Toma de muestras y laboratorio en infecciones orales
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TOMA DE MUESTRAS Y LABORATORIO
EN INFECCIONES ORALES
TEMARIO: CONSIDERACIONES
Infecciones asociadas :
Agentes asociados:
Metodología de búsqueda etiológica
Identificación y susceptibilidad
INFECCIONES
Manifestaciones orales de enfermedades sistémicas
Locales:
Caries
Periodontitis
Ulceras orales
Candidiasis
Actinomycosis
Tuberculosis y otras
AGENTES
Porphyromonas gingivalis*
Tannerella (Bacteroides) forsythia
Aggregatibacter actinomycetencomitans*
Streptococcus spp (hasta nivel especie)
Etc etc
Dificilidentificación
BACTERIAS - TINCION DE GRAM
POSITIVAS NEGATIVAS
COCACEAS BACILOS COCACEAS BACILOS
En racimo:
Staphylococcus spcoagulasa: (+) S. aureus
(-) S. coag. neg.S. saprophyticusS. epidermidis
Tetradas:Micrococcus sp
En pares o cadenas:
Enterococcus sp
Streptococcushemólisis: () S. pneumoniae
() S. viridans() muchas() S. pyogenes (A)() S. agalactiae (B)() S. grupo C (mitis)() S. grupo D (bouis)() S. grupo F() S. grupo G
Otros:
PeptoestreptococcusPeptococcusLeuconostocAerococcusLactococcusPediococcus
Difteromorfos:
CorynebacteriumPropionibacterium*
Grandes, con esporas:
Clostridium*Bacillus
Ramificados:
NocardiaActinomyces*
Otros:ListeriaLactobacillusMicobacterias
Diplococos:NeisseriasBranhamella
Cocaceas anaer:
Veionellas*
Cocobacilos:
AcinetobacterKingellaPasteurellaBrucella
Enterobacterias: Fermentan glucosa
Oxidasa -
L(+): E. coliK. pneumoniaeEnterobacter spCitrobacter sp
L(-): Proteus spProvidencia spSerratia sp Morganella spSalmonella** Shigella**
Yersinia**
No fermentadores:
Acinetobacter spPseudomonas spAlcaligenes spFlavobacterium spStenotrophomonasBurkholderia sp
Fastidiosos:Haemophilus spAggregatibacterCardiobacteriumEikenellaKingellaCapnocytophagaBordetella
Fermentadores glucosa Oxidasa +Vibrio**Aeromonas**
Otros:Bacteroides*Fusobacterium*Prevotella*
* Anaerobios
** Enteropatógenos
Medicina
EXÁMENES
Generales :
Hemograma
Proteina C Reactiva/VHS
Hemocultivos
Locales:
Gram /Cultivo tejido corriente/hongos
Reacción polimerasa en cadena
Sospecha de infección sistémica: derivar para manejo conjunto con
infectologos
DILEMAS
Dificultades de carácter técnico :
1. Muestra no exenta de contaminación con fluido oral y/u otro contaminante
2. Medios de cultivo óptimos para el desarrollo de los verdaderos patógenos no siempre disponible
3. Identificación precisa de ellos limitada1. Bioquímica tradicional
2. Bioquímica comercial (semi/automatizada)
3. PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
4. Determinación de susceptibilidad (no) estandarizada para todos.
5. Susceptibilidad in vitro v/s biopelículas
Microbiología endodóntica: últimos avances.
Rev. Estomatológica visión dental Vol9 N°3 2006 Lima Peru.
Luis Chavez de Paz, U. de Malmö, Suecia.
METODOLOGÍAS
1. Cultivo
Ampliamente distribuido en laboratorios clínicos
Identifica y apoya con determinación de susceptibilidad
Tiempos de espera entre 48 a 96 hrs o más si se incluyen anaerobios (7 días).
Requiere conocimiento de microbiología oral para hacer dgco apropiado… laboratorios de hospitales no preparados para ello!
Identificación limitada a métodos utilizados:
Clásico (batería bioquímica): generalmente hasta género en muchos patógenos orales
Semi-automatizado: regular concordancia, requiere confirmaciones (ej. galerías API)
Automatizado: buena concordancia, algunas especies no posible identificar
METODOLOGÍAS
2. Biología molecular
Limitado a laboratorios especializados y algunos adicionados a laboratorios clínicos de rutina
Métodología que permite identificar la mayor diversidad bacteriana en boca
Métodos diversos a revisar:
PCR tiempo real
PCR multiple
Identificación por ARNr16S
Arrays
QUÉ ES LA BIOLOGÍA
MOLECULAR O PCR
El proceso de detección de un agente infeccioso poramplificación genética se desarrolla de manerahabitual en tres etapas:
1° Extracción y purificación de los ácidos nucleicosdel microorganismo de la muestra biológica
2° Amplificación de un segmento seleccionado delgenoma del microorganismo mediantereacción en cadena de la polimerasa, es decir,la PCR propiamente dicha.
3° Detección de los fragmentos amplificados en laPCR (amplicones) por electroforesis en gel deagarosa o mediante hibridación con sondasespecíficas. En general todo este proceso sueledurar aprox 24 h .
PCR TIEMPO REAL
Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.
Mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.
Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.
Al ser simultánea se acortan los tiempos. Promedio 50 minutos. .. Puede ser múltiple además.
PCR MULTIPLE
Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y enun único tubo diferentes secuencias diana,permitiendo la detección e identificación simultánea dedistintos genes de interés.
Usos en dgco de sindromes clínicos como neumoniacomunitaria, meningitis, etc.
ARRAYS
Los chips o arrays de ADN son una serie de sondas de ADN unidas a un soporte sólido en una disposición regular y prefijada.
El ácido nucleico diana que será detectado puede ser ADN o ARN y previamente a la hibridación debe ser marcado con una sustancia fluorescente o radiactiva.
La principal ventaja con respecto a PCR es que pueden detectarse en un único procesamiento miles de genes.
Investigación de la patogenia bacteriana
análisis de la evolución bacteriana y epidemiología
estudio de los mecanismos de acción y de resistencia de los antibióticos
diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas.No disponible clinicamente
ANÁLISIS DEL ARN
RIBOSOMAL 16 S
Molécula muy antigua, presente en todas las bacteriasactuales.
Estructura y función constantes durante un tiempo muyprolongado, de modo que las alteraciones en lasecuencia reflejan probablemente cambios aleatorios .
El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500nt)minimiza las fluctuaciones estadísticas.
Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr16S existen bases de datos amplias, en continuocrecimiento que se compara con lo obtenido
Directo de cultivo puro o de muestra tejido/fluido estéril.
Útil en no cultivables o emergentes.
LIMITACIONES BIOLOGÍA
MOLECULAR
No disponible en laboratorios clínicos generales
Identifica MO vivos y muertos
No posible relacionar rol patógeno
No reproducible en cultivo
No permite determinación susceptibilidad
Riesgos contaminación toma muestra y procesamiento
Patógeno único? --- PCR múltiple? ---numerosas PCR?
Identifica con mayor precisión y rapidez
Permite cuantificar
PCR DISPONIBLES
Virus: herpes, enterovirus papiloma
Bacterias diversas:Aggregatibacter
actinomycetemcomitansActinomyces israeliiBacteroides fragilisCampylobacter rectusCapnocytophaga spp.Eikenella corrodensEnterococcus spp.Fusobacterium nucleatumFusobacterium spp.Mycobacterium avium-
intracellulare
Mycobacterium tuberculosisNeisseria gonorrhoeaePeptostreptococcus anaerobiusPeptostreptococcus microsPorphyromonas gingivalisPorphyromonas spp.Prevotella intermediaPrevotella nigrescensPrevotella spp.Streptococcus intermediusStreptococcus mutansTannerella forsythiaTreponema denticolaTreponema pallidum
TOMA DE MUESTRAS
Preparación:
Reunir material, realizar órdenes de exámenes, etiquetar tubos.
Higiene de manos y colocación de guantes (precauciones estándar que puede incluir gafas y mascarilla).
4 manos
TOMA DE MUESTRAS
Sitio exacto de la lesión
No poner en contacto con antisépticos
Rápido
Idealmente aspirar abscesos cerrados por punción o raspado, cureta (preferir por sobre hisopado) o trozo tejido biópsico (sin preservantes).
Previo a inicio de tto ATB (idealmente).
Inocular en medio de transporte aerobio/anaerobio
Transporte t° ambiente inmediato (excepto virus 4°C)
DERIVACIÓN SEGÚN AGENTE
BUSCADO
VIRUS: DETECCIÓN DIRECTA
detección elemento viral directamente desde la muestra(fase aguda 5-7 días)
frotar con fuerza mucosa para desprender células infectadas conhisopo. Conservación 4°C hasta 48 hrs o 7 días a -70°C.
Microscopía óptica+tinción: visualización de él en célulashumanas por técn.inmunológicas (IF), enzimas (ELISA) oisótopos radiactivos (RIA). No disponible virus orales.
Cultivo viral: cultivos celulares en forma de monocapas a partirde tejidos animales o humanos. Detección viral se efectúa por
1. Efecto citopático o su neutralización con sueros con Acfrente al virus sospechado.
2. Adición de Ac para detección medianteinmunoflurorescencia (identifica Ag). Shell vial.
3. Biología molecular.
VIRUS
PCR para los virus sospechados desde
muestra o cultivo viralDisponible toda la
familia HerpesVHS 1 y 2
VVZCMVVEB
HHV-6 y 8Echo
Coxsakie
Celulas no infectadas de riñón de conejo
Celulas infectadas de riñón de conejo
VHS-1
HONGOS
1. Cultivo hongos (toma y transp similar a bacterias)
Filamentosos: lento crecimiento.
Levaduriformes: rápido crecimiento, contaminantes/florav/s patógenos.
Ojo con: dermatofitos, dimórficos como Histoplasma (noforman parte de la rutina de laboratorios)
Metodología:
Siembra en agar sabouraud c/s CAF
Morfología colonias, micromorfología.
Levaduras: medios cromógenos, galerías identificación: API,ID 32C; Sistemas automatizados: Vitek .
Filamentosos: morfología colonia, tinción de colonia conazul de lactofenol-
CHROMagar Candida. C. albicans ATCC 90028 (arriba)C. krusei ATCC 6258 (derecha)C. glabrata (abajo), C. tropicalis (abajo izq)C. parapsilosis ATCC 90018 (arriba izq)
Candida krusei
BACTERIAS
1. Cultivo corriente:
Siembra en medios sólidos enriquecidos ydiferenciales (ASC-ACH-MC) y caldos (tioglicolato).
Adicionar anaerobios si lo solicitan y muestra no estáaireada.
Identificación a nivel especie solicitada.
2. Antibiograma:
La mayoría de los lab: difusión con disco, insuficientepara estomatología.
Requerido por tipo de patógenos orales: CIM dilucióno bien E test por difusión.
IDENTIFICACION
BACTERIANA
Identificación automatizada: sistema Vitek
Alrededor de 94% identificación especies cocáceas
Bajo nivel discriminación en alrededor 5%
Menos 1% sin identificar
Además incluye susceptibilidad con CIM
Optimo para laboratorios clínicos no moleculares.
SUSCEPTIBILIDAD
BACTERIANA
1. Susceptibilidad por difusión en agar:
1. Con discos
2. E-test (CIM)
2. Susceptibilidad por dilución
1. En placa (agar)
2. En caldo (tubos)
3. Microdilución
SUSCEPTIBILIDAD
BACTERIANA
1. Susceptibilidad por difusión en agar:
1. Con discos
2. E-test (CIM)
2. Susceptibilidad por dilución
1. En placa (agar)
2. En caldo (tubos)
3. Microdilución
ANTIBIOGRAMA: NORMA
CLSI
1. ANAEROBIOS: CIM
1. Beta lactámicos sólos y en combinación
2. Lincosamidas (clindamicina)
3. Carbapenémicos
4. Quinolonas (moxifloxacino)
2. STREPTOCOCCUS no beta hemolíticos (CIM)
1. Penicilina
2. Cefalosporinas 3° gen
3. Lincosamidas (discos)
4. Quinolonas (discos)
3. Otros: de acuerdo a la rutina de laboratorio
CONCLUSIONES
Diagnostico de laboratorio de infecciones estomatológicas limitado a:
Automatización y tecnologías del Laboratorio
Conocimiento de patógenos orales de profesionales del laboratorio
Solicitud expresa de búsqueda de patógenos puntuales por odontólogos
Comunicación directa entre ellos oportuna
Toma de muestra de buena calidad
Gracias