PROGRAMA DE TRABAJOS PRCTICOS

TRABAJO PRCTICO N 1.

A. Trabajo de laboratorio: Mostracin de microfotografas electrnicas de virus. Observacin microscpica de monocapas normales e infectadas con virus Herpes simplex. En la medida de lo posible, los alumnos realizarn coloraciones de Giemsa en monocapas previamente infectadas y no infectadas con virus. Caracterizacin del efecto citoptico viral.

B. Discusin: Conceptos de bioseguridad y profilaxis post-exposicin. Mtodos de diagnstico virolgico rpido: inmunofluorescencia indirecta, ELISA, aglutinacin, PCR, determinacin de IgM especfica. Comparacin con los mtodos de diagnstico clsicos. Seroconversin. Toma de muestras, envo al laboratorio.

Problemas para ser discutidos en el TP 1:

Problema 1.1.Basado en: Murria et al. (1995). A Morbillivirus that caused fatal diseases in horses and humans. Science 268:94-97

En la ltima primavera, en una cabaa de una zona rural surge un brote epidmico caracterizado por una infeccin respiratoria aguda en caballos, que al cabo de 2 semanas mata a 14 de los 21 caballos afectados. El centro nacional de sanidad animal no logra identificar el agente causal de esta enfermedad. Se lo consulta a Ud como mdico cuando dos criadores de dicha cabaa se ven afectados, presentando sbitamente un cuadro de dificultad respiratoria progresiva, que se acompaa de un sndrome gripal y elevada temperatura. Tras ser hospitalizados fallecen en la unidad de terapia intensiva. Las autopsias revelan una severa neumona intersticial (cuadro sugestivo de infecciones virales del tracto respiratorio). Como una etiologa viral parece evidente el laboratorio realiza sucesivas pruebas diagnsticas para todos los virus conocidos, siendo el resultado negativo en todas las ocasiones. Se especula que podra tratarse de un nuevo virus emergente. Ante esto, responda las siguientes preguntas:

1. Cmo determinara la causa infecciosa de esta enfermedad?2. Siendo que usualmente el primer paso para estudiar un virus es tener un sistema

donde replicarlo, qu estrategias podran implementarse para lograr un sistema que permita hacer que el supuesto virus pueda multiplicarse? Cules son las consideraciones que deberan tomarse respecto de las normas de bioseguridad para el trabajo a desarrollar en el laboratorio?

3. Cmo podra determinarse que en el sistema diseado en el punto anterior se encuentra el agente en cuestin?

4. Suponiendo que el virus en cuestin puede replicar, qu caractersticas del virus deberan determinarse para asignar en principio, su clasificacin y a travs de qu procedimientos?.

Problema 1.2. Basado en: Rodrguez Boulan, E., Sabatini, D. (1978) Asymmetric budding of viruses in epithelial monolayers: A model system for study of epithelial polarity Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5071-5075).

Para estudiar la brotacin de algunos virus envueltos, se infectaron cultivos de las lneas celulares MDCK, MDBK y ChEF con los virus VSV ( de la estomatitis vesicular, no humano), IV (Influenza) y SV (Sendai, un Paramixovirus), con una multiplicidad de infeccin de 1 UFP/ clula. Doce horas despus los cultivos fueron fijados y procesados para microscopa electrnica de transmisin empleando cortes ultrafinos.Caractersticas de las lneas celulares:

A- MDCK: cultivo de clulas epiteliales de rin de perro (polarizadas).B- MDBK: cultivo de clulas epiteliales de rin de vaca (polarizadas).C- ChEF: lnea celular de estirpe fibroblstica originada en embriones de pollo (no

polarizadas).

Resultados: Se esquematiza lo observado luego de la infeccin:

En base a lo observado, responda a las siguientes preguntas:1. El sitio por el que brota la progenie viral luego de replicarse en el interior de

una clula esta predeterminado?. Fundamntelo por s o por no.2. Qu caracterstica de la clula es fundamental para que hayan ocurrido los

fenmenos observados? 3. Se anima a plantear una hiptesis del mecanismo de este proceso?. Qu

implicancias en la patognesis viral podran ser consecutivas a este fenmeno estos resultados?

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TRABAJO PRCTICO N2

A. Trabajo de laboratorio: Observacin de preparados con monocapas celulares infectadas con deteccin de antgenos virales por inmunoperoxidasa. En lo posible, los alumnos realizarn una tcnica de deteccin de antgenos virales por inmunoperoxidasa. Mostracin de microfotografas de inmunofluorescencia.

B. Discusin: Mtodos de diagnstico virolgico en infecciones respiratorias. Resea de los virus ms frecuentemente involucrados. Mtodos de diagnstico virolgico en infecciones con puerta de entrada entrica. Resea de infecciones por virus productores de diarreas, hepatitis A y E y enterovirus. Tomas de muestras, envo al laboratorio, mtodos de diagnstico e interpretacin de resultados.

Problemas para ser discutidos en el TP 2

Problema 2.1.Un nio de 8 meses de edad tiene fiebre, anorexia, irritabilidad y dificultad respiratoria con tos, taquipnea y signos de obstruccin de la va area inferior, compatible con un cuadro de bronquiolitis.

1. En qu agentes etiolgicos pensara?2. Cules son los mecanismos patogenticos de esta enfermedad? Puede

relacionarlos con los datos clnicos?3. Qu muestra es la apropiada para obtener un diagnstico etiolgico de

certeza?.Cmo debe ser transportada la muestra?.Cmo la procesar el laboratorio de Virologa o de Microbiologa?

4. Cree Ud que es importante la realizacin de un diagnstico virolgico de certeza?. Por qu?.

5. Qu valor diagnstico tiene, en este caso, la deteccin de anticuerpos especficos en el suero?

Problema 2.2.En 1510, en Europa se registr una epidemia de Influenza. En 1918 volvi a ser detectada esta enfermedad en Espaa, luego se disemin y caus la muerte de 21 millones de personas. En 1933 fue aislado el virus que la provocaba y en 1950 se prepar la primera vacuna. A pesar de ello la OMS (Organizacin Mundial de la Salud) intensifica permanentemente la vigilancia en sus centros centinelas: Estados Unidos, Australia, Japn y Gran Bretaa, adems de otros grupos regionales.El virus influenza del tipo A se clasifica en distintos subtipos de acuerdo a sus glicoprotenas de superficie, HA (Hemaglutinina) y NA (Neuraminidasa), de las cuales se conocen 13 y 9 variantes respectivamente. A su vez, estos subtipos agrupan distintas cepas virales que son productos de cambios menores en estos antgenos de superficie.Con la aparicin de cada nuevo subtipo la poblacin mundial se enfrent a una nueva pandemia.En el siguiente cuadro se especifican el ao, el subtipo causal, y la magnitud de cada pandemia producida:

AO VIRUS SITUACION EPIDEMIOLOGICA

1918 H1N1 Pandemia de elevada magnitud

1957 H2N2 Pandemia de elevada magnitud

1968 H3N2 Pandemia de moderada magnitud

1977 H1N1 Pandemia de discreta magnitud (*)

(*) La poblacin principalmente afectada fue la nacida luego del ao 1957.

Actualmente coexisten los virus H3N2 y H1N1, a diferencia de lo que se haba observado anteriormente, cuando la aparicin de un subtipo coincida con la desaparicin del anterior.

1. Cmo explicara de acuerdo al cuadro la distinta magnitud de las pandemias?

2. Cmo explicara la distribucin poblacional de la pandemia de 1977?

3. Existe alguna asociacin entre las variaciones del virus Influenza (mayores y menores) y la magnitud epidemiolgica de la afectacin?

En el perodo transcurrido entre las pandemias se produjeron tambin brotes de Influenza de distinta magnitud, producidos por cepas resultantes de cambios en los antgenos de superficie:

4. Cree que esto tiene alguna importancia en la salud pblica?

5. En quines estara indicada la vacunacin contra Influenza y cada cunto tiempo deberan recibir la vacuna?

6. En 1966 y en 1997 en Hong Kong se desat una epidemia de gripe. Cul pudo ser el origen del virus? Cmo explica Ud. la emergencia de este tipo de virus en Asia?

Problema 2.3. Un paciente de 14 aos de edad presenta un cuadro clnico compatible con meningitis. Se realiza una puncin lumbar para obtener una muestra de lquido cefalorraqudeo. El mismo es incoloro. Se obtienen los siguientes resultados de los exmenes fsicoqumico, citolgico y microbilogico:

En la tincin de Gram no se observa la presencia de bacterias.La glucorraquia es similar a la glucemia (normal).

Hay una leve hiperproteinorraquia. Hay pleocitosis, con franco predominio mononuclear.

Se sospecha una meningitis de etiologa viral. En consecuencia:

1- Cules seran las muestras adicionales que deberan tomarse?. Cmo deberan ser tomadas y enviadas a un laboratorio de virologa?.

2- En qu virus o grupo de virus pensara como agentes etiolgicos?. 3- Qu mtodos de diagnstico rpido puede utilizar el laboratorio de virologa para

llegar a un diagnstico de certeza?.

Problema 2.4. Un nio de 20 meses de edad presenta desde hace 48 hs vmitos y fiebre. El esquema de vacunacin del chico es completo y, como dato adicional, la madre refiere que concurre a un jardn maternal (guardera), donde en los ltimos das varios otros nios tuvieron diarrea. Tiene un hermano de 1 mes de vida, que se alimenta exclusivamente con la leche materna. Preguntas:

1) Cules son los agentes etiolgicos a considerar en este caso?

2) Que regin del tubo digestivo se compromete y cul es la patogenia de la enfermedad?

3) Hay alguna forma de confirmar el diagnstico?

4) Qu riesgos corre el hermano del nio? Existe algn riesgo para el personal profesional que lo asiste?

5) Cmo es la prevencin de esta enfermedad?

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TRABAJO PRCTICO N 3

A. Trabajo de laboratorio: Mtodos de biologa molecular para el estudio de virus (purificacin, PCR, digestiones enzimticas, fundamentos de secuenciacin). Mostracin de geles, columnas y fotografas.

B. Discusin: Mtodos de diagnstico virolgico en infecciones con puerta de entrada

mucocutnea. Resea de infecciones por virus hepatitis B y C y por HIV,. Tomas de muestras, envo al laboratorio, mtodos de diagnstico e interpretacin de resultados.

Problemas para ser discutidos en el TP3

Problema 3.1Un paciente varn de 35 aos de edad, con antecedentes de adiccin a las drogas intravenosas, consulta por ictericia y alteracin del hepatograma.

1. Plantee cul es su sospecha clnica.

2. Enumere los posibles agentes etiolgicos.

3. Qu muestra tomara y cmo la enviara al laboratorio para obtener un diagnstico?

4. Qu estudios solicitara, qu tcnicas utilizar el laboratorio y cmo se confirmara un diagnstico de certeza?

5. Cmo sera el patrn serolgico ante una infeccin por el virus de la hepatitis B?

Problema 3.2Una mujer HIV negativa queda embarazada de su pareja que est infectada con HIV.Durante el embarazo y el post-parto se realizan estudios serolgicos que indican que la mujer no est infectada. La madre realiza la lactancia durante tres meses en forma normal.Al cumplir los veinticuatro meses el beb empieza a desmejorar y se determina que padece una infeccin pulmonar por Pneumocistis carinii. Posteriormente se lo diagnostica como HIV positivo.

1. Por qu va cree usted que el beb adquiri la infeccin?. Qu otras vas de transmisin vertical conoce?

2. Cmo se lleg al diagnstico en el beb?. Con qu muestra?

3. Podra haberse evitado la infeccin?. Qu debi haber hecho el mdico? Cmo se realiza el diagnstico dentro de los 18 meses de edad?

4. Cul es la importancia de un diagnstico precoz de infeccin, tanto en la madre como en el nio?

Problema 3.3Un paciente varn, de 21 aos, consulta por un cuadro de malestar general, fiebre y odinofagia (dolor al tragar). En el examen fsico se encuentran poliadenopatas blandas mviles y dolorosas, algunas occipitales, hepato-esplenomegalia y faringitis no exudativa. Sospechando un cuadro de etiologa infecciosa se solicita al laboratorio pruebas para bsqueda de agentes bacterianos asociados a faringitis con un hisopado de fauces, serologa para virus asociados a un cuadro de sndrome mononucleosiforme (virus Epstein Barr y, en segundo trmino citomegalovirus), y serologa para HIV.Los resultados son:

Hisopado de fauces: flora habitual Las pruebas para virus Epstein Barr son negativas; para citomegalovirus se

obtiene un resultado positivo para IgG especfica (ttulo: 256) y negativo para IgM.

ELISA para HIV: reactivo dbil (apenas por encima del cut off), aglutinacin de partculas: inespecfico; Western blot: Indeterminado con presencia de anticuerpos anti-p24 .

Ante estos resultados, 1. Puede obtener conclusiones diagnsticas?

2. Qu otros procedimientos diagnsticos podran usarse para esclarecer el estado de infeccin respecto al HIV?

3. Por qu debi realizarse el Western blot para HIV? Qu informacin obtiene de esta determinacin?

4. Qu entiende por carga viral ? Cul es el criterio que Ud. utiliza para solicitarla? Cules son las utilidades que son de importancia mdica?

Problema 3.4Un paciente presenta un cuadro de ictericia, astenia y malestar general que se autolimita por lo cual no consulta al mdico. Algunos meses ms tarde y luego de una donacin de sangre se encuentra que es reactivo en una prueba de tamizaje para HCV. Consulta a un mdico quien no indica conducta alguna, mientras se completan los estudios ya que supone que el paciente probablemente est curado.

1. Qu investigan las pruebas de tamizaje para HCV? Es de utilidad la deteccin de IgM especfica?

2. Cmo confirma el diagnstico serolgico?

3. Qu opina de la afirmacin de esa presunta curacin?

4. Cmo evaluara la presencia de enfermedad activa en este paciente?

El paciente no ha regresado a controlarse, pero 6 meses ms tarde consulta porque nuevamente padece un cuadro similar.

5. Cmo explica, desde el punto de vista de la patognesis viral, y mediante los distintos cursos probables de infeccin por este agente (viremia en funcin del tiempo) la alternancia de perodos de quiescencia clnica con otros sintomticos? Qu rol desempearan las cuasiespecies?

6. Recomendara algn estudio adicional para conocer el pronstico de la infeccin?

7. El paciente refiere estar en pareja en forma estable y lo consulta por medidas de prevencin para su pareja, qu le recomienda?

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TRABAJO PRCTICO N 4

Discusin: Mtodos de diagnstico virolgico en infecciones con puerta de entrada mucocutnea: Herpes simplex y Papiloma. Tomas de muestras, envo al laboratorio, tcnicas de diagnstico e interpretacin de los resultados.

Problemas para ser discutidos en el TP 4

Problema 4.1.En los siguientes resultados de pruebas serolgicas indique el estado de infeccin y, si es posible, el pronstico del paciente:

a) IgM Anti HAV + IgM Anti HBc Ag - IgG Anti HBc Ag +

b) IgM Anti HAV - IgM Anti HBc Ag - IgG Anti HBc Ag +

c) IgM Anti HAV - IgM Anti HBc Ag - IgG Anti HBc Ag + Ag HBs -

Ag HBe Anti HBs Ag + Anti HBe Ag +

d) IgM Anti VHA - IgM Anti HBc Ag - IgG Anti HBc Ag + Ag HBs +

Ag HBe + Anti HBs Ag - Anti HBe Ag

e) IgM Anti VHA - IgM Anti HBc Ag + IgG Anti HBc Ag - Ag HBs +

Ag HBe + Anti HBs Ag - Anti HBe Ag - Anti HCV +

f) IgM Anti VHA - IgM Anti HBc Ag - IgG Anti HBc Ag - AntiHBs + (75 mU/ml)

g) HBsAg + (*) HBeAg - anti-HBe - IgG anti-HBc: +

DNA viral: >105 copias/ml

* (en los ltimos 7 meses)

Problema 4.2.Una mujer embarazada de tres meses estuvo en contacto con un paciente con rubola hace 2 das. Ella recuerda que durante su niez un mdico le haba diagnosticado rubola tras un examen clnico. El mdico pregunta si su sobrino presentaba erupciones cutneas y, de ser as, cunto tiempo haca que tena estas erupciones.

1. Cmo obtendra el diagnstico de certeza de infeccin aguda por el virus rubola?

2. Qu medidas tomara en una mujer embarazada al determinar que no es inmune a la infeccin?Le dara la vacuna antirrubola?Por qu?

3. Segn el momento del embarazo en que se produce la primoinfeccin, cules son las complicaciones que puede llegar a tener el feto?

4. Qu hara usted si la paciente presenta rubola?

Problema 4.3En un examen ginecolgico de rutina se detecta una imagen colposcpica anormal en el cuello uterino de una paciente de 26 aos de edad. El gineclogo toma una muestra para realizar un estudio citolgico y, adems, una biopsia dirigida.

1. Qu virus pueden provocar lesiones en el cuello uterino?

2. El patlogo informa la presencia de coilocitos en la muestra citolgica. Con estos resultados Ud. descartara un proceso maligno?

3. En la biopsia se observan coilocitos, papilomatosis, imgenes epiteliales en empedrado e infiltrado inflamatorio mononuclear. La inmunomarcacin para HPV es positiva. Qu pronstico le dira a la paciente que tiene su enfermedad?

4. Existen diferencias en el potencial oncognico del virus de acuerdo al genotipo implicado? Qu otros factores contribuyen a esta neoplasia?

5. Explique brevemente la patognesis molecular del virus relacionada con la transformacin celular.

Problema 4.4.Una paciente de 22 aos de edad presenta molestias y prurito en la vagina. Se observa una ulceracin de base eritematosa en el crvix uterino y el fondo de saco vaginal posterior. Presenta, adems, adenopatas inguinales bilaterales y leve disuria.

1. Qu agente etiolgico sospechara para esta localizacin y para este tipo de lesin? Cul es su va de contagio?

2. Qu mtodos utilizara y cules no utilizara para confirmar su presencia?

3. Qu papel juega la respuesta inmune celular y la humoral en el desarrollo de esta infeccin?

4. Si la paciente estuviera embarazada; Qu riesgo habra para el feto?

Problema 4.5.Un paciente de 85 aos de edad presenta un dolor en el hemittax derecho que comienza en la columna vertebral y se irradia siguiendo el trayecto del dermatoma.

En la piel de la zona dolorida Ud. Advierte la presencia de mculas, ppulas y vesculas.

Cul sera su diagnstico presuntivo?

Explique qu conducta asumira con fines diagnsticos (toma de muestra, determinaciones a solicitar).

Teniendo en cuenta la patognesis viral, cmo explicara Ud. los intensos dolores que refiere el paciente?

Si un nio de 8 meses de edad entrara en contacto con el paciente durante el perodo en que este presenta vesculas en la piel, 1. qu enfermedad podra contraer?.

2. cul sera la va de contagio?3. qu pronstico puede tener?

4. podra prevenirse esta enfermedad?.

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TRABAJO PRCTICO N 4