Trabajo Práctico Nº4
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Trabajo Práctico Nº4
Aislamiento de Microorganismos
Diversidad Metabólica
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Objetivo del Trabajo Práctico
Aislamiento de microorganismos partir de distintos inóculos (agua, ricota, arroz, tierra y yogurt)
1)Enriquecimiento-Selección2)Selección-Diferenciación3)Obtención de un cultivo puro (Tinción de Gram y Pruebas Bioquímicas)
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Microorganismos a aislar:
• Enterobacterias (agua)• Pseudomonas spp. (agua)• Staphylococcus spp. (ricota)• Bacillus spp. (arroz)• Lactobacillus spp. (yogurt)• Azotobacter spp. (tierra)
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Medios de Cultivo: características generales
•Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas, vitaminas)
•Disponibilidad de oxígeno
•pH
•Humedad
•Temperatura
•Esterilidad
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• Medios Definidos o Complejos
• Medios Mínimos (definidos) o Ricos (complejos).
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•Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones) son conocidos.
Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:
Componente Gramos/litro
Glucosa 5 Fuente de C y energía
Na2HPO4 6 Buffer, fuente de P
KH2PO4 3 Buffer, fuente de P
NH4Cl 1 Fuente de N
NaCl 0.5 Fuente de Na
MgSO4•7H2O 0.12 Fuente de Mg
CaCl2•2H2O 0.01 Fuente de Ca
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•Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de desconoce (extractos, peptonas, etc).
Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:
Componente Gramos/litro
Extracto de carne
5 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C.
Peptona 6 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C.
Glucosa 5 Fuente de C y energía.
Na2HPO4•12H2O 4 Buffer y fuente de P.
FeSO4•7H2O 0.3 Indicador de producción de H2S. Fuente de Fe y S.
Indicador Sulfito de Bismuto
8 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
Verde Brillante 0.025 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
Ágar 20
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Peptonas: péptidos (aminoácidos libres), carbono y nucleótidos.
•Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la caseína.
•Peptona de carne: degradación pancreática de la carne.
•Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina.
•Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de crecimiento.
•Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura autolizada. Alto contenido de vitaminas.
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•Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.
•Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia (provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios complejos.
Por ej: Luria-Bertani (LB):
Componente Gramos/litro
Triptona 10 Aminoácidos, carbono, energía, macro y micronutrientes.
Extracto de Levadura
5 Vitaminas, macro y micronutrientes.
NaCl 10 Balance osmótico.
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•Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo en el organismo de interés.
•Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej: sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram positivos.
•Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo cuando el pH del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias que fermentan lactosa).
•Medio Selectivo y Diferencial.
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1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en un caldo de enriquecimiento.
2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.
3. Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial). Obtención de colonias aisladas.
4. Tinción de Gram
5. Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.
Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):
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Enterobacterias -Proteobacteria Bacilos Gram negativos Fermentadores de glucosa Anaerobios facultativos Flagelos peritricos Escherichia coli (algunas cepas patógenas) Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,
Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas. Oxidasa negativos
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Aislamiento de Enterobacterias (agua)
1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.
Peptona de Caseína Lactosa Bilis de Buey Púrpura de Bromocresol pH= 7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC
Si hay fermentación de lactosa:
Sólo ácido Coliformes, sin E. coliGas + ácido E.coli (junto a otras coliformes)
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Crecimiento en Caldo Mac
Conkey
Cambio de color a
amarillo
Formación de Gas
Escherichia coli (lactosa +)
Bueno Sí Sí
Enterobacter cloacae (lactosa +)
Bueno Sí Sí
Klebsiella pneumoniae (lactosa +)
Bueno Sí Sí
Proteus mirabilis Bueno No No
Pseudomonas aeruginosa
Malo
Staphylococcus aureus
Malo
Si hay formación de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
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2. Ágar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.
•Peptona de Caseína •Peptona de Carne •Cloruro de Sodio •Lactosa •Sales biliares •Cristal violeta•Rojo NeutropH= 7,1±0,1Incubar por 24 hs a 37ºC
Apariencia de las colonias
Microorganismo
Grandes, rojas, con halo
Escherichia coli (lactosa +)
Grandes, rosadas, mucoides
Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa +)
Incoloras, transparentes
Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp.
Pequeñas, opacas, aisladas
Enterococci, Staphylococci
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
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Escherichia coli Salmonella typhimurium
Ágar Mac Conkey
Lactosa + Lactosa -
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2. Ágar EMB: medio selectivo y diferencial (enterobacterias patógenas).
•Peptona de Carne •Hidrógenofosfato dipotásico•Lactosa•Sacarosa•Eosina Amarillenta•Azul de MetilenopH=7,0±0,2
Incubar por 24 hs a 37ºC
Apariencia de las colonias
Microorganismo
Transparentes, de color ámbar
Salmonella spp., Shigella spp.
Verdosas con brillo metálico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida
Escherichia coli (lactosa +, sacarosa +)
Más grandes que las de E. coli, mucosas, confluentes, con el centro pardo-grisáceo a la luz transmitida
Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa+, sacarosa-)
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
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Escherichia coli Enterobacter spp.
Ágar EMB
Lactosa + Lactosa +
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Pseudomonas spp. -Proteobacteria Bacilos Gram negativos Aerobios estrictos Con flagelos polares Producen pigmentos No fermentadores Oxidasa positivos Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en
humanos
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Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)
1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42ºC: enriquecimiento y selección.
2. Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas aeruginosa
• Peptona de Gelatina• MgCl2• Cetrimida• Glicerina• SO4K2
Incubar por 48 hs a 37ºC.Pseudomonas aeruginosa
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Staphylococcus spp.
• Cocos Gram positivos• Anaerobios facultativos• Fermentan glucosa (ac. láctico)• Asociados a piel y mucosas• Patógenos (S. aureus)• Resisten altas concentraciones salinas
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Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)
1. Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura ambiente)
2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazón (con NaCl 13%): medio selectivo para Estafilococos patógenos.
• Infusión de cerebro• Infusión de corazón• Proteosa peptona• D(+) Glucosa• NaCl (7.5% final)• Hidrógenofosfato disódicopH=7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC
Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida
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Aislamiento de Staphylococcus aureus
3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas).
• Peptona de carne• Extracto de carne• NaCl 7.5%• D(-)Manitol• Rojo fenolpH=7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC
3. Ágar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.Incubar por 48 hs a 37ºC
Apariencia de las colonias
Microorganismo
Con halo amarillo, luminoso; crecimiento intenso
Manitol-positivos: S. aureus
Sin cambio de color; poco crecimiento
Manitol-negativos: S. epidermidis y otros.
1. S. aureus2. S. epidermidis3. Micrococcus luteus
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Bacillus spp.
• Bacilos Gram positivos• Forman endosporas• Generalmente móviles con flagelos peritricos• Aerobios (facultativos)• B. cereus (alimentos)• B. anthracis
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Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)
1. Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección.2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.3. Incubar por 48 hs a 37ºC.4. Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo
y diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis)
• Peptona de carne• Extracto de carne• D(-)Manitol• NaCl• Rojo Fenol• Emulsión de yema de huevo/Polimixina B
Incubar por 48 hs a37ºC.
Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado blanco (Manitol – y lecitinasa +).
Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).
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Lactobacillus spp.
• Bacilos o cocobacilos Gram positivos• Fermentadores lácticos• Aerobios facultativos o microaerófilos
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Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)
1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento selectivo.Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso. pH = 5.7. Incubación en microaerobiosis.
Ágar MRS-Lactobacillus casei
2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el anterior, con mayores concentraciones de acetato y pH = 5.5 que inhiben flora acompañante.Incubación en microaerobiosis.
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Azotobacter spp.
• Bacilos o cocos Gram negativos• Habitan en el suelo y en el agua• Fijan nitrógeno atmosférico (N2 a NH3)• Vida libre• Forman quistes (similar a endosporas)
Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable).
Crecimiento a 28ºC.
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Microorganismo
Enriquecimiento-Selección
Selección-Diferenciación
Agua Enterobacterias
Caldo Mc Conkey
Ágar Mc Conkey y ágar EMB
Agua Pseudomonas Caldo M9-42ºC Ágar Cetrimida
Ricota Staphylococcus
Caldo cerebro-corazón con 7.5% NaCl
Ágar manitol salado rojo fenol y ágar azida
Arroz Bacillus 80ºC y caldo nutritivo
Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo y PmB.
Yogurt Lactobacillus Ágar MRSMicroaerobiosis
Ágar Rogosa Microaerobiosis
Tierra Azotobacter Caldo Fred& Waskman-28ºC
Ágar Fred & Waskman-28ºC