TRABAJO FIN DE GRADO

Tıtulo: Determinacion de polifenoles en infusiones mediante analisis

por inyeccion en flujo.

Autor: Maria Sandra Reyes Ballesteros

Tutor: Adolfo Narros Sierra, Maria Isabel del Peso

Departamento: Departamento de Ingenierıa Quımica Industrial y del Medio

Ambiente

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE MADRID

ESCUELA TECNICA SUPERIOR DEINGENIEROS INDUSTRIALES

TRABAJO FIN DE GRADO

Maria Sandra Reyes Ballesteros

Julio de 2017

Resumen

El presente TFG ha tenido como objetivo principal el montaje de un sistema de analisis

por inyeccion en flujo y el analisis mediante el mismo del contenido de polifenoles en te verde,

te blanco y Rooibos.

Los polifenoles encontrados en estos tes son considerados como beneficiosos para la salud, de ma-

nera que la cuantificacion de los mismos es objeto de numerosos estudios. Para la determinacion

de la cantidad de polifenoles totales se empleo el metodo de Folin Ciocalteu.

El montaje del sistema ha consistido en un montaje sencillo con dos canales por lo que se

circulan el portador (Reactivo de Folin Ciocalteu) y el reactivo (NaOH), la muestra se inyecta

en el canal 1(por el que circula el portador) y posteriormente este confluye con el canal 2 (por

el que circula el reactivo) la mezcla de ambos pasa al reactor y el producto de la reaccion llega

al analizador.

Tras la fase de montaje se llevaron a cabo vayos ensayos previos utilizando agua como

portador y reactivo y tinte azul como muestra, de esta forma se comprobo que no existıa ninguna

fuga o mal sellado que permitiera la entrada de aire al sistema, ası como la velocidad a la que

habıa de operarse la bomba para trabajar con un caudal optimo.

Finalmente se realizaron los analisis de los tes mencionados, obteniendose que la mayor

cantidad de polifenoles aparece en el te verde seguido del te blanco y por ultimo el Rooibos.

Se comprobo la utilidad y la fiabilidad del analisis por inyeccion en flujo.

Palabras clave: Analisis Por inyeccion en flujo, Polifenoles , Folin Ciocalteu

Codigos UNESCO: 2301 Quımica Analıtica 230691; Quımica Organica. Analisis Instrumental;

330903 Antioxidantes en Los Alimentos

V

Acronimos

FIA: Analisis por inyeccion en flujo

SFA: Analisis por flujo segmentado

PT: Polifenoles totales

EGCG: Epigalocatequin galato

VII

Glosario

flavonoides: Pigmentos naturales que se encuentran en las plantas y poseen actividad

antioxidante.

catequinas: Nombre que se le da a cierto subgrupo de la familia de los flavonoides con

una estructura determinada.

polifenoles: son sustancias que se encuentran en plantas y poseen mas de un grupo fenol,

son polifenoles tanto los flavonoides como las catequinas.

fitoquımicos: sustancias que se encuentran en las plantas y se consideran positivas para

la salud aun sin ser esenciales, en este trabajo se refiere a polifenoles.

especies de oxıgeno reactivo: iones de oxıgeno, radicales libres y peroxidos tanto

inorganicos como organicos.

IX

Indice general

Resumen V

Acronimos VII

Glosario IX

Contenidos XI

Indice de figuras XV

Indice de tablas XVII

1. Introduccion 3

2. Estado del arte 5

2.1. Analisis por inyeccion en flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2. Consumo de Te . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.2.1. Te verde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.2.1.1. Efectos antioxidantes del te verde . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2.2. Te blanco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2.3. Rooibos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.3. Determinacion del contenido de Polifenoles totales. Metodo de Folin-Ciocalteu . . 12

3. Objetivos 15

4. Metodologıa Experimental 17

XI

4.1. Montaje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4.2. Puesta en marcha y funcionamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

4.2.1. Obtencion de rectas de Calibrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4.3. Montaje FIA con un canal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5. Resultados y discusion 31

5.1. Introduccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.2. Te verde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.2.1. Estudio de la temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

5.2.2. Estudio del tiempo de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.2.3. tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.3. te blanco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.3.1. segundo calibrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.3.2. Estudio de la temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

5.3.3. Estudio del tiempo de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.3.4. Estudio del tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

5.4. Rooibos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.4.1. tercer calibrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.4.2. Estudio de la temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

5.4.3. Estudio del tiempo de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

5.4.4. Estudio del tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

5.5. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

6. Conclusiones 57

6.1. Estudio de las condiciones de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

6.2. Contenido de Polifenoles Totales (ındice PT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

7. Lıneas futuras 61

8. Planificacion temporal y presupuesto 63

Bibliografıa 68

Indice de figuras

2.1. Configuraciones SFA y FIA Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta

clave para la automatizacion analıtica, Marıa del Pilar Canizares Macıas . . . . . 6

2.2. Senal obtenida en una configuracion FIA. En la parte superior aparece la dis-

persion de la muestra Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta clave

para la automatizacion analıtica, Marıa del Pilar Canizares Macıas . . . . . . . . 7

2.3. montaje FIA de dos canales Fuente: Flow Injection Analysis [1] . . . . . . . . . 8

2.4. Mecanismo de accion del reactivo de Folin-Ciocaltu Fuente: Determinacion de

polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Martınez et al. , UPV . . . 13

4.1. Bomba peristaltica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.2. Montaje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

4.3. Ensayo a con azul de metileno a 5 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.4. Repeticion de ensayo con tinte, velocidad de la bomba: 5 rpm . . . . . . . . . . 22

4.5. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba: 10rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.6. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :20 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

4.7. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba:30 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

4.8. Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :40 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4.9. Ensayo 3 con tinte, velocidad de la bomba: 30 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4.10. montaje final . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.11. Espectros de muestras 3 a 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

4.12. Recta de calibrado acido Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4.13. Recta de calibrado acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.14. Montaje FIA un canal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

XV

5.1. Absorbancia a diferentes temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

5.2. Concentracion de polifenoles vs Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.3. Absorbancia a diferentes tiempos de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.4. Tiempo vs PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.5. Absorbancia a distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

5.6. Rectas de calibrado Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.7. Rectas de calibrado Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

5.8. Comparacion de las terceras rectas de calibrado obtenidas . . . . . . . . . . . . . 39

5.9. Absorbancia a diferentes temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

5.10. Temperatura vs PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.11. Absorbancias para distintos tiempos de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.12. Tiempo de extraccion vs. PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

5.13. Absorbancia para 3 minutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

5.14. Muestra recien preparada vs muestra con dos dıas de reposo . . . . . . . . . . . . 45

5.15. Absorbancias para distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

5.16. Recta de calibrado acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.17. calibrado acido Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

5.18. comparacion curvas de calibrado de acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

5.19. comparacion curvas calibrado acido Galico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

5.20. Absorbancia para diferentes temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

5.21. PT(ppm) vs Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

5.22. Absorbancia para distintos tiempos de extraccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

5.23. Tiempo de extraccion vs PT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

5.24. Asorbancias para distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

8.1. EDP del proyecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

8.2. Diagrama de Gantt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

Indice de tablas

2.1. Clasificacion de los polifenoles y ejemplos de ellos Fuente: Determinacion de

polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Garcıa Martınez et al. , UPV 12

4.1. Calibrado de la bomba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.2. Resultados a 10 y 20 rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.3. masas pesadas de acido Galico y acido Tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4.4. Muestras acido galico y acido tanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

4.5. longitudes de onda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

5.1. absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.2. Concentracion de polifenoles totales en funcion de la temperatura . . . . . . . . . 33

5.3. Absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.4. Tiempo (min) vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.5. PT para distintos tiempos de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

5.6. absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

5.7. Temperatura(oC) vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.8. Absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.9. Tiempo de extraccion (min) vs contenido de PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . 43

5.10. PT (ppm) vs. tiempo de reposo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

5.11. absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

5.12. Temperatura (oC) vs PT(ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

5.13. Absorbancias medias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

5.14. Tiempo de extraccion (min) vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

XVII

5.15. Tiempo de reposo vs PT (ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

5.16. Contenido de polifenoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

8.1. Costes de instrumentacion y equipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

8.2. Costes de Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

8.3. Costes de los reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

8.4. Costes de personal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

8.5. Presupuesto total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

1

2

CAPITULO 1Introduccion

Los antioxidantes naturales estan siendo cada vez mas apreciados por los consumidores de-

bido a sus efectos positivos [2] y a la posibilidad de emplearlos como aditivos naturales que

reemplacen a los sinteticos [3] El te es una fuente natural de antioxidantes ademas de ser una

de las bebidas mas consumidas a nivel mundial.

Sus propiedades medicinales han sido exploradas y conocidas desde los primeros periodos de

la civilizacion China, casi 5000 anos atras. Las propiedades de los tes varıan dependiendo de

su origen, condiciones climatologicas y metodos de procesamiento, pero en general se distingue

entre tes no fermentados (te verde y te blanco) y fermentados (Rooibos) siendo el te blanco el

menos procesado ya que se recoge antes de la maduracion de las hojas y se seca al aire. En este

trabajo se llevara a cabo la cuantificacion de los antioxidantes presentes en muestras de te verde,

te blanco y Rooibos mediante el metodo de Folin-Ciocalteu y analisis por inyeccion en flujo.

El analisis por inyeccion en flujo es una herramienta para la automatizacion del analisis

quımico, esto lo convierte en una herramienta de valor puesto que permite eliminar el error

craso que introduce la manipulacion humana y conlleva un ahorro notable de reactivos ası como

un gran aumento de la frecuencia de muestreo.

Tambien presenta la ventaja de ser mas barato que otras alternativas de automatizacion, esto lo

hace muy atractivo para su uso en aplicaciones en las que no se requiere un grado de precision

muy alto.

3

CAPITULO 1. INTRODUCCION

Respecto al metodo de Folin-Ciocalteu; se emplea por ser el metodo estandar para la cuan-

tificacion de polifenoles y otras especies antioxidantes segun la norma ISO 14502-1:2005 en la

que se detalla su uso para la cuantificacion de polifenoles en tes verde y negro. Consiste en

un determinacion colorimetrica empleando el reactivo de Folin Ciocalteu, este contiene acido

fosfotungstico (H3PW12O40) y acido fosfomolıbdico (H3PMo12O40) que son oxidantes que al

reducirse, oxidando los fenoles, producen un color azul con absorcian maxima a

765 nm, esto ocurre debido a la formacion de los llamados azules de tungsteno y molibdeno

(oxido de tungsteno y oxido de molibdeno).

El reactivo de Folin Ciocalteu reacciona con un amplio rango de polifenoles y, aunque las res-

puestas variaran con los distintos componentes la seleccion de acido galico como patron de

calibracion permite la obtencion de datos utiles sobre el contenido de polifenoles totales.

4

CAPITULO 2Estado del arte

2.1. Analisis por inyeccion en flujo

El analisis por inyeccion en flujo o FIA (flow injection analysis) aparecio por primera vez

en descrito por Ruzicka y Hansen en una patente en 1974. Se crea como respuesta al analisis

automatizado que existıa aquel momento, el analisis por flujo segmentado SFA (Segmented flow

analysis) [1]

En la siguiente figura se muestran las configuraciones tıpicas para SFA y FIA

5

CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE

Figura 2.1: Configuraciones SFA y FIA

Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta clave para la automatizacion analıtica,

Marıa del Pilar Canizares Macıas

Al principio, en los primeros trabajos de FIA se presuponıa la existencia de un flujo turbu-

lento, de esta manera se explicarıa el que no hubiera contaminacion mutua entre las muestras

[1].En trabajos publicados posteriormente White y sus colaboradores [4], Stewart [5] y Ruzicka

y su grupo[6] demostraron que para sistemas de flujo continuo el numero de Reynolds era en

la mayorıa de los casos menor que 2000, asegurando que el regimen existente es laminar en el

transporte de materia a traves de los tubos, mientras que para el SFA el numero de Reynolds

es mayor o igual a 3000, debido al regimen turbulento existente.

El que el flujo sea laminar otorga grandes ventajas al FIA :

Zona de muestra bien definida

Caudales pequenos

6

2.1. ANALISIS POR INYECCION EN FLUJO

Alta frecuencia de muestreo

Esto simplica el montaje, ya que no es necesaria una presion alta ni la existencia de burbujas

de aire que separen las muestras para evitar su contaminacion mutua al ser inyectadas sucesi-

vamente.

La base por tanto de este tipo de analisis se encuentra en el fenomeno de dispersion.

Las condiciones de trabajo habituales del FIA provocan que el bolo de muestra se disperse

en la solucion portadora o en el reactivo. A causa del regimen laminar la muestra aparece en

una zona definida, produciendose un gradiente de concentracion en esta zona que se relaciona

con el perfil de velocidad correspondiente al regimen laminar. Esto provoca la forma de los picos

que se forman en el analizador como se refleja en la siguiente figura.

Figura 2.2: Senal obtenida en una configuracion FIA. En la parte superior aparece la dispersion

de la muestra

Fuente: Analisis por inyeccion en flujo: herramienta clave para la automatizacion analıtica,

Marıa del Pilar Canizares Macıas

La dispersion de la muestra ocurre por medio de dos mecanismos:

Transporte por conveccion, que genera un flujo parabolico con velocidad nula en las paredes

y velocidad maxima igual al doble de la velocidad media.

Transporte por difusion causado por gradientes de concentracion tanto verticales como

horizontales.

7

CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE

Ası que, las senales FIA toman diferentes formas en funcion del tiempo que pasa en el sistema.

Si el tiempo es demasiado corto la dispersion no afecta; pero, si el tiempo de residencia fuera

demasiado largo ocasionan que el efecto de la difusion sea muy acusado, originando picos muy

anchos.

Por tanto, se ve que el tiempo de residencia es un parametro fundamental, y que tiene

que responder a un compromiso de manera que el transporte por conveccion tenga la misma

importancia que el transporte por difusion.

Las caracterısticas del pico (tiempos de arranque, residencia y ancho de banda y altura o

area de pico) dependen de las caracterısticas hidrodinamicas del sistema FIA que son caudal,

volumen de inyeccion, longitud del reactor, etc. Por ello, resulta difıcil modelar el modelo de

dispersion que pueda predecir el comportamiento de una muestra inyectada en un sistema FIA.

Para probar la validez del metodo se llevaron a cabo valoraciones acido base con naranja

de metilo, para este ensayo se utilizo el montaje FIA mas sencillo posible, en el que la solucion

portadora (acido) se hace circular por un canal en el que se inyecta la muestra (indicador) que

tras reaccionar pasa al elemento analizador. Pero despues de comprobar que efectivamente, este

montaje resultaba efectivo se paso a utilizar el siguiente mas sencillo, que aparece representado

en la siguiente figura,

Figura 2.3: montaje FIA de dos canales

Fuente: Flow Injection Analysis [1]

Este montaje de dos canales permite mas aplicaciones, y por lo general, los montajes FIA que

se utilizan tienen dos o mas canales. Aparecen entonces nuevos parametros a tener en cuenta,

como son las uniones entre canales, la geometrıa de la celda de flujo etc.

Conocido esto, diversos modelos teoricos han sido discutidos [7] [8] [9] [10] resolviendose que

el parametro mas adecuado para caracterizar la dispersion en un sistema FIA es el coeficiente

de dispersion de Ruzicka, propuesto por este y sus colaboradores [1]. Este parametro cuantifica

la dilucion que sufre el bolo de muestra cuando pasa por el detector y se define como la relacion

entre las concentraciones del analito antes (Co) y despues del analisis (C), es decir el inverso del

factor D de dispersion (D= Co/C).

Por tanto, para el maximo de la curva el valor D = Co / Cmax.

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2.1. ANALISIS POR INYECCION EN FLUJO

Puesto que siempre se puede encontrar una relacion entre la senal analıtica detectada (

absorbancia, ,mV, etc.) el registro de la misma (altura o ancho de pico ) y la concentracion de

la muestra o su producto de reaccion (C), el coeficiente D puede calcularse en funcion de la

senal detectada expresandose como D = Koho / k1hmax. Donde Ko y k1 son las constantes de

proporcionalidad que normalmente tendran el mismo valor puesto que no varıa la relacion entre

concentracion y altura entre ambas concentraciones.

Por otra parte, tambien hay que tener las condiciones hidrodinamicas del sistema. La dis-

persion global del sistema se puede considerar igual a la suma de las dispersiones originadas en

las tres partes del sistema FIA:

La dispersion originada tanto por el volumen de muestra como por los aspectos geometricos

del sistema de inyeccion

la dispersion originada por la geometrıa del reactor y el caudal circulado

la dispersion originada por la dilucion provocada por la geometrıa de la celda de flujo.

Que dependen principalmente del tiempo de residencia del bolo de muestra en cada una de

estas partes, por lo que se puede establecer que la altura de la senal dependera principalmente del

tiempo de residencia. Por lo que caudales bajos o reactores largos provocan alturas mayores de

la senal mientras que volumenes pequenos, que incrementan la dilucion, provocan la disminucion

de la altura del pico.

A todo lo expuesto hasta ahora se debe anadir el efecto de las reacciones quımicas ya que

cuando ocurren resultarıa erroneo considerar la dispersion como un fenomeno puramente fısico.

Se considera ademas el efecto de la cinetica de la reaccion ya que no se llega al equilibrio en

contra de lo que ocurre en el caso del SFA. Las principales variaciones que las reacciones quımicas

introducen en el sistema FIA son:

La posibilidad de que la medida que se realice sea del producto de la reaccion por lo que

el grado de conversion afecta a la altura del pico, respecto a la dispersion cuanto mayor

sea la velocidad de reaccion menor sera la dispersion

Cuando la propiedad que se mide tiene relacion con uno de los reactivos que desaparece

del flujo, que serıa el escenario opuesto al anterior, por lo que, un aumento de la velocidad

de reaccion provoca un aumento de la dispersion

Como se ha visto el analisis por inyeccion en flujo aparecio en 1975 de mano de Ruzicka

y Hansen pero desde entonces muchos estudios se han publicado al respecto, confirmando la

9

CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE

robustez y fiabilidad del metodo y adaptandolo cada vez a mas tipos de analisis mediante confi-

guraciones cada vez mas complejas, como por ejemplo su utilizacion combinada con biosensores

para la determinacion de ciertos metabolitos.

En conclusion, el analisis por inyeccion en flujo es una de las tecnicas que, al permitir

altas frecuencias de muestreo y mınima intervencion humana permite mejorar la calidad de

los resultados analıticos siendo una de las tecnicas mas sencillas para la automatizacion del

analisis quımico. Otras tecnicas de automatizacion han ido surgiendo durante los anos, pero

la flexibilidad, versatilidad y bajo coste del analisis por inyeccion en flujo han llevado a la

consolidacion de su uso.

2.2. Consumo de Te

En los ultimos anos el consumo de te en Espana ha aumentado, segun la consultora IRI entre

el 2014 y 2015, las ventas de tes e infusiones crecieron un 3.5 % en volumen en el interanual a 30

de octubre, superando de esta forma las 4.905 t, por valor de 145,9 millones de euros, un 4,5 %

mas. Por categorıas, las infusiones siguen siendo las mas demandadas, tras haber crecido un 2,9 %

tanto en volumen como en valor, lo que le da una cuota cercana al 65 % en ambas dimensiones.

Pese a ello, los tes comienzan a ganar terreno al anotarse un 4,8 % en volumen y mas del 7,5 % en

valor, con las variedades naturales evolucionando por encima del 17 % en toneladas y del 58 % en

terminos economicos; si bien este crecimiento es menor que en otros lugares del mundo, el te se

esta convirtiendo en la opcion preferida para sustituir al cafe principalmente por los beneficios

que reporta a la salud. A continuacion se discuten los beneficios que reporta el consumo del

te verde, te blanco y Rooibos.

2.2.1. Te verde

El consumo de te verde se ha asociado a la reduccion de la posibilidad de padecer cancer y al

control de enfermedades cardiovasculares. Dichos efectos positivos se asocian principalmente a su

contenido de flavonoides polifenolicos,conocidos como catequinas. Principalmente a la catequina

EGCG (Epigalocatequin galato). Los polifenoles del te verde son antioxidantes conocidos y ha

sido propuesto que estos fitoquımicos modulan los procesos bioquımicos y fisiologicos que llevan

a la iniciacion y propagacion de carcinogenesis y enfermedades cardiovasculares o sus factores

de riesgo, retrasandolos o reduciendo su alcance.

10

2.2. CONSUMO DE TE

2.2.1.1. Efectos antioxidantes del te verde

Cuando se acumulan especies de oxıgeno reactivo (EOR) se marca el inicio de estres oxida-

tivo , que a su vez se han asociado con acontecimientos intracelulares. Estos acontecimientos

intracelulares han mostrado una correlacion fuerte con el desarrollo de enfermedades como el

cancer, cardiovasculares y neurodegenrativas. De esta manera, por el contenido de polifenoles

del te verde, se asocia su consumo con la disminucion del riesgo de padecer dichas enfermeda-

des. Diversos estudios respaldan esta hipotesis exponiendo el aumento del nivel de antioxidantes

causado por el consumo de te verde. [11] [12]

2.2.2. Te blanco

El te blanco es originario de la costa sudeste de China donde se produce y es conocido

por su procesamiento mınimo y caracterısticas naturales. Por ello su demanda y su consumo ha

aumentado sistematicamente durante los ultimos anos. Comparte con la composicion del te verde

diferentes catequinas y en concreto la EGCG por lo que tambien tiene actividad antioxidante [13]

pero tambien cuenta con otros efectos beneficiosos en el rango de los ya descritos para otros tipos

de tes como el verde o oolong. La principal diferencia es que carece de etapas de fermentacion

como el Rooibos o de descativacion de encimas como el te verde. Ya que las condiciones de

manufactura afectan al contenido de catequinas hay mucho que se desconoce respecto a este

tipo de te.

2.2.3. Rooibos

El Rooibos es un te de hierbas, que se comercializa como una bebida buena para la salud

debido a su alto contenido de antioxidantes, procedente de Sudafrica no contiene cafeına y

tiene un contenido significativo de polifenoles. Como en los anteriores casos se relaciona con la

proteccion frente al cancer y las enfermedades cardiovasculares.

En este caso no existen las catequinas que encontramos en los tes anteriores, sin embargo

es la unica fuente natural de aspalatina y la principal de notofagina. Antioxidantes con efectos

antiinflamatorios [14] ademas de otros flavonoides.

11

CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE

2.3. Determinacion del contenido de Polifenoles totales. Metodo de

Folin-Ciocalteu

A causa de todos los beneficios mencionados anteriormente de la actividad antioxidante

derivada del contenido de polifenoles resulta de interes su cuantificacion en distintos productos

de consumo humano. El metodo mas comunmente utilizado para hacerlo es el de Folin Ciocalteu.

Los compuestos polifenolicos presentan en su estructura quımica uno o mas anillos de ben-

ceno y uno o mas grupos hidroxilados con algun elemento comun, como los grupos funcionales

esteres de metilo, glicosidos, etc. Se trata de moleculas muy reactivas que normalmente se en-

cuentran combinados con azucares pero tambien pueden unirse con acidos carboxılicos, acidos

organicos, aminoacidos y lıpidos. Clasificando los polifenoles segun su complejidad quımica pue-

den agruparse como se refleja en la siguiente tabla:

Estructura quımica Tipo Ejemplo de polifenol

C6 - C1 Acido Fenolico / Acido benzoico Acido Galico / Acido elagico

(C6 − C1)n Taninos hidrolizables

C6 - C2 Acido fenil acetico

C6 - C3 Acido hidroxicinamico / Cumarinas Acido cafeico/Acido ferulico

(C6 − C3)2 Linganos

C6 - C1 -C6 Benzofenonas / Xantonas

C6 -C2 -C6 Estilbenos Reveratrol

C6 -C3 -C6 Flavonoides / Chalconas Antocianinas, Flavonoles, Flavonas, Flavanonas, Isoflavonas, Flavanoles

(C6 − C3 − C6)n Proantoancinas / Taninos(4 ≤n≤11)

Tabla 2.1: Clasificacion de los polifenoles y ejemplos de ellos

Fuente: Determinacion de polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Garcıa Martınez

et al. , UPV

El metodo de Folin-Ciocalteu se basa en la reaccion de estos compuestos con el reactivo

de Folin-Ciocalteu, a pH basico para dar lugar a una coloracion azul que es susceptible de ser

determinada espectofotometricamente a 765 nm. Este reactivo contiene una mezcla de wolfra-

mato sodico y molibdato sodico en acido fosforico, las sales en medio acido dan el color amarillo

caracterıstico del reactivo, y al ser reducida por los grupos fenolicos da lugar al mencionado azul

intenso, cuya intensidad se medira para determinar el contenido de polifenoles.

12

2.3. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES. METODO DEFOLIN-CIOCALTEU

Figura 2.4: Mecanismo de accion del reactivo de Folin-Ciocaltu

Fuente: Determinacion de polifenoles totales por el metodo de Folin-Ciocalteu, Martınez et al.

, UPV

Al ser el mecanismo de la reaccion redox el grado en el que se completa se puede conside-

rar tambien como indicador de la actividad antioxidante total. Para cuantificar la cantidad de

polifenoles se recomienda utilizar como patron de calibracion el acido galico.

13

CAPITULO 2. ESTADO DEL ARTE

14

CAPITULO 3Objetivos

Tras el desarrollo del estado del arte del campo a estudiar, es preciso establecer un sarie de

objetivos a cumplir durante el desarrollo del presente trabajo, estos son:

Disenar un sistema FIA que permita analizar el contenido de polifenoles totales en muestras

de te de manera rapida y efectiva.

Realizar el montaje y la puesta a punto

Comprobar la validez de los datos de diseno del montaje FIA de la bibliografıa en los que

se basa el proyecto.

Estudiar el efecto de diferentes condiciones de extraccion.

Comparar la actividad antioxidante encontrada para diferentes tipos de te.

En general, este Trabajo de Fin de Grado busca realizar un montaje FIA sencillo y comprobar

su utilidad. Como aplicacion se toma el analisis del contenido de polifenoles totales en muestras

de te verde te blanco y Rooibos.

Esta aplicacion resulta interesante ya que el consumo de te es bueno para la salud por su

contenido en polifenoles.

15

CAPITULO 3. OBJETIVOS

16

CAPITULO 4Metodologıa Experimental

4.1. Montaje

Se realizo un montaje basico de analisis por inyeccion en flujo con dos canales como el

mostrado en la figura 2.3 Los equipos y materiales utilizados fueron los siguientes:

Materiales

Tubos de Teflon de diversos diametros internos

Inyector de jeringa

Union en T

Tubo de cristal hueco

Valvula de seis vıas (Cheminert C22)

Instrumentacion

Bomba persitaltica (Heidoplh, DP5201)

17

CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Figura 4.1: Bomba peristaltica

En primer lugar, se llevo a cabo el calibrado de la bomba peristaltica. Para ello se utilizaron

dos probetas de cinco mililitros, siendo sus masas vacıas: 11,3 g y 11,4 g para las probetas 1 y 2

respectivamente y un cronometro. La bomba se puso en funcionamiento durante cinco minutos

a diferentes velocidades tras los cuales se peso la cantidad de lıquido desplazado por ella. Los

resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla.

Velocidad de la

bomba (rpm)Masa 1 (g) Masa 2 (g) Caudal Q1 (ml/min) Caudal Q2 (ml/min)

5 2,4 2,8 0,48 0,56

10 4,9 6 0,98 1,2

20 9,6 11,8 1,92 2,36

30 13,7 16,7 2,74 3,34

40 18,4 22,3 3,68 4,46

Tabla 4.1: Calibrado de la bomba

La diferencia obtenida entre ambos caudales no se considero importante por ser lineal y

pequena. A partir de estos resultados se elaboraron rectas de calibrado a partir de las cuales se

hallara el caudal de la bomba a la velocidad de trabajo en cada experimento, ya que el caudal

es el parametro importante para el diseno pero no se puede fijar directamente en la bomba.

Una vez calibrado el sistema del bombeo se procedio al montaje de la hidraulica. En primer

lugar se eligieron los tubos para la bomba peristaltica de manera que los seleccionados para

18

4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO

el resto del montaje ( D.I 0,8 mm) encajaran en ellos. Despues se introdujo la valvula de la

inyeccion en el primer canal y se sujeto mediante un pie y una pinza, Se unieron ambos canales

mediante una union en T y por ultimo se cortaron 0,5 metros de tubo para que constituyeran el

reactor que se enrollaron alrededor del tubo hueco con el fin de ocupar el menor espacio posible.

Figura 4.2: Montaje

Se bombeo agua destilada a velocidades altas para comprobar que no existıan fugas. Al

comprobar que efectivamente no habıa fugas se conecto el final del reactor a la cubeta de flujo

terminando ası la fase de montaje.

4.2. Puesta en marcha y funcionamiento

Los equipos y materiales que se emplean para la puesta en marcha y durante el funciona-

miento del sistema son:

Equipos

Espectofotometro UV (Perkin Elmer, Lambda 35)

19

CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Reactivos

Acido Galico (Sigma Aldrich)

Acido Tanico (Sigma Aldrich)

Azul de metileno (preparado en el laboratorio)

Reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma Aldrich)

Na(OH) (Sigma Aldrich)

Te verde (DIA)

Te blanco (Argen Bio)

Rooibos (Argen Bio)

Agua destilada

Todos los reactivos son de grado analıtico.

Para la puesta en marcha se hizo circular agua por los dos canales y se utilizo azul de metileno

como muestra. Se realizaron experimentos con la bomba operando a diferentes velocidades para

volumenes de muestra de 25 microlitros.

Se utiliza azul de metileno ya que absorbe en la misma region que el reactivo de Folin

Ciocalteu reducido. [15] Estudiando el espectro de absorcion del azul de metileno se fija la

absorbancia para estos ensayos en 660 nm.

De esta manera al observar la forma de los picos de absorbancia se puede comprobar el fenomeno

de transporte predominante como se explico en el capıtulo 2.

Otro cometido de estos ensayos previos es la comprobacion de que el sistema no tiene fugas que

no se hayan detectado con anterioridad [1].

Se fijo la duracion de todos los ensayos en una hora, intentando inyectar una muestra cada vez

que la absorbancia volviera a cero. Esto resultaba ineficiente ya que se creaban tiempos muertos

muy largos entre muestras. Por eso se decide fijar en la medida de lo posible la frecuencia de

muestreo en una inyeccion por minuto.

En primer lugar se llevo a cabo un ensayo a 5 rpm, los resultados obtenidos se pueden

observar en la figura 4.3

20

4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO

Figura 4.3: Ensayo a con azul de metileno a 5 rpm

Se quieren destacar dos aspectos de la figura; En primer lugar las perturbaciones que se aprecian

tras la aparicion del tercer pico. Este tipo de perturbaciones aparecen cuando entra aire de alguna

manera en el sistema, formandose burbujas que al pasar por el instrumento de medida reflejan

grandes alteraciones en las absorbancias medidas.

El otro aspecto a tener en cuenta es la diferencia que se aprecia en los picos. Esto es importante,

ya que la repetibilidad es una de las grandes ventajas de utilizar este metodo, es necesario

asegurar que los valores de absorbancia maxima son lo suficientemente parecidos como para

afirmar que el ensayo es reproducible.

A continuacion se realizaron ensayos a 10, 20, 30 y 40 rpm ya que no arrojaron resultados

aceptables, al presentar diferencias notables en las alturas de los picos y dado que se trataba del

primer ensayo realizado, se realizo un segundo ensayo para intentar encontrar la causa de dicha

diferencia.

Las figuras siguientes muestran los resultados obtenidos en las repeticiones mencionadas.

21

CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Figura 4.4: Repeticion de ensayo con tinte, velocidad de la bomba: 5 rpm

Figura 4.5: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba: 10rpm

22

4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO

Figura 4.6: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :20 rpm

Figura 4.7: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba:30 rpm

23

CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Figura 4.8: Ensayo 2 con tinte, velocidad de la bomba :40 rpm

Tras llevar a cabo estos ensayos se extrajeron varias conclusiones; Para empezar, se puede apre-

ciar en las graficas la aparicion de ciertos datos aislados que se deben a pequenas burbujas que

o bien entran en la aguja al tomar la muestra, o bien se introducen al inyectarla. Tambien se

observa que la repetibilidad disminuye con la velocidad, por lo que se consideran mejores las

velocidades menores.

De nuevo, se empezo una nueva repeticion del ensayo a las diferentes velocidades, las primeras

medidas ( a 30 rpm) arrojaron los siguientes resultados:

24

4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO

Figura 4.9: Ensayo 3 con tinte, velocidad de la bomba: 30 rpm

Como se puede observar en la figura por la forma del ultimo pico se deduce que la muestra

esta entrando al detector mas lentamente. De manera que al revisar el montaje, se descubrio que

el motivo era una obstruccion causada por un trozo del septum de la valvula que se desprendio al

inyectar.

A la vista de los resultados obtenidos y de las dificultades que se desprenden de utilizar el

inyector de jeringa, se decide cambiarla por una nueva valvula de seis vıas. Para la utilizacion de

esta valvula fue necesario cambiar el volumen de muestra a 50 micro litros, ya que es el mınimo

posible. El montaje queda como aparece en la figura 4.10

25

CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Figura 4.10: montaje final

A continuacion se llevaron a cabo los mismos ensayos inyectando tinte en una corriente

de agua, obteniendo resultados mucho mas alentadores que los anteriores. Se observo como en

el caso anterior, que las velocidades menores arrojaban resultados mejores. En la tabla 4.2 se

pueden observar los resultados.

Velocidad de la

bombaAbsorbancia media desviacion estandar

10 2,21 0,021

20 1,91 0,084

Tabla 4.2: Resultados a 10 y 20 rpm

Se considera que las diferencias entre ambas no resultan tan favorables como para justificar

26

4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO

el uso de mas reactivo. Por lo que se elige trabajar a 10 rpm.

Con esto termina la puesta a punto, quedando los parametros FIA fijados en:

longitud del reactor: 50 cm

volumen de muestra: 50 micro litros

velocidad de la bomba: 10 rpm

4.2.1. Obtencion de rectas de Calibrado

Para realizar las rectas de calibrado se utilizaron acido Tanico y acido Galico. Primero se

prepararon las disoluciones madre de 1g/l, para ello se tomaron 0,1 gramos y se disolvieron en

100 ml de agua.

masa acido

Galicomasa acido Tanico

0.1016 0.112

Tabla 4.3: masas pesadas de acido Galico y acido Tanico

A partir de estas disoluciones se prepararon patrones para concentraciones de 5, 10, 20, 40

y 80 ppm.

Durante la etapa de calibracion de la bomba tambien se prepararon los reactivos, un litro de

Na(OH) 0,25 M y otro de reactivo FC 0,2M. [16] [17]

Para fijar la absorbancia a la que se realizaran los ensayos y utilizando las disoluciones madre

de 1g/l se tomaron las muestras recogidas en la siguiente tabla:

27

CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

no de muestra Composicion

1 1 ml FC + 4 ml agua

2 1 ml FC + 1 ml sosa + 3 ml agua

3 1 ml FC + 1 ml sosa + 1 ml tanico + 2 ml agua

4 1 ml FC + 1 ml sosa + 1 ml galico + 2 ml agua

5 1 ml FC + 1 ml tanico + 1 ml sosa + 2 ml agua

6 1 ml FC + 1 ml galico + 1 ml sosa + 2 ml agua

Tabla 4.4: Muestras acido galico y acido tanico

En la figura 4.11 se muestran los espectros de absorcion registrados de dichas muestras entre

900 y 350 nm

Figura 4.11: Espectros de muestras 3 a 6

Como se puede observar en la figura 4.11 los maximos de absorbancia para las muestras que

contienen uno de los acidos esta en el rango 700-760 nm. En la tabla 4.5 aparecen reflejadas las

longitudes de onda a la que aparecieron los picos de absorbancia para cada muestra.

28

4.2. PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO

no de muestra λ (nm)

3 689

4 714

5 755

6 758

Tabla 4.5: longitudes de onda

Conocido esto, se extraen varias conclusiones. Por un lado, el orden en el que se anaden los

reactivos influye significativamente en el producto. Tambien se aprecia que en las muestras en

las que se utilizo el acido Galico la longitud de onda es mayor, aunque esta diferencia es menos

importante en el caso de las muestras 5 y 6.

Puesto que el orden en el montaje FIA es el mismo que para las muestras 5 y 6 se escoge la

longitud de onda de 758 nm para los experimentos posteriores.

Tras conocer la longitud de onda que se habıa de fijar, y teniendo los reactivos preparados

se procedio a la obtencion de las rectas de calibrado. Para ello, se hicieron 5 inyecciones de cada

dilucion de las disoluciones madre de los acidos (80 ppm, 40 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm) a

partir de las absorbancias registradas se obtuvieron las siguientes rectas de calibrado.

Figura 4.12: Recta de calibrado acido Galico

29

CAPITULO 4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Figura 4.13: Recta de calibrado acido Tanico

4.3. Montaje FIA con un canal

Aparentemente, nada indica que no se pudiera simplificar el montaje FIA reduciendolo a un

solo canal, para conseguir esto el reactivo que se circula por el unico canal es una mezcla 1:1 de

reactivo FC y NaOH preparados para las calibraciones dado que se emplea el mismo caudal de

ambos.

Figura 4.14: Montaje FIA un canal

Este tipo de montaje reportarıa ahorro en reactivos y materiales por lo que de ser posible

su uso este serıa deseable. Por ello, utilizando los patrones preparados para la calibracion se

llevaron a cabo pruebas de dicho montaje.

Tras varios ensayos probando diferentes caudales se concluyo que el montaje con un canal

es inviable para esta aplicacion ya que no solo los picos tienen diferentes alturas si no que no

aparece una lınea base estable.

30

CAPITULO 5Resultados y discusion

5.1. Introduccion

En este capıtulo se exponen los resultados del analisis de muestras de te verde, te blanco y

Rooibos para la determinacion de la cantidad de polifenoles totales que contienen cada uno de

ellos.

Para cada tipo de te se llevo a cabo un pequeno estudio del efecto de las condiciones de prepa-

racion sobre la extraccion de los polifenoles.

Se comprueba ası la eficacia de la extraccion cuando se siguen las instrucciones de preparacion.

5.2. Te verde

Se utilizo Te verde al limon de DIA. La masa especificada por el fabricante por cada bolsita

es de 1,5 g. Antes de empezar, se realizaron pruebas para comprobar que dilucion era necesaria

para obtener picos de absorbancia dentro del lımite de deteccion. Se eligio una dilucion 1:4.

31

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

5.2.1. Estudio de la temperatura

Para el estudio de la temperatura se anadieron 150 ml de agua a 100oC , 60 oC y 30 oC ,

se dejaron en reposo durante 3 minutos y se introdujeron en un bano frıo. Despues se filtraron

(Albet, DP5892125) y por ultimo se llevaron hasta 200 ml.

Tomando estas preparaciones, se realizaron las diluciones, teniendo ası preparadas las mues-

tras que se analizaron a continuacion.

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Figura 5.1: Absorbancia a diferentes temperaturas

Como se aprecia en la figura 5.1 no se detecta una influencia muy marcada de la temperatura

mientras esta sea alta, sin embargo sı se nota un descenso drastico en la absorbancia cuando el

agua esta a 30 oC A partir de los valores reflejados en la figure se obtuvieron las absorbancias

medias para cada caso que aparecen en la tablas 5.1

32

5.2. TE VERDE

Temperatura (oC) Absorbancia media (A)

100 0,654

60 0,593

30 0,307

Tabla 5.1: absorbancias medias

Comparando estos valores con las rectas de calibrado se obtiene el contenido de polifenoles

totales (PT) en funcion de la temperatura.

Temperatura (oC) PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico

100 80,7 77

60 73,1 69,7

30 37,4 35,7

Tabla 5.2: Concentracion de polifenoles totales en funcion de la temperatura

Figura 5.2: Concentracion de polifenoles vs Temperatura

Como se aprecio al registrar la absorbancia de las diferentes muestras la concentracion de po-

33

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

lifenoles totales disminuye con la temperatura, es decir la extraccion empeora con la disminucion

de la temperatura del agua.

5.2.2. Estudio del tiempo de extraccion

En este estudio no se midio la temperatura del agua, si no que se llevo a ebullicion y se

tomaron muestras utilizando 5 minutos , 3 minutos y 1 minuto de extraccion.

Se registraron los siguientes resultados:

Figura 5.3: Absorbancia a diferentes tiempos de extraccion

Tiempo (min) Absorbancia media (A)

5 0,746

3 0,654

1 0,516

Tabla 5.3: Absorbancias medias

34

5.2. TE VERDE

Mediante estos resultados se obtuvieron los PT.

Tiempo (min) PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico

5 92,2 87,9

3 80,7 77

1 63,5 60,6

Tabla 5.4: Tiempo (min) vs PT (ppm)

Figura 5.4: Tiempo vs PT

Se puede ver que en este caso la dependencia del tiempo de extraccion es mas lineal que en

el caso de la temperatura, ya que no se aprecia ningun punto de inflexion. Se deduce por tanto

que el factor crıtico para conseguir una buena extraccion es la temperatura del agua.

5.2.3. tiempo de reposo

Para comprobar el efecto del tiempo de reposo se preparo una muestra con agua a 100 o

C y 3 minutos de extraccion y se dejo reposar durante dos dıas, esta muestra se midio y se

comparo con una recien preparada en las mismas condiciones.

35

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 5.5: Absorbancia a distintos tiempos de reposo

Se obtuvieron tambien los polifenoles totales en cada caso.

Tiempo de reposo PT(ppm) Tanico PT (ppm) Galico

2 dıas 97,9 93,4

Recien preparada 84,4 80,5

Tabla 5.5: PT para distintos tiempos de reposo

Como se ve en la tabla 5.5 el contenido de polifenoles aumenta al aumentar el tiempo de

reposo. Tambien aumenta la turbidez de la muestra, por lo que para descartar que el aumento

de absorbancia no se deba a esto se inyecto dicha muestra pasando agua por los dos canales para

comprobar si la absorbancia que se registraba en este caso era la diferencia entre las medidas

anteriormente. Los resultados que se obtuvieron no compensaban la diferencia por lo que se

concluye que el aumento de la absorbancia no va ligado a la turbidez.

36

5.3. TE BLANCO

5.3. te blanco

En este caso al hacer pruebas para comprobar los lımites de absorbancia se encontro que

esta era muy superior a la encontrada en el te verde, por lo que la muestra habıa de diluirse

segun un ratio 1:5 en lugar de 1:4 como en el caso anterior.

5.3.1. segundo calibrado

Para comprobar que los reactivos no se han degradado, afectando a la reaccion, se realiza

un nuevo calibrado. En la primera ocasion se utilizan los mismos patrones que se prepararon

para el primer calibrado, que se habıan almacenado. En este caso se puede apreciar que la

absorbancia sube, como lo hacıa la del te que habıa reposado durante dıas. Para comprobar este

efecto se volvieron a preparar los patrones y se obtuvo otra recta de calibrado, los resultados de

la comparacion entre las diferentes rectas de calibrado se muestran a continuacion:

Figura 5.6: Rectas de calibrado Tanico

37

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 5.7: Rectas de calibrado Galico

En el caso del acido Tanico, la recta 3, la obtenida con patrones recien preparados se acerca

mucho a la original, sin embargo en el caso del acido galico las absorbancias reflejadas en la

recta 3 son aun mayores que las anteriores.

Esto se toma como evidencia de la descomposicion del reactivo que aun no afectando al

acido Tanico afecta al Galico. En la figura 5.8 se observa una comparacion de las rectas de

calibrado para ambos acidos cuando se realizaron con patrones recien preparados, se aprecia

una diferencia notable de absorbancia para concentraciones mayores de 20 ppm.

Esto lleva a pensar que los resultados obtenidos con una o con otra no se pareceran como en el

caso anterior; esto se discutira mas adelante.

38

5.3. TE BLANCO

Figura 5.8: Comparacion de las terceras rectas de calibrado obtenidas

Estas rectas son las que se utilizaran para calcular las concentraciones durante toda esta seccion.

39

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

5.3.2. Estudio de la temperatura

Se prepararon muestras utilizando agua a 100oC , 80oC , 60oC y 30oC segun el mismo

procedimiento que el utilizado para el te verde. Se midieron las siguientes absorbancias:

Figura 5.9: Absorbancia a diferentes temperaturas

Temperatura (oC) Absorbancia media (A)

100 0,769

80 0,751

60 0,604

30 0,299

Tabla 5.6: absorbancias medias

A partir de estos datos se calculan los PT resultando:

40

5.3. TE BLANCO

Temperatura (oC) PT(ppm) Tanico PT (ppm) Galico

100 102,8 59,1

80 100,5 57,7

60 81.309 46.123

30 39.946 22.423

Tabla 5.7: Temperatura(oC) vs PT (ppm)

Figura 5.10: Temperatura vs PT

Las concentraciones de PT en la muestra son bastante diferentes en funcion de la recta de

calibrado usada para hallarlas, reflejando la diferencia que se observaba en la obtencion de dichas

rectas. Aun ası se destaca que la forma de la evolucion de las concentraciones en funcion de la

temperatura es la misma. Se aprecia que el efecto de la temperatura es mayor que en el caso

anterior pues la region en la que la concentracion permanece estable pasa a ser de 100 oC a 80

oC siendo antes de 100 oC a 60 oC .

41

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

5.3.3. Estudio del tiempo de extraccion

Se prepararon muestras con 5 minutos, 3 minutos y 1 minuto de tiempo de extraccion, y se

analizaron resultando:

Figura 5.11: Absorbancias para distintos tiempos de extraccion

Tiempo (min) Absorbancia media (A)

5 0,77

3 0,848

1 0,625

Tabla 5.8: Absorbancias medias

Se quiere destacar que, contrariamente al caso anterior se percibe una absorbancia menor

con cinco minutos que con tres. Al calcular los PT se encuentran los siguientes resultados:

42

5.3. TE BLANCO

Tiempo de extraccion (min) PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico

5 101,7 60,2

3 112,3 66,67

1 82,5 48,6

Tabla 5.9: Tiempo de extraccion (min) vs contenido de PT (ppm)

Figura 5.12: Tiempo de extraccion vs. PT

Los resultados, como pasaba en el caso de la temperatura, difieren mucho en funcion de como

se obtengan, en este caso cabe destacar que la muestra con cinco minutos presenta concentracion

menor que la preparada con tres minutos.

Puesto que la diferencia no es muy acusada se piensa que se produce a causa de la temperatura

a la que estuviera el agua en cada caso, ya que para el estudio del tiempo de extraccion no se

midio la temperatura del agua sino que simplemente se empleo agua hirviendo.

Para comprobar que estos resultados no eran fruto de un error, se preparo una nueva muestra

con 3 minutos de tiempo de extraccion obteniendose los resultados siguientes:

43

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 5.13: Absorbancia para 3 minutos

Puesto esta repeticion se hizo tras preparar nuevos reactivos, se han de emplear las rectas

de calibrado que se hallaron en ese momento y que aparecen representadas en las figuras 5.16 y

5.17.

Con ello se encuentra una concentracion de polifenoles de 68 ppm y 67,2 ppm empleando las

rectas de acidos Tanico y Galico respectivamente.

De esta manera se comprueba que mientras la concentracion reflejada en forma de acido galico

es muy similar en ambos casos para el acido tanico hay una amplia diferencia.

Esto indica que los resultados para el te blanco expresados como equivalente de acido Tanico

no son representativos.

Por otro lado, el que la concentracion sea tan parecida parece indicar que la extraccion de

polifenoles alcanza su maximo en el minuto 3 y a partir de entonces decae. Esto esta respaldado

por el parecido entre las concentraciones con 5 minutos halladas con 100oC y 80oC.

5.3.4. Estudio del tiempo de reposo

Igual que con el te verde, se analizo una muestra preparada con agua a 100oC y 5 minutos de

extraccion para despues reservarla durante dos dıas y analizarla de nuevo. En este caso tambien

se aprecio que la muestra se enturbio con el paso del tiempo, en la figura se puede apreciar esto

al compararla con una muestra recien preparada.

44

5.3. TE BLANCO

Figura 5.14: Muestra recien preparada vs muestra con dos dıas de reposo

45

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 5.15: Absorbancias para distintos tiempos de reposo

En este caso, aunque existe una diferencia entre las absorbancias es menor que la observada

anteriormente, aunque la turbidez no la compensa por completo (esto se comprobo igual que en

el caso anterior, inyectando la muestra utilizando agua como portador) por lo que se concluye

que existe tambien un efecto similar al que ocurrıa con el te verde pero en menor medida.

Los contenidos en polifenoles totales para cada muestra son:

Tiempo de reposo PT (ppm) Tanico PT (ppm)Galico

recien preparado 101,7 60,2

2 dıas 108 64

Tabla 5.10: PT (ppm) vs. tiempo de reposo

Como se apreciaba segun las absorbancias las diferencias entre el contenido de polifenoles

son muy pequenas.

46

5.4. ROOIBOS

5.4. Rooibos

Por ultimo se analizo infusion Rooibos, se utilizo el mismo metodo de preparacion que con

los anteriores tes, y se diluyo segun el mismo ratio (1:5) que el te blanco.

5.4.1. tercer calibrado

Al estar los reactivos proximos a acabarse se prepararon 500 ml mas de cada uno de ellos,

tambien uno de los tubos de la bomba se rompio debido al desgaste y, al no haber disponibles

tubos con el mismo diametro interno, se tuvieron que sustituir por tubos con menor diametro

interno (0.8mm) Se calibro la bomba de nuevo hallando que para trabajar con caudales aproxi-

madamente iguales que anteriormente ( 1ml/ min ) se debıa trabajar a 20rpm. Todo esto condujo

a que se realizaran tambien nuevas rectas de calibrado. Las rectas que se obtuvieron aparecen

representadas en las figuras 5.16 y 5.17.

Figura 5.16: Recta de calibrado acido Tanico

47

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 5.17: calibrado acido Galico

A continuacion, en las figuras 5.18 y 5.19 se muestran las comparaciones entre todas las rectas

de calibrado que se han generado durante el desarrollo del proyecto.

En ellas se aprecia el notable parecido entre estas ultimas rectas de calibrado y las primeras

que se obtuvieron, esto se considera evidencia de la descomposicion de los reactivos que creo la

diferencia entre las rectas del tercer calibrado.

48

5.4. ROOIBOS

Figura 5.18: comparacion curvas de calibrado de acido Tanico

Figura 5.19: comparacion curvas calibrado acido Galico

Estas ultimas rectas obtenidas son las que se utilizaran para hallar el contenido de PT en esta

seccion.

49

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

.

5.4.2. Estudio de la temperatura

Como para el te blanco se prepararon muestras siguiendo el mismo metodo y utilizando agua

a 100oC , 80oC , 60oC y 30oC . El analisis de dichas muestras arrojo los siguientes resultados:

Figura 5.20: Absorbancia para diferentes temperaturas

Temperatura (oC) Absorbancia media (A)

100 0,224

80 0,157

60 0,08

30 0,04

Tabla 5.11: absorbancias medias

50

5.4. ROOIBOS

Temperatura (oC) PT(ppm)Tanico PT(ppm) Galico

100 26.937 22.925

80 17.98 15.26

60 7.27 2.56

30 2.49 2.56

Tabla 5.12: Temperatura (oC) vs PT(ppm)

Figura 5.21: PT(ppm) vs Temperatura

La dependecia de la temperatura de la concentracion es la mas acusada de los tres casos

estudiados.

5.4.3. Estudio del tiempo de extraccion

Como en los estudios anteriores se prepararon tres muestras con cinco, tres y un minuto de

extraccion y se analizaron. Los resultados se recogen a continuacion.

51

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 5.22: Absorbancia para distintos tiempos de extraccion

Tiempo (min) Absorbancia media (A)

5 0,227

3 0,224

1 0,152

Tabla 5.13: Absorbancias medias

Tiempo de extraccion (min) PT(ppm) Tanico PT(ppm) Galico

5 27.24 23.19

3 26.94 22.93

1 17.358 14.74

Tabla 5.14: Tiempo de extraccion (min) vs PT (ppm)

52

5.4. ROOIBOS

Figura 5.23: Tiempo de extraccion vs PT

En este caso los resultados percibidos segun ambas rectas de calibrado son mucho mas similares

que en el anterior, tambien cabe destacar la poca diferencia que se encuentra entre los

contenidos de polifenoles totales con 5 y 3 minutos, dada la fuerte dependecia apreciada para

la temperatura se comprobo que para ambos casos se utilizaba agua a 100oC.

53

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

5.4.4. Estudio del tiempo de reposo

Figura 5.24: Asorbancias para distintos tiempos de reposo

Tiempo de reposo PT (ppm) Tanico PT (ppm) Galico

Recien preparado 26,46 22,93

2 dıas 20.95 18.18

Tabla 5.15: Tiempo de reposo vs PT (ppm)

En este caso, contrariamente a lo encontrado para los anteriores, la absorbancia disminuye

con el tiempo de reposo. Puesto que los polifenoles del Rooibos no son del mismo tipo que los de

los tes analizados anteriormente se cree que no experimentan los mismos fenomenos que estos

sino que se degradan, y el te pierde capacidad antioxidante.

54

5.5. RESULTADOS

5.5. Resultados

Para poder comparar el contenido de polifenoles en la siguiente tabla se muestran los conte-

nidos hallados anteriormente normalizados.

Se presenta la concentracion de polifenoles en mg por gramo de te.

Te verde (mg/g) Te blanco(mg/g) Rooibos (mg/g)

Acido Tanico 420,5 571,2 154,2

Acido Galico 401 338,3 133,5

Tabla 5.16: Contenido de polifenoles

Estos resultados provienen de las muestras preparadas a 100 o C con 5 minutos de tiempo

de extraccion por ser estas las instrucciones de preparacion del te, es decir, de la manera en la

que se consumirıa.

Como se vio en la seccion correspondiente al te blanco, la concentracion de polifenoles ex-

presada como acido Tanico es bastante mayor que si se expresa como acido Galico. Se considera

que la valida es la expresada como acido Galico.

Respecto al te blanco cabe decir que las condiciones de preparacion de las instrucciones no

son las optimas si no que se habrıa de utilizar 3 minutos como tiempo de extraccion, de hacerse

ası el contenido de polifenoles totales en mg/g de te serıa de 374,4 mg/g.

55

CAPITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSION

56

CAPITULO 6Conclusiones

6.1. Estudio de las condiciones de extraccion

Respecto a las condiciones de extraccion, los resultados confirman en casi todos los casos lo

que se intuıa, la extraccion mejora cuanto mayor es el tiempo de extraccion y la temperatura

siendo la unica excepcion el caso del te blanco que presento una mejor extraccion para tres

minutos que para cinco. Segun la bibliografıa [18] [19] tanto para el te blanco como para el

te verde, existe un aumento del ındice de polifenoles totales con el tiempo de extraccion ası como

evidencia de que el te blanco, pese a tener mayor contenido de polifenoles, respondıa con mayor

lentitud que el te verde al tiempo de extraccion. Por lo que para cinco minutos de extraccion el

contenido de polifenoles que se reflexaba en el te verde era mayor que en el te blanco.

Esto a priori, no coincide con lo encontrado ya que el punto de inflexion respecto al tiempo de

extraccion se ecuentra para 3 minutos en el te blanco y no para el te verde.

Dicho esto, estos resultados podrıan responder a la alta capacidad de oxidacion del te blanco

[19] que al pasar mas tiempo expuesto al ambiente se oxida parcialmente y por ello se encuentra

una menor cantidad de polifenoles que la que se espera.

Diversos estudios[17] [20] [16] del contenido de polifenoles totales utilizan el acido Galico

como patron ya que es ejemplo de los polifenoles del tipo C6-C1.

57

CAPITULO 6. CONCLUSIONES

De manera que se confirma que en caso de discrepancia, los resultados que se tienen en

cuenta son los expresados como acido Galico.

Respecto al tiempo de reposo se apreciaron diferentes comportamientos para cada te. Como

se ha indicado anteriormente,para el te verde el contenido de polifenoles totales aumenta con el

tiempo de extraccion encontrandose que un aumento sostenido durante las tres primeras horas,

para luego descender en caso de ciertos tipos de polifenoles.

Sin embargo, aumenta consistentemente durante 5 horas para otros tipos. [21]

Los efectos que experimentan las catequinas durante el tiempo de reposo son principalmente

la oxidacion y epiremizacion (entre otros muchos cambios quımicos). El efecto de la oxidacion se

evita mediante el pretratamiento de las hojas de te y la epiremizacion es relevante principalmente

si se prepara el te con agua de grifo. [22] Por lo que cabrıa pensar que estas reacciones no son las

causantes del aumento de los PT observado. Sin embargo y dado que no se monitorizo el cambio

de dicho contenido durante el tiempo que estuvo almacenado se cree que alcanzo el maximo

durante la primera media hora como es habitual y se mantuvo relativamente constante durante

las siguientes 48 horas. Otra posible razon del aumento aparente del contenido de polifenoles es

la degradacion en forma de rotura de las cadenas fenolicas para dar monomeros.

Respecto al te blanco, las catequinas que contiene son mas estables que las del te verde y

tambien, como se ha mencionado anteriormente es mas sensible a la oxidacion. De esta manera

se justificarıa que el aumento de la absorbancia registrada sea menor.

En el caso del rooibos, el tiempo de reposo tuvo un efecto negativo, es decir se redujo la

concentracion de polifenoles totales, esto se achaca a la diferente composicion de ambos, ya que

el Rooibos no contiene las catequinas que contienen el te verde y el te blanco que poseen mayor

poder antioxidante que los flavonoides del Rooibos se cree que este se oxida durante el tiempo

de reposo y esto se refleja en el descenso de concentracion observado.

6.2. Contenido de Polifenoles Totales (ındice PT)

El te blanco esta siendo investigado como posible sustituto del te verde por contener ambos

catequinas que se consideran muy beneficiosas para la salud. El Rooibos sin embargo tiene otro

tipo de antioxidantes y por tanto, no se estudia como alternativa para el te verde.

Como se menciono en el apartado 2.2.2 el te blanco apenas se procesa antes de comercializarse

y por ello, los diferentes tipos tienen distintas concentraciones de catequinas. Tambien se ha de

tener en cuenta que este tipo de te esta ganando popularidad recientemente por lo que no se ha

encontrado una literatura tan extensa como la que existe para el te verde.

Los estudios consultados muestran que el te verde presenta mayor actividad antioxidante que el

58

6.2. CONTENIDO DE POLIFENOLES TOTALES (INDICE PT)

te blanco. Esto se atribuye a la mencionada oxidacion que sufre el te blanco pero no el te verde

[13] .

Al comparar distintos tipos de te blanco [23] y te verde se encuentra que los contenidos de

catequinas entre distintas clases del mismo te eran sorprendentemente diferentes que se pueden

achacar a los diferentes procesados y practicas de horticultura [24] [25] pero aun ası se reporta

mayor actividad antioxidante para el te verde que para el te blanco, lo que puede deberse a la

capacidad antioxidante de componentes que no estan presentes en el te blanco puesto que otra

caracterıstica distintiva del mismo es su cultivo en el que se recogen las hojas de te antes de que

maduren, esto causa el menor contenido en estos polifenoles adicionales[26].

Se suscriben de esta manera los resultados hallados en el presente trabajo.

Respecto al Rooibos los estudios que comparan su capacidad antioxidante con la del te verde

encuentran que esta es menor [27] lo que responde a un menor contenido de polifenoles.

Cabe destacar la influencia de la fermentacion del Rooibos en el contenido de polifenoles que

aumenta cuando no se fermenta, el analizado en este trabajo era fermentado, se ha encontrado

[28] que la actividad antioxidante Rooibos no fermentado era aproxiamdamente el doble que la

del fermentado y esta a su vez un 50 % menor que la del te verde.

En este trabajo se ha encontrado que la actividad del te verde era aproximadamente el triple que

la del Rooibos (fermentado). Se comprueba que los resultados hallados coinciden con lo hallado

en el estudio biliografico.

Por ultimo se quiere comentar la relacion entre las concentraciones de polifenoles halladas y

las que se han consumido por los individuos que percibieron los beneficios para la salud de los

mismos en los estudios consultados [29] [30] [31]. La cantidad percibida por taza coincide con la

hallada en la bibliografıa y se estima que el consumo de la gente que presentaba beneficios para

la salud como de seis a diez tazas diarias de te verde, sabiendo que este te es la mayor fuente

de polifenoles de los estudiados se estima que el consumo de Rooibos o te blanco diario tendrıa

que ser mucho mayor.

Dicho esto, se destaca que aunque los polifenoles estan despertando un gran interes por los

beneficios que reportan, el grueso de los estudios realizados al respecto han sido in vitro o en

animales.

59

CAPITULO 6. CONCLUSIONES

60

CAPITULO 7Lıneas futuras

Una vez se ha comprobado el tiempo y los recursos consumidos para elaborar un montaje

FIA sencillo, se puede ampliar o modificar el mismo para utilizarlo en otras aplicaciones. Por

otro lado, al tener en cuenta las dificultades encontradas en el montaje ( desgaste de los tubos

de la bomba, obstrucciones , etc) Se puede mejorar el mismo de cara a estas nuevas aplicaciones.

Respecto a la aplicacion tratada en este proyecto, el estudio se podrıa ampliar de las siguientes

maneras:

Estudiando la influencia de los parametros FIA, longitud de reactor y volumen de muestra

ya que el caudal sı se ha tenido en cuenta.

Anadiendo nuevos tipos de te al estudio y ampliando la comparacion de los poderes anti-

oxidantes de distintas infusiones.

Ampliando el estudio de la calidad de la extraccion empleando distintos disolventes, y

estudiando mas temperaturas y tiempos.

En conclusion, dada la flexibilidad del analisis por inyeccion en flujo, una vez realizada una

toma de contacto como se ha hecho en el presente proyecto se puede emplear como herramienta

de automatizacion de cualquier analisis que se vaya a llevar a cabo en el laboratorio.

61

CAPITULO 7. LINEAS FUTURAS

62

CAPITULO 8Planificacion temporal y presupuesto

La planificacion temporal del Trabajo se ha realizado segun la siguiente Estructura de Des-

composicion del Proyecto que aparece en la figure 8.1

63

CAPITULO 8. PLANIFICACION TEMPORAL Y PRESUPUESTO

Figura 8.1: EDP del proyecto

A partir de esta planificacion se obtiene el siguiente diagrama de Gantt:

Figura 8.2: Diagrama de Gantt

64

El presupuesto del proyecto se divide en cuatro partidas en las que se detallan los costes del

material, equipos y reactivos utilizados en el presente TFG

1. Instrumentacion y equipos

A continuacion se muestra la lista de equipos empleados durante el proyecto, se considera

una amortizacion de 10 anos, para calcular el coste total a imputar se tiene en cuenta la

amortizacion equivalente a medio ano.

Tabla 8.1: Costes de instrumentacion y equipos

2. Materiales

A lo largo del desarrollo de los experimentos se han empleado los siguientes materiales,

que se listan detallando su coste, en la tabla 8.2.

Tabla 8.2: Costes de Materiales

65

CAPITULO 8. PLANIFICACION TEMPORAL Y PRESUPUESTO

3. Reactivos

El coste asociado a todos los reactivos empleados figura en la tabla 8.3.

Tabla 8.3: Costes de los reactivos

Para los calculos se han estimado las cantidades empleadas de cada reactivo segun lo

consumido en los experimentos.

4. Personal

El coste asociado al personal implicado en la realizacion de este trabajo aparece recogido

en la tabla 8.4.

Tabla 8.4: Costes de personal

5. Costes indirectos

Dentro de la partida de costes indirectos se incluyen todos aquellos gastos cuya cuantifi-

cacion es complicada como luz, agua, etc. Se estima como un 15 % del total de las otras

partidas. Con un subtotal de 10767,38ese obtienen unos costes indirectos de 1615,11e

66

6. Presupuesto total La tabla 8.5 recoge el presupuesto total para el proyecto realizado.

Tabla 8.5: Presupuesto total

67

CAPITULO 8. PLANIFICACION TEMPORAL Y PRESUPUESTO

68

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