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Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) 1568–1575

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Alimentario y Chemic un l Tóxicoology

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Supercritical fluid Extracción de orégano (Origanum vulgare) essentials aceites:Anti-Enflammatory las propiedades basaron en cytokine respuesta en THP-1 macrophages

Un. Ocaña-Fuentes *, E. Arranz-Gutiérrez, F.J. Señorans, G. RegleroDepartamento de Química- Física Aplicada, Área de Tecnología de los Alimentos, Facultad Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, C/Fco Tomás y Valiente 7, Madrid E-28049,

España

U n r t i c l e i n f o

Historia de artículo:

Recibido 1 febrero 2010

Aceptado 17 Marcha 2010

Palabras clave:

Supercritical Extracción

Orégano

Anti-Enflammatory respuesta

Cytokine Sabinene

Hidrato Thymol y

carvacrol.

U n b s t r u n c t

Dos fracciones (S1 y S2) de un orégano (Origanum vulgare) extrae obtenido por supercritical fluid extraction ha solido prueba anti-enflammatory efectos humano activado encima THP-1 células. El principal com- presente de libras en el supercritical fracciones de extracto de orégano eran trans-sabinene hidrato, thymol y carvacrol. Toxicidad de fracciones estuvo evaluada utilizando el mitochondrial-respiración-dependiente 3-(4,5- dimethylthiunzol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) método de reducción para varias concentraciones dur-ing 24 y 48 h de incubación. Las concentraciones más altas que 30 lg/mL de ambos supercritical S1 y S2 oreg-ano Las fracciones causaron una reducción en célula viability en una dosis-manera dependiente. Oxidized-LDLs (oxLDLs) activUnted THP-1 macrophlas edades estuvieron utilizadas como modelo celular

de atherogenesis y la secreción/de liberación de cytokines (TNT-un, IL-1b, IL-6 e IL-10) y su respectivo mRNA expresiones wantes de quantified ambos en presencia o ausencia de supercritical extractos de orégano. Los resultados mostraron una disminución en pro-enflamma-tory TNF-Un, IL-1b e IL-6 cytokines síntesis, así como un aumento en la producción de anti-enflamma-. tory cytokine IL-10. Estos resultados pueden sugerir un anti-enflammatory efecto de extractos de orégano y su compounds en un modelo celular de atherosclerosis..

2010 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservaron.

1. Introducción

AtherosclerosEs es una enfermedad progresiva caracterizada por la acumulación de lípidos y fibrous elementos en las arterias grandes. Crónico enflammation juegos una función importante en el development de atheroscler osis. Esto enflammation es el mecanismo que las respuestas de cuerpo a las interacciones entre modified lipoproteínas, monocitos, macrophages, T-células y arteriales endothelial células (Hansson, 2005; Libby, 2008; Zhao et al., 2005). Activado leuko- cytes, endothelial células y macrop henvejece producto pro-enflunmmatory cytokines incluyendo interleukin (IL)-1b, IL-6, así como. Tumor necrosis factor-un (TNF-un) y anti-enflsoy m atory cytokines,Como el cytokine IL-10 (Jung et al., 2008; Zhao et al., 2005). Estas células también producto pro-enflammatory enzimas, el inducible formas de óxido nítrico sintase (iNOS) y cyclooxyge nase (COX), los cuales son responsables para crecientes los niveles de óxido nítrico (NINGÚN) y pros- taglandins (PEG2) y es sabido de ser implicado en varias enfermedades crónicas que incluyen colon o esclerosis múltiples cáncer (Wu y Ng,. 2007).

Abreviaturas: oxLDLs, oxidized lipoproteínas de densidad baja; TNF, tumor

necrosis factor; IL, interleukin; ELISA, enzima-enlazado immunosorbent ensayo.

* Autor correspondiente. Tel.: +34 914978128; fax: +34 914978255.

Dirección de email: [email protected] (Un. Ocaña-Fuentes).

El uso de plantas con pharmaceut ical las propiedades tiene recibió interés aumentado hoy en día de ambos homeopathic y allo- pathic ramas. Además, estas plantas medicinales juegan una función importante en público salud, especialmente en países en desarrollo. Orégano (Origanum vulgare) es una planta aromática de el Mediterraneun flora aquello ha sido comúnly utilizó para propósitos médicos (Bukovska et al., 2007; Juhás et al., 2008). Algunos estudios anteriores haber re- ported antioxidante y antimicrobial actividades de extractos de orégano en la inhibición de Helicobacter pillori crecimiento (Chun et al., 2005; Wojdylo et al., 2007). El orégano también ha sido descrito tan anti- enflammatory cuándo utilizado tan tratamiento para colitis en ratones decreas- ing los niveles de el pro-enflammatory cytokines IL-1b, IL-6, GM-

CSF Y TNF un (Bukovska et al., 2007). Además, ha sido re-ported Que el uso de los aceites esenciales de orégano proporcionan un inter- esting perspectiva en la prevención de neurodegener untive desórdenes (Loizzo et al., 2009).

However, el biologicun l actividad de estas plantas fuertemente de- pends en su compositiencima. Thymol Y carvacrol es dos com- presente de libras en orégano con probado antioxidante y antimicrob ial properties (Mastelic et al., 2008). Carvacrol También ha mostrado un antiproliferative actividad en células de tumor de HeLa (Mastelic et al., 2008). Por otro lado, thymol ha mostrado beneficial ef- fects en el estado antioxidante de el cerebro de rata, el cual puede en la vuelta tiene enfluenced el concentration de docosahexaen oic ácido (DHA) (Youdim y Decanos, 2000). En este sentido, nuestro grupo tiene anteriorly

0278-6915/$ - ver asunto de frente 2010 Elsevier Ltd. Todos los

derechos reservaron. doi:10.1016/j.fct.2010.03.026

Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) 11 Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010)

demonstrated La actividad antioxidante de extractos de orégano obtuvo por subcritical extracción de agua que utiliza en vitro ensayos (Rodríguez- Meizoso et al., 2006).

Supercritical fluid extraction (SFE) Con CO 2 es una

tecnología de presión alta, consideró un método atractivo comparó a conven- tional técnicas como destilación de vapor o Soxhlet extracción porque evita soluto contaminatión con residuos solventes y el degradatión de termolabile compuestos (Almeida y Ferreira,. 2007). En este sentido, supercriticun l fluid extracción con CO 2

es en demanda creciente para producir alto-extractos de calidad de material de planta con propiedades medicinales (Mukhopadhyay, 2000) includ- ing orégano (Cavero et al. 2006).

El objetivo de este estudio es para describir el anti-enflsoym atory ef- fects de extractos de orégano natural obtuvieron por SFE, en un en vitro modelo de atheroscler osis y otras enfermedades crónicas, utilizando humano macrophages activó con oxidized lipoproteína de densidad baja (oxLDLs). Estos extractos podrían ser utilizados en el desarrollo de comidas funcionales nuevas para la prevención o tratamiento de enflammation-enfermedades crónicas basadas.

2. Materiales y métodos.

2.1. Supercritical fluid Extracción de materiales de planta

Secado y hojas de orégano molidas criogénicas (O. Vulgare) estuvo

sometido a supercritical fluid extracción (SFE) con C O2. El supercritical las

extracciones eran automovilísticas- ried fuera en un pilotos-planta-escala

supercritical fluid extractor (Thar Tecnología, Pitt- burgh, PA, EE.UU., modelo

SF2000) de 2 L capacidad que utiliza puro supercritical CO2 en una presión de 30

MPa y una temperatura de 40 C. Extractos de orégano estuvieron fraccionados

utilizando un dos-cascade depressurized el sistema constó de dos separators

(separator 1 y 2). Condiciones de fraccionamiento eran como sigue: separator 1

estuvo mantenido en una presión constante y temperatura de 15 MPa y 40 C,

respectivamente, mientras que separator 2 estuvo mantenido en una presión de 2

MPa, y una temperatura de 40 C. Bajo estas condiciones dos fracciones

estuvieron obtenidas, orégano S1 y orégano S2, correspondiendo a separator 1 y

2, respectivamente.

2.5. Citotoxicity Ensayo

SFE Extrae la toxicidad estuvo evaluada utilizando el mitocondrial-

respiración-depen- abolladura 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium (MTT) reducción meth- od. THP-1 células eran plated en 96

wells platos, diferenciados e incubated con concentraciones diferentes de extractos

de orégano para 24 y 48 h en 37 C in 5% CO2. Después de que tratamiento, las

células estuvieron lavadas con PBS e incubated con MTT 1 mg/mL en PBS para 2

h en 37 C in 5% CO2. Después, formazan los cristales produjeron de MTT por el

mitocondriales hydrolase, sólo activa en las células viables eran solubilized en

lysis buf- fer (10% SDS en 50% dimetilformamida pH = 7) y la absorbancia de cada

bien era entonces leído en 540 nm utilizando un microplate lector (Sunrise

Remoto, Tecan). La densidad óptica de formazan formado en células de control (sin

tratamiento con extracto) estuvo tomado cuando 100% viability.

2.6. Bioactivity Ensayo

Fracciones S1 y S2 estuvo disuelto en dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma–Al- drich) a concentración accionaria de 10 mg/mL determinado como las dosis máximas no cytotoxic por de célula viability ensayos. THP-1 células eran platted y diferenciados en 24 bien platos. Después de que diferenciación, las células estuvieron lavadas con PBS y activados con o sin Cu2 + oxidized LDLs

(Steinbrecher, 1987) para 24 h e incubated con el extracto diluido en FBS medio libre, para 24 o 48 h en 37 C in 5% CO2. Después- wards, el supernatant estuvo

congelado y el ARN de células estuvo aislado. Aliquots Estuvo analizado para determinar concentración de proteína y ocultado cytokines.

2.7. Enzima-enlazado immuno sorbent ensayo para quantificatión de cytokines.

Supernatants Era centrifuged en 12,000 rpm (Hettich, Universal 320-R, diam- eter 20 cm) para sacar debris, y almacenado en 80 C hasta que análisis para cytokine anal- ysis. IL-10, IL-1b, IL-6 y TNF- un era quantified utilizando ELISA cajas de BD. Biosciences, según las instrucciones del fabricante. 100 lL de 1:10 medio diluido estuvo añadido a anti-cytokine anticuerpo coated polystyrene wells e incubated para 2 h. Después de lavar, los platos eran incubated con biotin-labeled segundo- ary anticuerpo para 1 h. Los platos estuvieron lavados e incubated para 30 min en la oscuridad con solución de substrato. Solución de parón estuvo añadida y la absorbancia leída en

450 nm con k corrección en 570 nm utilizando un microplate lector (Sunrise

Remoto, Te- puede Austria GmbH, Grödig, Austria).

2.8. Aislamiento de ARN total

2.2. Análisis de el supercritical extracto por GC/SeñoraARN Total de THP-1 células estuvo aislada utilizando el

Trizol

Reactivo de invitro-.

Caracterización de el supercritical orégano de fracciones del orégano S1 y orégano S2 estuvo llevado a cabo por un GC-2010 (Shimadzu, Japón), equipado con una ruptura/splitless inyector, control de presión electrónica, AOC-20i inyector de coche, GCMS-QP2010 masa de Plus detector de espectrómetro, y un GCMSSolution software. La columna utilizó era un ZB-5 (Zebron) capillary columna, 30 m 0.32 mm yo.D. Y 0.25 lm la fase gruesa-

ness. Helio, 99.996% estuvo utilizado como gas cargador en un flow de 1

mL/Horno de min. tem- perature la programación era 60 C isotermo para 4 min,

aumentado a 64 C un t 1 C/ min, entonces aumentado a 106 C en 2.5 C/min.

temperatura de Horno era entonces aumentada de 106 a 130 C un t 1 C/min, y

entonces a 200 C un t 5 C/min, y entonces a un final temperatura de 250

C/min en 8 C/min cuál estuvo mantenido constante para 10 Muestra de min.

Inyecciones (1 lL) estuvo actuado en modo partido (1:20). La presión de ensenada de el automovilístico-rier El gas era 57.5 kPa . Temperatura de inyector era de 250 C y fuente de ión de la SEÑORA y

gen. Células (5 105) estuvo homogeneizado en 200 lL de Trizol

reactivo y, si

neces-sary, almacenado en 80 C. Homogeneización siguiente, las muestras quedaron

para descansar en temperatura de habitación para 5 min. Después, 40 lL del cloroformo estuvo añadido, el vigor de tubos- ously sacudido para 15 s y dejado para descansar en temperatura de habitación para 5 Tubos de min. era entonces

centrifuged En 12,000g (VWR, Galaxia 4D, diámetro 14 cm), 4 C para 15 min.

El acuoso (superior e incoloro) la fase estuvo transferida a un tubo nuevo.

Isopropyl alco-

hol (100 lL) estuvo añadido a la fase acuosa; el tubo era entonces suavemente mezclado y

Mesa 1

Composición de el supercritical extractos de orégano (Origanum vulgare L.), orégano

S1 y orégano S2. Contribución de cada compuesto a el total chromatographic área.

N- Yo: no-identified compuesto. R.Yo.: Índice de retención lineal. n.d. No-detectó.

Temperaturas de interfaz eran 230 y 280 C, respectivamente. El espectrómetro de

masa estuvo utilizado en modo de TIC, y las muestras estuvieron escaneadas de 40

a 500 m/z unidades. Com-

Compuesto Tiempo de retención (min)

R.Yo. % Área(Orégano S1)

% Área(Orégano S2)

Libras thymol, carvacrol y linalool era identified por comparación con estándar.

Masa spectra obtuvo en las mismas condiciones y comparados con la masa spectra Sabinene 10.20 971 n.d. 1.04

De biblioteca Wiley 229. Los restos de los compuestos eran identified por comparación con

Alfa-terpinene 12.52 1015 n.d. 0.74

La masa spectra de Wiley 229 biblioteca y por su índice de retención lineal. P-cymene 12.94 1023 5.70 1.78Limonene 13.19 1027 n.d. 0.57

Gamma-terpinene 14.93 1057 2.48 3.742.3. Cultura de célula Cis-sabinene 15.39 1065 2.76 3.67

HidratoHumano THP-1 célula de monocitos línea (Colección de Cultura de Tipo americana, ATCC)

Trans-sabinene 17.17 1096 45.21 45.05Estuvo mantenido en suspensión en RPMI 1640 medio de cultura (ATCC) supple- Hidratomented Con 10% FBS (GIBCO), 100 U/ml penicilina (GIBCO), 100 mg/ml streptomy- Linalool 17.35 1100 2.29 1.62cin (GIBCO), 0.05 mM b-mercaptoethanol (Sigma–Aldrich) y 2 mM L-glutamina 4-terpineol 21.74 1175 2.60 5.14(GIBCO), en una densidad de 3–9 10

5 células/ml en 37 C en 5% aire 95% CO2. Las células

eran dis-Alfa-terpineol 22.52 1189 2.37 2.84

carded Y reemplazado por stocks congelados cada 15 pasos. N-Yo 25.09 1231 n.d. 0.73


Las células eran pelleted vía centrifugación y evaluado para viability utilizando el Probar-

Linalyl Acetato 26.40 1254 1.62 1.51Cacerola-método de exclusión azul. Las células viables eran plated en una densidad de 5 10

5 células/ Thymol 28.65 1291 24.10 19.81

mL En 96 o 24 wells platos (100 lL y 1 mL respectivamente) e incubated con Carvacrol 29.23 1300 7.99 7.1712-myristate, 13-acetato (PMA) 100 ng/ml (Sigma–Aldrich) para 48 h en FBS libre Trans-caryophyllene 37.80 1412 n.d. 1.63Medio. Después, el wells estuvo lavado con PBS y el tratamiento inició.

Thymyl Metilo 25.61 1240 1.33 2.09

2.4. Diferenciación de célula

Éter

Trans-sabinene

Acetato de

hidrato

26.17 1250 1.55 0.87

Cél

ula

C

élu

la


incubated En temperatura de habitación para 10 min. Después de que incubación, las muestras eran centrifuged en 12,000g, 4 C para 10 min. Un gel-gustar la pelotita estuvo formada y el isopropyl el alcohol sacó. La pelotita estuvo lavada con 200 mL de 75% Etanol en DEPC trea- ted H2O, y centrifuged en 7600, 4 C para 5 min. El etanol era entonces sacado y la pelotita dejada para secar hasta incoloro. ARN total era entonces disuelto en 15 lL de DEPC.

H2O, incubated en 55 C para 10 min y almacenado en 80 C para uso futuro.

Higo. 1. Estructuras químicas de el presente de compuestos principal en el

supercritical extractos de orégano S1 y orégano S2: (un) trans-sabinene hidrato, (b)

thymol y (c) carvacrol.

2.9. Expresión de gen quantificatión

ARN total aislado de THP-1 células era quantificated de IL-1 b, IL-6, IL-10 y

TNF- una expresión de gen que utiliza real-tiempo PCR. ARN total (10 ng/lL) estuvo utilizado tan tem- plato para cDNA la síntesis que utiliza la Caja de Archivo de Capacidad Alta de Aplicado Biosys-

tems, según las instrucciones del fabricante. Real-tiempo PCR estuvo actuado

utilizando Taqman Sondas (Aplicados Biosystems) siguiendo el fabricante

recom- mendations. El Taqman las sondas utilizaron era: Hs99999029_m1 para

IL-1b, Hs00174131_m1 para IL-6, Hs999999035_m1 para IL-10, Hs00174128_m1

para TNF-

Un, Hs01075529_m1 para iNOS, Hs00153133_m1 para Cox-2, Hs00765730_m1 paraNFkb-1, Hs01115512_m1 para PPAR-c, y Hs99999901_s1 para 18S rRNA. Niveles de expresión del gen eran entonces normalizados a 18S rRNA expresión y comparó..

2.10. Análisis estadístico

Todos los datos estuvieron expresados como el SEM ± malo (Error Estándar de

Malo). Para comparaciones variables solas, Estudiante t-la prueba estuvo utilizada.

Para comparaciones variables múltiples, el dato estuvo analizado por uno-análisis

de manera de varianza (ANOVA) siguió por Dun- nett prueba de comparación

múltiple y Bonferroni la prueba cuándo necesaria utilizando el GraphPad

Prisma software estadístico (GraphPad Versión de Windows de Inc. de Software 5). P

Valores menos de 0.05 estuvo considerado significant.

3. Resultados

3.1. CompositIón de el supercritical fracciones de orégano

Dos fracciones de el O. vulgare Deja extracto, orégano S1 y orégano S2, estuvo aislado utilizando supercriticun l fluid extracción con C O2 y su composición estuvo determinada por

gasista chromatogra- phy-mass espectrometría (GCMS) (ve Mesa 1). Para ambas fracciones, el presente de compuestos principal era trans-sabinene hidrato, thymol

Un120

100

80

60

24h toxicidad de Orégano en Macrophage-THP-1 células

** ** ** *** ****** *** ***

*** *** ******

Or eGunno S1

Or eGunno S2

******

*** ***

40

20

0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0μG/ml

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70μG/ml

B 120 48h toxicidad de Orégano en Macrophage-THP-1 células Or egano S1

Or egano S2

100

80

*****

** ***** **

*** ****** *** *** *** ***

******

***

60

40

20

0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0μG/ml

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70μG/ml


Higo. 2. Efectos de S1 y S2 supercritical fracciones de orégano en macrophage-THP-1 célula viability. Las células estuvieron tratadas con concentraciones crecientes de

extractos de orégano, de 0 a 70 lg/ml, para 24 h (2Un) o 48 h (2B). Célula viability estuvo determinado por el MTT ensayo. Los valores representan el SEM ± malo de seis experimentos independientes y statis tic signifiel catión está representado por **P valores menos de 0.01 (muy significant), y *** P valores menos de 0.001 (extremadamente significant).

Yo

L-6

(%

of

TN

F-α

(%

of

ox

L D

L-

CC

Ctr

l-C

trl-

Y

Yo

L-1

0 (

% o

f Y

oL

-1β

(% d

e o

xL

CC

Ctr

l-C

trl-

YY


Y carvacrol. Las estructuras químicas de estos compuestos están mostradas en Higo. 1.

3.2. Efecto de supercritical orégano S1 y S2 fracciones en THP-1/ Macrophage-gustar célula viability

Con anterioridad a el bioactivity estudio para evaluar anti-enflunm matory propiedades, citotoxicity de orégano de fracciones S1 y orégano S2 estuvo determinado. Para cada fracción un MTT el ensayo estuvo actuado para varias concentraciones durante 24 y 48 h de incubación. Higo. 2 espectáculos los efectos de los extractos de orégano en THP-1 derivated macrophages. Para ambas fracciones (orégano S1 y orégano S2), y para incubaciones hasta 48 h había no significant disminución en célulaviability Para concentrations hasta 30 lg/mL. Para concentracionesMás alto que 30 lg/mL de orégano S1 y S2 hay una reducciónEn célula viability en una dosis-dependent manera. Estos resultados sugieren que concentrations encima 30 lg/mL es tóxico y su uso era discarded para el trabajo presente.

3.3. Efecto de supercritical orégano S1 y S2 fracciones en el pro- y anti-enflamm untory cytokines liberación

Para activar el THP-1 macrophedad, Cu2+ oxLDLs estuvo añadido a el medio de incubación. Estos oxLDL trató las células mostraron un en- arrugar en la proteína total ocultada (el dato no mostrado) cuál estuvo utilizado como una indicación de macrophage activación.

Para ambos periodos de incubación (24 y 48 h) oxLDL-activó las células mostraron un aumento en la liberación de todo el pro- y anti-enflsoy m atory cytokines analizado (TNF-

un, IL-1b, IL-6, e IL-10, respectively) comparando a no-activa ted controles (Higos. 3Y 4 ).

Tratamiento de activó células con supercri tical S1 y S2 oregano resultados de extractos en una reducción global de pro-enflamma tory cytokines liberación. Células incubated para 24 h con orégano S1 u oreg-ano S2, mostró una disminución en los niveles de liberación de TNF -un en una dosis-Dependeent manera, logrando niveles basales de TNF- una liberación cuándo incubated con 30 lg/mL de extracto. Cuándo el tratamiento soportóPara 48 h, concentraciones de únicos 30 lg/mL de orégano S1 y S2 fracciones produjeron un significant disminución en TNF-una liberación. No-Activó las células eran también tratadas con orégano S1 y S2 fracciones. A pesar de que había una dosis disminución dependiente en TFN-un, este re- sult estuvo encontrado no significant dentro del concentration varía utilizado para 24 h tratamientos. En contrario, un significant disminución en TNF-una liberación estuvo observada para 30 lg/mL de extraer cuándo el tratamiento era de 48 h. En este caso, el uso de orégano S2 fracción mostró unMucho más significant disminución.

En cuanto a IL-1b, tratamiento con cualquier de las fracciones de orégano dirigieron a una disminución en el cytokine liberación a niveles basales en activó células. Para no-activó células, había no significant los efectos después tratan- ment para ambos 24 y 48 h incubaciones.

Activó las células trataron con orégano S2 para 24 h mostró un de- arrugar en IL-6 secreción en una dosis-manera dependiente,

hasta concentrations de 30 lg/mL. En activó las células trataron con orégano S1 había una disminución de IL-6 secreción hasta no activó controles. Para concentraciones de orégano S1 y S2

fracciones de 30 lg/mL re- sults mostró una disminución evidente en IL-6 secreción cuándo comparada a no-activa ted células de control. Para 48 h ensayos de incubación, resultados para ambos S1 y S2 fracciones mostraron un significant disminución en IL-6 secreción comparó a el control activado. En las células trataron con10 y 20 lg/mL de orégano S2 la secreción de IL-6 era signifi-cantly Más bajo que la secreción basal en no-activated controles. Con respecto al no-activó las células trataron con orégano S1 y S2.

Un

24 h dosis-efecto de extractos de orégano encima B 24 h dosis-efecto de extractos de orégano encima150 TNF-α Niveles 150 IL-1β niveles

100

50** *

* ******

** * ** *

*** *** *** ******

*** *** * **

100

50

******

*** *** ** * *

**** *****

****

05 10 20 30 10 20 30 10 20 30

010 20 30 5 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30

Or e Gunno S1 +oxL DLOr e Guno S2 +oxL DL

Or e Gunno S1 -oxL DL


Or e Gunno S1 +oxL DL




C150

24 h dosis-efecto de extractos de orégano encima

IL-6 niveles

D200

24 h dosis-efecto de extractos de orégano encima

IL-10 niveles

100

****** * *

** **** ** *

150

100

** ****

** *

** **** ***

***

*** *** *** ***

50 ** * ** * ** * ***50

05 10 20 30 10 20

***

30 10

** *

20

** *

30 10

***

20 30

** *

05 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30

Y

Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) 11 Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) Or e Gunno S1 +oxL DLOr e Gunno S2 +oxL DL







Higo. 3. 24 h dosis–efecto de 0, 10, 20 y 30 lg/ml de S1 y S2 supercritical fracciones de orégano en la producción y secreción de TNF- un (3Un), IL-1b (3B), IL-6 (3C) e

IL-10 (3D) en macrophage-THP-1 células. Las células estuvieron diferenciadas y tratados tan descritos en Materiales y sección de Métodos. Indomethacin Es un positivo anti-enflammatory control. El dato representa significa ± SEM calculó de seis experimentos independientes con tres replicates para cada tratamiento. Statistic Dunnett múltiplo comparison prueba VS Ctrl + oxLDL signifiel catión está representado por *P valores: menos de 0.05 (significant), **P valores: menos de 0.01 (muy significant), y ** *P valores: menos de 0.001 (extremadamentesignificant). Statistic Bonferroni Prueba de comparación múltiple VS Ctrl-oxLDL signifiel catión está representado por P valores: menos de 0.01 (muy significant), y P valores: menos de.

0.001 (extremadamente significant).

IL-6

(%

de

oxL

DL

-T

NF

-α (

% o

f ox

LD

L-

CC

Ctr

l-C

trl-

YY

IL-1

0 (%

de

oxL

DL

-IL

-1β

(% d

e ox

LD

L-

CC

Ctr

l-ox

LD

LC

trl-

Y


Un

150

48h dose-effect de s ung e extr uncts on

TNF-α levels

B

150***

48h dose-effect of sung e ext runc ts on

YoL-1β levels

100*

** *

*** ** *

100

***

50 ** *

*** *** *** ** *

50 ***** * *** ** * ***

** *

** **** ** *

***** *

******

0 5 10 20 3010 20 30 10 20 30 10 20 30

0 5 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30

SUng e S1 +oxL DLSUng e S2 +oxL DL

SUng e S1 -oxL DL

SUng e S2 -oxL DL

SUng e S1 +oxL DL

SUng e S2 +oxL DL

SUng e S1 -oxL DL

SUng e S2 -oxL DL

C150

48h dosis-efecto de extractos de salvia encima

IL-6 levels

D

400

48h dosis-efecto de extractos de salvia encimaIL-10 levels

100

** * ** * * *

300

200

****** ** *

***

*** ** *

***

***** *

***

50 ** *

0

** * ** *** *

*** *** ** * ** * ***** *

100

0

**

***

5 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 5 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30

SUng e S1 +oxL DL Sage S2 +oxL DL

SUng e S1 -oxL DL

SUng e S2 -oxL DL

SUng e S1 +oxL DL

SUnge S2 +oxL DL

Sage S1 -oxL DL

SUng e S2 -oxL DL

Higo. 4. 48 h dosis–efecto de 0, 10, 20 y 30 lg/ml de S1 y S2 supercritical fracciones de orégano en la producción y secreción de TNF- un (4Un), IL-1b (4B), IL-6 (4C) e

IL-10 (4D) en macrophage-THP-1 células. Las células estuvieron diferenciadas y tratados tan descritos en Materiales y sección de Métodos. Indomethacin Es un positivo anti-enflammatory control. El dato representa significa ± SEM calculó de seis experimentos independientes con tres replicates para cada tratamiento. Statistic Dunnett múltiplo comparison prueba VS Ctrl + oxLDL signifiel catión está representado por *P valores: menos de 0.05 (significant), **P valores: menos de 0.01 (muy significant), y ** *P valores: menos de 0.001 (extremadamentesignificant). Statistic Bonferroni Prueba de comparación múltiple VS Ctrl-oxLDL signifiel catión está representado por P valores: menos de 0.01 (muy significant), y P valores: menos de.

0.001 (extremadamente significant).

Fracciones para 24 y 48 h, los resultados mostraron una reducción clara en IL-6 secreción en respetar a control no activado, para 10 y 20 lg/ mL concentrations, siendo el tratamiento con el más bajo concentration la mayoría de eficaz en reducir IL-6 secreción. En contrario, para ambos de la fracción de oréganos, 30 lg/mL el tratamiento no redujo el IL-6 secreción cuándo comparada a no-activa ted controles.

IL-10 secreción aumentada después de que tratamiento con cualquier de el oregano los extractos utilizaron. Para 24 h tratamientos, había un similares en- secreción arrugada de IL-10 para ambos extractos y para cualquier activados o no-activa ted células. El más bajo significant aumento en IL-10 secreción estuvo conseguida cuándo células era incubated con30 lg/mL de orégano S2. Para 48 h tratamientos en activó células, ambosLos extractos indujeron el mismo aumento en IL-10 expresión de alrededor. 2.5 tiempo el control activado. No-activó las células trataron con cualquier extracto de fracción tuvo un aumento más alto en IL-10 secreción que activó las células hicieron. Este aumento era similar

en ambos extractos ex- cept para 30 lg/mL de orégano S2, el cual era más bajo.

Para probar anti-enflammatory efectúa un grupo tratado con indomethacin (5 lg/ml) estuvo llevado a cabo como control estándar positivo(Kim et al., 2008; Berg et al., 1999). Extractos S1 y S2 en general mostrados un mejores anti-enflammatory efecto que indomethacin en este concentration, disminuyeing más el pro-

enflunmmatory cytokines (TNF-un e IL-1b) que indomethacin hizo e induciendo anti-enflsoy- matory liberación de IL-10 aquello no fue observado con indomethacin..

3.4. Efecto de supercritical orégano S1 y S2 fracciones en la transcripción de gen de enflammat ory cytokines

Relativo quantification (RQ) determinates el cambio en expres- sion de un pariente de secuencia del ácido nucleico a un control. Higos. 5 y 6.

Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) 11 Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) Representar el mRNA expresión para cada cytokine basó en suRQ Valores.

De acuerdo con el presente de resultados para cytokines liberación, transcripción de gen de analizado cytokines mostró un aumento en oxLDL-unc tivated células cuándo compared a no-activó células en ambos, 24 y 48 h, periodos de incubación..

TNF-Una disminución de expresión del gen sólo en activó las células trataron

Con orégano S2 en 24 h de incubación. Tratamiento de no-activated células con cualquier orégano S1 u orégano S2 mostró ninguna reducción en el transcription de este gen. En contraste a el re- sults presenteed para 24 h de incubación, en 48 h, transcription deEl TNF-un gen aumentó significantly para ambos activado yNo-activated células.

Por otro lado, expresión de IL-1 b gen decreased en activated las células trataron con ambas fracciones de orégano cuándo compared a células de control activado en 24 h de incubación. Aun así, tiempo de incubación más larga dirigió a un significant aumento en su expresión. En contrario, en el caso de no-activó células, tratamiento con orégano S2 aumentó la transcripción de IL-1 b en 24 h de incuba- tion. Este aumento estuvo encontrado para ser tres tiempo más alto en tiempo de incubación de 48 h. Tratamiento con orégano S1 mostró poco cambio transcription en 24 h, a pesar de que los resultados mostraron un aumento del IL-1b gen en 48 h.

Considerando IL-6 gen transcription, en el caso de activó células, el tratamiento con cualquier de las fracciones de orégano para ambos 24 y48 h tiempo de incubación, dirigido a gen transcription nivela cerrado a el logrado cuándo trabajando con no-activa ted células de control. Orégano único S2 causó un significant reducción en IL-6 transcription cuándo comparado con niveles de no activó células durante 24 h de incubación..

RR R

R


Un Effect of oregunno encima 24h mRNUn l evels of TNF- α

BEffect of oregano on 24h mRNUn l evels of yoL-1 β

1.5 1.5

1.0

0.5 ***

**

***

***

1.0

0.5

***

* ** **

***

0.0 0.0oxL DL + - + + + - - oxL DL + - + + + - -Or egano S1 30µg/ml - - - + - + - Or eGunno S1 30µg/ml - - - + - + -Or egano S2 30µg/ml - - - - + - + Or eGunno S2 30µg/ml - - - - + - +IndomethUnc in 5µg/ml - - + - - - - IndomethUnc in 5µg/ml - - + - - - -

C Effect of oregano on 24h mRNUn l evels of yoL-6

DEffect of oregano on 24h mRNUn l evels of yoL-10

1.5

1.0

0.5

**** *

******

*** ***

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

*****

oxL DL

0.0

+ - + + + - - oxL DL

0.0

+ - + + + - -

Or eGunno S1 30µg/ml

- Or egunno S2 30µg/ml

- Indomethunc in 5µg/ml

-

- - + - + -- - - + - +- + - - - -


- Or egunno S2 30µg/ml

- Indomethunc in 5µg/ml

-

- - +- - -- + -

- + -+ - +- - -

Higo. 5. Efecto después de que 24 h de tratamiento con 30 lg/ml de S1 y S2 supercritical fracciones de orégano en el gen de transcripción relativo quantificatión (RQ) de TNF- un (5Un), IL-1b (5B), IL-6 (5C) e IL-10 (5D) en macrophage-THP-1 células. Las células estuvieron diferenciadas y tratados tan descritos en Materiales y sección de Métodos. Indomethacin Es un positivo anti- enflammatory control. El dato representa significa ± SEM calculó de seis experimentos independientes con tres replicates para cada tratamiento. Statistic Dunnett prueba de comparación múltiple VS Ctrl + oxLDL signifiel catión está representado por *P valores menos de 0.05 significant **P valores menos de 0.01 muy significant y *** P valores menos de 0.001 extremadamente significant. Statistic ‘‘Bonferroni Prueba de comparación múltiple VS Ctrl-oxLDL signifiel catión está representado por

P valores menos de 0.01 muy significant y P

valores menos de 0.001 extremadamente significant.

En 24 h IL-10 gen transcription aumentó dos veces cuándo las células estuvieron tratadas con cualquier orégano S1 u orégano S2 extracto en activated las células de tratamiento compararon a no-trató niveles de células. En contrario, en tiempo de incubación de 48 h niveles de expresión del gen en activated las células trataron con el orégano estuvo reducido hasta no-activated niveles de células. Finalmente, en el caso de no-activa ted las células trataron con cualquier de fracciones de orégano y en ambos periodos de incubación, transcription de IL-10 gen no cambió comparado a no-activó células.

De modo parecido a cytokine liberación de proteína, anti-enflunm matory expresión de gen estuvo comparada a un grupo

tratado con indomethac in (5 lg/ml). Después de que 24 h de tratamiento, extractos S1 y S2 en general mostrados un altos anti-enflammatory efecto que indomethacin. Nunca-theless En 48 h el efecto opuesto era observard. Expresión de gen de anti-enflsoy m atory cytokine estuvo atenuado, mejoró el pro- enflammatory unos y presentes ed peores anti-enflammatory efectos que indomethacin en este periodo de tratamiento..

4. Discusión

Presente de resultados en este trabajo sugiere que supercriticun l orégano S1 y S2 fracciones pueden actuar tan eficaces inhibitors de oxLDL en- duced pro-enflammatory

cytokines (TNF-un, IL-1b e IL-6) secre- tion, y también tan enhancers de el anti-enflunm matory cytokine

IL-10 secreción, en macrophage THP-1 células. Pro-Enflsoym atory cytokines nivela decreased en una dosis-dep endent manera con cualquier fracción de orégano utilizada en tiempo de incubación de ambos 24 y

Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) 11 Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) 48 h. Estos resultados eran de acuerdo con los con respecto a la transcripción de cytokines genes en 24 h de incubación. Otros autores haber anteriormente informó un increment en cytokine secre- tion en activado macrophages trató con oxLDL (Osterud y Bjorklid, 2003). Los resultados similares han sido descritos para los aceites esenciales extrajeron de Cinnamom um osmophloeum, una tradición de hierba- el aliado utilizado en Asia como alimentario y como medicina qué contiene cinna- maldehyde. Estos essentials los aceites han sido también utilizados en murine macrophedades, causando anti-enflsoym atory efecto por decrecimientoTNF-Un, IL-6 e IL-1b secreciones (Chao et al., 2005). A nuestro sur-prise, después de que 48 h de tratamiento, TNF-un e IL-1b transcripciones de gen estuvieron aumentadas. IL-10 es un anti-enflamatory interleukin aquelloInhibe la secreción de pro-enflamma tory cytokines, probablemente por abajo-regulating NF-kB expresión (Bogdan et al., 1991; Scho- ttelius et al., 1999). Translocation De NF-kB a el núcleo está impedido por IL-10, el cual bloqueador IkB kinase actividad y también. Impide TNF-una degradación inducida de IkB kinase (BhattacharyyaEt al., 2004; Liu, 2005; Schottelius et al., 1999). NF-kB Es overex- pulsado en enflammation y realzar pro-enflammatory

cytokines como TNF-un, IL-1b e IL-6 (Asadullun h et al., 2008; Tak y Fuego- stein, 2001). Según nuestros resultados, supercritical el orégano ex-Los tramos causaron un downregulation de estos cytokines y por ello un anti-enflsoym atory efecto.

Presente de compuestos principales en supercriticun l extracto de orégano era sabinene hidrato, thymol y carvacrol. Anti-Enflunm matory efecto de thymol ha sido demoniostvalorados

en humanos neutrophiles incubated con 10 o 20 lg/ml de este compuesto (Braga et al., 2006). Edema de ratones está informado para ser reducido con una aplicación tópica

2**

***

****

1

*** ***0 0

oxL DL + - + + + - - oxL DL

+ - + + + - -Or eGunno S1 30µg/ml

- - - + - + - Or eGunno S1 30µg/ml

- - - + - + -Or eGunno S2 30µg/ml

- - - - + - + Or eGunno S2 30µg/ml

- - - - + - +End omethacin 5µg/ml

- - + - - - - IndomethUnc in 5µg/ml

- - + - - - -

0.0 0.0

oxL DL + - + + + - - oxL DL

+ - + + + - -


- - - + - + - Or eGunno S1 30µg/ml

- - - + - + -Or eGunno S2 30µg/ml

- - - - + - + Or eGunno S2 30µg/ml

- - - - + - +End omethacin 5µg/ml

- - + - - - - IndomethUnc in 5µg/ml

- - + - - - -

RR

RR


Un Effect de orégano encima 48h mRNA levels de TNF- α

BEffect De orégano encima 48h mRNA levels de IL- 1β

3

2 ***

4

** * ***3

**

******

1

C1.5

Effect De orégano encima 48h mRNA levels de IL-6.

D Effect de orégano encima 48h mRNA levels de IL-10.

1.5

1.0

0.5**

***

** * * **

1.0

0.5 ***

** ***

*** ***

Higo. 6. Efecto después de que 48 h de tratamiento con 30 lg/ml orégano S1 y S2 supercritical fracciones de orégano en el gen de transcripción relativo quantificatión (RQ)

de TNF- un (6Un), IL-

1b (6B), IL-6 (6C) e IL-10 (6D) en macrophage-THP-1 células. Las células estuvieron diferenciadas y tratados tan descritos en Materiales y sección de Métodos.

Indomethacin Es un positivo anti-enflammatory control. El dato representa significa ± SEM calculó de seis experimentos independientes con tres replicaticates para

cada tratamiento. Statistic Dunnett prueba de comparación múltiple VS Ctrl + oxLDL signifiel catión está representado por *P valores menos de 0.05 significant **P

valores menos de 0.01 muy significant y *** P valores menos de. 0.001 extremadamente significant. Statistic ‘‘Bonferroni Prueba de comparación múltiple VS Ctrl-oxLDL signifiel catión está representado por

P valores menos de 0.01

muy significant y P.

Valores menos de 0.001 extremadamente significant.

De 100 lcm/de g2 de carvacrol (Sosa et al., 2005). Además, antioxi- dant properties de thymol y carvacrol ha sido demonstrated en varios estudios, sugiriendo su uso como nutraceuticals ingredi- ents en el desarrollo de comidas funcionales noveles. Derivados de thymol y carvacrol ha sido descrito como antioxidante according a el DPPH radical scavenging método (Mastelic et al., 2008). Aceites esenciales de orégano y sus componentes carvacrol y thymol inhibió 3-nitrotyrosine formation, biomarker de el oxidative tensión, supporting el nutraceutical valor de orégano y el potencial de thymol y carvacrol en impedir el formation de productos tóxicos por la acción de especie de nitrógeno reactivo (Prieto et al., 2007). También, thymol y carvacrol impidió autoxidation de lípidos (Yanishlieva et al., 1999). Aun así, anti-enflsoym atory o efectos antioxidantes de sabinene el hidrato no ha sido descrito en literatura tan lejos.

En resumen, CO2 orégano supercritical extrae mostrado anti-

enflammatory propiedades por: (un) reduciendo la liberación de pro-enflsoy- matory cytokines, y (b) aumentando el anti-enflsoym atory secre- tion en activado macrophages. Nuestros extractos, orégano S1 y orégano S2 presentó no significant diferencias en su composi- tion, citotoxicity o efectos en el cytokine respuesta. Así que cualquiera de las condiciones fraccionarias utilizó en SFE es capaz de obtener la fracción ex- tramos con anti-enflsoy m atory propiedades. Estos resultados sugieren aquel orégano supercriticun l los extractos podrían ser utilizados como opciones noveles para el tratamiento de enfermedades crónicas basó encima enflammatory procesos.

Conflict De Interés.

Los autores declaran que hay no conflicts de interés..

Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) 11 Un. Ocaña-Fuentes Et al. / Toxicología alimentaria y Química 48 (2010) Acknowledgements

Los autores gratefully reconocer el financial soporte de Foncasal Comercial S.L. (Proyecto CENIT HIGEA CEN-20072003), el Comunidanuncio Autonoma de Madrid (ALIBIRD, número de proyecto S-505/AGR-1469) y Consolider Ingenio 2010 (Proyecto CSD/2007/063). E. Arranz Gustaría dar las gracias a Ministerio de Educación para el FPU predoctoral camaradería. Gracias a el Servicio de Bioquí- mica e Investigación, Hospital Ramón y Cajal para la donación de el LDLs y especialmente a Gema de la Peña Martin.

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