Tincin simple, tincin diferencialLa mayora de los colorantes de clulas o tinciones son de naturaleza orgnica y aromtica. Existen dos tipos generales de colorantes: bsicos y cidos. En los bsicos, el grupo cromforo (que da el color) es bsico o catinico, por ejemplo el grupo azo (N=N). Los colorantes cidos poseen generalmente grupos nitrilo (NO2) o aromticos. Ejemplos de colorantes cidos son eosina y azul de anilina. De colorantes bsicos, azul de metileno, cristal violeta y azul de toluidina. El mecanismo de accin de la mayora de los colorantes se basa en la propiedad de protenas, ciertos polisacridos y cidos nucleicos de ionizarse como cidos o como bsicos, lo que les permite reaccionar con los grupos cromforos de las tinciones. La carga neta de las molculas es la que determina con qu tipo de colorante reacciona, y es lo que permite realizar tinciones especficas para distintos tipos de molculas y estructuras celulares. Existen numerosas tinciones que se utilizan en microscopa y permiten una mejor observacin de las estructuras celulares al contrastar en forma selectiva molculas determinadas. Generalmente se usan diferentes colorantes, algunos ejemplos de ellos son el lugol que tie los granos de almidn de color azul-morado, la floroglucina que tie de rojo violeta las paredes celulares lignificadas, el azul de metileno que tie el protoplasma y las paredes celulares celulsicas, etc. La fijacin es un mtodo que se utiliza para preservar la morfologa y la composicin qumica de las clulas que componen una preparacin microscpica. Consiste en agregar agentes fijadores a la muestra como acetona, formaldehdo o glutaraldehdo, los cuales mantienen las interacciones entre las molculas (protenas, cidos nucleicos, etc.) y permiten que las preparaciones duren en buen estado durante meses o aos. Uno de los mtodos ms utilizados para realizar preparaciones permanentes consiste en fijar el material de inters en una solucin FAA (formaldehdo-alcohol-cido actico), concentracin (entre 50 y 100%) y finalmente embeberlo en parafina para obtener bloques que puedan ser cortados en secciones muy finas utilizando un micrmetro.

Estas secciones que contienen material fijado y desecado se colocan cuidadosamente en un portaobjetos, y se disuelve la parafina con un solvente orgnico como xilol. Una vez hecho esto, la muestra se tie para contrarrestar las distintas estructuras celulares y se protege con un cubreobjeto montado sobre una sustancia sellante.

Tincin de BacteriasSi se desean observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, resulta sumamente til el utilizar las preparaciones fijas y teidas, debido a que estas permiten que las clulas se visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar las distintas especies por su coloracin, este mtodo en particular se llama tincin diferencial o selectiva. Los pasos a seguir para la tincin de las bacterias es hacer el frote, la fijacin y la aplicacin de las soluciones colorantes. La amplia gama de colorantes que se pueden utilizar, ha obligado a separarlos en tres grupos generales, los de trifenilmetano, los de oxacina y los de tiacina. Esta clasificacin es buena para la distincin de las familias de colorantes, pero en general se utiliza la clasificacin de acuerdo a su carcter cido base, es decir, cidos, bases o neutros, debido a que de esto depende mucho su comportamiento. La coloracin se da de acuerdo con a la accin de los iones complejos del colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula.

Entre los diversos tipos de coloracin de bacterias, estn la coloracin simple, diferencial y la tincin negativa.

Coloracin Simple:Este tipo de coloracin consiste en inundar con un colorante cualquiera la lmina donde se tienen las bacterias, luego lavarlas con agua, y algunas clulas retendrn el colorante, por reaccin con el mismo.

Coloracin diferencial:Este tipo de coloracin es sumamente importante, ya que discrimina entre un tipo de bacterias y otro de acuerdo con su susceptibilidad ante uno u otro colorante. Entre estos mtodos se encuentra la coloracin de Gram, que es sumamente importante en microbiologa. Este mtodo discrimina entre clulas grampositivas y clulas gramnegativas, es generalmente utilizado debido a que muchas de las clulas patgenas son del tipo gramnegativo, aparte de esta diferencia las clulas grampositivas son ms susceptibles a la penicilina y ms resistentes a la accin mecnica y exposicin a algunas enzimas que las gramnegativas. La forma en que se realiza este mtodo es aplicando cristal violeta a la laminilla, luego se aplica yodo como colorante, luego se lava con alcohol, para finalmente aadirle un colorante de contraste. En general, se obtienen bacterias de color rojo y violeta. Las clulas gramnegativas pierden el cristal violeta durante el lavado, por lo tanto aparecen rojas ante el contraste de la safranina, las clulas

grampositivas retienen el cristal violeta, por lo tanto se observan violeta profundo. Otro tipo de coloracin diferencial es el mtodo de cidoresistencia, que se usa ampliamente para el gnero Mycobacterium. Esta es la tincin que se realiza con fucsina fenicada (calentada), cido-alcohol y azul de metileno. Las bacterias que obtienen cierta coloracin con este mtodos son acidorresistentes, toman un color rojo, las que lo pierden se coloran con azul de metileno y no son acidorresistentes. Adems se puede contar el mtodo de Giemsa, que tiene utilidad para determinar la presencia de rickettsias dentro de clulas huspedes. Esta prueba se utiliza para pruebas con sangre y para pruebas de protozoos. Tincin Negativa Esta prueba consiste en la visualizacin de bacterias en una pelcula oscura, se realiza aadiendo tinta china o nigrosina a la suspensin bacteriana, se coloca en un portaobjetos como una pelcula y se deja secar, luego al observar en el microscopio, se observar que los microorganismos aparecen transparentes.

Preparacin de colorantes1.

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Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen) o cido clorhdrico concentrado ..........................................................3 ml o Etanol 95% ....................................................................................97 ml Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos. o Azul de metileno................................................................................1 g o Agua destilada...............................................................................100 ml Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. o Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................1 ml o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml o Agua destilada...............................................................................100 ml Colorante para esporas: o Solucin acuosa saturada de verde malaquita Colorante para flagelos de Leifson: o Solucin A Fucsina bsica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml o Solucin B cido tnico................................................................................3 g Agua destilada.........................................................................100 ml o Solucin C Cloruro sdico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado hermticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g o Agua destilada.................................................................................100 ml Eosina: Para observacin de clulas sanguneas. o Eosina...............................................................................................0,3 g o cido actico glacial......................................................................0,025 ml o Agua destilada...................................................................................100 ml Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple. o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 ml o Agua destilada.................................................................................100 ml Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente. o Fucsina bsica......................................................................................1 g o Etanol 95%........................................................................................10 ml o Fenol 5% en solucin acuosa............................................................100 ml Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas. o Hematoxilina.........................................................................................2 g o Agua destilada......................................................................................1 l Lactofenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos. o cido lctico.....................................................................................100 ml o Fenol................................................................................................100 g

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Glicerol.............................................................................................200 ml Agua.................................................................................................100 ml Lactofenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solucin de azul algodn Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)......................10 ml Glicerol.....................................................................................10 ml Agua.........................................................................................80 ml Mezclar esta solucin con lactofenol a partes iguales Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram. o Yodo...................................................................................................1 g o Yoduro potsico..................................................................................2 g o Agua destilada.................................................................................300 ml Orcena A: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................45,8 ml o cido clorhdrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml o Agua..................................................................................................45,8 ml Orcena B: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................55 ml o Agua..................................................................................................55 ml Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina.........................................................................................0,25 g o Agua destilada..................................................................................100 m Sudn III: Tincin especfica de grasas. o Alcohol etlico...................................................................................100 ml o Sudn III...................................................................................hasta saturacin Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)o o