TRABAJO PRACTICO N°3

CROMATOGRAFÍA

OBJETIVOS:Comprender el fundamento y las aplicaciones de las diferentes técnicas cromatografías.Separar una mezcla de colorantes por cromatografía en columna.Identificar cada uno de los colorantes por cromatografía analítica en placa delgada.

NATALIA A. BELÉNANDREA DOS SANTOS

ROMINA CHARCASProfesoras Claudia Elalle- Alejandra Salerno

Materiales utilizados Columna. Vaso de

precipitados. Soporte

universal. Doble nuez. Cuba

cromatografía. Erlenmeyer . Agarradera. Algodón- Pinza de Mohr. Probeta . Papel filtro. Balanza.

Rojo de metilo.

Azul de metileno.

Cloruro de metileno.

Silicagel para columna.

Metanol.

Procedimiento Primera parte

ELECCION DE LA FASE MOVIL POR TCLNumeramos cuatro vasos de precipitados (cubas) y les agregamos a cada una 4ml de los siguientes solventes en el orden detallado:1-Diclorometano2- Metanol3- Diclorometano:metanol 3:14- Diclorometano:metanol 30:1

Cortamos los capilares a la mitad con calor de manera que quede sellado uno de sus extremosCon la parte abierta tomamos una pequeña muestra de la mezcla que queremos separar.

Marcamos con lápiz un punto cercano a donde sembraremos la muestra (sobre la placa gel) y procedemos a sembrar depositando la pequeña muestra en la placa como se ve en la imagen

Colocamos una placa en cada cuba y esperamos unos minutos para ver los resultados.

El punto comienza a separarse en dos colores, rojo de metilo y azul de metileno.Optamos por el eluyente que permite a nuestro componente inicial separarse y al mismo tiempo recorrer la placa de silice, porque de lo contrario uno de los componentes terminaría atrapado en la silica.

Indudablemente el eluyente que utilizaremos como adsorbente es el DICLORO:METANOL

SEGUNDA PARTE

SEPARACION DE LOS COMPONENTES DE LA MEZCLA POR CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

• Armamos el equipo adecuado para realizar el trabajo de cromatografía en columna, esta debe quedar en posición vertical.

• Insertamos una pequeña torunda (bolita de algodón) dentro de la bureta con ayuda de la varilla de vidrio.

• Agregamos dos tapitas de silicagel dentro de la columna a través de un embudo

Preparamos 40ml de la fase móvil elegida, en este caso utilizamos 30ml de diclorometano y 10 ml de metanol.

Con el embudo pequeño agregamos el liquido de la FM1 para humedecer la silica.

Si el líquido se detenía debíamos abrir el robinete para que este siga circulando.

Dejamos caer en un matraz todo el liquido que sobre por arriba del límite del sólido. Una vez que seca el liquido le agregamos 0,5 ml de la mezcla que nos entrega la profesora.

Le agregamos nuevamente una torunda de algodón para evitar que por agregado de la FM1 se resuspenda la silica.

Volvemos a agregar la FM1

Observamos como de a poco comienzan a

separarse los colores en azul oscuro y

anaranjado

Abrimos el robinete para dejar fluir la fase móvil mientras seguimos agregando mas de la misma.

Todo el eluyente que desechamos de la bureta lo hacemos dentro del matraz. Una vez que el liquido naranja toca la torunda de algodón en la parte inferior, cerramos el robinete

Colocamos la gradilla de madera con un tubo de ensayo

debajo de la bureta para recoger el

liquido naranja en éste. Abrimos

nuevamente el robinete y

comenzamos a recogerlo.

El liquido naranja comienza a

depositarse dentro del tubo de ensayo.

La parte posterior de la silica comenzaba a

secarse por lo que agregamos de a poco

FM1 hasta que obtuvimos el total del liquido naranja dentro del tubo de

ensayo.

Nuevamente desechamos el resto

de liquido que no sirve en nuestro experimento.

Preparamos la FM2 (mezcla de

diclorometano: metanol: ácido

acético 30:10:4)

La FM2 sirve para desplazar el liquido azul que se había

separado.Una vez que llega

este a la torunda de algodón procedemos de la misma forma que con el liquido

anterior.

De esta forma obtenemos los dos líquidos a analizar (Eluato1 y Eluato2)

dentro de diferentes tubos de ensayo.

TERCERA PARTE

IDENTIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEPARADOS CON LOS TESTIGOS ADECUADOS POR TLC

Con los dos tubos de ensayo con los líquidos separados procedemos a sembrar cada uno de los eluatos con el testigo correspondiente.

Para esto colocamos una pequeña muestra de cada muestra sobre el vidrio reloj.

Utilizamos nuevamente el método del capilar para depositar la muestra sobre la placa gel.

Ubicamos una muestra del liquido que separamos y una muestra del testigo, hacemos lo mismo con el liquido azul.

Colocamos en el vaso de precipitados dicloro:metanol 3:1 y colocamos las placas que sembramos en el paso anterior.

Observamos que las marcas subieron al mismo tiempo por lo que deducimos que se trata de la misma sustancia que contenían los testigos. Rojo de metilo y azul de metileno.

CONCLUSIONES

• Conclusión parte1 : a partir de los resultados obtenidos en las placas TLC, se dedujo que la fase móvil mas eficiente para la cromatografía de esta mezcla de colorantes en la solución 3(diclorometano-metanol 3:1). Esto se debe a que con esta fase móvil, la mezcla recorre una distancia mayor desde un punto de siembra que en las otras placas y los componentes se separan con una distancia cercana, que permite realizar una cromatografía en columna con mayor rendimiento.

• Conclusión parte2: teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la cromatografía en columna, se determinó que para separas los dos compuestos con una diferencia de polaridad notable es necesario polarizar la fase móvil y la polarización debe hacerse luego de obtener el primer eluato, es decir, la fracción de un compuesto menos polar (en este caso luego de retirar el rojo de metilo). También se observo que la cromatografía resultó exitosa , ya que al comparar el testigo de cada componente con el eluato obtenido, la TLC y el RF de cada una fue similar.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué métodos de separación conocen?2. Definan cromatografía. ¿Cuáles son los distintos métodos cromatográficos y qué

fundamentos tiene cada uno? 3. ¿Cuál es la diferencia entre absorción y adsorción? Nombre adsorbentes para

TLC.4. ¿Cuáles son los componentes de un sistema cromatográfico? 5. ¿Cual es el adsorbente en una TLC? Mencione ejemplos.6. ¿Qué es una serie eluotrópica? En qué se basa? 7. ¿Qué diferencias existen entre cromatografía en placa delgada y en columna? 8. ¿Qué entiende por activación de una placa? 9. ¿Cuál es la importancia de la homogeneidad en el armado de la fase fija en la

cromatografía en columna?10. ¿Qué es la relación de frente (Rf) y de qué factores depende? Puede usarse

como criterio de identificación y/o pureza? 11.¿Qué es el desarrollo y elución de un cromatograma? 12. ¿Qué es el revelado de un cromatograma? 13. ¿Qué métodos conoce para sembrar una columna? 14. Si las fracciones eluidas mediante cromatografía en columna son incoloras,

¿cómo procedería para saber en qué tubos se encuentra/n la/s sustancia/s y si la separación fue efectiva?

1-¿Qué métodos de separación se conocen? Destilación simple:Se usa para la separación de líquidos, durante el calentamiento basándose en la diferencia de los puntos de ebullición, en la que el componente más volátil pasa a la fase vapor, luego este se enfría para recuperar el componente en forma líquida por medio de la condensación. La principal finalidad de la destilación es obtener el componente más volátil en forma pura.La destilación sencilla, se usa para separar aquellos líquidos cuyos ebullición difieren extraordinariamente (en más de 80°C aproximadamente) o para separar líquidos de sólidos no volátiles  

Decantación: Este método se puede utilizar en caso de tratarse de una mezcla heterogénea de dos líquidos inmiscibles y de diferentes densidades, para ello se utiliza un embudo de decantación, en el que el líquido más denso queda abajo y el menos denso arriba.

Cromatografía:Es una técnica que permite la separación de gases o líquidos de una mezcla en la cual sus componentes se desplazan a distinta velocidad mediante una fase móvil que puede ser un gas o un líquido. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una columna o superficie sólida,( esta fase será elegida selectivamente teniendo en cuenta que los dos componentes deben desplazarse, pero a velocidad distinta)En consecuencia del diferente desplazamiento, los componentes de la mezcla se separan en bandas que luego podrán ser analizadas.

Cromatografía en papel:se aplica una pequeña mancha de la muestra a separar, en una placa cromatográfica a aproximadamente 1cm de la base y luego se lo sumerge en un solvente adecuado, a medida que el disolvente asciende por la placa, encuentra a la muestra que comienza a desplazarse con este.en la cromatografía en papel los componentes de la mezcla interaccionan con la fase estacionaria de ésta, de manera que los componentes se desplazan a distintas velocidades, dependiendo de la solubilidad (los mas solubles se desplazan más rápidamente y los menos solubles, mas lentamente, por lo general los componentes más polares quedan más tiempo retenidos en el absorbente, por lo que los componentes de la muestra recorrerán distancias diferentes, dependiendo de la fuerza de sus interacciones químicas con la fase estacionaria del papel.

Cromatografía en columna:En la cromatografía en columna, la fase estacionaria(absorbente) se coloca en el interior de una columna de vidrio, la que finaliza con una llave para controlar el paso de las sustancias al exterior de la columna; La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil, la mezcla a separar se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria, de forma que los componentes de la mezcla se desplazarán junto con la fase móvil, a través de la fase estacionaria, las fracciones menos polares que son las que menos se retienen en el absorbente, serán las primeras en salir de la columna, en cambio las sustancias más polares quedan retenidas por más tiempo en el absorbente.

2-Definan cromatografía, ¿cuáles son los distintos métodos cromatográficos y qué fundamentos tiene cada uno? La cromatografía es un método físico de separación, en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una móvil y la otra, estacionaria; En la cual los componentes se desplazan con la fase móvil (disolvente adecuado), a través de la fase estacionaria (puede ser gel de sílice), a distintas velocidades debido a la interacción de los componentes con la fase estacionaria, (los más polares quedarán retenidos por más tiempo en el absorbente, por lo que su desplazamiento será más lento), esto hará que uno de los componentes descienda más rápidamente a través de la columna permitiendo la separación de éstos. Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en función del mecanismo de separación de los componentes entre las fases o por la forma de operar del sistema: Cromatografía de adsorción:La separación depende del equilibrio de adsorción y desorción de los componentes de una mezcla, entre la fase estacionaria y la fase móvil. La fuerza con que es adsorbido el componente depende de su polaridad, actividad del adsorbente, y polaridad de la fase móvil. Cuanto más polar sea el compuesto más fácil será adsorbido. Se prefiere compuestos con polaridad baja o media, ya que los muy polares requieren adsorbentes poco activos debido a la retención.

Cromatografía de reparto:Se basa en la separación de una mezcla de sustancias, mediante el reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria, que es líquida, la mayor o menor migración de los componentes dependerá del coeficiente de reparto entre la fase estacionaria y la fase móvil Kd= X2/X1Se utiliza para la separación de compuestos de polaridad media y alta. Cromatografía por tamaño molecular:Consiste en la separación de moléculas basándose en el tamaño, en lugar de la solubilidad o polaridad, las fases estacionarias que se emplean son inorgánicas o gel orgánico. Estas fases estacionarias presentan cavidades en las que las moléculas de los compuestos a separar pueden penetrar y ser retenidas, siendo las moléculas mayores las eluidas de la columna en 1° lugar.    Cromatografía por tamaño molecular.  

 Cromatografía de intercambio iónico: Permite la separación de iones o moléculas polares basándose en las propiedades de carga eléctrica. Hay una fase estacionaria o intercambiador iónico y una fase móvil; la fase estacionaria es insoluble y en su superficie tiene cargas electroestáticas fijas que retienen contra iones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil.

3- ¿Cuál es la diferencia entre absorción y adsorción?  La adsorción es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de un sólido, quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases y la absorción es la retención de una especie química por parte de una masa, debido a la tendencia que esta tiene a reaccionar químicamente con la misma, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial. 

4-¿Cuáles son los componentes de un sistema cromatográfico? Fase estacionaria: puede ser un sólido, un gel o un líquido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también estar químicamente unido al sólido (fase ligada) o inmovilizado sobre él (fase inmovilizada). Fase ligada:Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a lapared interior de la columna (lugar donde se produce la separación). Fase inmovilizada:Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamientoquímico) tras un recubrimiento. Fase móvil:Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una direccióndefinida. Puede ser un líquido (cromatografía líquida, LC), un gas (cromatografía deGases, GC) o un fluido supercrítico (cromatografía con fluido supercrítico). En laCromatografía de gases se puede usar la expresión gas portador para la fase móvil. Enla cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión eluyente.  Efluente:La fase móvil que abandona la columna.

Muestra:Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en ellecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil. Componentes de la Muestra:Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por lafase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos atiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términoseluito y analito para un componente de la muestra. 5Soluto:Término que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografía de reparto. Disolvente:En ocasiones se refiere a la fase estacionaria líquida en la cromatografía dereparto. Zona:Región del lecho cromatográfico donde se localizan uno o más componentes de lamuestra. Se puede usar para ello también el término banda. Cromatograma:Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector (la concentraciónde un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración enel efluente) frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana,"cromatograma" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas. Cromatógrafo:El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.

5- ¿Cuál es adsorbente en una TLC? El adsorbente en una TLC, puede estar en un soporte como por ej placas de máximo 20 x 20 cm de vidrio, aluminio o plástico recubiertas de una cara de una fina capa de material adsorbente que puede ser celulosa, gel de sílice, óxido de aluminio o poliamida.

 6- ¿Qué es una serie eluotrópica?  Una serie eluotrópica es una lista de disolventes ordenados conforme a su capacidad relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado. Así, en columnas de gel de sílice, el poder eluyente disminuye en el orden siguiente:Agua > metanol > etanol > acetona > acetato de etilo > cloroformo > benceno >Tolueno > tetracloruro de carbono > ciclohexano > hexano 7- ¿Cuál es la diferencia entre la cromatografía en placa delgada y en columna?Las diferencias de ambas técnica se basa en la distinta configuración de ambos sistemas cromatográficos.

A. En la cromatografía plana la separación se realiza por distancias, mientras que en la columna se hace por tiempos o volúmenes.

B. En la cromatografía plana la velocidad de la fase móvil solo puede controlarse indirectamente, ya que esta gobernada por fuerzas capilares que son las que permiten el paso de dicha fase a través del lecho cromatográfico, en la cromatografía en columna la velocidad de la fase móvil puede controlarse fácilmente.

C. El tiempo que dura la separación en cromatografía plana es el tiempo necesario para que el frente del disolvente llegue a una zona determinada del lecho cromatográfico y es independiente del camino recorrido por los componentes de la muestra, en la columna cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la columna, por lo que el tiempo que tarda la separación esta determinado por el tiempo que tarda el componente mas lento en llegar al detector .

D. En la cromatografía en columna la separación de varias muestras se realiza en forma secuencial y la cromatografía plana la separación es en forma simultánea, siendo todas ellas sometidas al mismo tiempo al proceso separativo.

E. La elección de la fase móvil en cromatografía plana se realiza de forma que de la separación requerida, no importando que algunos componentes de la muestra queden en el origen, ya que las placas se desechan en cada separación y en la cromatografía en columna la fase móvil debe elegirse de forma que eluya todos los componentes de una muestra.

F. Mientras que la cromatografía en columna es un proceso dinámico, pasando cada soluto eluido a través del detector, en cromatografía plana es estático.

G. Los solutos más retenidos en cromatografía plana forman manchas compactas, por lo que se detectan con mayor sensibilidad, los solutos más retenidos en la columna son los que dan picos más anchos, menos resueltos y sensibles .(En la cromatografía plana la fase móvil y estacionarias no están muy bien definidas y se encuentran en estado dinámico con la fase de vapor que rodea al sistema cromatográfico .)

8. ¿Qué entiende por activación de una placa?

La activación de una placa consiste en una deshidratación para lograr una mejor adsorción evitando procesos mixtos de partición/adsorción , la activación se puede realizar en la estufa, aproximadamente a una temperatura de 120°c

9. ¿Cuál es la importancia de la homogeneidad en el armado de la fase fija en la Cromatografía en columna?

La homogeneidad de la fase fija en la columna es importante, se recomienda dar golpecitos suaves para que esta se distribuya de manera uniforme para evitar formación de burbujas de aire o canales. Para obtener una eficacia óptima en la separación cromatográfica, se debe evitar el ensanchamiento de las bandas debido a la dispersión ya que cuanto más ancha sea la banda menor número de ellas podrán ser resueltas en un espacio y tiempo dado. Las anchura de estas bandas dependen de factores como el tamaño de partículas del lecho estacionario, su homogeneidad o velocidad de la fase móvil.,

10. ¿Qué es la relación de frente (Rf) y de qué factores depende? Puede usarse como criterio de identificación y/o pureza?

Es el último punto alcanzado por el disolvente en su avance. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias relativas recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El símbolo utilizado para designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante:

Distancia recorrida por el compuesto desde el origenRf = Distancia del origen al frente del disolvente

Como el denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debería ser un decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un porcentaje. La RF depende de factores como espesor de la placa, fase móvil y estacionaria, cantidad de muestra.La RF se puede utilizar como criterio de pureza .El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.

11. ¿Qué es el desarrollo y elución de un cromatograma?

Es el fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil.

12. ¿Qué es el revelado de un cromatograma?

El revelado de un cromatograma es lo que permite la visualización de compuestos en una placa cromatográfica, en caso de que estos no son coloreados. Para ello hay distintos métodos:

Métodos físicos: El más común consiste en añadir al absorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.Métodos químicos: Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores. Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. Se suelen utilizar otros reactivos reveladores como ácido sulfúrico o permanganato potásico

13. ¿Qué métodos conoce para sembrar una columna?

Para realizar una siembra en la columna se recurre a introducir un volumen de la muestra sobre superficie de la fase estacionaria, con ayuda de una pipeta y para sembrar en una placa se puede utilizar un tubo capilar, para colocar sobre la placa una pequeña gota de la muestra.

14. Si las fracciones eluidas mediante cromatografía en columna son incoloras, ¿cómo

Procedería para saber en qué tubos se encuentra/n la/s sustancia/s y si la

separación fue efectiva?

Si las fracciones eluidas son incoloras se puede realizar el análisis del eluato por cromatografía en capa fina o sobre el papel por lo que se hace necesario el uso de un revelador para la localización de sustancias.