Toxicidad y bioacumulación del plomo en Macrobrachium ...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
“Toxicidad y bioacumulación del plomo en
Macrobrachium americanum”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
JOAQUÍN REYES CHÁVEZ
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE 2012
II
III
IV
V
Este trabajo de tesis se llevó a cabo en el Departamento de Acuacultura del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). Bajo la dirección del Dr. Juan
Carlos Sainz Hernández y M.C. Juan Pablo Apún Molina. El presente trabajo recibió
financiamiento del IPN a través del proyecto SIP, con número de registro 20121065.
El autor agradece el apoyo brindado por el IPN como becario PIFI y del programa de
becas posgrado, así como al Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología
(CONACYT) por la beca otorgada con clave 366434 durante la realización de la
presente investigación.
VI
DEDICATORIA.
A mi familia: Con toda la fuerza de mi corazón. …
Les pido perdón por todo el tiempo que les falte, para culminar esta tesis
VII
AGRADECIMIENTOS.
Al creador de la vida, por darme la oportunidad de vivir y poder alcanzar mis metas. A mi director de tesis, el Dr. Juan Carlos Sainz Hernández, agradezco infinitamente todo su apoyo, por compartir desinteresadamente sus conocimiento, experiencias, consejos y su amistad, más que un profesor y director; un gran amigo. Mi compa ya estas “misión cumplida”. A mi Co-director M.C. Juan Pablo Apún Molina, por el apoyo brindado. Al equipo de trabajo que colaboró de alguna forma en el trabajo de campo, laboratorio y bioensayos: Genaro, Jazz, Arturo, Ely Sara, Polanco, Daniel. A los señores; “El che” y don “Jesús” del poblado El Opochi, Sinaloa de Leyva por la captura de los organismos. A mis compañeros y amigos de generación; oh-John, Che-luís, Magnolia, José Pedro, Tomas, Lizet, Lalo, shio, Styl, José, Samuel, Jorge, Juan Carlos, Porfirio †, Sheila, Liz, Fátima, Eli, Irene, Alfredo; y Abraham, Carlos, Viri, Carmen, Judith, Dámaris. A Dorín, Don Roberto, Ricardo y Celestino; por ser nuestros centinelas en la vida estudiantil. A la Secretaría de Marina-Armada de México, por darme la oportunidad de superarme profesionalmente. A la empresa CLARVI Lideres en Tratamientos de Agua, en la Ciudad de Los Mochis, Sinaloa. Por abrirme sus puertas al realizar una estancia de investigación; en el asesoramiento y uso de técnicas de AAG. ¡Muchas gracias a todos!
VIII
ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO PÁGINAS
ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………..
VIII
ABREVIATURAS………………………………………………………………. X
GLOSARIO……………………………………………………………………… XII
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………. XIV
ÍNDICE DE CUADROS………………………………………………………... XVI
RESUMEN………………………………………………………………………. XVII
ABSTRACT……………………………………………………………………... XVIII
I.
INTRODUCCIÓN………………………………………………………...
1
II. ANTECEDENTES………………………………………………………. 5
II.1 Toxicidad…………………………………………………………. 5
II.2 Bioacumulación………………………………………………….. 5
II.3 Expresión de proteínas quelantes (metalotioneínas)……….. 6
II.4 Sistema de secuestro y detoxificación de metales………….. 7
III. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………... 8
IV. HIPÓTESIS………………………………………………………………. 9
V. OBJETIVOS……………………………………………………………... 10
V.1 Objetivo general…………………………………………………. 10
V.2 Objetivos específicos…………………………………………… 10
VI. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………... 11
VI.1 Colecta, transporte y aclimatación de los animales…………. 11
VI.2 Diseño experimental…...……………………………………….. 12
VI.2.1 Laboratorio…….………………………………………. 12
VI.2.2 Determinación de parámetros fisicoquímicos….….. 12
VI.2.3 Bioensayo I (Exposición aguda)…………………….. 12
VI.2.4 Bioensayo II (Exposición crónica)…………………... 13
VI.3 Cuantificación de plomo……………...………………………… 13
IX
VI.4 Ingesta……………………………………………………………. 15
VI.5 Análisis del sistema inmunológico…………………………...... 15
VI.5.1 Obtención de la hemolinfa….……………..………… 15
VI.5.2 Coagulación…………………………………...………. 16
VI.5.3 Cuantificación de proteína…………………………... 16
VI.5.4 Hemocitos totales………………………………..…… 16
VI.5.5 Medición de fenoloxidasa (FO) y profenoloxidasa
(proFO)….……..……………………………………….
17
VI.6 Método estadístico……………………………………………… 18
VII. RESULTADOS………………………………………………………….. 20
VII.1 Bioensayo I………………………………………………………. 20
VII.1.1 Concentración letal (CL50)……………………...……. 20
VII.1.2 Concentración Sub-letal (CSL)………………...……. 22
VII.2 Bioensayo II……………………………………………………… 23
VII.2.1 Bioacumulación de plomo…………………………… 24
VII.2.2 Ingesta…………………………………………………. 28
VII.2.3 Sistema inmunológico………………………………... 29
VII.3 Parámetros fisicoquímicos……………………………………... 34
VIII. DISCUSIONES………………………………………………………….. 36
IX. CONCLUSIONES……………………………………………………….. 41
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 43
XI. ANEXOS…………………………………………………………………. 49
X
ABREVIATURAS
APDC Dihidrógeno de Fosfato-Tritón X-100-Triclorometano
AAG Absorción atómica de gases
Ca2+ Calcio ionizado
°C Grado centígrado
CL50 Concentración letal que provoca la muerte al 50% de la
población
CSL Concentración sub-letal
CSL11 Concentración sub-letal que provoca la muerte al 11% de
la población
Cd2+ Cadmio ionizado
Cr2+ Cromo ionizado
Cu2+ Cobre ionizado
(CH3COO)2·Pb·3H2O Acetato de plomo
EE Error estándar
EDTA Etilendiaminotetracetato (agente quelante)
FO Fenoloxidasa (activa)
Fe2+ Hierro ionizado
g Gramo
g Gravedades (9.81 m·s-2)
h Hora
HCl Ácido clorhídrico
HNO3 Ácido nítrico
kDa Kilogramo por Unidad de un Dalton
L-Dopa L-dihidroxifenilalanina
min Minutos
mM Milimolar
mL Mililitro
mg g-1 Miligramo de soluto por gramo
mg mL-1 Miligramo de soluto por mililitro de solución
Mn2+ Manganeso ionizado
XI
MT Metalotioneínas
Ni2+ Níquel ionizado
nm Nanómetro
µg mL-1 Microgramo de soluto por mililitro de solución
µL Microlitro
UpH Unidades de Potencial de iones de hidrogeno
proFO Fenoloxidasa (inactiva)
% Porcentaje
SLH Sobrenadante de lisado de hemocitos
Pb2+ Plomo ionizado
TCA Tasa de conversión alimenticia
V/V Volumen de solución por volumen de solvente
Zn2+ Zinc ionizado
XII
GLOSARIO
Ad libitum: (Expresión en latín que significa “a placer, a voluntad”). En biología se
aplica, cuando no se ha impuesto ningún control a su alimentación.
Apoptosis: Muerte celular programada por reacciones bioquímicas de una forma
ordenada y ejercidas bajo funciones normales.
Bentónico: Animal que se mueve regularmente sobre la superficie del sustrato,
recorriendo.
Bioacumulación: Efecto biológico pertinente con la capacidad que tiene un tejido
vivo para acumular contaminantes, estos pueden ser eliminados o magnificados.
Bioindicador biológico: Es una especie cuya presencia en un ambiente
determinado da información sobre las características ecológicas o del impacto al
medio ambiente (efecto antropogénico).
Contaminación: La presencia de una sustancia en el ambiente que debido a su
composición química o cantidad retarda el funcionamiento de procesos naturales y
produce efectos ambientales indeseables.
Circadiano: (Del latín circa, que significa “alrededor de” y dies que significa “día”).
Oscilaciones de las variables biológicas en intervalos regulares de tiempo.
Dosis: Cantidad de substancia a la que se expone el organismo por una unidad de
tiempo.
Dosis sub-letal: Se refiere a una cantidad de sustancia tóxica, pero no lo suficiente
para producir la muerte a un organismo.
Desintoxicación: Eliminación de sustancias tóxicas.
Encapsulación: Respuesta multicelular para eliminar partículas extrañas que no
pueden ser destruidas por los mecanismos humorales.
Exposición aguda: Exposición única de una sustancia tóxica que puede causar
daños severos o la muerte; en un periodo corto de tiempo (minutos u horas).
Exposición crónica: Exposición continúa de una sustancia tóxica durante un
periodo prolongado (meses o años).
Homeostasis: (Del griego homo que significa “similar” y estasis “posición”
“estabilidad”). Característica de un organismo vivo, regular las funciones dentro de él
para mantener una condición estable absorción de nutrientes (metabolismo).
XIII
Fagocitosis: Capacidad de algunas células de destruir las bacterias o agentes
nocivos para el organismo.
Hemocito: Son células fagocíticas circulantes en la hemolinfa, se han considerado
análogos a los leucocitos de mamíferos debido a las funciones que realizan en el
mecanismo de defensa como parte de la respuesta inmune innata.
Hemolinfa: Líquido circulatorio de los artrópodos, moluscos, etc. Análogo de la
sangre en invertebrados. Su composición varía mucho de una especie a otra. Puede
ser de diferentes colores o incluso incolora; los pigmentos pueden proceder de la
alimentación o de los procesos metabólicos y no tienen ninguna función biológica, ya
que en el transporte de gases es independiente del aparato circulatorio.
Organismo Centinela: Cualquier organismo no-humano que pueda reaccionar ante
un contaminante ambiental antes de que el contaminante impacte sobre los
humanos.
Sistema inmune innato: (Del latín immunitas, que significa “no atacable” y del latín
innatus, que significa “nacer con el mismo”). Se conoce como el conjunto de
mecanismos y células que actúan como defensa de un organismo ante posibles
infecciones y sustancias extrañas, esto quiere decir que el sistema logra reconocer
de manera genérica a los patógenos y sustancias que no son propias de los tejidos.
Metales pesados: Se refiere aquellos elementos que tienen una densidad mayor a
4.5 g cm-3.
Tóxico: Es una sustancia química que, administrada a un organismo vivo, tiene
efectos nocivos.
Toxicidad: Es la medida usada para evaluar el grado de tóxico de alguna sustancia.
XIV
ÍNDICE DE FIGURAS
CONTENIDO PÁGINA
Figura 1 Río Sinaloa, zona de colecta de Macrobrachium
americanum………………………………………………………..
11
Figura 2 Curva de mortalidad de M americanum. Cinco grados de
libertad y un 95% de confianza…….........................................
23
Figura 3 Control (condiciones óptimas). Dosis de plomo expuesto
(0.186 µg mL-1). Concentración promedio de plomo
experimental (expuestos). No existe diferencias significativas
(p˃0.05).Barras de error = promedio EE……………………..
24
Figura 4 Concentración de plomo en exosqueleto (plomo µg g-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesto
(0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican diferencias
significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….
25
Figura 5 Concentración de plomo en hepatopáncreas (plomo µg g-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesto
(0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican diferencias
significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….
26
Figura 6 Concentración de plomo en hemolinfa (plomo µg mL-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesto
(0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican diferencias
significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….
27
Figura 7 Concentración de plomo en músculo (plomo µg g-1). Control
(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesto (0.186 µg
mL-1). Superíndices distintos indican diferencias
significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….
28
Figura 8 Ingesta (gr alimento consumido · gr peso del organismo-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesto
(0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican diferencias
significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….
29
XV
Figura 9 Tiempo de coagulación. Control (Condiciones óptima). Dosis
de plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos
indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error =
promedio EE…………………………………………………….
30
Figura 10 Proteína en plasma. Control (Condiciones óptima). Dosis de
plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos
indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error =
promedio EE…………………………………………………….
31
Figura 11 Proteína en SLH. Control (Condiciones óptima). Dosis de
plomo expuestos (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos
indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error =
promedio EE…………………………………………………….
32
Figura 12 Cantidad de hemocitos totales. Control (Condiciones
óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg mL-1).
Superíndices distintos indican diferencias significativas
(p<0.05). Barras de error = promedio EE…………………….
32
Figura 13 Actividad de la profenoloxidasa en SLH. Control
(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuestos (0.186 µg
mL-1). Superíndices distintos indican diferencias
significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….
33
Figura 14 Actividad de la profenoloxidasa en plasma. Control
(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg
mL-1). Superíndices distintos indican diferencias
significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE…….
34
XVI
ÍNDICE DE CUADROS
CONTENIDO PÁGINA
Cuadro 1 Método establecido según INSHT 1990, para determinar
plomo en sangre. Para horno de grafito
AAG………………….……………………………………………..
14
Cuadro 2 Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a diferentes
concentraciones de plomo, bioensayo (presuntivo)…………..
20
Cuadro 3 Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a diferentes
concentraciones de plomo, bioensayo (confirmativo)…………
21
Cuadro 4 Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a diferentes
concentraciones de plomo, por triplicado y promedio………...
22
Cuadro 5 Cálculo numérico de la CL50 por el método de Probits………. 22
Cuadro 6 Parámetros fisicoquímicos del bioensayo I y II. Dosis de
plomo expuesto (0.186 µg mL-1), temperatura, oxígeno
disuelto y potencial de hidrógeno. Promedio EE……………
35
XVII
RESUMEN
La evolución tecnológica ha hecho que el plomo (Pb) sea uno de los
contaminantes antropogénicos más importante a nivel mundial al incorporarse
fácilmente a los ciclos biogeoquímicos, resultando tóxicos para la biota y la salud
humana. El plomo se considera un elemento no esencial y tóxico para las células,
teniendo la capacidad para unirse al azufre de los aminoácidos y desplazar al Calcio
(Ca+2). En este trabajo se propuso analizar y entender el proceso de acumulación y
desintoxicación de plomo en el langostino Macrobrachium americanum para lo cual
se determinó la concentración letal 50 % y una dosis sub-letal que permitiera
observar el desarrollo de la intoxicación y desintoxicación. Los resultados muestran
una acción tóxica del plomo; con efectos letales a CL50 de 0.389 µg mL-1 a 96 hrs y
sub-letal CSL11 de 0.186 µg mL-1 a 24 h, concentraciones cercanas a los límites
puestos por la norma oficial mexicana (NMX-001-ECOL-1996). La distribución del
plomo en los tejidos presentó un orden cumulativo: hepatopáncreas (2.150 µg g-1) ˃
exosqueleto (0.335 µg g-1) ˃ músculo (0.056 µg g-1) ˃ hemolinfa (0.039 µg mL-1),
formándose 2 grupos de tejidos: el grupo I comprendido por el hepatopáncreas y
exosqueleto, los cuales desarrollaron una acumulación y grupo II comprendido por el
músculo y hemolinfa, los cuales desarrollaron una depuración. Los resultados de
acumulación y desintoxicación en función de la actividad del sistema
profenoloxidasa, número de hemocitos y el contenido de proteína, sugieren dos
procesos de desintoxicación. El primer proceso comienza desde el primer contacto
con el plomo y hasta la tercera semana después de la exposición. Actúa un proceso
mediado por metalotioneínas (ricas en cisteínas) proteínas quelantes de metales que
después son fagocitadas por los hemocitos. El segundo proceso comienza a partir de
la cuarta semana después de la exposición. Aquí el plomo es directamente absorbido
por las células de la glándula digestiva y precipitado en vacuolas dentro de las
mitocondrias y lisosomas. Los tejidos donde parece no haber depuración son la
glándula digestiva y el exoesqueleto. La especie M. americanum puede funcionar
como centinela debido a que tiene susceptibilidad al plomo en concentraciones por
debajo de la norma oficial.
XVIII
ABSTRACT
Technological development have made the lead (Pb) one of the most important
anthropogenic pollutants worldwide wich is easily incorporated into the
biogeochemical cycles, resulting toxic to biota and human health. Lead is non
essential and a toxic element for cells, it links to sulfur-containing amino acids and it
has the ability to displace divalent elements like Ca+2. In this research the goal was to
analyze and to understand lead detoxication in the prawn Macrobrachium
americanum. It was necessary to define the lethal dose 50 (LD50) and a subletal dose
(SLD) that allow us to observe the progress of the intoxication and detoxication.
Results showed a toxic action of lead over M. americanum with a LD50 of 0.389 µg
mL-1 to 96 hrs and SLD11 of 0.186 µg mL-1 to 24 h. These concentrations are close to
the proposed limits by Mexican regulation (NMX-001-ECOL-1996). Lead distribution
in the tissues showed different levels of concentration: Digestive gland (2.150 µg g-1)˃
Exoskeleton (0.335 µg g-1)˃ Mussels (0.056 µg g-1)˃ Haemolynph (0.039 µg mL-1).
Two groups of tissue were clearly separated: group 1 comprised by the digestive
gland and exoskeleton, which developed an accumulation y group 2 comprised by
haemolymph and mussel which developed debugging. Accumulation and detoxication
in function of the prophenoloxidase system activity, number of haemocytes and
protein concentration suggest two detoxication processes: first process begins since
the first contact with lead until third week after exposure. Process in mediated by
Metallotioneine which is a metal chelate protein that is phagocyted by hemocytes.
Second process start on the forth week after exposure, this process consists in a
direct absorption oh lead by the cells of the digestive gland and precipitated into
vacuoles inside of mitochondria or lysosome. No depuration appears to occur in the
digestive gland and exoskeleton. The species M. americanum can function as
sentinel because the susceptibility and concentration of lead below the official
standard.
1
I. INTRODUCCIÓN
La evolución tecnológica está basada en la capacidad para tomar y modificar
diversos elementos del entorno y utilizarlos para satisfacer nuestras necesidades
básicas. El proceso de nuevas tecnologías aplica poco conocimiento de interés
relacionados con el desarrollo sustentable y en consecuencia, gran parte de la
industria emplea y libera al ambiente en forma sistemática, elementos que pueden
resultar tóxicos para los organismos. Un buen ejemplo de las consecuencias de este
enfoque, es la actual problemática ambiental relacionada con los metales pesados
empleados por distintas ramas de la industria (Garza, 2004).
Todos los ecosistemas terrestres y acuáticos, tienen la capacidad de adquirir y
de acumular metales esenciales (Fe2+, Mn2+, Zn2+ y Cu2+) y no esenciales (Hg2+, Cr2+,
Pb2+, Cd2+ y Ni2+) para el desarrollo de las plantas y animales. En ambos casos una
exposición por encima de una concentración crítica puede ser nociva para los
organismos (Camacho y Gamboa, 2003).
De estos elementos, el plomo es la materia prima o componente fundamental
en diversos procesos tecnológicos debido a sus propiedades fisicoquímicas como
ductilidad, alta densidad y resistencia química, así como, su fácil extracción, relativa
abundancia y bajo costo (ATSDR, 2007). Se le ha usado en la elaboración de
medicinas, pinturas, tuberías, municiones, vitrificado de cerámicas, aleaciones para
soldaduras, baterías eléctricas, protección contra radiaciones ionizantes y como
aditivo antidetonante en las gasolinas. Es por ello que, no resulta sorprendente que a
raíz de la actividad humana la concentración de este metal en el medio ambiente se
haya incrementado de forma importante, así como, la exposición al mismo (Tong et
al., 2000).
El plomo puede ser extremadamente tóxico para las células por la tendencia a
competir por lugares específicos dentro de la célula (el azufre de las proteínas) y
además tiene la capacidad de desplazar al calcio (Ca+2), lo cual se debe al radio
iónico muy similar (Reyes-Gil, 1999).
En México, el langostino de río (Macrobrachium americanum) llamado
localmente como “cauque”, es una de las especies de crustáceos de mayor tamaño.
2
Su distribución se encuentra en la mayoría de los ríos y arroyos desde el Estado de
Sonora hasta Chiapas (Díaz, 2001). Su clasificación taxonómica lo coloca en el
orden Decapoda, de la familia Palaemonidae, del género Macrobrachium y de la
especie americanum (Bate, 1986). En las zonas altas del Estado de Sinaloa, se
captura el M. americanum por la gente nativa y en su estadio juvenil se traslada al
fondo del río donde viven bajo piedras, varas y vegetación sumergida, por lo que se
considera un organismo bentónico y omnívoro el resto de su ciclo de vida (Sainz,
2006).
Organismos acuáticos como la especie M. americanum pueden ser utilizados
como bioindicador de contaminación, que incluye la medición de metales pesados en
el organismo y/o en determinados órganos. Esto nos ofrece información sobre el
estado fisiológico a nivel sub-celular de los crustáceos (Fatemeh y Shahab, 2011).
El concepto de organismo centinela fue definido por Stahl en 1997, como
“cualquier organismo no-humano que pueda reaccionar ante un contaminante
ambiental antes de que el contaminante impacte sobre los humanos”. De este modo
las respuestas endógenas del organismo proveen una señal de alerta temprana
sobre potenciales riesgos para la salud humana y de los ecosistemas. Para llevar a
cabo el monitoreo medioambiental, se utilizan especies especialmente susceptibles.
En caso de estudiar efectos a corto plazo, buscando una acción aguda, el organismo
centinela debe tener una alta sensibilidad al agente de interés y mostrar una pronta
respuesta (Poletta, 2011).
Llevar a cabo estudios controlados en laboratorio, son útiles para determinar
las relaciones dosis-respuesta y para estudiar los mecanismos moleculares de
regulación de una respuesta tóxica (Suarez, 2003).
El sistema inmune de los crustáceos, comprende mecanismos celulares y
humorales (inmunidad innata o no específica) que contribuyen a la defensa del
organismo, evitando invasiones microbianas, virales y de materiales extraños (Díaz,
2005), que son eliminados de la hemolinfa y tejidos (Söderhall y Cerenius, 1992;
Vázquez et al., 1998). Su función es mantener la individualidad biológica del
organismo mediante, la diferenciación y eliminar todo material extraño de sus tejidos
(Vargas-Albores, 1996).
3
En particular, los crustáceos decápodos poseen un sistema circulatorio abierto
en el cual la hemolinfa distribuye nutrientes, hemocianina (proteína involucrada en la
respiración), hormonas y células (Hernández et al., 1996).
La respuesta celular del sistema inmune de los crustáceos, se expresa en
varios tipos de células que están involucradas en la eliminación de partículas
extrañas que llegan al hemocele de los crustáceos (Johnson, 1987):
a) Los podocitos o nefrocitos, Se localizan en branquias y están especializados en
la pinocitosis de proteínas y virus.
b) Las células fagocíticas fijas, se presentan en el corazón de los crustáceos y son
derivadas del tejido hematopoyético, las cuales están involucradas en la filtración
de sustancias virales.
c) El órgano linfoide, es considerado como parte integral del sistema circulatorio
que funciona como filtro de la hemolinfa, eliminando y capturando partículas
virales (Van de Braak et al., 2002).
d) Los hemocitos, son células fagocíticas circulantes en la hemolinfa. Se han
considerado análogos a los leucocitos de mamíferos debido a las funciones que
realizan en el mecanismo de defensa como parte de la respuesta inmune innata,
participando en el reconocimiento, destrucción de partículas extrañas y agentes
infecciosos (Raa, 1996). Estas células llevan a cabo reacciones inmunes como
fagocitosis, encapsulación, nodulación, citotoxicidad (Söderhäll y Cerenius, 1992)
y coagulación de la hemolinfa. Se han descrito tres tipos de hemocitos, utilizado
criterios morfológicos, antigénicos y funcionales (Johansson et al., 2000):
Hemocitos hialinos, los cuales no poseen gránulos, tienen capacidad
fagocítica e intervienen en la coagulación (Raa, 1996).
Hemocitos semigranulosos, los cuales poseen abundantes gránulos,
intervienen en la fagocitosis, encapsulación y en la liberación del sistema
profenoloxidasa (proFO) encargado y responsable de la melanización
(Destoumieux et al., 2000).
Hemocitos granulosos, estos hemocitos están cargados de gránulos y
almacenan las enzimas que constituyen el sistema proFO en los crustáceos a
4
una concentración más elevada que los hemocitos semigranulosos (Smith y
Söderhäll, 1983).
Cuando el organismo es invadido por un gran número de microorganismos
nocivos y este no puede fagocitarlos, el sistema celular lleva a cabo la
formación de nódulos. Este es un mecanismo muy eficiente para la
eliminación de partículas extrañas en invertebrados, incluyendo a los
crustáceos (Söderhäll y Cerenius, 1992).
Las metalotioneínas (MT); fueron descritas por primera vez por Kagi y Vallee
(1960), para designar proteínas ricas en azufre que contenían Cd, Zn y Cu. Estas
proteínas fueron caracterizadas como; pequeñas proteínas (6-7 kDa) citosólicas
implicadas en la homeostasis en las células y los procesos de desintoxicación por
metales, contienen alrededor de 60 aminoácidos (ninguno aromático) y un alto
contenido de residuos de cisteína. Las MT tienen dos subunidades globulares, cada
una comprende aproximadamente diez residuos de cisteína que no forma enlaces
disulfuro y son responsables del secuestro de metales con su grupos sulfhídrilo
(tiólico) (Fatemeh y Shahab, 2011).
Las MTs se producen principalmente en el citosol y también están presentes en el
núcleo y los lisosomas (Decataldo et al., 2004). Las MTs están involucradas en
muchos procesos fisiopatológicos como la homeostasis de las células y
desintoxicación por iones metálicos, la proliferación celular y la apoptosis (Doki y
Monden, 2004). Enfocándose en la importancia de desintoxicación por los metales
pesados, estas proteínas pueden servir como biomarcadores de contaminación por
metales pesados, que constituyen una relación de 5-7 moles de metales pesados por
mol de proteína (Fatemeh y Shahab, 2011).
5
II. ANTECEDENTES
II.1.-Toxicidad.
Suarez Álvarez (2003) realizó un experimento para medir la toxicidad aguda
del plomo en camarón rosado Farfantepenaeus notialis, provocando la mortalidad por
dos vías 1) coagulación de la hemolinfa y 2) formación de mucus en las branquias.
Las concentraciones de seguridad o umbral para el plomo fue de 50 µg L-1, valor que
no debe ser superado en las aguas receptoras para no causar daños a las
poblaciones del crustáceo.
Con el fin de evaluar la toxicidad de metales pesados en organismos
acuáticos, Qing Wang et al., (2009) investigaron el efecto de Hg, Cd y Pb en larvas
de almeja Meretrix meretrix. El resultado de la CL50 para la etapa de embriogénesis
fue de 5.4 µg L-1 para Hg, 1014 µg L-1 para Cd y 297 µg L-1 para Pb. Mientras que
para la etapa larvaria fue de 14.0 µg L-1 para Hg, 68.0 µg L-1 para Cd y 353 µg L-1
para Pb, respectivamente. Estos resultados demostraron que las etapas tempranas
del desarrollo de M. meretrix es altamente sensible a metales pesados y puede ser
utilizado como un organismo centinela.
Benediet et al., (2008) realizaron un estudio para determinar los límites de
toxicidad del plomo en los invertebrados Daphnia magna y Cyclop sp, especies
importantes en la cadena trófica de los peces del Río Cross, Nigeria. Los resultados
mostraron que las concentraciones tóxicas de plomo para estas especies fueron 190
µg L-1 y 300 µg L-1, respectivamente.
II.2.- Bioacumulación.
Camacho y Gamboa (2003) expusieron postlarvas de Macrobrachium
rosenbergii a cinco concentraciones diferentes de metales pesados (Pb, Ni, Cd y Cu)
durante 48 horas. Los resultados de la CL50 fueron de 165.6, 242, 0.079 y 1.12 µg L-
1, respectivamente; demostrando que la sensibilidad del langostino a los metales
pesados fue Cd ˃ Pb ˃ Cu ˃ Ni.
Boada et al., (2007) estudiaron contenido de metales pesados en camarones
peneidos silvestres L. schmitti, F. subtilis, F. notialis y F. brasiliensis en el Golfo de
Cariaco, Venezuela. Se determino la concentración de Cu, Cd, Pb y Zn, en músculo
6
y cefalotórax mediante la técnica de espectrofotometría de absorción atómica. El
orden decreciente de acumulación del contenido de metales fue el siguiente:
cefalotórax: Zn >Cu > Pb > Cd. Músculo: Zn >Pb > Cu > Cd. Sin embargo, dichas
concentraciones estuvieron dentro de los límites internacionales máximos
permisibles para cada metal en camarones.
Nguyen (2008) observó una acumulación de elementos traza en el langostino
gigante de río M. rosenbergii. La acumulación de metales tuvieron el siguiente orden
decreciente músculo (Se >Cr >Cs >Pb), exosqueleto (Sr >Mo >Sb) y hepatopáncreas
(Cd >Se >Mo >Hg). Las concentraciones encontradas de plomo fueron; músculo
(0.002 - 0.033 µg g-1), exosqueleto (0.026 – 0.134 µg g-1) y hepatopáncreas (0.032 –
0.109 µg g-1). Estas concentraciones de elementos traza reflejan el aporte de
contaminantes en siete zonas industrializadas y urbanas en la región sur de Vietnam.
Ayala Rodríguez (2009). Encontró metales pesados asociados a la erosión de
las rocas (proceso litogenético) y arrastres de fertilizantes de los campos agrícolas
del valle de Guasave, Sinaloa. Las concentraciones de los metales en el Río Sinaloa
para marzo del 2009 presentaron la siguiente secuencia de concentración: Fe > Mn >
Pb > Zn > Ni > Cd. Las concentraciones máximas se encontraron en la parte media
del Río Sinaloa (Quemazones) con 130 µg L-1. El autor recomendó el uso de
organismos bioindicadores para estudiar los cambios asociados con las actividades
antropogénicas.
Soto-Jiménez et al., (2011). Evaluaron la transferencia del plomo en 4 niveles
de la cadena trófica; Tetraselmis suecica, Artemia franciscana, Litopenaeus
vannamei y Haemulon scudderi. Encontrando que el plomo produce una red de
bioacumulación principalmente en los peces (3.4 µg g-1) y camarones (3.5 µg g-1).
II.3.- Expresión de proteínas quelantes (metalotioneínas).
Pedersen et al. (1997) reportaron una clara inducción de MT en las branquias
y hepatopáncreas del cangrejo Carcinus maenas relacionados con la presencia de
cobre tanto en el campo y en el laboratorio. De hecho, señalan que los aumentos en
las concentraciones de MT están asociados con la disminución de la sensibilidad de
un organismo a los metales.
7
Reyes-Gil (1999) realizó un estudio con la exposición de diferentes metales
pesados en organismo acuáticos. El trabajo encontró la expresión de unas proteínas
llamadas metalotioneínas. Estas proteínas tienen la capacidad de unir iones
metálicos en su estructura molecular. Debido a esta particularidad pueden
considerarse como biomarcadores moleculares específicos.
Amiard et al., (2006) utilizaron organismos acuáticos como bioindicadores de
contaminación estudiando la presencia de metalotioneínas, así como, el proceso de
desintoxicación por metales pesados. Concluyeron que las especies acuáticas que
viven en un medio contaminado por metales pesados expresan altas
concentraciones de MTs.
II.4.- Sistema de secuestro de metales.
Ahearn et al., (2004) realizaron un estudio sobre la fisiología celular y
mecanismos moleculares de desintoxicación por metales pesados en el crustáceo
Homarus americanus. Los resultados mostraron que el secuestro de metales se
origina en la síntesis de proteínas en las células epiteliales de la hemolinfa, que
posteriormente son transportados a las vacuolas de las células de las membranas
lisosomales hasta llegar a las células hepatopancreaticas. Concluyeron que la
fijación de los metales es llevado a cabo por los hemocitos que funcionan como
sumideros de metales.
8
III. JUSTIFICACIÓN
El plomo es un importante contaminante ambiental con peligrosos efectos
sobre la salud humana. Su amplia distribución en el medio ambiente se han
convertido en un problema de salud pública en el mundo. Por ello, se han realizado
diversos estudios e investigaciones sobre la calidad del agua de los ríos y en
especies sensibles a sustancias tóxicas (metales pesados), con la analogía de
relacionarlo con indicadores de contaminación. Por tal motivo, es necesario realizar
estudios de toxicidad con bioensayos controlados empleando organismos acuáticos
presentes en el Río Sinaloa tales como Macrobrachium americanum, para evaluar la
concentración letal 50 % (CL50) y el comportamiento celular (expresión del sistema
inmunológico y bioacumulación) por el efecto tóxico del plomo. Por esta razón el uso
de este organismo podría ser útil en estudios de campo para conocer el estado
ambiental.
9
IV. HIPÓTESIS
La toxicidad del plomo sobre el langostino Macrobrachium americanum tendrá
un efecto letal en los límites que marca la norma oficial mexicana (NMX-001-ECOL-
1996) y a una dosis sub-letal ocasionará una bioacumulación en los tejidos del
animal alterando el sistema inmunológico.
10
V. OBJETIVO
V.1. OBJETIVO GENERAL.
Determinar la toxicidad y bioacumulación del plomo en Macrobrachium americanum.
V.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.
1. Determinar la toxicidad del plomo evaluando la concentración letal 50% de la
población (CL50) y determinar la concentración sub-letal (CSL).
2. Determinar la bioacumulación de plomo en los tejidos del M. americanum
(exoesqueleto, hepatopáncreas, hemolinfa y músculo) expuestos a una
concentración sub-letal de plomo (CSL).
3. Evaluar el efecto de la ingesta y las variables inmunológicas (tiempo de
coagulación, Cantidad de proteína total, Cantidad de proteína SLH, Cantidad
de hemocitos, Cuantificación de la actividad de la profenoloxidasa y
Cuantificación de la actividad de la fenoloxidasa) en M. americanum,
expuestos a una concentración sub-letal de plomo (CSL).
11
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
VI.1. Colecta, transporte y aclimatación de los animales.
Durante el año 2011, los especímenes de Macrobrachium americanum se
capturó en el Río Sinaloa, en el poblado el Opochi, municipio de Sinaloa de Leyva,
estado de Sinaloa, entre las coordenadas geográficas 25º49´20´´ latitud N -
108º12´37´´ longitud O y 25º49´25´´ latitud N - 108º12´20´´ longitud O (Figura 1) . Los
organismos se colectaron durante la noche mediante el uso de trampas llamadas
nasas con ayuda de carnada en el interior de las jaulas que sirvieron para atraer a
los organismos. Una vez atrapados se seleccionó 128 organismos machos de 42.6 ±
4.5 g de peso corporal para realizar el bioensayo I (presuntiva y confirmativa) y
bioensayo II. Para evitar el estrés se trasladaron inmediatamente a las instalaciones
de CIIDIR-Sinaloa a una razón de 10 organismos en tanques de 50 L utilizando la
misma agua del río con aireación constante.
En el laboratorio se mantuvieron en tanques de aclimatación; en tinas de
plástico ovaladas de 120 L con 50 L de agua de Río filtrada (20 µm), durante 10 días
con una circulación continua de agua, aireación constante y alimentación ad libitum
para garantizar la supervivencia en condiciones de cautiverio.
Figura 1. Río Sinaloa, zona de captura de M. americanum.
12
VI.2. Diseño experimental.
VI.2.1. Laboratorio.
Para trabajar con la detección de metales pesados se tomó en cuenta lo
siguiente: todo el material que se utilizó en los bioensayos se lavó previamente con
HNO3 y HCl al 30%, para evitar la contaminación del medio exterior se implementó
un invernadero en el área de acuacultura donde se realizaron los bioensayos y la
oxigenación de los estanques se acondicionó con un filtro catalítico de eliminación de
partículas de 0.2 micras (Moody y Lindstrom, 1977).
Los bioensayos de toxicidad se fundamentó según con los procedimientos
estandarizados descritos por APHA (1992) el cual se incluyó una solución
experimental tóxica con acetato de plomo ((CH3COO)2·Pb·3H2O) con la finalidad de
evitar variaciones del potencial de hidrógeno (pH) en cada uno de los tratamiento con
plomo. La ruta de intoxicación que se implementó fue por las vías de respiración y
por contacto mediante inmersión total del animal en una solución tóxica del plomo,
además se consideró como un animal muerto cuando tenía movimientos letárgicos.
VI.2.2. Determinación de los parámetros fisicoquímicos.
Cada tres horas se tomaron datos de temperatura, potencial de hidrogeno
(pH) y oxígeno disuelto, tanto en el agua experimental de plomo como el agua
control. Estos parámetros se midieron por medio de un termómetro de mercurio, un
potenciómetro marca Hanna® Instruments modelo HI-98128 y un oxímetro marca
YSI® modelo 55-12 FT, respectivamente.
VI.2.3. Bioensayo I (Exposición aguda).
Para determinar la concentración letal 50% de la población (CL50), se llevó a
cabo un bioensayo presuntivo, donde se utilizaron cuatro concentraciones de plomo
por triplicado: 400, 500, 1000 y 2000 µg L-1 y un control sin plomo como blanco,
durante 96 h. Se colocaron cinco organismos por cada tina de 100 L con 50 L de
agua experimental. Las concentraciones iniciales se tomaron en cuenta como
antecedentes lo que han estudiado Benediet et al., (2008) y Qing Wang et al., (2009),
y concentraciones encontradas en el Rio Sinaloa (Ayala Rodríguez, 2009).
13
Posteriormente se llevó a cabo un bioensayo confirmativo donde se utilizaron
siete concentraciones de plomo; 187, 355, 389, 419, 432, 1037 y 1336 µg L-1 (en
referencia al bioensayo presuntivo) y un control sin plomo. Se colocaron 10 animales
por cada tratamiento por triplicado y un control de referencia. En ambos bioensayos
(presuntivo y confirmativo) se siguió el método estadístico de Bliss (1935) y Stora
(1974) descritos detalladamente en el apartado VI.3 del presente escrito. De este
bioensayo también se obtuvó la concentración sub-letal (CSL) como la dosis cuando
resultó el mínimo efecto (primera mortalidad).
VI.2.4. Bioensayo II (Exposición crónica).
Para determinar el efecto inmunológico y la bioacumulación de plomo en cada
órgano (exoesqueleto, músculo, hepatopáncreas y hemolinfa) de M. americanum se
realizó un experimento a una concentración conocida de plomo, la cual fue
determinada a partir del bioensayo I, que resultó ser la concentración sub-letal (CSL).
Se colocaron nueve organismos en cada tratamiento y un control de referencia
durante seis semanas. Cada tratamiento se realizó por triplicado. En cada semana se
sacrificó un animal para su análisis.
Los organismos se alimentaron una vez al día (18:00 h) ad libitum, en tinas
independientes.
VI.3. Cuantificación de plomo.
Para conocer las concentraciones reales empleadas en cada tratamiento, se
cuantificó la concentración de plomo (Pb) en agua experimental. La muestra se
aciduló a pH 2 con ácido nítrico concentrado grado ultra-puro la muestra se inyectó al
equipo por aspersión directa. La absorbancia del elemento se analizó en un
espectrofotómetro de Absorción Atómica de Gases (AAG) Marca Varian® Modelo
Spectro AA-220, con lámparas de cátodo hueco mono elementales a una longitud de
onda de 217 nm aplicando el método de flama con quemador aire/acetileno. La
cuantificación de plomo se realizó previa construcción de curvas de calibración con
estándares certificados Perkin Elmer (NMX-AA-051-SCFI 2001; Varian instruments
1989).
14
Para cuantificar el plomo en hemolinfa se siguió el protocolo establecido por
INSHT (1990), el fundamento del método se basó en utilizar un tensoactivo o
modificador de matriz que funcionará como quelante. La hemolinfa se trató con
anticoagulantes isotónicos. Esta se homogenizó con un agitador, posteriormente se
mezcló con 600 µL del modificador de matriz (Dihidrógeno de Fosfato-Triton X-100-
APDC-Triclorometano) y con una alícuota de 50 µL de hemolinfa con anticoagulante.
La muestra preparada se introdujo directamente en el horno de grafito del AAG. El
análisis se efectuó con un programa de temperaturas y tiempos (Cuadro 1):
Cuadro 1. Método establecido según INSHT 1990, para determinar
plomo en hemolinfa. Para horno de grafito AAG.
ETAPA TEMPERATURA
(°C)
RAMPAS
(Seg)
ISOTERMAS
(Seg) ESPECIFICACIONES
1 110 10 10 SECADO
2 200 10 10 SECADO
3 800 10 10 MINERILIZACIÓN
4 850 5 5 MINERILIZACIÓN
5 1700 0 3 ATOMIZACIÓN
6 2600 1 3 LIMPIEZA
7 20 1 4 RECUPERACIÓN
Para la determinación de la bioacumulación del plomo (Pb) en los diferentes
tejidos (exoesqueleto, músculo, hepatopáncreas y hemolinfa), se llevó a cabo por la
técnica de AAG. Para ello se realizó el siguiente procedimiento químico que consistió
en secar en un horno a una temperatura de 60°C., un peso aproximadamente de 0.5
gr de cada tejidos el cual fue colocado en frascos de teflón de alta temperatura y
presión de 250 ml de capacidad posteriormente se efectuó una digestión ácida el
cual se añadió 10 ml de ácido nítrico concentrado grado ultra-puro, teniendo cuidado
de evitar pérdidas de muestras. Para la digestión total del tejido se empleó una
plancha de calentamiento a 85±5ºC para su digestión total aproximadamente durante
3 a 4 horas.
La solución resultante se dejó enfriar y se aforó a 20 ml con agua desionizada
ultra-pura. La absorbancia del elemento se analizó en un equipo de AAG Marca
15
Varian Modelo SpectrAA-220, con lámparas de cátodo hueco mono elementales de
plomo a una longitud de onda de 217 nm aplicando el método de flama con
quemador aire/acetileno. La cuantificación de plomo se realizó previa construcción de
curvas de calibración con estándares certificados Perkin Elmer (NMX-AA-051-SCFI
2001; Varian instruments 1989). La validación de la calidad de los análisis se realizó
empleando material de referencia certificado de tejido de molusco SRM 1566b
(Tejido de ostra 1566b, Departamento de Comercio, E.U.A., Instituto Nacional de
Estándares y Tecnología. Gaithersburg, M. D. 20899).
VI.4. Ingesta.
Se alimentó ad libitum (pesando la ración suministrada) todos los días a las
18:00 hrs (noche). Posteriormente al día siguiente a las 07:00 hrs (mañana) se
recolectó y se peso el alimento no consumido. La diferencia de pesos dio la ingesta
que el organismo asimiló. Además se realizaron biometrías y se relacionó con la
ingesta para calcular la Tasa de Conversión Alimenticia (TCA). Se empleó este
procedimiento ya que esta especie en particular tiene hábitos nocturnos
(alimentación, apareamiento, etc.) y durante el día están escondidos en sus refugios.
VI.5. Análisis del sistema inmunológico.
El sistema inmune de cada uno de los langostinos y el control, se analizó
semanalmente en cada uno de los tratamientos con muestras de hemolinfa en el
bioensayo II.
VI.5.1. Obtención de la hemolinfa.
La extracción de la hemolinfa se realizó entre las 8:00 y 9:00 hrs tiempo que
los organismos se encontraban en ayunas para evitar diferencias debidas al ritmo
circadiano. La hemolinfa se extrajó con una jeringa para insulina (1 mL, 27G x 13
mm) de la parte ventral que comprende el primer segmento de los pleópodos,
ligeramente anterior al poro genital. La jeringa se cargó con una solución isotónica
para invertebrados dulce acuícolas y EDTA como anticoagulante (SIC-EDTA, Na2)
previamente enfriado a 4 °C (Vargas-Albores et al., 1996) en una proporción 2:1 (2
16
volúmenes de anticoagulante por cada volumen extraído de hemolinfa). Al extraer la
hemolinfa, se evitó la formación de burbujas en la jeringa ya que estas podrían
acelerar el proceso de coagulación. Inmediatamente después de ser extraída la
muestra de hemolinfa, se tomaron sub-muestras en tubos Eppendorf colocados a 4
°C, las cuales se utilizaron posteriormente para las determinaciones de los siguientes
parámetros; conteo total de hemocitos, fenoloxidasa (FO), pro-fenoloxidasa (proFO),
proteína total y metales pesados.
VI.5.2. Coagulación.
Semanalmente se tomaron muestras de tres organismos expuestos y
controles. Se utilizó una jeringa de insulina de 1 ml, la muestra de hemolinfa se
colocó en un portaobjetos donde se friccionó para detectar el tiempo de coagulación
se registró el tiempo transcurrido desde el sangrado hasta la coagulación.
VI.5.3. Cuantificación de proteínas.
Para evaluar la concentración de proteína total en hemolinfa, se determinó la
concentración de proteína en plasma y SLH utilizando la técnica de Bradford (1976)
utilizando albúmina de suero bovino para construir una curva estándar. La técnica se
basa en la unión del colorante Comassie azul brillante G-250 a las proteínas, cuyo
color puede ser medido la absorbancia con un espectrofotómetro Thermo Spectronic
Genesys 2 (Thermo Scientific®) a 595 nm. Para evaluar su concentración se realizó
una dilución 1:100 en las muestras de proteína en plasma, se tomó 20 µL de plasma
(diluido) y se colocó en la microplaca. Posteriormente, se adicionaron 200 µL de la
solución de Bradford, la mezcla se incubó por 10 min y se tomó la lectura en el lector
de microplacas a 595 nm.
VI.5.4. hemocitos totales.
El conteo de los hemocitos se realizó con una cámara de Neubauer con la
retícula de 0.01 mm. Para ello, se tomaron 50 µL de hemolinfa y se diluyeron (1:5,
v/v) en una solución de formol al 4%. A partir de esta dilución se realizaron dos
conteos en el microscopio, (sin diferenciar hemocitos hialinos, semi-granulares y
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granulares) en cada segmento. El promedio de la cuantificación de las células por
cada sector de la cámara se multiplicó por 10,000 y por la dilución de la solución
anticoagulante para obtener el total de hemocitos x 100 mL-1 hemolinfa.
VI.5.5. Medición de fenoloxidasa (FO) y profenoloxidasa (proFO).
Primeramente se separó la fracción de hemocitos y del plasma centrifugando
la hemolinfa a 800 x g por 5 min a 4 C. El plasma se recuperó sin arrastrar la pastilla
que se formó en el fondo, posteriormente se preservó a 4 C. El paquete celular se
lavó con 1 mL de anticoagulante. La muestra lavada se centrifugó nuevamente a 800
x g por 5 min a 4 C y el sobrenadante se desechó. Al paquete celular se adicionó 1
mL de cacodilato al 10 mM pH 7.0 a 4°C y se centrifugó a 14,000 x g durante 10 min
a 4 C, para romper las células y liberar el contenido celular, a este extracto se le
conoce como sobrenadante del lisado de hemocitos (SLH). El SLH y el plasma se
mantuvieron a 4 C para los análisis de profenoloxidasa (proFO) y fenoloxidasa (FO).
Para el análisis posterior de proteína en SLH y plasma, se preservaron a ultra
congelación (-70 C).
La medición de la proFO y la FO se realizó con la técnica descrita por
Hernández-López et al., (1996). La actividad de la FO presente en el plasma se midió
como la formación de dopacromo a partir de L-dihidroxifenilalanina (L-Dopa). A 50 µL
de muestra, se le adicionaron 50 µL de búfer de cacodilato 10 mM, pH 7 y 50 µL de
L-Dopa (3 mg mL-1 en agua destilada). Se incubó durante 10 min a temperatura
ambiente (aproximadamente a 25 °C), después se le adicionaron 100 µL de búfer de
cacodilato y se determinó la absorbancia a 492 nm en un espectrofotómetro Thermo
Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific®). En todos los ensayos se utilizó cacodilato
como control negativo. Para la actividad de la proFO presente en el SLH se activó
previamente como sigue: a 50 L de SLH y se le añadió 50 L de tripsina (0.1 mg
mL-1) para convertirla en FO incubando por 10 min a 25 ºC y a continuación se
adicionó 50 L de L-dihidroxifenilalanina (L-Dopa) (3 mg mL-1). Se realizó una
segunda incubación por 5 minutos a 25 °C finalmente se adicionaron 100 L de
cacodilato, y se leyó la absorbancia a 492 nm. La actividad total se expresó como el
18
cambio en la absorbancia a 492 nm/min/mg de proteína de cada langostino. La
cantidad de proFO disponible en la muestra se calculó de la siguiente forma:
FO + FO activada con tripsina = FO total
FO total - FO = proFO
VI.6. Método estadístico.
Para calcular la CL50 se utilizó el método estadístico de Bliss (1935) el cual se
basa en la relación dosis-efecto. Este método tiene una variación lineal de los Probits
de mortalidad en función de los logaritmos de las concentraciones. Además minimiza
los extremos y maximiza las concentraciones. Para este método se realizaron una
serie de transformaciones hasta llegar una recta de regresión, considerada como
información válida estadísticamente.
Se transcribe de este método de la siguiente manera:
1.- Convertir las concentraciones (d) de exposición a logaritmo natural (X).
2.- Convertir el número de organismos muertos (r) a porcentajes (% de efecto).
3.- Establecer los Probits empíricos (PE) de las tablas de Bliss (anexo 1), en
función de los organismos muertos.
4.- Graficar una curva provisional, probits empíricos que serán interpolados
frente al logaritmo natural de las concentraciones (X).
5.- Se estiman los Probits calculados (Y), para establecer la curva de
mortalidad.
donde:
m= Probit 5 de la (curva provisional).
S= diferencia (máximo y mínimo) de (X) / diferencia (máximo y mínimo) de
(PE).
X= Logaritmo natural de la concentración.
6.- Se grafica una nueva curva de mortalidad con los logaritmos de las
concentraciones y los Probits calculados (Y), así la CL50 se lee a 50% o
Probit 5 con respecto a los logaritmo de las concentraciones.
19
7.- Se calcula el antilogaritmo del logaritmo (X) y se obtiene el resultado.
8.- Se calcula los grados de libertad n-2 y se hace la prueba de normalidad y
linealidad de la recta.
Para analizar las posibles significancias entre las diferentes replicas con
respecto al control se realizó una prueba t de student con un α=0.05 de 2 colas.
20
VII. RESULTADOS.
VII.1. Bioensayo I
VII.1.1. Concentración letal (CL50).
Se realizó un bioensayo (presuntivo) para determinar la concentración que
causa el 50% de mortalidad (CL50) de la población de cauques, durante una
exposición aguda. Grupos de animales se expusieron a cuatro dosis de plomo
disuelto en el agua. Los resultados de las distintas dosis experimentales evaluadas
por AAG fueron 419, 1037, 1336, 1667 µgL-1 (concentraciones reales). Se obtuvo
que; las dosis empleadas no fueron las adecuadas ya que se obtuvieron altas
mortalidades y no se puede observar el efecto de la mortalidad del 50% de la
población (Tabla 2), la concentración letal (CL50) se ubicó entre 419 y 1037 µg L-1 a
las 96 hrs de exposición. Por lo que fue necesario realizar un segundo bioensayo
(confirmativo) considerando el resultado anterior ajustando las concentraciones más
cercanas al 50% de mortalidad.
Cuadro 2. Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a
diferentes concentraciones de plomo, bioensayo (presuntivo).
CONCENTRACIÓN DE PLOMO µg L-1
HORAS/MORTALIDAD.
24 48 72 96
419 0 1 2 3
1037 1 2 3 4
1336 4 5 5 5
1667 5 5 5 5
El Bioensayo (confirmativo), siguió el mismo procedimiento que en el
bioensayo anterior solo se ajustó las concentraciones con una mayor cercanía a la
mortalidad del 50%, la CL50 dando intervalos de concentración por arriba y abajo
entre (419 y 1037 µg L-1). Se formaron siete dosis de plomo experimental, los
resultados obtenidos de las lecturas por AAG al evaluar las distintas dosis fueron
187, 355, 389, 419, 432, 1037 y 1336 µg L-1. Se realizó por triplicado y con un control
de observación, los datos obtenidos se obtuvieron la media aritmética y se
consideraron números enteros ya que se cuantifica como organismos muertos.
21
Se observó en las concentraciones más altas una mortalidad total en las
primeras 24 horas de exposición con el contaminante, posteriormente en las
concentraciones medias mortalidades de 3 a 4 organismos a las 72 horas con una
mejor resistencia y en las concentraciones más bajas una mortalidad de 1 organismo
(Tabla 3).
Cuadro 3. Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a
diferentes concentraciones de plomo, bioensayo (confirmativo).
CONCENTRACIÓN DE PLOMO µg mL-1
HORAS/MORTALIDAD.
24 48 72 96
0.187 0 0 0 1 0.355 0 0 1 2 0.389 0 1 2 4 0.419 1 3 4 6
0.432 3 4 5 7
1.037 5 6 7 8
1.336 9 9 9 9
En esta segunda prueba (confirmativa), se le aplico el método estadístico de
Bliss, en el Cuadro 4, se muestra los promedio de las mortalidades para cada dosis
experimental observándose una mortalidad gradual ascendente conforme aumenta
las dosis experimentales, posteriormente fue necesario transformación los números
Probit empíricos a números Probit calculado (Cuadro 5). Con esta información se
elaboró una gráfica donde se relacionó los números probit calculados y el logaritmo
natural de cada concentración experimentales, obteniendo una curva lineal (Figura 2)
de esta gráfica se tomó el valor de 5 probit (como valor del 50% de efecto) y se
calculó mediante la ecuación lineal de la recta (Figura 2), que dio un resultado de 2.6
logaritmo natural de la concentración a este valor se le calcula el antilogaritmo y ese
es el resultado final de la concentración letal al 50% CL50, se obtuvo como resultado
que la CL50 a 96 horas fue de 0.398 µg mL-1, con 5 grados de libertad y un 95% de
confianza.
22
VII.1.2. Concentración sub-letal (CSL11).
Para determinar la concentración sub-letal (CSL), se tomaron los datos del
mismo procedimiento anterior, solo que se tomó como resultado la primera
mortalidad registrada del bioensayo (confirmativo), ya que es la primera respuesta
que expresa el organismo en relación a la mínima dosis (Cuadro 5), la primer
mortalidad se reflejo con un efecto del 11.11 %. Se tomó este valor de referencia y la
ecuación lineal de la recta (Figura 2), que dio un resultado de 2.27 logaritmo natural
de la concentración a este valor se le calcula el antilogaritmo y ese es el resultado
final de la concentración sub-letal al 11% de mortalidad de la población (CSL11) a las
96 horas fue de 0.186 µg mL-1, con 5 grados de libertad y un 95% de confianza.
Cuadro 4. Mortalidad de M. americanum, dosis expuestas a
diferentes concentraciones de plomo, por triplicado y promedio.
CONCENTRACIÓN DE PLOMO µg mL-1
MORTALIDAD 1RA. REPLICA
MORTALIDAD 2DA. REPLICA
MORTALIDAD 3RA. REPLICA
PROMEDIO
0.187 1 1 1 1
0.355 1 2 2 2 0.389 4 4 3 4 0.419 6 5 6 6 0.432 7 7 7 7 1.037 8 8 8 8
1.336 9 9 9 9
Cuadro 5. Cálculo numérico de la CL50 por el método de Probits.
CONCENTRACIÓN DE PLOMO
µg mL-1
MORTALIDAD % DE
EFECTO LOGARITMO DE LAS CONCENTRACIONES
PROBIT EMPIRICO
PROBIT CALCULADO
0.187 1 11.11 2.27 3.77 2.94 0.355 2 22.22 2.55 4.23 4.69 0.389 4 44.44 2.59 4.85 4.94 0.419 6 66.66 2.62 5.41 5.13 0.432 7 77.77 2.64 5.74 5.22 1.037 8 88.88 3.02 6.18 7.60 1.336 9 100 3.13 9.09 8.29
23
Figura 2. Curva de mortalidad de M americanum. Con cinco grados
de libertad y un 95% de confianza.
VII.2. Bioensayo II.
Para llevar a cabo el bioensayo II se tomó en cuenta la concentración sub-letal
al 11% de mortalidad de la población (CSL11), con base al resultado del bioensayo I
(0.186 µg mL-1). Se prepararon 3 réplicas de las dosis experimentales y un control
como blanco con 10 organismos en cada estanque, procurando de manera constante
tener siempre la misma concentración de 0.186 µg mL-1. Las concentraciones reales
de las dosis experimentales tuvieron una variación cercana a la dosis experimental
(0.195 ± 0.011 µg mL-1), sin diferencia significativa. La figura 3 muestra la
reproducibilidad de las dosis de plomo usadas en el bioensayo II con una exposición
crónica de los organismos.
y = 6.263x - 11.28 R² = 0.999
2
3
4
5
6
7
8
9
2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4
Pro
bit
cal
cula
do
s
Logaritmo de las concentraciones de "Pb"
CL50 y CSL11 M. americanum
24
Figura 3. Control (condiciones óptimas). Dosis de plomo expuesto
(0.186 µg mL-1). Concentración promedio de plomo experimental
(expuestos). No existe diferencias significativas (p˃0.05). Barras de
error = promedio EE.
VII.2.1. Bioacumulación de plomo en M. americanum.
Exosqueleto.
La cantidad de plomo fijado en el exosqueleto en los animales del tratamiento
control presentó una oscilación de 0.002 hasta 0.018 µg g-1. Sin embargo, en el
tratamiento con la dosis de plomo tuvo una tendencia a bioacumular en este tejido,
donde a partir de la semana dos aumentó considerablemente con respecto al control
de 0.154 hasta 0.335 µg g-1; presentando diferencias significativas con respecto al
control (Figura 4).
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0 1 2 3 4 5 6
Plo
mo
(µ
g m
l-1)
Tiempo (semanas)
CONTROL
DOSIS REAL
25
Figura 4. Concentración de plomo en exosqueleto (plomo µg g-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuestos (0.186 µg
mL-1). Superíndices distintos indican diferencias significativas
(p<0.05). Barras de error = promedio EE.
Hepatopáncreas.
La concentración de plomo en el control no fue detectable, mientras que el
tratamiento con plomo presentó un comportamiento de acumulación durante las seis
semanas. Sin embargo se observa que a partir de la semana tres aumentó
considerablemente de 0.499 hasta 2.150 µg g-1 (Figura 5), estadísticamente se
observaron diferencias significativas con respecto al control. Con referencia a los
demás tejidos (exosqueleto, musculo y hemolinfa) el hepatopáncreas presentó la
mayor concentración de bioacumulación.
26
Figura 5. Concentración de plomo en hepatopáncreas (plomo µg g-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuestos (0.186 µg
mL-1). Superíndices distintos indican diferencias significativas
(p<0.05). Barras de error = promedio EE.
Hemolinfa.
Los resultados muestran (Figura 6) que el control presentó concentraciones no
detectables, de igual forma en el tratamiento con las dosis de plomo al inicio del
bioensayo II y la semana 1 arrojo concentraciones no detectables, en la semana 4
expresó un comportamiento con una baja acumulación hasta 0.039 µg mL-1.
Consecutivamente se generó una depuración en la semana 5 hasta no detectar
plomo, en la semana seis se normalizó con respecto al control de referencia.
Estadísticamente se observó diferencias significativas con respecto al control solo en
las semanas 2, 3, 4 y 6.
27
Figura 6. Concentración de plomo en hemolinfa (plomo µg mL-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuestos (0.186 µg
mL-1). Superíndices distintos indican diferencias significativas
(p<0.05). Barras de error = promedio EE.
Músculo.
El control presentó concentraciones no detectables, de la misma
manera en el tratamiento con plomo al inicio del bioensayo II y la semana 1
mostró concentraciones no detectables, en la semana cuatro obtuvo un
comportamiento con una baja acumulación hasta 0.056 µg g-1.
Posteriormente surgió una depuración en la semana cinco hasta no detectar
plomo, en la semana 6 se normalizó la presencia de plomo en referencia con
el control. (Figura 7). Estadísticamente se observó diferencias significativas
con respecto al control solo en las semanas tres y cuatro.
28
Figura 7. Concentración de plomo en músculo (plomo µg g-1).
Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo (0.186 µg mL-1).
Superíndices distintos indican diferencias significativas (p<0.05).
Barras de error = promedio EE.
VII.2.2. Ingesta.
La alimentación de los organismos durante el desarrollo del bioensayo II fue a
libre demanda con hábitos nocturnos, por ende se garantizó que siempre estuvieron
alimentados. El control tuvo un ligero incremento en su ingesta que osciló desde la
semana uno con 3.60 TCA hasta la semana seis con 4.93 TCA. No obstante el
tratamiento con la dosis de plomo a una CSL11 (0.186 µg mL-1) se vio afectado
siempre por debajo del control a partir de la semana tres hasta seis con 3.34 hasta
3.94 TCA, en todos los casos mencionados presentó diferencias significativas con
respecto al control (Figura 8). A pesar de presentar un bajo consumo de alimento los
organismos presentaban condiciones favorables para seguir sobreviviendo aun en
condiciones de toxicidad con plomo.
29
Figura 8. Ingesta (gr. alimento consumido. gr. peso del organismo-
1). Control (Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg
mL-1). Superíndices distintos indican diferencias significativas
(p<0.05). Barras de error = promedio EE.
VII.2.3. Sistema inmunológico.
Tiempo de coagulación.
Los resultados del bioensayo II en lo que respecta con el tiempo de
coagulación de la hemolinfa, se encontró que en el control de referencia se mantuvo
durante la transición de las 6 semanas entre 20 a 35 segundos que tardo en
coagular, sin embargo, se observó que en el tratamiento con la concentración CSL11
osciló de 21 hasta 100 segundos. Estadísticamente se observó diferencias
significativas del control con respecto al concentración CSL11 de plomo a partir de la
semana 2 y aumentando considerablemente hasta la semana seis (Figura 9).
30
Figura 9. Tiempo de coagulación. Control (Condiciones óptima).
Dosis de plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos
indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error = promedio
EE.
Cantidad de proteína en plasma.
En lo que respecta a la cantidad de proteína en el plasma de la hemolinfa,
este resultó tener una mayor concentración en referencia con el SLH. El control
presentó a lo largo de las seis semanas una distribución similar que fluctuó de
141.122 hasta 150.222 mg ml-1; sin embargo en el tratamiento con la dosis de plomo
a una CSL11 (0.186 µg mL-1) presentó afectaciones en la concentración de este
parámetro, en la semana 0 a la tres bajo, desde 147.367 hasta 108.784 mg ml-1. En
todos los casos mencionados presentó diferencias significativas con respecto al
control. Posteriormente, en la semana 4 a la 6, se normalizó su concentración con
respecto al control (Figura 10).
31
Figura 10. Proteína en plasma. Control (Condiciones óptima). Dosis
de plomo expuesto (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican
diferencias significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE.
Proteína en SLH.
La cantidad de proteína que presentó el SLH en el control a lo largo
del bioensayo II, resultó tener una concentración bien definida el cual osciló
de 0.822 hasta 0.996 mg/ml; sin embargo, en el tratamiento con la dosis de
plomo a una CSL11 (0.186 µg mL-1) se vio afectado este parámetro, en la
semana dos y tres subió considerablemente hasta 1.866 mg ml-1.
Posteriormente, en las semanas cuatro y cinco disminuyó gradualmente
hasta 1.051 mg ml-1; en todos los casos mencionados presentó diferencias
significativas con respecto al control (Figura 11).
32
Figura 11. Proteína en SLH. Control (Condiciones óptima). Dosis de
plomo expuestos (0.186 µg mL-1). Superíndices distintos indican
diferencias significativas (p<0.05). Barras de error = promedio EE.
Conteo de hemocitos.
La cantidad de hemocitos totales del control tuvo como promedio 0.9 millones
células ml-1., mientras que, para el tratamiento con plomo presentó desde 0.7 hasta
4.9 millones células ml-1. Estadísticamente se observaron diferencias significativas
del control con respecto a la concentración CSL11 de plomo a partir de la semana uno
y aumentando considerablemente hasta la semana seis (Figura 12).
Figura 12. Cantidad de hemocitos totales. Control (Condiciones
óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg mL-1). Superíndices
distintos indican diferencias significativas (p<0.05). Barras de error =
promedio EE.
33
Actividad de fenoloxidasa (SLH).
Los resultados de la actividad de la fenoloxidasa en SLH mostró que el control
presentó una actividad de 0.77 hasta 1.18 [(Abs min-1 mL-1 de muestra) × 10-3]. Sin
embargo, en el tratamiento con la dosis de plomo a una CSL11 (0.186 µg mL-1)
presentó un aumento a partir de la semana uno con 4.58 [(Abs min-1 mL-1 de
muestra) × 10-3] hasta una máxima en la semana tres con 10.00 [(Abs min-1 mL-1 de
muestra) × 10-3]. A partir de la semana dos hasta la semana 3 presentó diferencias
significativas con respecto al control (Figura 13).
Figura 13. Actividad de la profenoloxidasa (SLH). Control
(Condiciones óptima), Dosis de plomo expuestos (0.186 µg mL-1).
Superíndices distintos indican diferencias significativas (p<0.05).
Barras de error = promedio EE.
Actividad de fenoloxidasa (plasma).
La actividad de la fenoloxidasa en el plasma, en el tratamiento control presentó una
distribución desde 3.17 hasta 3.77 [(Abs min-1 mL-1 de muestra) × 10-3]. El
tratamiento expuesto al plomo en la semana uno registró 1.66 [(Abs min-1 mL-1 de
muestra) × 10-3] por debajo al control y en la semana tres y seis aumento hasta 5.39
y 5.91 [(Abs min-1 mL-1 de muestra) × 10-3] respectivamente. (Figura 14).
34
Figura 14. Actividad de la profenoloxidasa en plasma. Control
(Condiciones óptima). Dosis de plomo expuesta (0.186 µg mL-1).
Superíndices distintos indican diferencias significativas (p<0.05).
Barras de error = promedio EE.
VII.3. Parámetros fisicoquímicos.
Según Díaz 2001 los intervalos óptimos para el cultivo de langostino en
ambientes controlados son: oxígeno disuelto de 5.0 a 6.0 mg L-1; pH de 7.5 a 8.5 y
temperatura de 26 a 32 °C.
Los parámetros fisicoquímicos (Cuadro 6) en el bioensayo I presentó los
siguientes valores promedios, la temperatura (29.84 ± 2.29 °C), oxigeno disuelto
(5.53 ± 0.46 mg L-1) y pH (8.16 ± 0.06 UpH). En el bioensayo II registró los siguientes
valores promedios, la temperatura (24.11 ± 2.09 °C), oxigeno disuelto (5.81 ± 0.86
mg L-1) y pH (8.10 ± 0.04 UpH).
35
Cuadro 6. Parámetros fisicoquímicos del bioensayo I y II. Dosis de
plomo expuesto (0.186 µg mL-1), temperatura, oxígeno disuelto y
potencial de hidrógeno. Promedio EE.
TRATAMIENTOS TEMPERATURA
(° C) OXÍGENO DISUELTO
(mg L-1) pH
(UpH)
Bioensayo I Control 28.08±1.67 5.98±0.38 8.21±0.07
Dosis de plomo replica 1 30.41±2.19 5.44±0.33 8.14±0.05 Dosis de plomo replica 2 31.03±1.94 5.17±0.22 8.13±0.05
Dosis de plomo replica 3 28.41±2.83 5.28±0.22 8.10±0.05 Bioensayo II
Control 25.91±0.61 6.82±0.27 8.10±0.01
Dosis de plomo replica 1 25.01±2.70 6.08±0.55 8.10±0.01
Dosis de plomo replica 2 26.30±3.39 5.47±0.99 8.10±0.01
Dosis de plomo replica 3 26.27±2.66 5.55±0.75 8.10±0.01
36
VIII. DISCUSIONES
Explorar, comprender e identificar las dosis necesarias para llevar a cabo los
experimentos fueron las bases más solidas para desarrollar los bioensayos tóxicos in
vitro. De acuerdo con Bliss (1935), estadísticamente se puede calcular la
concentración letal al 50% (CL50). En el presente trabajo se emplearon diferentes
dosis de plomo (acetato de plomo) empleando a un organismo biológico como
centinela “Macrobrachium americanum” dando como respuesta un efecto de
mortalidad a las 96 hrs. Estos resultados fueron calculados obteniendo una CL50 de
0.398 µg mL-1 a 96 horas, demostrando que M. americanum es altamente sensible al
plomo. Aquí cabe señalar que la NMX-001-ECOL-1996 de la Calidad del Agua para
la Protección de la Vida Acuática en ríos, el grado máximo permitido es de 0.400 µg
mL-1 promedio mensual, por lo que se sugiere una revisión de la norma para una
protección real de la vida acuática.
Se encontraron resultados similares en trabajos reportados por Qing Wang et
al., (2009), en un estudio con la almeja M. meretrix evaluaron la toxicidad con plomo
encontrando una CL50 de 0.353 µg mL-1 en etapa larvaria. Así mismo, Benediet et al.,
(2008) realizaron un estudio para determinar los límites de toxicidad de plomo donde
también se encontró una similitud en Cyclop sp, con 0.300 µg mL-1. Camacho y
Gamboa (2003), trabajando con postlarvas de M. rosenbergii encontraron una CL50
de 0.165 µg mL-1 a 48 horas con plomo.
Los resultados de la prueba estadística de Bliss (1935), indican que la
concentración sub-letal del mínimo efecto fue al 11% (CSL11), con una concentración
de 0.186 µg mL-1 a 24 horas. Este parámetro presentó resultados muy similares a lo
recomendado en la NOM-001-ECOL-1996 de la calidad del agua en el uso y
aprovechamiento del agua en ríos para la protección de la vida acuática, cuya
concentración es de 0.200 µg mL-1 como promedio diario. Además Benediet et al.,
(2008) también encontraron límites de toxicidad del plomo en Daphnia magna
mostrando una concentración de 0.190 µg mL-1. Bajo este mismo criterio,
37
recientemente Ayala Rodríguez (2009) encontró en el Río Sinaloa concentraciones
máximas de 0.130 µg mL-1 en la sindicatura de Los Quemazones, Guasave.
La CSL11 calculada y empleada en este trabajo resultó ser apropiada para la
descripción del comportamiento de algunas variables que intervienen en la toxicidad
del plomo en M. americanum.
Uno de los primeros signos observados en los organismos expuestos fue la
disminución de la ingesta hasta un 12% con respecto a la semana uno. Conforme los
organismos controles iban creciendo, la ingesta aumentó de forma continua hasta
llegar a un aumento del 36% al final del experimento.
Las moléculas de plomo tienen la capacidad de unirse a sitios específicos de
aminoácidos que tienen en su cadena azufre (cisteínas). Además son altamente
inhibidoras de enzimas que necesitan un co-factor (Zn, Fe, Cu, Ca) para activarse
(Castillo-Rodríguez, 2005). De acuerdo con Sritunyalucksana y Söderhäll (2000) la
coagulación de la hemolinfa es una respuesta de defensa en los crustáceos, para
sellar sus heridas evitando la entrada de partículas extrañas. Ellos describen que el
ion calcio (Ca++) es un factor limitante para que se lleve a cabo con mayor eficiencia
la coagulación, por lo que podemos relacionar en este estudio los organismos
tratados con plomo resultaron afectados ya que resultó que disminuyó la capacidad
de coagulación de 21 a 100 segundos, conforme aumentaba el tiempo de explosión
del plomo. Debido a la acción tóxica del plomo impidió que se llevará a cabo una
serie de reacciones enzimáticas proteolíticas en el plasma de la hemolinfa donde se
sustituyo el Calcio por el Plomo. Por lo tanto se infiere que el plomo tuvo la
capacidad de desplazar al Calcio (Ca+2) y la afinidad para sustituirlo por tener un
radio iónico muy similar (Pb+2), cambiando la funcionalidad de la moléculas y
haciéndola menos efectiva ya que el tiempo de coagulación se prolongó hasta los
100 segundos (Reyes-Gil 1999, Boada et al., 2007).
38
Los hemocitos forman parte importante de la coagulación de la hemolinfa,
gracias a la enzima Transglutaminasa (TGasa) que se encuentra en el interior de las
células hialinas (hemocitos), el cual solo es liberada al plasma en presencia de
alguna herida (Yeh et al., 1998). En el presente trabajo, los hemocitos aumentaron
paulatinamente durante todo el experimento, lo cual hace pensar que había
suficiente TGasa y que el mal funcionamiento de la coagulación fue dada por la
sustitución del calcio por el plomo.
La distribución del plomo en los tres tejidos y en la hemolinfa del organismo
presentó un orden cumulativo decreciente de la siguiente manera: Hepatopáncreas˃
Exosqueleto˃ Músculo˃ Hemolinfa. Observándose dos grupos con comportamientos
diferentes: Grupo I.- El hepatopáncreas y exosqueleto, desarrollaron una
acumulación creciente durante las seis semanas. Grupo II.- El músculo y hemolinfa
desarrollaron una baja acumulación durante las cuatro semanas que posteriormente
se origino una depuración en la semana cinco5.
Según lo reportado por Soto-Jiménez et al., (2011), encontraron que el plomo
dentro de la cadena trófica produce una red de bioacumulación donde principalmente
recae en dos niveles tróficos; en los peces hasta 3.4 µg g-1 y en camarones hasta 3.5
µg g-1. En el presente trabajo se relaciona de igual manera la bioacumulación del
plomo en el hepatopáncreas de M. americanum iniciando desde una concentración
no detectable hasta 2.15 µg g-1.
Por otra parte se han reportado valores de plomo en organismos silvestres.
Según Nguyen (2008) en hepatopáncreas, exosqueleto y músculo de M. rosenbergii,
en un rango de 0.011 a 0.109 µg g-1, 0.026 a 0.134 µg g-1 y 0.002 a 0.025 µg g-1,
respectivamente. Además, Ala et al., (2010) encontraron concentraciones en hígado
y músculo de Clarias gariepinus desde 5.51 a 20.73 µg g-1 y 5.89 a 14.51 µg g-1,
respectivamente. Resultados similares se encontraron en el presente estudio en el
exosqueleto y musculo de M. americanum, según Nguyen (2008) y por debajo según
lo reportado por Ala et al., (2010).
39
El sistema ProFO actúa ante la presencia de materiales extraños (Vargas-
Albores; 1996), sin embargo, para la eliminación de materiales tóxicos que no son
reconocidos directamente por el sistema ProFO como los metales pesados, existen
varias vías de desintoxicación entre las que destaca la quelación de los metales
divalentes como el plomo por una proteína llamada Metalotioneína (Roesijadi 1992),
la cual después de atrapar el plomo expone un sitio que es reconocido por la FO. La
Metalotioneína una vez reconocida u opsonizada por la FO, es fagocitada por los
hemocitos, los cuales forman vacuolas y desintoxican al organismo (Ahearn et al.,
2004). La metalotioneína puede remover hasta 5-7 moles de metales pesados por
mol de proteína (Fatemeh y Shahab 2011).
En el presente trabajo, los hemocitos aumentaron continuamente de manera
significativa hasta el final del experimento, al mismo tiempo la proteína del plasma
disminuyó regularizándose en la cuarta semana, mientras que la proteína aumento
en los hemocitos. La cantidad de proteína en el plasma es 100 veces mayor que en
los hemocitos y la disminución puede estar relacionada con la disminución en la
ingesta, por lo que no se detecta una relación con la generación o consumo de
proteína ligada al plomo. Sin embargo, el aumento de proteína en los hemocitos
concuerda con la fagocitosis de la metalotioneína que queló el plomo hasta la tercera
semana. Esta explicación concuerda con los niveles de actividad de la FO y proFO,
la primera semana se consumió la FO de manera significativa aunque también hubo
un aumento de su producción en la ProFO. La tercera semana es clave en el proceso
de desintoxicación, aquí se encontraron las máximas concentraciones de proFO y
FO y proteína dentro de las células y en la cuarta semana también las máximas
concentraciones de plomo en hemolinfa y músculo. Para la quinta semana los niveles
de plomo en hemolinfa y musculo descendieron a cero, lo que significa que el
proceso de desintoxicación vía metalotioneína funcionó adecuadamente.
A partir de la cuarta semana, los datos sugieren que se detuvo el proceso de
desintoxicación por metalotioneína y se activó otro proceso diferente. Ahearn et al.,
(2004) hace referencia a diferentes procesos de secuestro y desintoxicación por
metales pesados en crustáceos. Ellos proponen un mecanismo de transporte de
40
cationes en la glándula digestiva en donde los metales pesados se absorben por el
epitelio de la glándula digestiva para secuestrarlas en las mitocondrias o en
lisosomas como un precipitado insoluble. En el presente trabajo no se tiene evidencia
clara del proceso que siguió después de la desintoxicación en la tercer semana,
únicamente se tiene el dato de un aumento progresivo de plomo en la glándula
digestiva, lo cual nos da indicios de la participación de esta glándula en el secuestro
del plomo. Como dato adicional, las glándulas digestivas de los langostinos
expuestos, se melanizaron (tornando una apariencia más obscura) y fueron de
menor tamaño que los controles (Anexo 3).
En el exoesqueleto también se detectó hasta 10 veces más plomo que en la
hemolinfa y se concentró en forma continua hasta la sexta semana, esto nos dice
que el plomo que se inserta en el exoesqueleto, tomando el lugar del calcio, no se
retira sino hasta que el organismo muda, quedando el plomo disponible para ser
ingerido por el mismo langostino u otros organismos que ingieren el exoesqueleto
(Soto-Jiménez et al., 2010).
41
IX. CONCLUSIONES
OBJETIVO 1.
La CL50 y CSL11 obtenidas por el método estadístico de Bliss fueron de 0.398
µg mL-1 y 0.186 µg mL-1 respectivamente, estas concentraciones son menores
que las concentración marca en la NMX-001-ECOL-1996 tanto para el máximo
promedio mensual y máximo promedio diario.
M. americanum puede utilizarse como organismo centinela por tener
sensibilidad al plomo al expresar una CL50 y CSL11 más bajo que las normas
ambientales mexicanas (NMX-001-ECOL-1996).
OBJETIVO 2.
El hepatopáncreas desarrolló la mayor bioacumulación de plomo.
En el músculo y hemolinfa se desarrolló la menor bioacumulación de plomo.
OBJETIVO 3.
La CSL11 de plomo (0.186 µg mL-1) tuvo un efecto crónico sin mortalidad en M.
americanum lo cual permitió el estudio del efecto de la ingesta y las variables
inmunológicas.
Los organismos expuestos al plomo tuvo una disminución de la TCA hasta un
36% con respecto al control.
Los organismos expuestos al plomo disminuyo su capacidad de coagulación
retardándose hasta 100 segundos.
El sistema de inmunológico innato del M. americanum no reconoció y eliminó
el material tóxico del plomo, por lo que la desintoxicación fue por la vía de la
quelación del plomo por la Metalotioneína que expone un sitio específico para
42
poder ser reconocida y opsonizada por la FO y posteriormente fagocitada por
los hemocitos y almacenada en las vacuolas.
43
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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49
XI ANEXOS
Anexo1. Tabla. Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad (Bliss, 1935).
% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66
10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12
20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45
30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72
40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97
50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23
60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50
70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81
80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23
90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33
% 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
99a 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 9,09
a Valores entre 99,0 y 99,9.
50
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