NEUROFARMACOLOGÍA

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INTRODUCCIÓNDisfunción cognitiva en neurología y patología médica

En medicina, los trastornos de las funciones cognitivas se aso-cian generalmente con las llamadas ‘demencias degenerativasprimarias’, de especial importancia por su alta frecuencia y pre-valencia en las poblaciones con un índice de envejecimientocreciente, típicas de los países desarrollados. Se trata de un gru-po heterogéneo de enfermedades caracterizadas por un deterio-ro mental progresivo que incluye combinaciones variables depérdida de memoria, alteraciones del juicio, el cálculo, el len-guaje, la orientación, las habilidades y la conducta, y trastornospsiquiátricos. Los hallazgos anatomopatológicos de este grupode enfermedades consisten en la pérdida de neuronas, localiza-da preferentemente en la corteza cerebral, junto con cambiosdegenerativos de las neuronas supervivientes, inclusiones pro-teicas y alteración vascular y de la glía. La localización de lapérdida neuronal y la naturaleza de los cambios degenerativos yde las inclusiones son los factores que diferencian a las distintasafecciones [1]. Ejemplos de este grupo de enfermedades dege-nerativas serían las demencias frontotemporales, la demenciacon cuerpos de Lewy difusos y la enfermedad de Alzheimer. Es-ta última es el prototipo de enfermedad demenciante neurode-generativa por excelencia, al ser la más frecuente y la mejor es-tudiada [2].

Sin embargo, a medida que el interés por el estudio de lasfunciones intelectuales ha ido aumentando, se ha comprobadoque existen alteraciones cognitivas en otras enfermedades neu-rológicas degenerativas cuyas manifestaciones cardinales con-sisten en un trastorno del movimiento, como las ataxias cerebe-

losas, las enfermedades de las motoneuronas o las distrofiasmusculares, y que engloban a la enfermedad de Parkinson [3,4],el temblor esencial [5], la enfermedad de Huntington [6,7], laparálisis supranuclear progresiva [8], las ataxias hereditarias[9], la esclerosis lateral amiotrófica [10] y las miopatías [11].

Es de destacar que prácticamente todas las enfermedadesneurológicas adquiridas o secundarias del sistema nervioso, in-cluidas las traumáticas, vasculares, infecciosas, inflamatorias,desmielinizantes, tumorales, iatrogénicas, tóxicas, metabólicaso psiquiátricas, se han asociado con deterioro intelectual o de-mencia [12]. También algunas enfermedades sistémicas, comoel dolor crónico [13] o las afecciones reumáticas [14] y digesti-vas [15,16], se han asociado con la disfunción cognitiva. Por lotanto, la ubicuidad de la disfunción intelectual en la patologíahumana, junto con el hecho de que la alteración cognitiva essiempre una causa importante de incapacidad para el paciente, yde estrés y sobrecarga para los familiares, los cuidadores y la so-ciedad en general, subraya la importancia del problema y la nece-sidad de profundizar en el conocimiento de las causas, los me-canismos patogénicos y el tratamiento de estos trastornos.

Pese al espectacular avance de las técnicas y los conoci-mientos en neuroimagen, neuroquímica, neurogenética, neuro-psicología, neurofisiología y neurofarmacología, la investiga-ción con pacientes presenta importantes limitaciones que haceimprescindibles los estudios experimentales con modelos ani-males de los distintos tipos de disfunción cognitiva. Hay unagran variedad de modelos animales de deterioro cognitivo, cla-sificados en función del mecanismo por el que éste se produce,sea selección o manipulación genética, utilización de agentesambientales durante el desarrollo o la edad adulta, o manipula-ción farmacológica de la respuesta cognitiva del animal. Aun-que los estudios in vitro de tejido cerebral tienen su interés, enel campo de la farmacología cognitiva es necesario utilizar unoo varios modelos animales para determinar la utilidad de unnuevo fármaco y su posología, debido a la complejidad de lafunción cognitiva, en la que intervienen múltiples estructurascerebrales interconectadas.

El objetivo de esta revisión es describir las principales prue-bas de conducta usadas en animales de experimentación para

MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES

Resumen. Introducción. El aumento de la prevalencia de la disfunción cognitiva y la demencia, asociado, entre otros factores,al envejecimiento de la población en los países desarrollados, ha despertado un gran interés por el estudio de la etiopatogéne-sis del déficit cognitivo y de las posibles dianas farmacológicas para mejorar la función intelectual o frenar la neurodegenera-ción subyacente en estos síntomas. Desarrollo y conclusiones. Un instrumento esencial a tal fin es la utilización de modelosanimales de las enfermedades humanas que cursan clínicamente con deterioro cognitivo y demencia. En esta revisión analiza-mos los modelos animales de estos trastornos y las principales pruebas que, mediante la observación de la evolución de laconducta del animal de experimentación, permiten valorar sus funciones cognitivas y su modificación por los tratamientos ex-perimentales que se quieran ensayar, de cara a su posible aplicación a los pacientes. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45]Palabras clave. Atención. Conducta. Demencia. Deterioro cognitivo. Memoria. Modelos animales.

Aceptado tras revisión externa: 30.06.08.a Instituto de Neurociencias de Alicante. Universidad Miguel Hernández-CSIC. San Juan de Alicante, Alicante. b Servicio de Neurología. HospitalGeneral de Alicante. Alicante, España.

Correspondencia: Dr. Jorge Manzanares. Instituto de Neurociencias deAlicante. Universidad Miguel Hernández-CSIC. Apartado de Correos 18.E-03550 San Juan de Alicante (Alicante). E-mail: jmanzanares@umh.es

Los autores manifiestan la inexistencia de posibles conflictos de interés.

© 2008, REVISTA DE NEUROLOGÍA

Métodos de evaluación de trastornos cognitivos en modelos animales

F. Navarrete a, J.M. Pérez-Ortiz a, T. Femenía a, M.S. García-Gutiérrez a,

M.E. García-Payá a, C. Leiva-Santana b, J. Manzanares a

F. NAVARRETE, ET AL

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evaluar una serie de trastor-nos cognitivos, examinandosus fundamentos, sus ventajase inconvenientes y su poten-cial proyección en la clínica.

Función cognitiva: atención,aprendizaje y memoria

Antes de mostrar las pruebasde conducta que se empleanen la evaluación del deteriorocognitivo, es importante des-cribir una serie de conceptosrelacionados con la funciónintelectual. El sistema de cog-nición en general se componede procesos de funcionalidady de aprendizaje y memoria.Entre los de funcionalidad, seincluyen, por una parte, pro-cesos de ‘preatención’, en losque se realiza el filtrado de lainformación sensoriomotorapara centrar la atención en loselementos más relevantes delentorno [17] y cuya alteracióngenera una sobrecarga senso-rial y una fragmentación cog-nitiva que podría contribuir alas alteraciones que se dan endistintos trastornos psicóticos[18], y por otra parte, proce-sos de ‘atención’, esto es, atención reflexiva,orientación visual, orientación aprendida, vigi-lancia, habituación y atención selectiva, mante-nida o dividida.

En los procesos de aprendizaje y memoriase incluyen el aprendizaje asociativo, espacialo no espacial, y la memoria a corto y largo pla-zo. Se puede definir el concepto de memoriacomo ‘la retención a largo plazo de representa-ciones internas dependientes de la experiencia’[19]. La memoria se puede dividir en dos gran-des bloques: memoria implícita (no declarati-va) y explícita (declarativa) [20,21]. La memo-ria implícita es la resultante de procesos deaprendizaje no consciente realizados a travésde hábitos y habilidades, mediante estimulación o sensibiliza-ción previa, y en los que interviene la musculatura esquelética obien respuestas emocionales y de aprendizaje no asociativo. Lamemoria explícita o declarativa engloba la retención del conoci-miento de determinados acontecimientos, lugares o hechos, yen ella toma parte el lóbulo medio temporal del diencéfalo. Estainformación se retiene mediante un esfuerzo consciente y a tra-vés de asociaciones nuevas [21]. La adquisición de la memoriaexplícita es un proceso que requiere tres fases:

– Codificación: captación de detalles sobre los estímulos y elentorno para su posterior consolidación (procesamiento dela información para almacenarla).

– Almacenaje: retención de la información a lo largo del tiempo.– Recuperación: utilizar la información retenida para crear una

representación consciente del suceso o para ejecutar una res-puesta motora aprendida.

En la memoria explícita se incluyen tres categorías diferentes:memoria inmediata, memoria a corto plazo y memoria a largoplazo [20,22].

Todos los aspectos mencionados anteriormente del aprendi-zaje y la memoria se han estudiado a lo largo de los años graciasa modelos animales, que han permitido conocer las estructurascerebrales que intervienen en su funcionamiento (Fig. 1).

Tipos de modelos animales de trastornos cognitivos

Los modelos animales de trastornos cognitivos se han basado ma-yoritariamente en primates, ratas y ratones, cuyos procesos neu-

Figura 1. Tipos de memoria y estructuras cerebrales relacionadas. En función de cómo se recibe y almacena lainformación, cabe distinguir dos grandes tipos de memoria: la implícita, que no requiere un aprendizaje conscien-te, y la explícita, producto de un esfuerzo cognitivo consciente.

Figura 2. Prueba go/no go. Este ensayo tiene lugar en cámaras de conducta operante dondeel animal recibe estímulos go a los que debe responder presionando una palanca, por lo cual re-cibirá una recompensa, o estímulos no go, frente a los que debe retener su respuesta.

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ronales son similares a los de la función cognitiva humana. Sepueden distinguir varios tipos de modelos experimentales:

– Modelos farmacológicos: permiten la evaluación de fármacos.– Modelos genéticos: basados en animales manipulados gené-

ticamente (transgénicos y knock-out) [23-28].– Modelos toxicológicos: para determinar la toxicidad de me-

tales pesados, tóxicos y neurotoxinas [29].

Hay modelos animales que simulan síndromes específicos de dé-ficit cognitivo en los cuales el factor desencadenante es el enve-jecimiento [30-32] o los traumatismos craneoencefálicos [33,34].Recientemente, se han empleado también otros modelos comple-mentarios que se realizan con animales no mamíferos, como pe-ces cebra (Danio reiro), moscas del vinagre (Drosophila mela-nogaster) y gusanos (Caenorhabditis elegans), para cribar com-puestos potencialmente tóxicos o terapéuticos, y determinar al-guna de las bases neuromoleculares de la función cognitiva.

PRUEBAS DE CONDUCTA PARA LA EVALUACIÓN DE TRASTORNOS COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES

A la hora de abordar el estudio de la función cognitiva utilizan-do modelos animales debemos tener presentes sus múltiples di-mensiones y decidir cuál de ellas deseamos investigar para ele-gir la prueba específica más apropiada.

Evaluación de la atenciónPreatención

Inhibición prepulso. Permite evaluar la capacidad de un indivi-duo para filtrar la información disponible a través de la aplica-ción de un estímulo de baja intensidad (prepulso) que antecedea un estímulo intenso (pulso). Si a un estímulo alto le precedeuno de menor intensidad, la respuesta al segundo estímulo se re-duce. En esta prueba se mantiene constantemente un sonidoneutro (blanco) con el objetivo de crear un ruido de fondo esta-ble. El estímulo acústico prepulso se aplica entre 4 y 18 dB porencima de este ruido de fondo y precede sistemáticamente al es-tímulo mayor (pulso) cuya magnitud varía entre 100 y 120 dB yque se aplica durante 60 a 140 ms. El prepulso auditivo inicialinhibe la magnitud de la respuesta de sobresalto posterior anteel pulso, inhibición que se incrementa conforme aumenta la in-tensidad del prepulso [35].

Atención

Orientación y habituación. Para medir la respuesta de orienta-ción visual en ratas y ratones se utiliza una técnica que consisteen colocar un objeto en el campo de visión del animal y evaluarla capacidad que tiene para rastrear el objeto. Una manera de lle-var a cabo la prueba es colocar el animal en un área circular don-de primero se le deja pasar una fase de habituación de unos dosminutos, seguida de la introducción de un pequeño objeto quedurante 12 segundos se mueve siguiendo el perímetro del áreacircular en el campo de visión del ratón. Cada presentación delobjeto constituye un ensayo de la prueba y en cada ensayo se mi-de la respuesta de orientación en intervalos de uno o dos segun-dos. Se considera que el animal se orienta cuando dirige su cabe-za hacia el objeto o bien lo rastrea mientras se encuentra girando.

Prueba go/no go. Este ensayo se divide en pruebas go y pruebasno go. La prueba go consiste en la presentación de un estímulo

al animal de experimentación (por ejemplo, luz), ante el cual elanimal debe responder y recibirá una recompensa por ello. En elcaso de la prueba no go se aplica una determinada señal antesde la señal go (por ejemplo, un tono antes de la luz) y el animalde experimentación tiene que aprender a retener su respuestapara recibir el refuerzo (Fig. 2).

La prueba está constituida por tres fases:– Formación: el ratón aprende a realizar una tarea con el obje-

tivo de conseguir un refuerzo y tras esto se le aplica la señalgo durante cinco días consecutivos en los que se llevan a ca-bo 40 pruebas al día.

– Prueba go: comienza con la presentación de la señal go y,cuando el ratón responde a dicho estímulo dentro de un de-terminado período de tiempo (por ejemplo, 60 segundos), sele suministra la recompensa. Es entonces cuando el ratóndispone de un tiempo determinado, 20 segundos, para loca-lizar y consumir la comida. Un fallo en cualquier parte de laprueba supone la interrupción antes de la siguiente pruebago. Cuando el ratón complete con éxito el 85% de las prue-bas go durante al menos tres días consecutivos, se introduceen la prueba go/no go.

– Prueba go/no go: esta fase dura aproximadamente 10 días,durante los cuales se van intercalando aleatoriamente laspruebas go y no go. Tras la señal no go, el ratón debe apren-der a contener su respuesta durante unos 15 segundos pararecibir la recompensa. Si el ratón responde antes de tiempoo mientras se está aplicando la señal, se considera fallo y nose le proporciona la recompensa. Si el ratón no logra retra-sar su respuesta durante un período determinado (15 segun-dos), se debe repetir la prueba con un intervalo de tiempomenor (2-10 segundos), con el fin de averiguar si el déficitse debe a una incapacidad para retrasar su respuesta duranteun período prolongado o a una incapacidad de aprender latarea no go.

Inhibición latente. Esta prueba permite estudiar la atención se-lectiva del ratón, así como determinados aspectos del aprendiza-je y la memoria. El concepto de inhibición latente hace referen-cia al retraso que se produce en el condicionamiento a un estí-mulo cuando ese estímulo ha sido presentado previamente sinninguna consecuencia [36]. El procedimiento consistiría en tenerdos grupos de animales, el primer grupo se coloca en el aparatodonde se realiza la prueba y se permite que lo explore duranteuna hora. El segundo grupo se coloca en el aparato el mismotiempo pero reciben el estímulo condicionado (por ejemplo, untono intermitente y/o luces). Al día siguiente, los ratones sonexaminados en el mismo aparato y el estímulo condicionado pre-cede a un shock eléctrico en las patas (estímulo aversivo). Si elratón sale de la cámara durante el tono de 8 segundos, se con-sidera respuesta de evitación. Si abandona la cámara tras el tonode 8 segundos y durante la presentación del siguiente tono de 8segundos y shock eléctrico, la respuesta se registra como escape.Si no abandona la cámara en ninguno de los momentos expues-tos anteriormente, se considera que la respuesta es fallida. Coneste sistema se consiguen curvas de aprendizaje a lo largo deltiempo en las cuales la evitación, el escape y las respuestas falli-das del ratón pueden seguirse con detalle. Cuando se procede acomparar ambos grupos, se observan claras diferencias entreellos. La inhibición latente se pone de manifiesto en los ratonesque han sido expuestos previamente al estímulo, ya que mues-tran un retraso en la adquisición de la respuesta condicionada.

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Evaluación del aprendizaje y la memoriaMemoria no espacial

Prueba de reconocimientode objetos. Desde que En-naceur et al [37] introduje-ron la prueba de reconoci-miento de objetos, se haido incrementando su usocomo modelo de investiga-ción y poderosa herramien-ta experimental para valo-rar los efectos de los fár-macos sobre la memoria ylos mecanismos neurobio-lógicos relacionados con elaprendizaje y la memoria[38-45]. Esta prueba sefundamenta en la tendencianatural de los ratones a ex-plorar nuevos objetos yambientes y compararloscon otros que les son fami-liares. Al exponer al ratón auna serie de objetos se es-pera a que éste los explorey se mide el tiempo de exploración, que se define como el pe-ríodo durante el cual el animal olisquea o toca el objeto con laspatas delanteras a una distancia menor o igual a 1 cm. En cadaparte de la prueba se cambian los objetos y al inicio se estable-ce el intervalo de tiempo entre la exposición inicial y las si-guientes, con lo que se consigue una valoración de la memoria acorto y largo plazo. La prueba se realiza en un campo abiertoque situamos en una habitación homogéneamente iluminada ycon objetos que deben ser de similar textura, color y tamaño,pero de distinta forma (Fig. 3).

En una primera fase de habituación, se coloca el animal enel campo abierto sin ningún objeto y se deja transcurrir un tiem-po variable (10-30 minutos) para que se familiarice con el en-torno. A las 24 horas se realiza el entrenamiento, para lo cual secolocan dos objetos idénticos (objetos A) en distinta posición(posición 1 y posición 2) y se deja el animal en el interior de lacaja durante 5 o 10 minutos, en los que se contabiliza el tiempode exploración (T). En la siguiente fase se deja un objeto A (quellamaremos objeto familiar) y se coloca en la otra posición unobjeto nuevo (objeto B). La memoria a corto plazo se mide a lahora y a las tres horas del entrenamiento, anotando el tiempo deexploración de los objetos familiar (TA) y nuevo (TB). Transcu-rridas 24 horas desde el entrenamiento, se mide la memoria alargo plazo, para lo cual se cambia el objeto B por un objetonuevo (C) y se sigue el mismo procedimiento. El resultado es-perado es que los ratones sin deterioro cognitivo exploren másel objeto nuevo que el familiar. En cambio, para un ratón con al-guna alteración en la función cognitiva, el objeto familiar y elnuevo le parecerán igual de novedosos y no habrá diferencia en-tre los tiempos de exploración.

Prueba de reconocimiento social. El procedimiento del recono-cimiento social lo introdujeron Holloway y Thor [46] y poste-riormente fue desarrollado por Robert Dantzer et al [47] paraestudiar la regulación neuropeptidérgica sobre el comportamien-

to y la memoria en ratas y ratones. La prueba de reconocimien-to social se centra en el grado de familiaridad entre dos indivi-duos. Tal y como se describe en la figura 4, se lleva a cabo enuna jaula que tiene una ventana con una malla de alambre [48].Junto a la jaula donde se realiza la prueba se coloca otra circularque, a su vez, está dividida en dos cámaras, cada una de ellascon una ventana con una malla de alambre. La prueba comienzacon la habituación, situando al ratón en la jaula principal duran-te 10 minutos para que se familiarice con el entorno y dejandovacía la cámara circular. Posteriormente, en uno de los compar-timentos de la cámara circular se coloca un ratón que llamare-mos ‘familiar’, ya que estuvo en contacto previamente durantecinco minutos con el ratón experimental (se puede utilizar unratón de su misma jaula) y en el otro compartimento se colocaun ratón nuevo, que nunca ha sido expuesto al ratón experimen-tal. La caja circular se gira para enfrentar, por medio de las ven-tanas de acoplamiento, al ratón de la caja principal con cada unode los dos compartimentos en sesiones de cinco minutos. La ex-periencia se realiza cuatro veces. En las tres primeras el animalse enfrenta a un ratón familiar y durante el transcurso de estassesiones el ratón se acostumbra a esa exposición y varía su in-vestigación social (habituación). En la cuarta exposición se girala cámara y se muestra el ratón nuevo (deshabituación). En to-das las sesiones se mide el tiempo de exploración, definido co-mo el tiempo que el animal emplea en acercarse u olisquear laventana de acoplamiento. Los ratones con una función cogniti-va no deteriorada pasarán más tiempo olisqueando a los ratonesnuevos que a los familiares; los que tengan un déficit cognitivono distinguirán entre los ratones familiares y los nuevos (sutiempo de exploración será similar).

Memoria espacial

Laberinto acuático de Morris. Una de las pruebas más común-mente utilizadas por los investigadores para el estudio de lamemoria espacial es el laberinto de agua diseñado por Morris

Figura 3. Prueba de reconocimiento de objetos. El experimentador puede estudiar la memoria a corto y largo plazomodificando el intervalo de tiempo entre la primera exposición a dos objetos idénticos y las siguientes exposicio-nes, en las que se evalúa el grado de exploración del objeto familiar frente a otro nuevo.

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[49]. La prueba se desarrolla en unapiscina circular dividida en cuatro cua-drantes imaginarios (designados comonoroeste, suroeste, noreste y sureste)que dispone de una plataforma móvilde escape oculta y parcialmente su-mergida. En uno de los cuadrantes sesitúa la plataforma móvil, que debequedar a una altura de 0,5 cm por de-bajo del agua. Los puntos de escape selocalizarán en siete posiciones dife-rentes, a igual distancia, fijadas alea-toriamente a través de la prueba, y sedeben utilizar los mismos para todoslos animales. Alrededor de la piscinase colocan numerosas señales visualespara facilitar la orientación espacialdel animal. Las señales luminosas sonlas más utilizadas en este tipo de labe-rinto (Fig. 5).

En una primera fase de adquisi-ción se introduce al animal con el ho-cico apuntando hacia las paredes de lapiscina para que busque la plataformadurante 60 o 120 segundos. En casode no que no la encuentre, se le colocaentre 20 y 30 segundos sobre ésta. Seconsidera que un animal ha encontra-do la plataforma cuando permaneceen ella 5 o 10 segundos. Después seretira el animal de la plataforma y sele deja descansar cuatro minutos antesde iniciar el siguiente ensayo. Esteprocedimiento se repite con cada ani-mal hasta 12 entrenamientos consecu-tivos. La capacidad del animal para lo-calizar eficientemente la plataformadepende de la utilización de las clavesque rodean a la piscina (son necesa-rias al menos dos señales fuera del la-berinto para localizar la meta invisi-ble). Esta fase de adquisición o apren-dizaje puede durar varios días. Dosdías después de finalizar la fase anteri-or se lleva a cabo una última prueba deretención o ensayo de investigaciónsin plataforma durante 60 o 100 se-gundos. Si el animal ha aprendido,nadará más tiempo en el cuadrantemeta, es decir, donde previamente es-taba situada la plataforma. Las medi-das conductuales más utilizadas son lalatencia de escape en los ensayos deadquisición (tiempo que transcurrehasta que alcanza la plataforma) y elporcentaje de tiempo en el cuadrantemeta durante la prueba final. La ad-quisición se refleja en las menores la-tencias de escape a lo largo de los díasy el mayor porcentaje de tiempo en elcuadrante meta.

Figura 4. Prueba de reconocimiento social. La exposición repetida del animal a un individuo familiarprecede a una última confrontación con un individuo desconocido, momento en el que se evalúa elgrado de interacción respecto al que se produjo con anterioridad.

Figura 5. Laberinto acuático de Morris. En esta prueba se evalúa el tiempo de latencia que emplea elanimal en alcanzar la plataforma sumergida, que representa un estímulo reforzante de escape. Si laplataforma permanece en el mismo lugar, se evalúa la memoria espacial de referencia, y si varía, seanaliza la memoria espacial de trabajo.

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Laberinto de Barnes. Esta prueba permite estudiar el aprendi-zaje y la memoria espacial, la memoria de trabajo y de referen-cia, y la memoria a corto y largo plazo, así como otras tareasmás complejas en ratas y ratones. Fue diseñada por Barnes enla Universidad de Arizona [50] y consiste en un laberinto secodonde se utilizan luz y ruido como estímulos aversivos. El re-fuerzo que recibe el animal es escapar de estos estímulos. El la-berinto está constituido por un disco de plástico opaco elevadodel suelo mediante un trípode (Fig. 6). A lo largo del perímetrodel disco se distribuyen 20 agujeros de 5 cm de diámetro y de-bajo de uno de ellos se coloca un cajón de escape de plásticoopaco. Se pueden situar diversas pistas espaciales alrededor delcilindro, que permanecerán constantes durante todo el estudio,y también se pueden colocar debajo de algunos agujeros ca-jones falsos en los que parece posible introducirse, pero cuyoespacio disponible es en realidad tan pequeño que impide queel animal se pueda esconder. Un foco de luz (de unos 150 W) yun generador de ruido (sobre 80 dB) constituyen los estímulosaversivos.

El procedimiento comienza con un entrenamiento que con-siste en colocar el animal en la caja de escape y dejarlo allí du-rante un minuto, para continuar un minuto más tarde con las di-versas sesiones de exploración. Todas las sesiones empiezan co-locando el animal en el centro del laberinto en el interior de una‘cámara de inicio’, que consiste en un cilindro opaco de unos10 cm de alto. Al cabo de 10 segundos, se retira la cámara deinicio, se conectan la luz y el zumbido, y se deja que el animalexplore el laberinto. El estrés producido por estos estímulos in-ducirá al animal a buscar un espacio cerrado donde esconderse.La sesión termina cuando el animal encuentra el túnel de escapeo cuando transcurren cinco minutos, momento en el que se leintroduciría manualmente en dicho túnel. Cuando el animal en-tra en la cámara de escape, los estímulos aversivos cesan y se ledeja en la oscuridad un minuto antes de devolverlo a su jaula. Eltúnel de escape está situado siempre debajo del mismo agujero,que se elige de forma aleatoria para cada animal. La prueba serealiza durante varios días hasta que en siete u ocho pruebasconsecutivas se produzcan menos de tres errores. Se valoran elaprendizaje espacial y la memoria midiendo el tiempo que in-vierte el animal en encontrar el cajón refugio y el número deerrores que comete antes de encontrarlo. Se considerará unerror cada vez que intente introducirse en un agujero que no esel correcto. Los intentos sucesivos en un mismo agujero equivo-cado se consideran el mismo error.

Aprendizaje asociativo

Prueba de evitación pasiva. La prueba de evitación pasiva esuna prueba unidireccional que permite estudiar el aprendizajeadquirido y la memoria. El animal se condiciona con un estímu-lo aversivo y posteriormente se valora si recuerda esa experien-cia. Para llevar a cabo esta prueba se utiliza una caja con doscompartimentos, uno claro y otro oscuro, separados entre sí poruna puerta corredera. En el compartimento claro hay una luzpotente enfocando directamente al ratón, mientras que en el os-curo hay un circuito cerrado que producirá pequeñas descargaseléctricas. Se pretende que el ratón aprenda a evitar el compar-timento oscuro donde se le aplica la descarga [51].

La prueba comienza con un entrenamiento que consiste encolocar al ratón en el compartimento iluminado. A los 5 segun-dos se abre la puerta y se le permite dirigirse al compartimentooscuro (el ratón tenderá espontáneamente a desplazarse a los

espacios oscuros, pues la luz directa le produce ansiedad). En elmomento en que el ratón entre con las cuatro patas en la cáma-ra oscura se cerrará la puerta y recibirá una descarga eléctricade 0,1-0,4 mA durante 2 segundos. Treinta segundos despuésde la aplicación de la descarga, se devuelve al ratón a su jaulahasta el momento de la prueba, que consiste en volver a ponerel ratón en la cámara iluminada y levantar la puerta que separalas dos cámaras. Durante la prueba no se aplica al animal nin-guna descarga y se observa durante 5 minutos, registrando di-versos parámetros, entre los que se incluyen el tiempo de laten-cia hasta que entra en la cámara oscura (como indicador de me-moria), el número de veces que cruza de una cámara a otra, eltiempo total que pasa en cada una de las cámaras y la frecuen-cia con la que se asoma a la cámara oscura hasta que realmenteentra en ella. El ensayo se puede llevar a cabo a los 30 o 60 mi-nutos del entrenamiento, para evaluar la memoria a corto plazo,y a las 8 y 24 horas, para valorar la memoria a largo plazo. Esposible utilizar otras variantes experimentales en las pruebas deevitación pasiva, como las empleadas en la tarea de evitacióninhibitoria del descenso de la plataforma (step-down inhibitoryavoidance task).

Prueba de evitación activa. Las pruebas de evitación activa re-quieren varias sesiones de aprendizaje, a diferencia de las deevitación pasiva, en las que el ratón aprende en una sola sesión,pero nos permiten examinar funciones cognitivas complejas yvalorar la adquisición y consolidación de la memoria en un mis-mo animal durante el experimento [52]. La prueba de evitaciónactiva se puede clasificar en evitación activa de un sentido y evi-tación activa de dos sentidos. La diferencia radica en que en la

Figura 6. Laberinto de Barnes. El animal se sitúa primero en el centro delaparato en una cámara de inicio y a continuación se le deja que explorelos diversos orificios ante la exposición a estímulos aversivos, como lu-ces y sonidos. Se evalúa el tiempo que emplea en encontrar la salida queconduce al cajón refugio.

Aversión:luces 150 W

Cajónrefugio

Falsocajón

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prueba de evitación activa de un sentido el ratón siempre recibeel shock eléctrico en la misma cámara/localización (es unidirec-cional) [53], mientras que en la de dos sentidos el animal apren-de, a través de diferentes pistas, a predecir la descarga eléctrica,independientemente de la cámara de ensayo (contexto) dondese produzca (es bidireccional) [54].

La prueba de evitación activa de un sentido se realiza en unacaja con dos compartimentos comunicados entre sí por una puer-ta e iluminada con luz natural. En un compartimento se colocauna bombilla y, cuando ésta se enciende, se emite un sonido du-rante 10 segundos y se abre simultáneamente la puerta para queel ratón pueda cambiar de compartimento. Al cesar el estímuloluminoso y sonoro el ratón recibirá una descarga de 0,1 mA du-rante 20 segundos si no ha cambiado de compartimento, hastaque escape a la cámara adyacente. Esta prueba, repetida hasta 20veces al día y con intervalos de 20 segundos, constituye el pe-ríodo de entrenamiento. En cada ensayo se registra el tiempo delatencia hasta que se produce la respuesta de evitación (escapara la otra cámara). Se considera como fallo si esta respuesta nose produce. Este entrenamiento diario se repite hasta que el ra-tón alcanza un criterio que refleja aprendizaje. Las curvas deaprendizaje a lo largo del tiempo revelan adquisición y consoli-dación de la evitación.

En la prueba de evitación activa de dos sentidos, el ratónpuede recibir la descarga eléctrica en cualquiera de las dos cá-maras, dependiendo de su localización actual. El animal deberesolver un conflicto, ya que la cámara donde recibió la des-carga en el ensayo previo se convierte en cámara segura du-rante la siguiente prueba. Por lo tanto, tiene que aprender a in-hibir su tendencia a evitar el compartimento donde acaba derecibir una descarga y utilizar el estímulo condicionado parapredecir y evitar una nueva descarga [54]. Esta prueba se rea-liza en una caja con dos compartimentos iluminados con unabombilla cada uno. Se introduce el ratón en uno de los doscompartimentos y se le permite explorarlo durante cinco mi-nutos. A continuación se conecta el sistema de sonido y luzque constituye el estímulo condicionado. Si el animal no cru-za a la cámara adyacente tras 8-10 segundos, se le aplica unshock eléctrico. La luz, el sonido y el shock eléctrico cesan siel animal cruza a la otra cámara o si transcurren 10 segundosdesde la aplicación del shock eléctrico. Las respuestas se co-difican como evitación (el ratón pasa a la cámara adyacentetras el estímulo condicionado pero antes del shock eléctrico),escape (el animal cruza a la otra cámara durante el shock eléc-trico) o fallo (el ratón no pasa a la cámara adyacente durantelos siguientes 10 segundos tras el shock eléctrico). El períodode aprendizaje consiste en realizar esta prueba al mismo ratón70 veces durante 70 minutos con intervalos de 30-90 segun-dos. El análisis de las curvas de aprendizaje nos revela infor-mación acerca de la adquisición o pérdida de cada respuesta(memoria a corto plazo). La repetición de la prueba a las 24horas del primer ensayo nos permite valorar la memoria a largoplazo.

Memoria emocional

Condicionamiento aversivo al sabor. El modelo de condiciona-miento aversivo al sabor fue descubierto en 1955 por García etal [55]. Para desarrollar el condicionamiento aversivo al sabor,el animal debe poder reconocer el estímulo condicionado y lle-gar a enfermar con la exposición al estímulo no condicionado.Es importante que se desarrolle esta asociación entre el estímu-

lo condicionado y el no condicionado para que finalmente,cuando se presente el estímulo condicionado sólo, el animal loevite. La prueba consiste en una primera fase de habituación enla que se deja al animal durante 24 horas sin comida, restricciónque asegura la ingestión posterior de una cantidad adecuadaque, a su vez, favorecerá la asociación entre el estímulo condi-cionado y el no condicionado. Pasadas esas 24 horas, se trasla-da a cada ratón a la jaula de prueba, en el centro de la cual se co-loca un pequeño comedero. Su base puede estar aromatizadacon un 1% de vainilla o extracto de almendra y endulzada con0,25 M de solución de sacarina. A los ratones se les asigna alea-toriamente uno de estos dos aromas. El cuenco de la comida de-be pesarse antes y después de la fase de condicionamiento (30-60 minutos) para asegurar que el animal ha ingerido una canti-dad suficiente. Tras la exposición al estímulo condicionado, sele inyectan a cada ratón 0,15 M de cloruro de litio o agua estérily se le devuelve a su jaula, donde se mantiene 24 horas más conrestricción de comida hasta someterlo a la prueba de retención.Dicha prueba consiste en colocar dos dispositivos de comida,uno con el aroma a vainilla y el otro con extracto de almendrapara la libre elección del animal. Se espera que los ratones con-dicionados a la vainilla prefieran la almendra y los condiciona-dos a la almendra prefieran la vainilla.

Sobresalto potenciado por el miedo. Se trata de una prueba pa-vloviana de miedo condicionado en la que una respuesta de te-mor ante un estímulo acústico puede aumentarse cuando éstese presenta junto con otro estímulo aversivo que genera res-puestas de miedo [56,57]. El ensayo se suele llevar a cabo du-rante cuatro días, comenzando con cinco minutos diarios deaclimatación en la jaula donde se realizará el experimento. Elprimer día, se miden las respuestas de miedo a través de un ran-go de intensos estímulos acústicos que se aplican durante 40 msa diferentes intensidades (100, 105 y 110 dB). Es importanteevaluar al ratón un número limitado de veces para evitar queuna presentación frecuente pueda causar habituación a estosestímulos. El segundo día se aplican esos mismos estímulos,pero en la mitad de los ensayos el estímulo acústico de sobre-salto se presenta inmediatamente seguido de un tono de 12 kHzy 70 dB durante 30 segundos (estímulo condicionado), y en laotra mitad sólo se suministra el estímulo acústico del primerdía. Para calcular la magnitud de la respuesta al estímulo con-dicionado, la respuesta al estímulo acústico cuando se presentaaisladamente se resta de la respuesta al estímulo acústico cuan-do se presenta con el estímulo condicionado, se divide el valorresultante por el número de respuestas al estímulo acústicocuando se ha presentado solo y finalmente se multiplica por100. Los valores positivos indican que el tono aumenta la res-puesta de sobresalto inicial; en cambio, los valores negativossugieren una reducción en la respuesta cuando se presenta elestímulo condicionado. El tercer día se aplica el tono (estímulocondicionado) seguido de un shock eléctrico (estímulo no con-dicionado) y la asociación entre ambos estímulos se repite diezveces, con un intervalo entre pruebas de 90 a 180 segundos.Transcurridas 24 horas, los animales se evalúan del sobresaltopotenciado por el miedo bajo las mismas condiciones utiliza-das el segundo día, midiendo la potenciación del sobresalto conla misma fórmula utilizada en el precondicionamiento. En losanimales que hayan adquirido el sobresalto potenciado por elmiedo, el porcentaje de potenciación debería ser más alto trasel condicionamiento.

F. NAVARRETE, ET AL

REV NEUROL 2008; 47 (3): 137-145144

CONCLUSIONES

Los modelos animales de trastornos cognitivos desempeñan unpapel clave en la comprensión de las bases neuroquímicas de lafunción/disfunción cognitiva. Con su utilización podemos pro-fundizar en las bases fisiopatológicas del deterioro que se pro-duce por el simple hecho de envejecer o el que aparece asocia-do a diferentes situaciones patológicas, como la enfermedad de

Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, las demencias vascu-lares, la angiopatía amiloide cerebral, las enfermedades prióni-cas, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Hun-tington, la esquizofrenia y otras enfermedades neurodegenera-tivas. Además, los modelos animales nos permiten comprobarla eficacia de nuevos fármacos e identificar posibles dianas te-rapéuticas.

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METHODS TO EVALUATE COGNITIVE DISORDERS IN ANIMAL MODELSSummary. Introduction. The increasing prevalence of cognitive dysfunction and dementia associated, among others, topopulation aging in developed countries has grown a great interest in the study of the etiopathogenesis of cognitive deficit andthe likely pharmacological targets which improve intellectual function or alter the neurodegeneration underlying thesesymptoms. Development and conclusions. An essential tool for that purpose is the use of animal models of human-relatedpathologies which clinically develop with cognitive impairment and dementia. In this review we will analyse the animalmodels of these disorders and, specially, the main tests that, by means of the observational evolution of the experimentalanimal, allow assessing its cognitive functions and its modification by experimental treatments that are wanted to investigatefor its eventual introduction into clinics. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45]Key words. Animal models. Attention. Behaviour. Cognitive impairment. Dementia. Memory.