.7.a. There, each single spectrum represents changes in vibrational
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
145
modes occurring at increasing sample potentials relative to the unique reference
spectrum. In this way, positive-going (upward) bands can be assigned to the weakening
or extinction of vibrational modes at the sample potential while negative-going
(downward) bands to their strengthening. At this point, it should be noted that PSS
contained within PEDOT matrix is not redox-active and, consequently, it is expected
that its vibrational modes will show zero or negligible intensity in the normalized
differential FTIR spectra.
The first spectrum in Fig. 3.7.a was obtained at a sample potential of 0.6 V. There,
three obvious negative-going bands are detected at 1535, 1420 and 1250 cm-1
, in
addition to two positive-going bands at 1470 and 1365 cm-1
. The band at 1535 cm-1
can
be assigned to the antisymmetric C–C stretching mode within oxidized thiophene
rings.60-63
Fig. 3.7.b shows how the integrated band intensity of this feature increases
almost linearly at increasing potentials. From this behaviour, it is derived that the
electrochemical injection of positive charge within the polymer backbone results in a
significant and gradual activation of vibrational modes coming from oxidized
(polaronic) structures of the PEDOT-PSS. Since there is no degradation of the polymer
within the potential window employed in the experiment, the almost linear trend
replicates the growing oxidative doping level of the deposited material. Furthermore,
the intensity stabilization from 1.2 V means that the complete oxidation of the polymer
has been achieved at this potential and overoxidation of the polymer structure could
occur beyond such limit.
Chapter 3
146
Table 3.1. Proposed assignments for the in situ FTIR bands of reduced and oxidized forms of
PEDOT:PSS
PEDOT Structure Frequency/cm-1
Assignment Refs.
Reduced
1470 Aromatic C–C ring str. 59,63,64,65
1365 Aromatic C–C ring str. 60,61,64,65
Oxidized
1535 Cα–Cβ antisymm str. 60-63,66
1420 Cα–Cβ symm str. 60,62,64,66
1250 Cα=Cα symm str. 61,66
On the contrary, the intensity of the two positive-going bands (which are related
to a pair of ring-stretching vibrations of thiophene, typical of five-membered
heterocycle compounds65
remains almost constant upon positive charge injection. This
result strongly suggests that the two vibrational modes coming from the reduced state of
the polymeric material vanish at the early stages of electrochemical oxidation and,
consequently, it seems that a sudden loss of the aromatic character of thiophene rings
takes place at very low potentials, above 0.2 V.
Changes in band frequency at increasing potentials have been also depicted for the
1535 cm-1
absorption band in Fig. 3.7.c. The clear frequency shift observed, with a
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
147
tuning rate close to 30 cm-1
V-1
, resembles an electrochemical Stark effect.67
It is known
that most thiophene-based conjugated polymers, including also EDOT-based materials,
present IR bands whose positions are almost independent on the applied potential. In
some particular cases, frequency shifts at increasing doping levels were found, but
always associated to specific families of thiophene derivatives.68-70
No clear explanation
of this phenomenon has been offered in the literature to date, although it is believed that
electronic transitions between different charged moieties upon oxidation (specifically
polaron to bipolaron transitions) could be at the origin of the observed energy shift.
Along with the antisymmetric C-C stretching in oxidized EDOT units, the parent
symmetric vibration appears as a negative absorption peaking at 1420 cm-1
in the
spectra of Fig. 3.7.a. Finally, the low frequency feature at 1250 cm-1
can be attributed to
an inter-ring C–C stretching vibration.61, 63
All these assignments have been summarized
in Table 3.1. Vibrational modes coming from C–S bonds in thiophene rings appear at
frequencies below those of the CaF2 window cut-off and, consequently, are undetectable
in our experiments.
Chapter 3
148
120014001600
0.6V
0.7V
0.8V
0.9V
1.0V
1.1V
1.3V
Wavenumber / cm-1
1.2V
1535
1470
1420
1365
1250
0.01R/R=
a
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.320
40
60
80
100
120
140
Inte
gra
ted inte
nsity / a
.u.
E/ V vs RHE
b
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3
1530
1535
1540
1545
1550
1555
Wa
ve
nu
mb
er
/ cm
-1
E/ V vs RHE
c
Figure 3.7. (a) In situ FTIR spectra collected for a thin (0.04 μm) deposit of PEDOT on a gold electrode
in PBS. Reference spectrum obtained at 0.2 V. 100 interferograms at each potential. (b) Integrated
intensity of the Cα–Cβ antisymmetric stretching against the applied potential. (c) Dependence of the Cα–
Cβ antisymmetric stretching frequency on the applied potential.
Once the assignments of the main in situ infrared features have been carried out,
the question of how the electron transfer between PEDOT-PSS and cyt c modifies the
recorded spectra can be addressed. The spectroelectrochemical response of a PEDOT-
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
149
PSS layer was tested in working solutions containing either PBS (Fig. 3.8.a) or cyt c in
PBS (Fig. 3.8.b). In order to increase the signal-to-noise ratio, reference (0.5 V) and
sample (0.7 V) potentials were adjusted around the cyt c redox transition and five
potential steps between reference and sample potentials were carried out. The 500-
interferogram resulting spectra were co-added in order to obtain a unique computed
spectrum with enhanced quality in each working solution.
1200140016001800Wavenumber / cm
-1
1546
14151250
1640
=0.1(R/R)
a
1200140016001800Wavenumber / cm
-1
1430
1255
1546
1690
1390
1515
=0.1(R/R)b
Figure 3.8. (a) In situ FTIR spectra recorded in PBS for a 0.04 μm PEDOT layer deposited on gold. (b)
In situ FTIR spectra for a 0.04 μm PEDOT deposit in PBS containing 1 mg mL-1
cyt c. Reference: 0.5 V.
Sample: 0.7 V. 500 interferograms at each potential.
It can be observed that both spectra are dominated by bands assigned to the redox
transitions of the conjugated polymer backbone, in addition to a strong positive band at
around 1640 cm-1
coming from the unbalanced O-H bending of water molecules and
Chapter 3
150
associated to the swell-shrink process of PEDOT. It is also worth noting in the spectrum
of Fig. 3.8.a that positive features vanish at 1365 and 1470 cm-1
(see Fig. 3.7.a for
comparison). This is because the reference spectrum was acquired here at a higher
potential (0.5 V instead of 0.2 V). The aromatic character of thiophene rings was
already lost at 0.5 V and, as a result, only negative-going bands can be observed, since
they simply show intensification of the oxidation process at 0.7 V with respect to 0.5 V.
Therefore, it is derived that positive bands at 1515 and 1390 cm-1
in Fig. 3.8.b come
unambiguously from the reduced state of cyt c and not from PEDOT-PSS. The former
feature is clearly identified as the amide II band71
and the latter integrates the amide III
region.72
On the other hand, the negative band at around 1430 cm-1
is overlapped with
the PEDOT Cα–Cβ symmetric stretching and it can be attributed to the intensification of
the C-H bending at aminoacid side chains occurring upon oxidation.32, 71, 72
Another
major feature in the spectrum of Fig. 3.8.b involves the amide I infrared region, between
1600-1700 cm-1
, which is modulated by the secondary structure of the protein and is
really distorted by the H2O bending vibration.
To clarify cyt c infrared transitions appearing in this spectral region, additional
experiments were performed using deuterated water as the solvent. Fig. 3.9 shows a set
of spectra for PEDOT-PSS modified electrodes acquired at sample potentials of 0.7 V
in PBS/D2O solutions, either in the absence or in the presence of cyt c.
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
151
1200140016001800
1605
1655
1235
Wavenumber / cm-1
1655
a
b
c
1235
1565
=0.1(R/R)
1290
1415
1285
1546
16201640166016801700
wavenumber / cm-1
1685
1660
1639
1622
R/R
d
= 0.05
Figure 3.9. In situ FTIR spectra collected for a 0.04 μm PEDOT layer in: (a) PBS/D2O solution; (b) 1 mg
mL-1
cyt c in PBS/D2O solution; (c) 3 mg mL-1
cyt c in PBS/D2O solution. Sample 0.7 V. Reference 0.5
V. 500 interferograms at each potential. (d) Deconvolution of the amide I band from spectrum c.
Chapter 3
152
In addition to the IR absorptions assigned to polymer vibrational transitions,
spectra collected in the presence of protein (Fig. 3.9.b and 3.9.c) show negative bands at
1605 cm-1
coming from the ν37 stretching vibration of the heme group and positive
bands at 1565 cm-1
. This latter feature is assigned to the complex amide II absorption
which, in the present case, appears interfered by PEDOT vibrational bands. In spite of
this, the key feature for the two spectra collected in the presence of cyt c is the
appearance of a clear-cut, positive amide I band centred at 1655 cm-1
. As shown in Fig.
3.9.d, this multiple absorption results from the combination of several CO, CN and
CCN vibrational transitions coming from the oxidized state of the protein,73
namely
type III β-turn at 1685 cm-1
, type II β-turn and α-helix at 1660 cm-1
and extended β-
strand at 1639 cm-1
. A further contribution at 1622 cm-1
is usually assigned to side chain
interactions not associated with the secondary structure of cyt c.31, 34, 74, 75
The relative intensity between type III and type II β-turn infrared absorptions has
been used by Ataka and Heberle to reveal the orientation of cyt c during the redox
transfer to electrodes modified with SAMs.72
It was established that hydrophobic SAMs
favoured the approach of cyt c through the type III β-turn, while more hydrophilic (OH-
terminated) SAMs tend to face type II β-turns toward the electrode surface. The pre-
eminence of the latter band in Fig. 3.9.d strongly suggests that PEDOT-PSS behaves as
a hydrophilic SAM and favours the approach of the heme group in an angle close to the
surface normal. Such an orientation promotes the direct electron transfer between cyt c
and the gold electrode modified with PEDOT.
On the other hand, it is known that cyt c does not undergo significant
conformational changes when switched from the oxidized to the reduced state.
Consequently, differential bands observed in the infrared spectra of Fig. 3.9 should be
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
153
attributed mainly to changes in the orientation of cyt c on the electrode surface, which
are induced externally through the reversible electrochemical oxidation-reduction
process. In an ideal case, applying higher potentials to the electrode would result in the
generation of a larger number of polaronic moieties along hyper-conjugated PEDOT-
PSS chains. However, due to some structural heterogeneity shown by conducting
polymers, injected charge appears usually at more localized polymer fragments.76
Changes in protein orientation (perceived in the form of a combined positive band at
1655 cm-1
) are therefore limited to the interaction with PEDOT in the immediacy of
those active (oxidized) polymer centres. Obviously, those orientation changes can be
detected because of the successful charge transfer to cyt c. On the basis of horse cyt c
crystal structure (entry 1HRC of Protein Data Bank, PBD), the most probable
orientation of the protein with respect to the electrode surface during the electron
transfer seems that one presented in Fig. 3.10.
Chapter 3
154
Figure 3.10. Preferred orientation of cyt c during the electron transfer to a PEDOT layer, as deduced
from the combination of crystal structure data and in situ FTIR results. Lys 13, 27, 72 and 86 residues
interacting with negatively-charged PSS chains are represented in blue colour. The electro-active heme
group, which interacts with PEDOT rings, is represented in red colour. Cyt c structure created by Swiss
PDB Viewer 4.1.0 with crystallographic data taken from the Protein Data Bank (PDB entry 1HRC).
Several authors have shown that positively charged residues located at the surface
of the cyt c protein, mainly Lys residues, play a major role in the electron transfer
process. Those specific protein positions can operate as binding sites that facilitate the
electron transfer to partners like cytochrome c oxidase, for which lysine residues 8, 13,
27, 72, 79 and 86 participate in binding, while the remainder lysine centres are not
essential for ET.72, 77
The arrangement proposed in Fig. 3.10 explains the higher intensity shown by
type II β-turn (residues 32-38) and short stranded β-sheet (comprising residues 37-40
and 57-59) in the deconvoluted spectra of amide I band. The presence of ionizable
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
155
groups in His 33, Arg 38 and Lys 39 provides a net positive charge in this protein
segment at pH 7 78, 79
and the electrochemical injection of positive charge through the
PEDOT backbone could induce additional electrostatic repulsions pulling the segment
away from the conducting polymer interface. This effect is detected as a vanishing of
the corresponding vibrational modes in the FTIR spectrum of Fig. 3.9.a. On the other
hand, it is remarkable the absence of differential infrared bands coming from type III β-
turn (residues 14-19 and 67-70). Such a behaviour reveals that these protein sites remain
unmodified upon oxidation and, probably, they are preferred positions for the protein to
interact with the conducting polymer. As shown in Fig. 3.10, the proposed orientation
favours the approach of cyt c to the surface through positively-charged Lys 13, 27, 72
and 86, which seem active residues facilitating the electron transfer from the conducting
polymer to the heme group. The interaction of positive Lys residues with the polymer
substrate seems favoured by the excess of dopant PSS anions relative to EDOT
monomers (ratio close to 4:1, as deduced from XPS data in Fig. 3.2). In addition, the
alignment proposed in Fig. 3.10 agrees with that reported previously for cyt c adsorbed
on bare gold electrodes.77
It was demonstrated that this particular configuration hampers
the direct electron transfer to cyt c due to the suppressed rotation of the adsorbed
protein. Since, in the present case, the electron transfer takes place from a PEDOT-PSS
layer under similar protein alignment, the rotation of cyt c should be not confined after
its interaction with this particular conducting substrate.
Chapter 3
156
3.4. Conclusions
We explored the direct electrochemistry of cytochrome c promoted by the
conducting polymer PEDOT-PSS. This material was synthesized from aqueous solution
and retains its conductive state at physiological pH. It provides several advantages over
conventional chemical modifiers (such as SAM films or metallic oxides): PEDOT-PSS
is straightforward to synthesize, it can be deposited on any conducting substrate and its
properties, like morphology or thickness, are easily tunable. We demonstrated
electrodes modified with PEDOT-PSS are able to bring charge to cyt c in solution. The
electron transfer rate is about two orders of magnitude higher than those obtained with
either conventional or SAM-modified electrodes.
The redox state of the polymer was monitored by in situ FTIR spectroscopy. The
injection of positively charged polaronic species produces quinoid domains in the
PEDOT backbone. The doped (and therefore conducting) polymer state extends over a
wider potential window (0.2-1.2 V) than that required to induce redox transformations
in cyt c (0.5-0.9 V).
PEDOT-PSS presents IR-active vibrational modes interfering with those
associated to intrinsic cyt c redox processes. Under suitable experimental conditions, it
was possible to remove vibrational interferences on the amide I band of cyt c. During
the oxidation, lysine residues involved in the cyt c coupling processes with their cognate
partners (i.e. Lys 13, 27, 72 and 86) interact electrostatically with PSS polyelectrolyte,
the anionic dopant. This kind of interaction favors the orifice in the crevice containing
the heme group to be oriented towards electroactive PEDOT chains, thus facilitating the
electron transfer.
DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
157
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DIRECT ELECTRON TRANSFER TO CYTOCHROME C INDUCED BY A CONDUCTING POLYMER
169
TOC graphic
170
IV
173
Capítulo 4
4. Enhancement of the direct electron transfer to
encapsulated cytochrome c by electrochemical
functionalization with a conducting polymer
174
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
175
4.1. Introduction
Direct electrochemistry of proteins has become a major subject for the
development of biotechnological applications. Electrochemical techniques allow
fundamental studies about structural organization (as a function of redox environment)
and the study of key mechanisms for electron transfer. Deeper knowledge of these
processes would allow the development of more efficient biotechnological devices, such
as highly active enzymatic fuel1-4
or third-generation biosensors.5-7
A key aspect of these devices is the direct electron transfer (DET) without redox
mediators between an immobilized enzyme molecule and the electrode surface. Proteins
can be immobilized following several strategies like covalent binding, physical
adsorption or encapsulation within inert matrices.8-10
Among the available encapsulating
agents, silica synthesized from sol-gel methodologies provides soft immobilization
conditions and offers protection against some bulk solution components, thus reducing
the risk of denaturation because of pH or ionic strength effects.11-15
Following this
approach, in this PhD thesis it has been employed silica to immobilize the redox active
protein cytochrome c (cyt c).
Cyt c is a water soluble hemoprotein, with an electron-transducing role in the
biological respiratory chain, that has been used in several bioelectrochemical devices.16-
18 Paired with cytochrome oxidase it has been employed in biofuel cell cathodes
19, 20
and, thanks to its direct activity as a peroxidase, also in biosensors.21-29
Indeed, cyt c can
be used in combination with other enzymes, such as the xanthine oxidase, to take
advantage of its redox activity in the development of new biosensors.30-34
Chapter 4
176
Direct electrochemistry from cyt c to surface-modified metal electrodes or metal
oxides electrodes has been also reported. The electron transfer is promoted by the
attractive interaction of positively charged lysine moieties to surfaces.35
Several studies
on this topic were performed using transparent indium-doped tin oxide electrodes by
Bowden and coworkers.36-39
In early studies they pointed out that the electron transfer
rate to cyt c in solution depends on both electrode pretreatment and protein
concentration. The magnitude of the heterogeneous rate constant was found to decrease
as the cyt c concentration increased.38, 39
Cyt c can be adsorbed by these electrodes
while retaining its native state and, therefore, its electroactivity.36, 40-44
In a previous contribution,45
it has been demonstrated that interactions between
silica gel and encapsulated cyt c electrodes are relevant for an optimization of the
electron-transfer to ITO electrodes. The authors found that methyl-modified silica
lowers the affinity between negatively charged silica pores and protein molecules. The
optimum organosilica film contains 20-30 % methyl groups and promotes the
detachment of the positively charged cyt c from the pores, thus positioning the redox
center towards the electrode surface.
It is recognized that silica constitutes a suitable inert matrix for the encapsulation
of several biomolecules.11, 46-49
However, this material presents a serious drawback from
an electrochemical point of view, which is the lack of intrinsic electron conductivity.
For that reason, the electrochemical response of cyt c encapsulated in silica is restricted
to those protein molecules placed at pores nearby the electrode surface.45
As a result, it
is thought that the thicker the silica layer, the higher the amount of isolated cyt c
showing no redox activity.
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
177
The problem was solved by using electrically insulating silica matrices in
previous works.50-52
There, authors performed the encapsulation of highly
electrocatalytic single-walled carbon nanotubes within silica (SWCNT@SiO2). Such
materials showed good electrochemical performance, which even improved the
heterogeneous rate transfer for several redox probes. However, this was followed by a
minor increase in the true electroactive area because most SWCNTs remained isolated
into the silica network and were not electrically connected with the supporting
electrode.53
A conducting polymer was then inserted within the silica pores to wire the
electrode surface to the isolated nanotubes50, 51
and the result was a hybrid silica
material with improved electrocatalytic performance.52
Several strategies can be followed to improve the electrical connection between
encapsulated proteins and substrate electrodes through different nanostructured
materials, including metal nanoparticles, carbon nanotubes, metallic or molecular
nanowires.54-57
In the present thesis, a different method for the electrical activation of
the encapsulated protein has been proposed. This method involves the insertion of
conducting polymer wires through the pores of silica. The goal is to improve the
electron transfer between electrode surface and cyt c encapsulated within a methyl-
modified silica matrix. Since part of the protein molecules remain in isolated locations
of the silica layer after encapsulation, the intention is to wire them to the electrode
surface by means of the electrochemical insertion of a conducting polymer
(PEDOT:PSS).
Chapter 4
178
4.2. Experimental section
Cytochrome c (Cyt c) from horse heart (98 %), 3,4-ethylendioxythiophene
(EDOT) (97 %), poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) (p.a.), tetraethyl orthosilicate
(TEOS) and triethoxy(methyl)silane (MTES) were purchased from Sigma-Aldrich.
Hydrochloric acid (p.a.) was purchased from VWR-Chemicals. Potassium dihydrogen
phosphate (p.a.) and dipotassium hydrogen phosphate (p.a.) were from Merck. All the
aqueous solutions were prepared using ultrapure water from an Elga Labwater Purelab
system (18.2 MΩ cm).
Cyclic voltammetry was performed with a potentiostat (Elektronik Potentiostat
Wenking ST 72, Bank Elektronik Germany), a wave programmer (EG&G PARC) and a
digital recorder (eDAQ - 410), with eDAQ EChart data acquisition software. The
electrochemical cell was purged by bubbling a N2 flow for 20 min in the solution, and
the N2 atmosphere was maintained during the whole experiment. A platinum wire has
been used as a counter electrode and indium-tin oxide glass substrate (ITO Delta, CG-
60IN, 60 S cm-1
) were used as working electrodes. Before using it, the ITO glass was
degreased by sonication in an acetone bath and rinsed with an excess of deionized
water. A working electrode with a geometric area of 1 cm2 was immersed in the solution
for each electrochemical characterization. The electroactive area of ITO modified
electrodes was determined from the measurement of the double layer charge. A
reversible hydrogen electrode (RHE) immersed in the same electrolyte solution within a
Luggin capillary was used as the reference electrode.
UV-Visible spectra were acquired with a JASCO V-670 spectrophotometer. UV-
Visible spectroelectrochemical experiments were performed using a
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
179
bipotentiostat/galvanostat (µStat 400 DropSens) with DropView data acquisition
software. The spectroelectrochemical cell was a conventional quartz cell (1 cm optical
path) with a Teflon cap to fit an ITO/glass working electrode, a silver wire
pseudoreference electrode and a platinum wire as a counter electrode. The
spectroelectrochemical cell was purged by bubbling an Ar flow for 10 min through the
solution and Ar atmosphere was maintained during all the experiments.
For the synthesis of the silica-modified electrodes containing cyt c, two stock
solutions were prepared as follows:
Solution 1, Methyl-modified silica precursor solution was prepared by mixing
1.48 mL TEOS (6.63 mmol) and 0.464 mL MTES (2.33 mmol) with 2.983 mL HCl
0.01 M under magnetic stirring conditions at room temperature during two hours in a
closed vial. Then the resulting solution was rota-evaporated until the complete removal
of the stoichiometric amount of ethanol released from the hydrolysis reaction.
Solution 2, cytochrome c solutions with concentration ranging between 10-100
mg mL-1
were prepared by dissolving the protein in a phosphate buffer solution (PBS,
pH 7) made of K2HPO4 0.15 M + KH2PO4 0.1 M.
For the encapsulation and immobilization of cytochrome c on the electrode 20 µL
of solution 1 plus 20 µL of solution 2 were placed in an Eppendorf vial. The
concentration of cytochrome c in this silica solution ranged from 5 to 50 mg mL-1
. 20
µL of this mixture was dispensed over a clean ITO electrode. After 20-40 s, a
homogeneous silica gel containing cyt c is formed over the ITO surface.
Chapter 4
180
For simplicity, the mass of cyt c loaded in the silica gel has been used to label
each material. For example, the electrode prepared from a precursor solution containing
10 mg mL-1
of protein is labelled as cyt c(0.2 mg)@SiO1.87Me0.26.
The electropolymerization of PEDOT:PSS was performed by the potentiodynamic
method in an aqueous solution containing 0.15 % PSS + 45 mM EDOT monomer. The
mixture was sonicated for 10 min to dissolve the monomer.
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
181
4.3. Results and discussion
The hydrophobic, partially methylated silica matrix has been evaluated as an
electron-transfer immobilization host for cyt c. Fig. 4.1.a shows cyclic voltammograms
recorded in a pH 7 phosphate buffer solution at several hemoprotein loadings. Solid line
in Fig. 4.1.a shows the electrochemical response of the cyt c(0.2 mg)@SiO1.87Me0.26
electrode.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-4
-2
0
2
4
j /
A c
m-2
E / V vs RHE
(a)
Chapter 4
182
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
j (
A c
m-2)
Cyt c loading (mg)
(b)
Figure 4.1. (a) Cyclic voltammograms for cyt c encapsulated in a silica matrix, cyt c(x mg)
@SiO1.87Me0.26, and recorded for different protein loadings in the gel (––) x= 0.2; (– – –) x= 0.4; (– · –)
x= 0.7; (·····) x= 1.0 mg. Electrolytic medium: pH 7 PBS. Scan rate: 100 mV s-1
. (b) Peak current density
versus concentration of cyt c in the precursor solution. Obtained from a CV set as in (a).
The anodic peak centered at 0.86 V during the forward potential scan is related to
the oxidation of ferrocytochrome c to ferricytochrome c. The reverse scan shows the
reduction counter process, which appears as a cathodic feature peaking at around 0.47V.
Fig. 4.1.a also shows the stabilized voltammograms recorded at increasing
loadings of cyt c. As expected, oxidation-reduction peak currents rise at increasing
amounts of encapsulated cyt c and, simultaneously, the associated voltammetric waves
become more defined.
The current intensity of the encapsulated cyt c peaks were analysed for a cyt
[email protected] electrodes by plotting the logarithm of the current intensity versus the
logarithm of the sweep rate in a PBS solution (see Fig. S1 in the Appendix A). The
slope of the linear fit is close to 0.5, which means a peak current nearly proportional to
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
183
square root of the scan rate. Similar results were obtained for different protein loadings.
In this way, despite that cyt c is encapsulated, its electrochemical behaviour resembles
that of a free species in solution. It can be then inferred that the silica host allows a
certain mobility of proteins within its pores.
The evolution of anodic peak currents was plotted against the amount of cyt c
incorporated in silica in Fig. 4.1.b for a number of samples. There, it can be observed
that peak currents are proportional to the amount of cyt c up to a value of 0.5 mg within
the gel. Higher protein loadings seem not to affect significantly the recorded current,
which reaches a constant value.
In order to compare the amount of electroactive protein with the total protein
encapsulated within the silica matrix, a deeper analysis of voltammetric results was
performed. The evolution of the redox current intensity as a function of the scan rate
were examined. To estimate the apparent concentration of encapsulated protein
Randles-Sevcik equation can be used:
⁄
⁄
being C the concentration of protein (mol cm-3
), A the electroactive area of the
electrode (cm2), D the diffusion coefficient of encapsulated protein (4.7×10
-7 cm
2 s
-1
within the silica gel)45
and ν the scan rate (V s-1
).
From this equation, the apparent concentration of electroactive cyt c is in the order
of 10-5
M for all the electrodes tested (the values of electroactive cyt c relative to the
total amount of encapsulated protein are presented in Fig. S2 of the Appendix A).
Chapter 4
184
It can be observed that the amount of electroactive protein is much smaller than
the encapsulated one (indeed, only of the 2 % protein shows electroactivity). This
suggests that most cyt c molecules are located within isolated pores or, alternatively,
they underwent some kind of modification (oligomerization, aggregation, etc.)58, 59
making them inactive.
The voltammetric peak-to-peak separation was also studied by the Nicholson
method in order to obtain heterogeneous transfer rate constants (kº)60
for the different
electrodes containing cyt c. Fig. 4.2 shows kº values for different amounts of
encapsulated protein.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
1.0x10-5
1.5x10-5
2.0x10-5
2.5x10-5
3.0x10-5
3.5x10-5
kº
(cm
s-1)
Encapsulated cyt c (mg)
Figure 4.2. Heterogeneous rate constant calculated from voltammetric data for the redox reaction
of cyt c encapsulated in silica.
Low kº values were obtained (in the order of 10-5
cm s-1
) that may reveal high
affinity of silica pores to cyt c for the heme group that may hinder the transfer to the
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
185
ITO surface. In a previous work45
the authors detected that the presence of OH-
terminated silica pores results in a lack of redox response from encapsulated protein.
However, the insertion of methyl functionalities in the silica structure reduced the pore-
cyt c interaction and allowed the observation of the electrochemical response of
encapsulated cyt c.
On the other hand, as shown by Runge et al.,42
the presence of silica can disturb
the orientation of cyt c with respect to the electrode surface, thus decreasing the
efficiency of the electron transfer.
It is also worth mentioning that increasing amounts of encapsulated cyt c lead to a
decrease in the value of the transfer constant. This effect of cyt c concentration on kº
was already observed for several electrodes.38, 61
kº decrease almost one order of
magnitude at bare ITO after changing cyt c concentration from 38 to 300 µM.38
These
values are well below the concentration range employed in the present work (400 µM to
4 mM), so it was expected lower kº figures (in the order of 10-5
cm s-1
), which are
compatible with the work by Marten and McKenzie.59
For cyt c concentrations up to 53
mM at titania membranes deposited on ITO, kº values were in the order of 10-6
cm s-1
.
There, the formation of cyt c aggregates and the electron transfer through a “hopping”
mechanism were at the origin of the low kº values. Similar hopping mechanism was
reported by Beissenhirtz et al. for cyt c multilayers assembled within a polyelectrolyte
film.62
In our case, the existence of a limiting load value of cyt c at around 0.5 mg
strongly suggests that there is an increasing excess of electroactive molecules residing
in non-accessible sites of the silica matrix. Then, a strategy to connect those
Chapter 4
186
electroactive yet isolated cyt c molecules to the electrode surface by means of a suitable
conducting polymer will be developed.
It is known that conducting polymers can be inserted into the pores of host silica
matrices by means of electrochemical methods. The usual technique involves either a
potentiostatic or potentiodynamic polymerization of the selected monomer on a working
electrode previously covered by the silica layer.50-52
First, the electrochemical response of a SiO1.87Me0.26 layer recorded in aqueous
solution containing 45 mM EDOT monomer and 0.15 % PSS (Fig. 4.3) is shown.
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
-2
0
2
4
6
I /
A
E / V vs RHE
(a)
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
187
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
-4
0
4
I /
A
E / V vs RHE
(b)
Figure 4.3. Cyclic voltammograms recorded for a SiO1.87Me0.26 layer deposited on ITO in 45 mM
EDOT + 0.15 % PSS aqueous solution. a) First potential cycle; b) 35 subsequent cycles.
Scan rate 100 mV s-1
.
During the first forward scan (Fig. 4.3.a) an anodic current develops from 1.3 V
corresponding to the oxidation of EDOT monomer. As a result of the electrochemical
reaction, a current plateau grows continuously within the 0.1 - 1.1 V potential region
during successive potential scans, as observed in Fig 4.3.b. This featureless current
extending up to 1.1 V is characteristic of a pseudocapacitative process occurring at the
deposited polymer in its conducting state. The current intensity can be used to estimate
the amount of polymer inserted within the silica layer, assuming a mass capacitance of
67.7 F g-1
, as determined by Bobacka et al.63
The double layer capacitance was
determined from voltammetric measurements of currents at potentials between
0.2-0.5 V.
The electropolymerization of PEDOT:PSS across a silica material previously
loaded with protein, cyt c(0.5 mg)@SiO1.87Me0.26, shows marked differences against the
cyclic voltammograms in Fig 4.3. Electropolymerization of PEDOT:PSS across this
electrode cyt c is shown in Fig. 4.4.
Chapter 4
188
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
-3
0
3
6
9
j /
A
cm
-2
E / V vs RHE
(a)
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-10
0
10
j /
A c
m-2
E / V vs RHE
(b)
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-40
-20
0
20
40
j /
A
cm
-2
E / V vs RHE
(c)
0 10 20 30 40
0
1
2
3
4
5
Deposited P
ED
OT
/
g
nº cycles
(d)
Figure 4.4. (a) First voltammetric cycle showing the potentiodynamic growth of a PEDOT:PSS film over
a cyt c (0.5 mg)@SiO1.87Me0.26 material. (b) 2nd
-24th
cycle and (c) 25th
-40th
cycle. Polymerization
conditions: [EDOT] = 45 mM; [PSS]= 0.15 % (w/w). Background electrolyte: pH 7 phosphate buffer.
Scan rate: 100 mV s-1
. (d) Plot showing the mass of PEDOT deposited into the cyt c(0.5
mg)@SiO1.87Me0.26 material at increasing number of potential cycles up to 1.4 V.
The first voltammetric scan (Fig. 4.4.a) shows two separate electrochemical
processes. The first one is a pair of redox peaks (0.87 V/ 0.43 V) that can be clearly
ascribed to the reversible oxidation of iron centers at cyt c molecules. The second one
corresponds to EDOT monomer oxidation, which occurs at potentials above 1.3 V.
After several potential cycles in the 0.1-1.4 V potential range (shown in Figs. 4.4.b and
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
189
4.4.c) the monomer oxidation process gives rise to the insertion of the corresponding
electroactive polymer (PEDOT:PSS) within the silica matrix pores.
The pair of peaks associated with the redox process of cyt c is discernible during,
roughly, the 25 first scans. From that point, the overlapping of PEDOT:PSS redox
currents makes it difficult to recognize the cyt c voltammetric features (see Fig. 4.4.c).
The mass of inserted polymer was estimated from the pseudocapacitative current in the
0.2-0.5 V potential range and it has been depicted against the number of polymerization
cycles in Fig. 4.4.d. The shape of this plot suggests an autocatalytic growth of the
polymer inside the silica matrix, as it has been already reported.64, 65
UV-vis spectroscopy has been widely employed in the literature to characterize
the oxidation state of cyt c66, 67
and electrochemical in situ experiments of cyt c(0.5
mg)@SiO1.87Me0.26 have been performed with the same purpose. The characteristic
spectra of cyt c does not undergo substantial modifications after the encapsulation
within the gel (see Fig. S3 in the Appendix A). Particularly, it is observed that the Soret
band does not shift, revealing that the protein remains native when encapsulated.45
Fig.
4.5 shows two UV-Vis spectra corresponding to electrochemical oxidized and reduced
cyt c encapsulated in silica and immersed in PBS medium.
Chapter 4
190
360 400 440 480
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
520 560 600
0.06
0.12
0.18
0.24
0.30A
bso
rban
ce
/ nm / nm
Figure 4.5. In situ UV-Vis spectra collected for a cyt c(0.5 mg)@SiO1.87Me0.26 in PBS. Static spectra
acquired at 1.1 V (solid line) and 0.3 V (dashed line).
The spectrum of oxidized ferricytochrome c was acquired at 1.1 V, where the
protein is in its native form. It is characterized by the ππ* electronic transitions of the
porphyrin group with an intense Soret band in the region between 380 and 460 nm and
poorly defined lower energy Q-bands at around 500-570 nm. On the other hand, the
spectrum of reduced ferrocytochrome c was collected at 0.3 V. There, the Soret band
shifts to red and intensifies slightly, while the Q band splits into two well-defined
features, the so-called α and β bands, peaking at 520 and 549 nm, respectively.
The conventional absorption spectra presented in Fig. 5 cannot be used to gain
accurate time-resolved information from the investigated system because the absolute
intensity change is too low. Therefore, to make clear the effect of time on the
electrochemical reduction treatment, we have presented in Fig. 4.6 normalized
differential UV-Vis spectra, A/A0.
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
191
350 400 450 500 550 600 650 700 750
120 min
60 min
20 min
/ nm
10 min
A/A0=5%
549
519
418
363 450 568
Figure 4.6. In situ UV-Vis differential absorption spectra collected for a cyt c (0.5 mg)@SiO1.87Me0.26
electrode in PBS medium at different times after the application of a 0.3 V pulse (Sample potential).
Reference potential 1.1 V.
To achieve this, each absolute spectrum collected at the sample reduction
potential (0.3 V) was referred to the initial spectrum obtained at the reference potential
(1.1 V) and then normalized with the reference signal. Working in this way, upward
(positive) bands in the computed spectrum reveal the promotion of new electronic
transitions at the sample potential (0.3 V) that were absent at the reference potential and,
besides, the evolution of spectra with time is clarified. As observed in Fig. 4.6, three
positive absorption features develop at 418, 519 and 549 nm while negative bands
appear clearly at 363, 450 and 568 nm after 120 min reduction treatment. It is worth
noting that the bipolar character observed for the electronic transitions in the spectral
region of the Soret band is an artifact that comes from the potential-induced red shift of
this band in the original absolute spectra.
Chapter 4
192
Thanks to the differential spectra, it is possible to assess the ability of
PEDOT:PSS to transfer charge to cyt c molecules at non-accessible sites of the
methylated silica matrix. In this way, an experiment parallel to that shown in Fig. 4.6
was performed for an electrode containing 6.45 µg of PEDOT:PSS, cyt c (0.5 mg)-
Fig. 4.7 shows the differential UV-Vis absorption bands acquired during the
electrochemical reduction of cyt c at 0.3 V, where sample spectra are referred to the
initial spectrum collected at 1.1 V. As in the previous experiment, the obtained bands
are related with the effective reduction of the iron group. It can be observed a faster
growth of these bands for the electrode containing PEDOT:PSS (note the different scale
of the value axis in Fig. 4.6). Apart from this observation, there is another outstanding
difference between both figures, which is the baseline distortion at wavelengths above
600 nm in Fig. 4.7. This element reveals the existence of polaron electronic transitions
in the conducting polymer component at the reference potential that are absent in the cyt
[email protected] system. The absolute spectra of reduced and oxidized PEDOT:PSS are
shown in the Appendix A (Fig. S4).
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
193
350 400 450 500 550 600 650 700 750
120 min
60 min
20 min
/ nm
10 min
A/A0=10%
418
363 450
519
549
Figure 4.7. In situ UV-Vis differential absorption spectra collected in PBS medium at increasing times
for a cyt [email protected] (6.45 µg polymer inserted) after the application of a sample reduction
potential of 0.3 V. Reference potential 1.1 V.
To disclose the effect of PEDOT:PSS on the rate of protein reduction it is required
to monitor absorption intensity changes in the absence and in the presence of this
conducting polymer. As observed in Fig. 4.7, the intensity of the β peak at 549 nm is
particularly sensitive to the redox state of the iron center and such feature makes this
band very useful for our purpose.
The band intensity recorded for the peak at 549 nm has been plotted in Fig. 4.8.a
against the reaction time at 0.3 V. For comparison, this figure shows also the behavior
of the β band in a parallel experiment performed with a cyt [email protected] electrode
with no PEDOT:PSS inserted.
Chapter 4
194
0 20 40 60 80 100 1200.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
A
/A0
t (min)
(a)
0 4 8 12 16 20 24 281.0x10
-3
1.5x10-3
2.0x10-3
2.5x10-3
3.0x10-3
3.5x10-3
Rate
(m
in-1)
Deposited PEDOT (g)
(b)
Figure 4.8. (a) Time dependence of the differential absorption band (sample potential 0.3 V, reference
potential 1.1 V) at 549 nm for a cyt c(0.5 mg) @SiO1.87Me0.26 electrode. Square symbols correspond to an
electrode without PEDOT:PSS, triangles correspond to an electrode containing 6.45 µg PEDOT:PSS
inserted.(b) Shift rate of the 549 nm electronic absorption against the amount of PEDOT:PSS inserted.
The band intensity rises linearly at increasing times and shows a shift rate close to
1.7×10-3
min-1
in absence of PEDOT:PSS. However, for the electrode containing
PEDOT:PSS, two well-defined trends are observed. At short times, the shift rate is
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
195
about to 5×10-2
min-1
but, after a transient period of 30 minutes, data can be fitted with a
linear trend showing lower slope. The same behavior is observed for other samples
containing different amounts of PEDOT in the range 0.6-25.8 µg. Interestingly, during
the initial stages of electrochemical reduction (up to 30 min) it was found that shift rates
are almost independent of the amount of PEDOT loaded. On the contrary, after this
transient period, different linear trends with slopes strongly dependent on the
PEDOT:PSS loading are observed. These slopes are plotted against the amount of
PEDOT:PSS in Fig. 4.8.b. There, it is observed that the shift rate increases sharply at
low polymer loadings, then it passes through a maximum value of 3.3×10-3
min-1
for a
moderate 6.5 µg PEDOT:PSS loading and, finally, declines slightly for higher weights
of inserted polymer.
Owing to the high complexity of the studied system, which involves species such
as cyt c, PEDOT, PSS and the silica layer, the analysis of the observed drop occurring,
roughly, above 8 g PEDOT is not straightforward. Despite this, two are the most
reasonable hypothesis that could explain this behavior. On the one hand, the high
amount of PEDOT:PSS filling the silica pores may restrict the free movement of cyt c,
causing a growing number of these molecules not to settle adequately for the charge
transfer.68
On the other hand, the existence of a vertical conductivity gradient at inserted
PEDOT:PSS masking the results should not be ruled out. Those silica pores away from
the ITO substrate (i.e. closer to the electrolyte solution) are richer in counteranions than
inner pores. Since the electrochemical reduction at 0.3 V promotes the cutback of
positively charges along the polymer chain, the different amount of available negative
charge could promote a conductivity alteration perpendicular to the electrode substrate.
It is not easy to discern between these two possibilities but, undoubtedly, the shift rate
Chapter 4
196
in Fig. 4.8.b is related with the effective population of cyt c transferring charge to the
electrode. Therefore, it is derived that a moderate amount of inserted PEDOT:PSS is
suitable to reach most of those formerly inactive (isolated) protein molecules showing
no other detrimental effects.
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
197
4.4. Conclusions
In this chapter the direct electron transfer between ITO electrodes and cytochrome
c molecules encapsulated within partially methylated silica matrices (SiO1.87Me0.26) has
been studied. As expected, it was found that increasing the amount of cyt c results in
higher peak currents related with the redox transformation of the protein iron center.
However, the proportionality between immobilized cyt c amount and recorded redox
current breaks at high cyt c loadings. This observation strongly suggests that a portion
of the encapsulated electroactive protein actually exists in non-accessible sites of the
dielectric silica matrix. The electrochemical insertion of a conducting polymer
(PEDOT:PSS) through the silica matrix proved a successful strategy to connect the
electrode surface with those formerly isolated protein molecules.
The kinetics of the electron transfer between protein and ITO electrode was
followed by in situ UV-vis spectroelectrochemical experiments. The presence of
PEDOT inside the silica produced up to a 3-fold enhancement in the protein reduction
rate. However, it was demonstrated that the amount of inserted polymer plays a
significant role on the electrochemical reduction rate. Small and moderate loadings
resulted in better performance than higher PEDOT:PSS loadings, probably due to the
restriction imposed by the conducting polymer to the free movement of cyt c, since a
suitable orientation of the iron redox center is required for the charge transfer. The
presence of low conductivity domains in the PEDOT:PSS material could be also at the
origin of the observed effect and this possibility should not be ruled out. For a film
containing 0.5 mg protein, the best electrochemical reduction rate was obtained after the
Chapter 4
198
insertion of 6.45 µg PEDOT, a value that corresponds to 1.1 units of EDOT monomer
per cyt c molecule.
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
199
4.5. Appendix A. Supplementary data
0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
log (
I p)
log (scan rate)
A
0 5 10 15 20 250
2
4
6
8
10
12
14
16
18
I (
A)
(Scan rate)^0.5 (mV s-1)
0.5
B
Figure S1. (A) Evolution of the log of the intensity for the oxidation at 0.86 V of cyt c against the log of
the voltammetric scan rate for a electrode cyt c(0.5 mg)@SiO1.87Me0.26. Data were fitted to a linear
relation with a slope of 0.56. (B) Randles-Sevcik plot for the oxidation at 0.86 V of cyt c for an electrode
cyt c(0.5 mg)@SiO1.87Me0.26.
Chapter 4
200
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010E
lectr
oa
ctive
cyt c (
mg)
Encapsulated cyt c (mg)
Figure S2. Electroactive cyt c determined from Randles-Sevcik plot against the encapsulated cyt c
loading.
400 450 500 550 600 650 700
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Absorb
ance
/ nm
solution
@SiO2
Figure S3. UV-vis spectra of cyt c 50 mg mL-1
in PBS solution (black solid line) and cyt c encapsulated
in silica cyt c(0.5 mg)@SiO1.87Me0.26 (red dashed line).
ENHANCEMENT OF THE DIRECT ELECTRON TRANSFER TO ENCAPSULATED CYTOCHROME C
BY ELECTROCHEMICAL FUNCTIONALIZATION WITH A CONDUCTING POLYMER
201
400 500 600 700
0.12
0.13
0.14
0.15
0.161.1V
Ab
s /
u.a
.
/ nm
PEDOT 6.5 g
0.3V
Figure S4. In situ UV-Vis spectra collected for ITO/PEDOT:PSS electrode in PBS solution at different
potentials.
Chapter 4
202
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Chapter 4
212
V
215
Capítulo 5
5. Hydrogen Peroxide biosensor based on
Cytochrome c immobilized in a Silica-modified
electrode
216
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
217
5.1. Introduction
The recognition abilities of biological organisms for foreign substances have
become an interesting research topic. Scientists have developed new chemical analytical
tools, known as biosensors that convert a biological response into an electrical signal.
These devices have many favourable analytical characteristics, such as high selectivity,
sensitivity, portability, high speed of response, low cost and potential for
miniaturization.1
A wide range of reactive oxygen species (ROS), including superoxide anion
radical (·O2-), hydroxyl radical (·OH), peroxyl (ROO·), nitric oxide (NO·), singlet
oxygen (1O2), and hydrogen peroxide (H2O2) are produced metabolically in living
organisms. ROS are considered as the mediators of cellular pathology in association
with aging and severe human diseases such as cancers and cardiovascular disorders.2-6
Among the ROS, H2O2 is the most stable compound which can diffuse across
membranes through water channels, causing oxidative protein modifications at distal
areas.7 Consequently, a sensitive method for reliable determination of H2O2 is
necessary. The determination of H2O2 is of considerable importance in many different
fields, such as clinical, food, pharmaceutical, and environmental analysis.8
It is well established that oxidative stress is an important cause of cell damage
associated with the initiation and progression of many diseases. Moreover, all air-living
organisms contain antioxidant enzymes that limit oxidative stress by detoxifying
reactive oxygen, including H2O2. Morgan et al. discuss the molecular mechanisms by
which H2O2 is sensed and the increasing evidence that antioxidant enzymes play
Chapter 5
218
multiple and key roles as sensors and regulators of signal transduction in response to
hydrogen peroxide.9
A researching review about various sensing materials used in enzyme-free H2O2
sensors was reported by Chen et al. Besides the determination of H2O2, this review
covers the recent progress for the determination of other compounds such as glucose or
uric acid, focusing on the electrocatalytical properties of the electrodes and the
performance of those devices.10
Heme proteins such as hemoglobin,8 myoglobin (Mb) and cytochrome c (cyt c)
are known to be able of catalyzing reduction of ROS as hydrogen peroxide.11
The model
molecule studied in this chapter has been cytochrome c (cyt c), which is a small heme
protein (MW= 12 384 Da) and it is generally used as an example to investigate the
dynamic and thermodynamic mechanism of the enzyme reaction and develop biosensor
for the determination of H2O2 or related compounds, due to its close similarity to
peroxidase.12
Prieto-Simón et al. analysed, in their critical review, the electrochemical
biosensors developed for the evaluation of the antioxidant capacity of specific
compounds such as cytochrome c, superoxide dismutase or DNA.13
In fact, Wang et al. developed several studies related to a sensitive biosensor
towards H2O2 based on the immobilization of cyt c on macroporous ordered silica foam
as host of the protein14
and a mesoporous interface assembled from carbon
nanospheres.15
Moreover, Salamifar et al. reported the design and fabrication of H2O2 sensor
using heme proteins immobilized on a macroelectrodes and ultramicroelectrodes
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
219
(UMEs). In this sensor design, the heme centers are directly “wired” to the electrode via
self-assembled monolayer (SAM).16
Eguílaz et al. reported the non-covalent functionalization of multi-walled carbon
nanotubes (MWCNTs) with cyt c with a critical analysis of the influence of the
experimental conditions on the exfoliation of the CNTs. The resulting biosensor
demonstrated a highly competitive strategy to quantify hydrogen peroxide.17
For this application it is convenient to perform the immobilization of the protein
on an electrode. Direct adsorption of enzymes/proteins onto the electrode surface may
frequently result in their denaturation and the loss of bioactivity. Therefore, a wealth of
nanomaterials such as nanoparticles,18
nanotubes,19
nanoporous materials14, 15
are
employed to immobilize the enzymes and at the same time, to connect their redox active
center to the electrode surface without losing its bioactivity.
The immobilization of proteins can be performed by using sol-gel method, which
is a soft chemical procedure that is carried out at room temperatures.20
Among the
advantages of using that kind of methodology for the immobilization of a protein stand
out the following: firstly, the silica matrices are optically transparent, affording optical
monitoring of the spectroscopic properties;21
secondly, a porous matrix is formed
around the protein molecule, entrapping in an aqueous media, and protecting it from the
bulk solution;22
finally, the resulting solids have been reported to be chemically,
thermally and structurally stable, and biomolecules immobilized by this procedure
retain their functional characteristics and properties.
Nevertheless, there are some drawbacks10
it is convenient to take care. Using sol-
gel method, the orientation of those active centers is not the most suitable, since in the
Chapter 5
220
porous matrix can appear large diffusional barriers that difficult the Direct Electron
Transfer (DET),23
loss of activity of the enzyme because of the orientation of the active
centers to the electrode surface,24
and leakage along time, since the porous matrix is
slowly filling of solution molecules.21
The electron transfer at a bare electrode surface is interrupted by the three
dimensional structure of the enzymes since the redox active centers can be shielded by
their insulated protein shells and unfavourable orientation on the electrode surface.25
Moreover, in previous chapters, it is known that some of the active centers of cyt
c remain closer to the electrode surface, but only a little percentage (~ 2 %) shows
electroactivity towards the DET.26, 27
This drawback has been solved by the
electrochemical insertion of a conducting polymer, poly(3,4-ethylenedioxy-thiophene)-
polystyrene sulfonate (PEDOT-PSS), through the silica pores. The presence of PEDOT-
PSS enhances the electron transfer since it connects the isolated proteins to the electrode
surface and furthermore, it has been concluded that the presence of this conducting
polymer inside the silica produced up to a 3-fold enhancement in the protein reduction
rate.27
On the other hand, the H2O2 reduction mechanism can be understood if previous
results related to the oxidation/reduction state of cytochrome c are evaluated. Alonso et
al. informed that cyt c is in its native state when it is encapsulated in the silica matrix.
They observed the Soret band at 409 nm, and a wide band centered at around 535 nm
which is called Q band in the electronic Ultraviolet-Visible spectrum.26
And this feature
is related to the oxidized state of the cyt c. Moreover, the last results showed that in the
reduced ferrocytochrome spectrum the Soret band shifted some nanometers to the red
area, and the Q band split into two well-defined bands at 520 nm and 549 nm, which we
called α and β bands, respectively.27
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
221
In this chapter, an amperometric biosensor has been developed which is included
in the Third Generation Biosensors since the Direct Electron Transfer between the redox
active biomolecule and the electrode surface is carried out. Here, the redox
enzyme/protein acts as an electrocatalyst, promoting the electrons between the electrode
surface and the substrate molecule involving no mediators in this process.26
Furthermore, in the present study, cytochrome c has been immobilized on an
electrode inserting electrochemically different amounts of PEDOT-PSS through the
silica matrix, and the effect of the presence of this conducting polymer in the detection
of H2O2 has been analysed.
Chapter 5
222
5.2. Experimental section
Cytochrome c (Cyt c) from horse heart (98 %), 3,4-ethylendioxythiophene
(EDOT) (97 %), poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) (p.a.), tetraethyl orthosilicate
(TEOS), triethoxy(methyl)silane (MTES) and hydrogen peroxide solution (wt. 30 %)
were purchased from Sigma-Aldrich. Hydrochloric acid (p.a.) was purchased from
VWR-Chemicals. Potassium dihydrogen phosphate (p.a.) and dipotassium hydrogen
phosphate (p.a.) were from Merck. All the aqueous solutions were prepared using
ultrapure water from an Elga Labwater Purelab system (18.2 MΩ cm).
Cyclic voltammetry was performed using a potentiostat (Autolab PGStat100N)
where a wave programmer and a digital recorder were included in the software Autolab.
The electrochemical cell was purged by bubbling a N2 flow for 20 min in the solution,
and the N2 atmosphere was maintained during the whole experiment. A platinum wire
was used as a counter electrode and an indium-tin oxide glass substrate (ITO Delta, CG-
60IN, 60 S cm-1
) was used as a working electrode. Before using it, the ITO glass was
degreased by sonication in an acetone bath and rinsed with an excess of deionized
water. A working electrode with a geometric area of 1 cm2 was immersed in the solution
for each electrochemical characterization. The electroactive area of ITO modified
electrodes was determined from the measurement of the electrical double layer charge.
A silver/silver chloride electrode (Ag/AgCl, 3 M KCl) immersed in the same electrolyte
solution was used as the reference electrode. All the potentials were referenced to the
reversible hydrogen electrode (RHE).
Amperometric experiments were performed in N2-saturated phosphate buffer
solution (0.15 M K2HPO4 + 0.10 M KH2PO4) by applying a certain value of potential as
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
223
a working potential and allowing the transient current to reach a steady-state value prior
to the addition of the analyte and the subsequent current monitoring. All experiments
were performed at room temperature.
For the synthesis of the silica-modified electrodes containing cyt c, two stock
solutions were prepared as follows:
Solution 1, Methyl-modified silica precursor solution was prepared by mixing
1.48 mL TEOS (6.63 mmol) and 0.464 mL MTES (2.33 mmol) with 2.983 mL HCl
0.01 M under magnetic stirring conditions at room temperature during two hours in a
closed vial. Then the resulting solution was rota-evaporated until the complete removal
of the stoichiometric amount of ethanol released from the hydrolysis reaction.
Solution 2, cytochrome c solutions with concentration ranging between 10-100
mg mL-1
were prepared by dissolving the protein in a phosphate buffer solution (PBS,
pH 7) of K2HPO4 0.15 M + KH2PO4 0.1 M.
For the encapsulation and immobilization of cytochrome c on the electrode 20 µL
of solution 1 plus 20 µL of solution 2 were placed in an Eppendorf vial. The
concentration of cytochrome c in this silica solution ranged from 5 to 50 mg mL-1
.
20 µL of this mixture was dispensed over a clean ITO electrode. After 20-40 s, a
homogeneous silica gel containing cyt c is formed over the ITO surface.
For simplicity, the mass of cyt c loaded in the silica gel has been used to label
each material. For example, the electrode prepared from a precursor solution containing
10 mg mL-1
of protein is labelled as cyt c(0.2 mg)@SiO1.87Me0.26.
Chapter 5
224
The electropolymerization of PEDOT-PSS was performed by the potentiodynamic
method in an aqueous solution containing 0.15 % PSS + 45 mM EDOT monomer. The
mixture was sonicated for 10 min to solve the monomer in the surfactant solution. The
polymerization of PEDOT-PSS was performed using cyclic voltammetry. Details on the
electropolymerization were given in chapter 4.27
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
225
5.3. Results and discussion
Figure 5.1 shows the chronoamperogram of the reduction process of H2O2
applying a potential value of 0.5 V vs RHE and using an ITO electrode modified with a
silica matrix. Several aliquots of H2O2 at higher concentration each time were added
into the solution cell. Firstly, it can be observed the data for the electrode in which there
is no protein in the silica matrix (black line) and a slightly change in the current density
can be observed during the first 10 minutes of the performance. After that, from the
fourth aliquot of H2O2 (8.4·10-5
M H2O2 in solution) to the following, the changes in the
current density become evident. On the other hand, a second electrode in which
cytochrome c (0.5 mg) has been encapsulated in the silica gel (red line) can be
observed. Here, it can be clearly appreciated the changes in the current density during
the whole performance. It is possible to observe that from the first aliquot of H2O2
(1.5·10-5
M H2O2 in solution) to the latter a significant change in the reduction current is
observed in the system. So, it indicates that the protein rises up the electrocatalytic
performance for the reduction of H2O2.
Chapter 5
226
0 10 20 30
2.6·10-4M8.4·10
-5M2.5·10
-5M
4.6·10-4M1.6·10
-4M4.5·10
-5M
t / min
1.5·10-5M
0,2 A cm-2j
Figure 5.1. Chronoamperogram of the reduction process of H2O2 applying a potential value of 0.5 V vs
RHE, analysing the effect of the amount of cytochrome c encapsulated in the silica matrix: no protein
(black line) and 0.5 mg cyt c immobilized in gel (red line).
Stable current obtained after the addition of each aliquot has been plotted as a
function of the concentration of H2O2 in order to analyse the sensitivity to H2O2 for each
electrode.
Figure 5.2 shows the plot of current density vs the concentration of H2O2 in the
electrochemical cell for three electrodes containing different amounts of cytochrome c
encapsulated in the silica matrix. First, for the electrode in which no protein has been
encapsulated in the silica gel it is possible to observe a linear trend up to 4.6·10-4
M
H2O2 which slope value is -0.59 mA cm-2
M-1
. For the electrodes that contain the redox
cyt c, a linear trend between 0 to 4.6·10-4
M H2O2 can also be appreciated. The slope
values in these cases are higher than in silica and indicates a better performance for the
detection of H2O2 (increased sensitivity). The sensitivity amounts to -1.42·mA cm-2
M-1
when 0.05 mg of cytochrome c have been immobilized, meanwhile a value of -2.82·mA
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
227
cm-2
M-1
is reached when 0.5 mg of cytochrome c was encapsulated. Table 5.1 shows
the values of sensitivity obtained for all the electrodes.
0,0 1,0x10-4
2,0x10-4
3,0x10-4
4,0x10-4
5,0x10-4
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
0,0
0,5 mg cyt c
0,05 mg cyt c
j / A
·cm
-2
[H2O
2] / M
0 mg cyt c
Figure 5.2. Plot of current density vs the concentration of H2O2 in electrochemical cell in cyt c
encapsulated in silica matrix at different amounts of protein, 0 mg cyt c (filled circles);
0.05 mg cyt c (empty circles); 0.5 mg cyt c (red squares).
Table 5.1. Slope values (sensitivity) of different modified electrodes in
chronoamperometric performance of H2O2.
Electrode Sensitivity / mA cm-2
M-1
0 mg cyt c - SiO1.87Me0.26 0.59
0.5 mg cyt c - SiO1.87Me0.26 2.82
0.5 mg cyt c - SiO1.87Me0.26 -
0.04 µg PEDOT:PSS 5.80
Chapter 5
228
Cyt c encapsulated catalyses the H2O2 reduction reaction following the
mechanism indicated below (Fig. 5.3). At the detection potential (+0.5 V vs RHE) the
heme protein encapsulated in the silica matrix is in its reduced state (see Fig.4.1 in
chapter 4). H2O2 is reduced to H2O at the heme center of the protein while
ferrocytochrome c is oxidized to ferricytochrome c. In the present case, for a cyt
[email protected] electrode, only a little percentage of cyt c is electroactive since a major
fraction of this protein remains isolated on the electrode surface. For that reason, the cyt
[email protected] electrode has been functionalized with the conducting polymer
PEDOT-PSS.
Figure 5.3. Mechanism of electrocatalytic reduction process of H2O2 in chronoamperometric
measurements.
Experiments for the detection of H2O2 have been performed in the system in
which cyt c (0.5 mg) has been encapsulated in the silica matrix and different amounts of
the conducting polymer PEDOT-PSS were electrochemically inserted.
Fig. 5.4.a shows the plot of current density vs the concentration of H2O2 in the
electrode cyt c (0.5 mg) encapsulated in silica matrix with different amounts of
electrochemically inserted PEDOT-PSS. For the ITO electrode which contains 0.08 µg
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
229
PEDOT-PSS a linear range can be distinguished from 0 to 1·10-4
M H2O2 with a slope
value of –2.52 mA cm-2
M-1
. The following electrode which corresponds to 0.4 µg
PEDOT-PSS shows a higher slope value of -5.80 mA cm-2
M-1
which is double larger
than the previous one, considering the same range of H2O2 concentration. For a
moderate amount of PEDOT-PSS (0.9 µg), a slightly lower slope value of -4.56 mA cm-
2 M
-1 is reached up to 10
-4 M H2O2.
At higher concentration of H2O2, a second linear range from 1·10-4
to 5·10-4
M
with a lower slope is observed in all of three electrodes.
The effect of the inserted amount of PEDOT-PSS has been fully examined. For
performing it, a batch of different deposits of the conducting polymer within the porous
matrix that includes the protein encapsulated has been carried out.
Fig. 5.4.b shows the sensitivity (slope values of the linear range) of the
electrocatalytic reduction of H2O2 against the inserted amount of PEDOT-PSS in the
silica matrix. The sensitivity values have been worked out considering the linear range
from 0 to 1·10-4
M H2O2 (see Fig. 5.4.a). Here, a positive effect of the presence of
PEDOT-PSS in the reduction performance of H2O2 can be observed (see Table 5.1).
After the insertion of the first amount of polymer (0.08 µg PEDOT-PSS) there is no a
significant difference in the electrocatalytic reduction of H2O2, considering the electrode
in which no PEDOT-PSS has been inserted.
After this, however, a further enhancement in the sensitivity of H2O2 is observed
when 0.4 µg PEDOT-PSS are inserted and a plateau up to 3.6 µg PEDOT-PSS is
appreciated. For amounts of conducting polymer higher than 3.6 µg, the sensitivity
starts to decline. This result may indicate that high amounts of inserted polymer drives
Chapter 5
230
to the blocking of the matrix pores, hampering the electrocatalysis of cyt c for the
reduction of H2O2.
0,0 1,0x10-4
2,0x10-4
3,0x10-4
4,0x10-4
5,0x10-4
0.9 g0
00.4 g
[H2O
2] / M
0.2A·cm-2
0.27 g0
a
j
0,1 1 10
0
1
2
3
4
5
6
se
nsitiv
ity (
mA
·cm
-2·M
-1)
mass of PEDOT-PSS / g
b
Figure 5.4. (a) Plot of current density vs the concentration of H2O2 in cyt c (0.5 mg) encapsulated in
silica matrix cyt c (0.5mg) @SiO1.87Me0.26 modified with different amounts of inserted PEDOT-PSS:
0.08 µg (black circles); 0.4 µg (blue triangles); 0.9 µg (red circles); (b) Plot of slope values (sensitivity)
of reduction process of H2O2 against the amount of inserted PEDOT in a cyt c (0.5mg) @SiO1.87Me0.26.
HYDROGEN PEROXIDE BIOSENSOR BASED ON CYTOCHROME C IMMOBILIZED
IN A SILICA-MODIFIED ELECTRODE
231
5.4. Conclusions
In this chapter a biosensor for H2O2 detection was designed based on the
immobilization of the redox protein cytochrome c on a silica-modified electrode. The
silica matrix presents a good affinity and biocompatibility for cyt c, and the
encapsulated protein is able to promote the electrocatalytical reduction of H2O2 showing
an enhancement of 2 times higher in the reduction performance of the electrode.
On the other hand, since silica is not a conductive material, the insertion of
PEDOT-PSS was performed by electrochemical method to improve the performance of
the biosensor. The insertion of the conducting polymer within the pores of silica matrix
including the protein produces a 2-fold enhancement of the sensitivity related to the
reduction reaction of H2O2.
Chapter 5
232
5.5. References
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VI
239
Capítulo 6
6. Conclusiones generales
240
Conclusiones generales
241
A continuación, se resaltan las conclusiones generales:
Se han sintetizado electrodos funcionalizados electroquímicamente con el
polímero conductor poli(3,4-etilendioxitiofeno:poli(4-estirensulfonato) (PEDOT:PSS).
El polímero PEDOT:PSS presenta su estado dopado (conductor) en una ventana
amplia de potencial comprendida entre 0.2 – 1.2 V.
Al aplicar un potencial de oxidación al PEDOT:PSS se observa una activación de
los modos vibracionales propios del estado oxidado del polímero, sin haber una
degradación del material.
Se ha analizado la composición elemental de PEDOT:PSS que se compone
mayoritariamente de S proveniente del polielectrolito aniónico PSS, y por tanto, la
superficie del electrodo modificado PEDOT:PSS presenta carga neta negativa.
Electrodos modificados con PEDOT:PSS son capaces de transferir carga
electrónica a la proteína citocromo c (cyt c).
Electrodos funcionalizados con PEDOT:PSS presentan una velocidad de
transferencia electrónica al citocromo c de dos órdenes de magnitud mayor a la obtenida
empleando electrodos convencionales o modificados con SAMs.
Durante la oxidación de citocromo c con un electrodo modificado con
PEDOT:PSS los residuos de lisina (Lys) próximos al centro hemo interaccionan de
forma electrostática con la superficie cargada negativamente del polímero.
Se ha inmovilizado la proteína citocromo c en un electrodo basado en una matriz
de sílice funcionalizada con grupos metilo mediante el método sol-gel.
Capítulo 6
242
La relación entre la cantidad de proteína inmovilizada y la densidad de corriente
indica que menos de un 2 % de la proteína es electroactiva.
La inserción electroquímica de polímero conductor PEDOT:PSS a través de los
poros de la matriz de sílice sirve para conectar eléctricamente las moléculas de
citocromo c que han quedado aisladas de la superficie del electrodo.
Cantidades moderadas de PEDOT:PSS (1.3 – 7.2 µg cm-2
) presentan una óptima
respuesta de transferencia electrónica a la proteína.
La proteína cyt c encapsulada en sílice puede ser reducida electroquímicamente en
ausencia de polímero. La inserción de PEDOT:PSS triplica la velocidad de este proceso
de reducción.
La proteína incluida en la matriz de sílice presenta buenas propiedades
electrocatalíticas para la reducción de H2O2, obteniéndose una relación lineal entre la
corriente medida y la concentración de este analito (hasta 5·10-4
M H2O2).
Se ha empleado el sistema proteína inmovilizada en la matriz de sílice en la
detección de peróxido de hidrógeno (H2O2) para desarrollar un biosensor electroquímico
de tercera generación.
La inserción de PEDOT:PSS (0.4 - 4.0 µg cm-2
) produce una mejora de la
sensibilidad del biosensor para concentraciones de H2O2 de hasta 10-4
M.
