TESIS DOCTORALBACTERIAS PROBIÓTICAS DE LECHE MATERNA EN NUTRICIÓN INFANTIL: UN

PASO MÁS EN LA EVOLUCIÓN DE LAS FÓRMULAS INFANTILES. VALIDACIÓN

DE L. salivarius CECT5713 Y L. fermentum CECT5716.

Lluis Sempere BordesGranada, 2011

Universidad de Granada Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Lluis Sempere BordesD.L.: GR 4526-2011ISBN: 978-84-694-5752-8

BACTERIAS PROBIÓTICAS DE LECHE MATERNA EN NUTRICIÓN INFANTIL: UN PASO MÁS EN LA EVOLUCIÓN DE LAS FÓRMULAS INFANTILES. VALIDACIÓN

DE L. salivarius CECT5713 Y L. fermentum CECT5716.

Memoria que presenta el biólogo Lluis Sempere Bordes, para aspirar al grado de Doctor en Biología por la Universidad de Granada.

Ldo. Lluis Sempere Bordes

Los directores de esta Tesis Doctoral, Dra. Mónica Olivares Martín, Doctora en Farmacia por la Universidad de Granada, del departamento de Biomedicina de Biosearch life, S.A. (Granada) y del Dr. Federico Lara-Villoslada, Doctor en Farmacia por la Universidad de Granada, del de-partamento de Seguridad alimentaria de Puleva Food S.A. (Granada).

CERTIFICAN que los trabajos que se exponen en esta memoria de Tesis Doctoral: “Bacterias probióticas de leche materna en nutrición infantil: un paso más en la evolución de las fór-mulas infantiles. Validación de L. salivarius CECT5713 y L. fermentum CECT5716” han sido realizados en el departamento de Biomedicina del Biosearch life S.A., bajo la tutela de la Dra. Olga Martínez Agustín, del departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Farmacia de Granada, correspondiendo fielmente a los resultados obtenidos. La presente memoria ha sido revisada por nosotros, encontrándola conforme para ser presentada y aspi-rar al Grado de Doctor en Biología por el tribunal que en su día se designe.

Dra. Mónica Olivares Martín Dr. Federico Lara-Villoslada

En el trascurso de la Tesis varias veces he pensado en el momento en el que escri-

biría estas líneas, las cuales expresan mi más sincero agradecimiento a las personas que me

han ayudado en la realización de esta memoria. Ver la luz al final del túnel produce una gran

satisfacción tras tanto trabajo, muchas veces con los “guantes puestos” y otras leyendo,

analizando datos y escribiendo.

Quiero agradecer a mis directores de Tesis la enorme ayuda que me han prestado

en todo momento, por su orientación y ánimos, sin ellos todo esto habría sido imposible.

A la Dra. Mónica Olivares por ofrecerme la oportunidad de trabajar con ella. Llevo 4 años

y medio en este laboratorio y me has enseñado muchísimas cosas, guiándome por este

complejo mundo de la investigación y animándome en todo momento, transmitiéndome

una enorme ilusión por la investigación y ayudarme a formarme como científico. Ha sido

un placer y te lo agradezco muchísimo. Al Dr. Federico Lara por su enorme ayuda en la real-

ización de esta Tesis, además de sus consejos y enseñanzas dentro del laboratorio cuando

trabajábamos juntos.

A los componentes de mi laboratorio. Gracias a todos por ayudarme, darme ánimos

y hacer que exista un clima de trabajo sencillamente espectacular! A Belén, mi compañera

de fatigas en esto de hacer una Tesis. Me has ayudado mucho a afrontar el día a día apoyán-

dome en todo momento. Muy pronto terminarás la tuya, ánimo!! A Antonio por su enorme

esfuerzo y dedicación, las miles de horas trabajando juntos, recuerda, ¡¡plaquea y no mires

atrás!!.jejeje. A Óscar por enseñarme muchísimas cosas, a formarme como científico y a

iniciarme en el mundo de la Biología Molecular. Y que decir de Robe, siempre dándome

ánimos, igual que Ana que aunque hayas llegado hace poco me has ayudado a tomarme las

cosas con más humor. Y a ti José, por tu trabajo y ayuda, es el momento de que recojas el

testigo, tu eres el siguiente predoctoral en el fascinante mundo de los probióticos!!

A compañeros de trabajo de otros departamentos, como lo son Mary, Yanis, Alberto

y Rachel del departamento de Probióticos , a Carlos de Nutrición y a otros que no están por

aquí, como David, Pablo y Marian. A todos gracias por vuestro, apoyo, cariño y ánimos. A

Paz por estar siempre ahí cuando la he necesitado, aconsejándome y siendo mi gran confi-

dente en ocasiones delicadas además de sus consejos y ayuda en el laboratorio.

Al Dr. Jordi Xaus por confiar en mí en mis primeros meses en este laboratorio. A la

Dra. Saleta Sierra, por ayudarme a dar mis primeros pasos en el mundo de la investigación.

A la Dra. Olga Martínez Agustín por ser mi tutora en la realización del DEA. A los

grupos de investigación del Dr Juan Miguel Rodríguez y del Dr. Julio Gálvez, por permitirme

trabajar con ellos.

A Ana, mi chiquilla, que tanto me ha ayudado día tras día, escuchándome, aconse-

jándome y dándome mucho cariño. Muchas gracias!!

Por otro lado quiero darle las gracias a mis amigos que me han dado cariño y ayu-

dado a que todo sea más llevadero. A Sergio, Ana, Aza, Chicha, a Tete y a muchos más.

Por último agradecer a mi familia su apoyo incondicional. A mis padres, mi herma-

no, mi yaya, a mi tata Isabel, mis primas Lara y Laia y al resto de familiares. Muchas gracias

a todos.

A mis padres, a Pol y a Ana

Índice

Índice

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ABREVIATURAS

INTRODUCCIÓN

1. La alimentación del lactante

1.1. La lactancia natural.

1.1.1 Componentes de la leche materna: fracción proteica

1.1.2. Nucleótidos

1.1.3. Composición en hidratos de carbono

1.1.4. Composición lipídica

1.1.5. Minerales

1.1.6. Vitaminas

1.1.7. Poliaminas

1.1.8. Componentes inmunológicos de la leche materna

1.1.9. Microbiota de la leche humana

1.2. Lactancia artificial

2. La microbiota del tracto gastrointestinal

2.1. Composición y distribución

2.2. Funciones de la microbiota intestinal humana

2.2.1. Función metabólica

2.2.2..Función protectora frente a infecciones

2.2.3..Función inmunológica y efectos sobre la maduración del

sistema inmune

2.2.4. Interacción de las bacterias comensales con el

sistema inmune.

3. Origen de la microbiota

3.1. Adquisición de la microbiota intestinal humana

3.2. La leche materna como fuente de bacterias comensales.

3.3. Mecanismos de transferencia bacteriana madre-hijo

4. Enfermedades relacionadas con alteraciones de la microbiota

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5. Probióticos

5.1. Definición

5.2. Seguridad del uso de bacterias probióticas en nutrición humana.

5.2.1. Origen

5.2.2. Identificación de cepas

5.2.3. Resistencia a antibióticos

5.2.4. Identificación de las cepas seleccionadas

5.3. Funcionalidad

5.3.1. Resistencia durante el tránsito por el aparato digestivo

5.3.2. Adhesión y colonización intestinal

5.3.3 Propiedades beneficiosas

5.3.3.1. Propiedades antimicrobianas

5.3.3.2. Inmunomodulación

5.4. Aplicaciones de los probióticos. Probióticos y salud

5.4.1. Intolerancia a la lactosa

5.4.2. Infecciones gastrointestinales

5.4.3. Prevención y tratamiento de reacciones alérgicas

5.4.4. Infecciones respiratorias en adultos y en niños

5.4.5. Prevención de caries

5.4.6. Tratamiento y prevención de la enfermedad

inflamatoria intestinal y otras enfermedades intestinales.

5.4.7. Tratamiento en infecciones por Helicobacter pylori

5.4.8. Aplicaciones médicas de los probióticos en el futuro.

6. Probióticos en la alimentación infantil

6.1. Infecciones gastrointestinales

6.2. Infecciones respiratorias

6.3. Desórdenes intestinales menores

6.4. Alergias

6.5. Diarrea asociada al consumo de antibióticos

6.6. Enterocolitis necrotizante

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7. Caracterización del carácter probiótico de las cepas aisladas de leche materna

Lactobacillus salivarius CECT 5713 y Lactobacillus fermentum CECT 5716.

7.1. Estudios de tolerancia y seguridad

7.1.1. Características genéticas

7.1.2. Ausencia de actividades potencialmente perjudiciales

7.1.3 Estudios de tolerancia y seguridad en animales

de experimentación.

7.1.4 Tolerancia en humanos

7.2 Colonización

7.3. Efectos a nivel gastro-intestinal

7.3.1. Potencial antimicrobiano

7.4. Efectos inmunomoduladores

7.4.1. Inmunomodulación en animales

7.4.2. Evidencias en humanos

7.5. Efecto de L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713

sobre la mastitis.

OBJETIVOS

RESULTADOS

1. Tolerancia del consumo de Lactobacillus salivarius CECT5713 en

adultos sanos y efectos sobre la función intestinal y respuesta inmune.

2. Seguridad, tolerancia y efectos beneficiosos del consumo de una

fórmula de continuación suplementada con la cepa probiótica aislada de leche

materna Lactobacillus salivarius CECT 5713 en niños de 6 meses.

3. Seguridad, tolerancia y efectos beneficiosos del consumo de una

fórmula de continuación suplementada con la cepa probiótica aislada de leche

materna Lactobacillus fermentum CECT 5716 en niños de 6 meses.

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DISCUSIÓN

1 Administración de Lactobacillus salivarius CECT 5713 en adultos

sanos. Efectos en el sistema inmune y en el sistema gastrointestinal.

2 Bacterias probióticas de leche materna en nutrición infantil.

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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Abreviaturas

Abreviaturas

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AGCC: Ácidos grasos de cadena corta

CECT: Colección española de cultivos tipo

EFSA: European Food Safety Authority (Agencia española de seguridad alimentaria)

EII: Enfermedad Inflamatoria Intestinal

ESPGHAN: European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (So-

ciedad Europea de Gastroenterología Pediátrica, Hepatología y Nutrición)

FAO: Food and Agriculture Organization (Organización de las Naciones Unidas para la agri-

cultura y la alimentación)

FIAF: Fasting induced adipose factor

GALT: Gut-Associated Lymphoid Tissue (Tejido linfoide asociado a la mucosa)

GUM: tracto genial utrinario

IEL: Linfocitos intraepiteliales

LPS: Lipopolisacárido

MLN: Nódulo linfático mesentérico

NASPGHAN: North American Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nu-

trition (Sociedad norteamericana de pediatría, gastroenterología pediátrica, hepatología y

nutrición)

NK: Natural killer

OMS: Organización Mundial de la Salud

PP: Placas de Peyer

QPS: Qualified Presumption of Safety

RM: Mucosa del tracto respiratorio

SLGM: Mucosa de las glándulas salivales y lacrimales

Abreviaturas

xii

TGI: Tubo gastrointestinal

TLR: Toll like receptor

TNBS: Ácido trinitro-benceno sulfónico

TNO: Nederlandse Organisatie voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk onderzoek (Neth-

erlands Organization for Applied Scientific Research) Leide (Holanda)

ufc: unidad formadora de colonias

Introducción

Introducción

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1. La alimentación del lactante

1.1 Lactancia natural

La leche materna es una fuente completa y variada de alimento que aporta los nu-

trientes fundamentales para el desarrollo del recién nacido. Posee una alta especificidad y

una riqueza de componentes que la convierte en uno de los fluidos más complejos del ser

humano. Su composición está adaptada, al igual que en cada especie, a las necesidades

nutricionales del recién nacido. La leche materna proporciona una amplia gama de compo-

nentes, no sólo relacionados con los requerimientos del crecimiento (proteínas, grasas, hi-

dratos de carbono, minerales y vitaminas) sino que también proporciona un grupo de com-

ponentes con actividades bioquímicas y fisiológicas esenciales para el correcto desarrollo y

crecimiento de numerosos órganos y tejidos del recién nacido así como numerosos factores

de defensa contra antígenos y agentes patógenos. Así, la leche humana contiene hormo-

nas y factores de crecimiento, enzimas, proteínas (lactoferrina, lactoperoxidasa, lisozima,

inmunoglobulinas...) y péptidos bioactivos, poliaminas, oligosacáridos, probióticos, ácidos

grasos poliinsaturados de cadena larga, gangliósidos y un largo etcétera.

1.1.1 Componentes de la leche materna: fracción proteica

Las caseínas y las proteínas del suero

Las proteínas mayoritarias de la leche humana se dividen en caseínas y proteínas del

lactosuero (ver tabla 1.1). El contenido total de proteínas de la leche humana es el más bajo

de todos los mamíferos (0,8-1,2% frente a 3,3% de las leches de vaca y de cabra), debido al

crecimiento relativamente lento del niño. La relación entre caseínas y proteínas del lacto-

suero difiere de unas madres a otras, pero en general se acepta que es de 40/60, frente a

80/20 en las leches de vaca y cabra. Esta menor proporción de caseínas facilita la digestión

y reduce el tiempo de vaciado gástrico, probablemente debido a la mayor digestibilidad de

las proteínas séricas (Akrê J, 1994; Riordan J, 1998). Además hay estudios que indican que

la mayor proporción de proteínas del lactosuero podría inducir una mayor colonización in-

testinal por bacterias con carácter probiótico (lactobacilos y bifidobacterias) (Balmer y col.

1989).

Trabajos más recientes han permitido visualizar un mapa comprensivo de la pro-

teómica del lactosuero de leche bovina, es decir, de las proteínas y fracciones proteicas que

Introducción

4

lo conforman pudiendo ser de gran utilidad para la elaboración de fracciones específicas

que contengan bioactividades de interés (Fong y col 2008).

Tabla 1.1. La fracción proteica de la leche materna (Adaptado de Donovan y col. 2006)

Lactoferrina

Dentro de las proteínas del suero se encuentra la lactoferrina. Esta proteína es uno

de los componentes más importantes de la leche materna debido a las funciones biológicas

que se le atribuyen. Posee la capacidad de unirse a dos átomos de hierro y es capaz de re-

sistir la acción de enzimas proteolíticas, sobre todo en su forma saturada de hierro. Prueba

de ello es que se encuentra en las deposiciones del lactante alimentado con leche materna

(Brines y col. 1983). Además se ha encontrado en la orina de los lactantes, evidenciando

que no sólo es capaz de resistir la digestión, sino que también puede ser absorbida y ex-

cretada intacta (Hutchens y col. 1991).

Por el hecho de que una gran parte del hierro presente en la leche va unido a

la lactoferrina, se ha postulado que probablemente esta proteína sea la responsable

de los óptimos niveles de hierro encontrados en los niños alimentados con leche ma-

terna, más que en aquellos niños que son alimentados con fórmulas infantiles aún cu-

ando el preparado tiene una mayor concentración en hierro (0,7mg/L en las fórmulas

respecto a los 0,2-0,4mg/L encontrados en leche materna) (Fransson y col. 1980). Por

Mujer Vaca

Caseínas 2,0-2,5 26,5

Caseína α - 13,5

Caseína β 1,5 9

Caseína γ 0,5 4

Proteínas del suero 6,3 6,5

Lactoglobulina β 3,2

Lactoglobulina α 1,9 1,2

Inmunoglobulinas 1,3 0,9

Albúmina sérica 0,4 0,4

Lactoferrina 1,7 0,1

Lactoperoxidasa - 0,03

Lisozima 0,4 0,0004

Otras 0,6 0,7

Concentración (g/L)

Introducción

5

ello esta proteína está siendo incluida en algunas fórmulas infantiles.

Por otro lado la lactoferrina ayuda a proteger a los niños frente a infecciones gracias

a sus características antifúngicas, antivirales y antimicrobianas. Los mecanismos a través

de los cuales ejerce esta actividad son muy variados y todavía no están del todo claros.

Uno de los mecanismos propuestos se basa en su alta afinidad por el hierro que actuaría

secuestrándolo impidiendo su utilización por las bacterias y por tanto inhibiendo su multi-

plicación y dificultando la expresión de factores de virulencia (Orsi y col. 2004; Reyes-Reyes

y col. 2005). También se ha descrito que la lactoferrina es capaz de cambiar propiedades

de las membranas llevando a una pérdida de la integridad de la misma (Naidu y col.1997).

Además de lo anteriormente dicho, la lactoferrina impide la agregación y formación de

biofilms por patógenos oportunistas como Pseudomonas aeruginosa y del Streptococcus

mutants, causantes de fibrosis quística y de caries dental (Berlutti y col. 2004; Rogan y col.

2004).

En cuanto a las propiedades antivirales que posee la lactoferrina es posible que

esté relacionada con la inhibición del proceso de absorción de la partícula viral por parte

de la célula. Existen estudios in vitro que demuestran esta inhibición para virus tales como

el herpes simples o el causante de la Hepatitis C (Jenssen 2005; Marchetti y col. 1998; Yi y

col. 1997).

Además existen diversos estudios que han demostrado que la lactoferrina prom-

ueve el crecimiento de bacterias probióticas como los lactobacilos y bifidobacterias. El me-

canismo parece estar relacionado con la presencia de proteínas de unión a la lactoferrina

en la membrana celular de estas especies, pudiendo de esta forma anclar la proteína a la

superficie celular y beneficiarse del hierro que posea la lactoferrina (Kim y col. 2004). Por

tanto su efecto anti-infeccioso junto con su capacidad para promover el crecimiento de

especies beneficiosas podría estar jugando un papel importante en la instauración de una

microbiota favorable en el niño.

Debido a estas capacidades se considera que la lactoferrina es uno de los factores

de la leche materna que contribuyen a la protección frente a infecciones en los niños ama-

mantados (Lonnerdal 1997).

Introducción

6

Aminoácidos y péptidos con actividad biológica.

La fracción proteica, al igual que el resto de los componentes de la leche, está tam-

bién adaptada a las necesidades del niño. De esta forma la leche materna se caracteriza por

poseer unas concentraciones bajas de fenilalanina y tirosina, que en altas concentraciones

podrían ser perjudiciales para el organismo ya que son difícilmente metabolizables. Por el

contrario posee taurina, que está ausente en las leches de vaca y cabra y que es vital para

el desarrollo de la retina y para la estabilidad de las membranas celulares.

Por otro lado, como resultado de la digestión de las proteínas de la leche se produ-

cen aminoácidos libres y péptidos que poseen propiedades biológicas que regulan procesos

fisiológicos muy importantes. Estos péptidos bioactivos pueden atravesar el epitelio intes-

tinal, llegando de esta forma a la circulación sistémica donde pueden transportarse hacia

distintos órganos y tejidos periféricos donde ejercen su función.

A nivel del sistema digestivo se han descrito propiedades moduladoras de ciertos

péptidos como las α y las β casomorfinas, sobre la motilidad, permeabilidad intestinal y lib-

eración de hormonas intestinales. Al reducir la motilidad intestinal su uso en el tratamiento

de diarreas puede ser clave a la hora de combatir esta patología (Baró y col. 2001).

Entre los péptidos resultantes de la digestión existen algunos que poseen propie-

dades inmunomoduladoras (encefalina), estimulando la proliferación de células T y otras

células fagocíticas importantes en la defensa frente a infecciones (Baró y col. 2001; Kayser

y col. 1996; Lebalnc y col. 2002). También existen péptidos con actividad antimicrobiana

como la isracina (Baró y col 2001).

Otra característica de estos péptidos con actividad biológica viene relacionada con

su efecto sobre el sistema cardiovascular, produciendo una serie de efectos antihipertensi-

vos, como es el caso de la casokinina (Schlimme y col. 1995) o de la β-lactosina B (Muraka-

mi y col. 2004), o efectos de acción antitrombótica como las casopletinas (Fiat y col. 1993;

Jolles y col. 1986) o péptidos derivados del CMP (caseinomacropéptido) (Thomä-Worringer

y col. 2006).

1.1.2 Nucleótidos

Los nucleótidos desempeñan un papel clave en numerosos procesos bioquímicos y

Introducción

7

fisiológicos, tales como la transferencia de energía, son precursores de la síntesis de ácidos

nucleicos (ADN y ARN) y son claves en numerosas rutas biosintéticas y procesos metabóli-

cos. Los nucleótidos son sintetizados de forma endógena, por lo que no es necesario un

aporte de éstos en la dieta, sin embargo, en la época de lactancia y crecimiento esta sínte-

sis es insuficiente para cubrir la gran demanda existente por parte del organismo, por lo que

se necesita un aporte en la dieta. Por ello se les ha conferido el carácter de semiesenciales.

Las funciones biológicas atribuidas a los nucleótidos se pueden clasificar en los

siguientes apartados (ver figura 1).

Figura 1.1 Funciones biológicas de los nucleótidos

Modulación de la respuesta inmune

La adición de nucleótidos a la dieta en lactantes hace que se produzca un aumento

en la actividad de las Natural Killer (NK) y una mayor producción de IL-2 (Carver 1996).

Además otros estudios con fórmulas infantiles en los que se han adicionado nucleótidos de-

muestran que existe una mayor respuesta del recién nacido frente a vacunas de la difteria

y de H. Influenzae tipo b (Pickering y col. 1998) así como también una mayor concentración

Funciones biológicas

de los nucleótidos

Función hepática

Metabolismo hepático

Función en el tracto

intestinal

Modulación de la respuesta

inmune

Introducción

8

de IgA e IgM séricas en recién nacidos (Martinez-Augustin y col. 1997). Por otra parte se ha

correlacionado la adición de nucleótidos a fórmulas infantiles con una menor incidencia de

diarreas (Brunser y col. 1994).

Papel de los nucleótidos en el tracto gastrointestinal

El epitelio intestinal está en continua renovación, de tal forma que puede quedar to-

talmente renovado en un plazo de 3-6 días. Para esta renovación es necesaria la presencia y

actuación de los nucleótidos, tanto los endógenos como los que se aportan con la dieta. De

hecho experimentos in vivo con ratas destetadas que recibieron una dieta con un aporte

de nucleótidos presentaron una mayor altura de las criptas al igual que un aumento en la

actividad de la disacaridasa, junto con valores más elevados de contenido en ADN a nivel

de la mucosa (Uauy y col. 1990).

Papel de los nucleótidos en el funcionamiento hepático

Si bien el hígado tiene un papel principal en la síntesis endógena de nucleótidos

para el organismo, se ha observado que los nucleótidos exógenos son capaces de modular

el crecimiento hepático y su regeneración. Este hecho ha llevado a los investigadores a re-

alizar numerosos trabajos en modelos de experimentación animal con lesiones hepáticas

inducidas experimentalmente. A partir de ellos, se ha demostrado que la administración de

nucleótidos mejora la función hepática y la recuperación de estas lesiones. En definitiva,

estos estudios sugieren que la administración exógena de nucleótidos es susceptible de

modificar la composición, las funciones y la capacidad de regeneración del hígado, siendo

esta adición particularmente importante cuando, por la existencia de lesión o enfermedad

hepática, la capacidad del hígado para suministrar nucleótidos preformados estuviera dis-

minuida (Carver 1996).

Metabolismo lipídico

Los nucleótidos de la dieta favorecen la desaturación y la elongación de los ácidos

grasos esenciales, pudiendo de esta forma contrarrestar el efecto inhibitorio en situaciones

de exceso de substrato (ácido linoleico) en la dieta (Martínez-Valverde y col. 1996).

Diversos estudios demuestran el efecto de los nucleótidos de la dieta en el perfil de

ácidos grasos tanto en modelos animales (Boza y col. 1992; Jimenez y col. 1992) como en

Introducción

9

recién nacidos (Gil y col. 1986), viéndose un incremento de las concentraciones plasmáticas

y eritrocitarias de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Esos trabajos sugieren

que los nucleótidos exógenos favorecerían la elongación a 20 átomos de carbono de los

ácidos grasos esenciales. Otro mecanismo de actuación podría estar relacionado con la

inhibición de la actividad de las desaturasas por altos niveles de 18:2n-6 (ácido linoleico) en

la dieta (Martínez Valverde y col. 1996).

1.1.3 Composición en hidratos de carbono

La composición glucídica de la leche es elevada comparada con la leche de otros

animales como la vaca. Su componente mayoritario es la lactosa (55-70 g/L), un disacárido

con un componente energético muy alto que se hidroliza dando lugar a dos monosacáridos,

la glucosa y la galactosa. Este último monosacárido es crucial para el desarrollo cerebral

del recién nacido. De hecho, la mayor concentración de lactosa en la leche humana en

comparación con la leche de otros mamíferos, podría estar relacionada con el mayor desar-

rollo cerebral del hombre (Riordan 1998). Además la lactosa facilita la absorción de calcio y

favorece el crecimiento de una flora fecal protectora frente a bacterias patógenas.

Además de la lactosa, la fracción glucídica presente en la leche está compuesta tam-

bién de oligosacáridos, glucolípidos y glucoproteinas .

Los oligosacáridos de leche humana han sido objeto de numerosas investigaciones.

En los últimos años se ha empezado a descifrar su complejidad en la leche humana iden-

tificándose más de 200 especies moleculares distintas (Ninonuevo y col. 2006). Los más

abundantes (más de 1 g/L) son los que contienen una o más moléculas de ácido siálico. Esta

complejidad y variabilidad de oligosacáridos no se encuentra en la leche de otras especies

(Bode 2006; Newburg y col 1995). Los valores existentes en la leche humana se encuentan

en los 5-8 g/L.

La capacidad que poseen los oligosacáridos de resistir los procesos de hidrólisis enz-

imática que se dan en la digestión (Engfer y col. 2000) les confieren una serie de propie-

dades como su capacidad para ser prebióticos, lo cual conlleva una mejora e incremento en

la colonización por parte de las poblaciones de bacterias comensales y toda una regulación

de las poblaciones bacterianas que habitan en el tracto gastrointestinal. Además existe un

alto interés por el posible papel de los oligosacáridos como receptores de patógenos. Al

Introducción

10

ser sintetizados por las mismas glicotransferasas que participan en la síntesis de glucolípi-

dos y glucoproteínas de las células intestinales, los oligosacáridos presentan una similitud

estructural con los carbohidratos de la superficie de las células intestinales. Así estos com-

puestos podrían actuar como receptores de microorganismos patógenos, constituyendo

un mecanismo de defensa adicional para el recién nacido (ver tabla 1.2) (Kunz y col. 2000).

Tabla 1.2. Oligosacáridos de la leche humana como receptores de microorganismos.

Adaptado de Kunz y col. 1993.

1.1.4 Composición lipídica

Dentro de la composición de la leche, la fracción lipídica es la que posee una mayor

variabilidad ya que depende en gran medida de los hábitos dietéticos de la madre (Smit y

col. 2002). La grasa es una de las principales fuentes de energía para el recién nacido cu-

briendo entre el 30 y el 50 % de sus necesidades. Además existe un aporte de colesterol por

parte de la madre, esencial para el desarrollo cerebral del recién nacido (Akre y col. 1994).

En cuanto a su perfil de ácidos grasos, nos encontramos con que la leche materna

aporta ácidos grasos de cadena larga, como el ácido araquidónico (AA 0,44g/100g de grasa)

y el ácido docosahexanoico (DHA 0,30g/100g de grasa).

Tanto el DHA como el AA no se consideran ácidos grasos esenciales, ya que pueden

Receptores Microorganismo

glicoproteínas contendiendo manosa Escherichia coli ( fimbria tipo 1)

oligosacáridos fucosilados E. coli ( enteretoxina termoestable)

Tetra y pentasacáridos E. coli

Sialil (2-3) lactosa y glicoproteínas E. coli ( fimbria si)

Sialil α (2-3) galactósidos y mucinas E. coli ( fimbria si)

Oligosacáridos neutros Streptococcus pneumoniae

Epítopos Fuc α (1-2) Gal Cándida albicans

Gal β (1-4) GlcNAc o Gal β(1-3) GlcNAc Pseudomonas aeruginosa

Sialil lactosa Helicobacter pylori

Sialil lactosa Streptococcus sanguis

Sialil lactosa y glicoproteínas Helicobacter pylori

Glicoproteínas sializadas α (2-3) Mycoplasma pneumoniae

Poli-N- acetil-lactosaminas Mycoplasma pneumoniae

α (2-3) poli-Nacetil-lactosaminoglicanos Streptococcus suis

Sialil α (2-3) lactosa Virus influenza A

Sialil α (2-3) lactosa Virus influenza B

9-0 NeuAc α (2-3) R Virus influenza C

Introducción

11

ser sintetizados a partir de ácido linoleico (LA) y del α linolénico (ALA), que están presentes

en la leche materna (ver figura 1.2). Pero los lactantes poseen esta capacidad reducida por

lo que es muy importante el aporte de ambos ácidos grasos de cadena larga (Koletzko y col.

1999). Existen numerosos estudios que demuestran la importancia de estos ácidos grasos

poliinsaturados de cadena larga en el desarrollo cerebral, cognitivo y visual además de en

el crecimiento y en la función inmunitaria del recién nacido (Cheatham y col. 2006; Fleith y

col. 2005; Hamosh y col 1998; Yavin 2006).

El ácido graso más abundante en la leche materna es el ácido oleico. Este ácido

graso, al igual que el linoléico y el alfa linolénico, es el precursor a partir de la dieta y a partir

de los cuales, gracias a procesos metabólicos de desaturación y elongación, se sintetizan los

ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga ( ver figura 1.2).

Introducción

12

1.1.5 Minerales

La concentración de minerales presente en la leche humana es constante y está

compuesta por sodio, potasio, cloro, calcio, magnesio y fósforo, además de trazas de hierro,

zinc, cobre, manganeso, selenio y yodo.

La proporción de minerales en la leche materna es más baja que la que podemos

encontrar en la leche de otros animales lo que junto a una baja proporción de proteínas le

confiere una menor osmolaridad, facilitando de esta forma la función renal del lactante.

Existen estudios que han demostrado la alta biodisponibilidad de los minerales de

la leche materna y su relación con otros componentes que facilitan su absorción, metabo-

lismo y excreción (Piciano y col. 1998). De este modo, la alta biodisponibilidad compensa

la baja concentración de ciertos minerales como el calcio y el zinc por ejemplo, cuyo con-

tenido es muy bajo pero es suficiente para cubrir las necesidades del recién nacido.

1.1.6 Vitaminas

La leche materna posee una carga de vitaminas completa, ya que posee tanto las

que son de naturaleza soluble, como la vitamina C, como las de naturaleza liposoluble como

las vitaminas A y E, todas ellas en proporciones adecuadas a las necesidades que presenta

el lactante. Sin embargo, es posible que existan deficiencias de vitamina K en los primeros

días tras el parto, ya que la producción endógena de esta vitamina por parte de bacterias

entéricas es muy baja. Algo similar ocurre con la vitamina D, en cuyo caso se debe a la poca

exposición de los lactantes a la luz solar.

1.1.7 Poliaminas

Las poliaminas son elementos nitrogenados que están presentes en tejidos animales, en

virus y en bacterias. Ejemplos de poliaminas serían la putrescina, la espermidina y espermina.

La leche materna posee una carga de poliaminas aunque todavía no se ha establecido

una clara función en la nutrición del lactante. Existen estudios que sugieren un efecto trófico

directo sobre las células intestinales inmaduras, mejorando la permeabilidad de la mucosa (Buts

y col. 1993).

Introducción

13

1.1.8 Componentes inmunológicos de la leche materna.

En la leche materna existen componentes inmunológicos que confieren una respu-

esta frente a agentes infecciosos en el lactante. Esta cualidad de la leche materna es funda-

mental, destacándose la existencia de dos tipos de respuesta, una específica y una no espe-

cífica, clasificadas a su vez como respuesta de tipo humoral y de tipo celular (Ver figura 1.3).

En cuanto a los elementos celulares presentes en la leche, están compuestos básica-

mente por leucocitos presentes en alto número en la etapa de lactancia.

-Linfocitos: en la leche materna existen tanto linfocitos de tipo B como T. Los linfoci-

tos B se encargan de la síntesis de anticuerpos mientras que los linfocitos T poseen

una actividad citotóxica frente a microorganismos.

-Macrófagos y polimorfonuclerares: estos componentes son los mayoritarios en la

leche y no poseen especificidad. Poseen capacidad fagocítica. Además, los mac-

rófagos son los responsables de la síntesis de componentes humorales tales como

moléculas de complemento C3 y C4, lisozima y lactoferrina (Xanthou M y col 1998).

En cuanto a los elementos humorales que se encuentran en la leche, uno de los más

abundantes son las inmunoglobulinas las cuales son transferidas de la madre al hijo por

medio de la leche, protegiendo de esta forma al lactante frente a patógenos.

Dentro de la variedad de inmunoglobulinas presentes en la leche, la principal inmu-

noglobulina es la IgA. Ésta posee un carácter protector y de prevención frente a la posible

adhesión por parte de patógenos a la pared intestinal del lactante. Además esta inmuno-

globulina es capaz de proteger al lactante frente a patógenos tales como rotavirus, Esch-

erichia Coli, Shigella, Salmonella, Clostridium difficile, Giardia lamblia y Campylobacter (do

Nascimento y col. 2003).

También existen otros tipos de inmunoglobulinas presentes en la leche humana, como es

el caso de la IgD cuya acción es de tipo protectora en la zona de la glándula mamaria. Otra inmu-

noglobulina presente en la leche es la IgE que favorece la liberación de mediadores químicos au-

mentando así la permeabilidad intestinal y facilitando la salida de la IgG que contribuye al sistema

defensivo del organismo por medio de la opsonización de bacterias y virus. Finalmente tenemos

la IgM, necesaria para la protección inicial del neonato frente a las infecciones maternas.

Introducción

14

Además de las inmunoglobulinas, existen otros componentes inmunológicos de

tipo humoral inespecíficos, como son la lactoferrina, los nucleótidos, las poliaminas y los

oligosacáridos comentados en apartados anteriores.

1.1.9 Microbiota de la leche humana

Tradicionalmente se mantenía que la leche materna es estéril. La presencia de bac-

terias en este fluido se relacionaba con condiciones patológicas, sin embargo a principios

de este siglo se puso de manifiesto que la leche materna de forma natural posee una carga

microbiana muy variada. Así pues, existen distintos grupos bacterianos en este fluido bi-

ológico, diferenciándose estafilococos, estreptococos, micrococos, lactobacilos y entero-

cocos (Martín y col.2003). Además la presencia de oligosacáridos y algunas proteínas pre-

sentes en la leche favorecen las condiciones de crecimiento de algunos grupos bacterianos

frente a otros.

El hecho de que la leche materna posea una variada carga microbiana y la enorme

complejidad en cuanto a su composición, podría estar relacionada con las diferencias ex-

istentes entre la flora intestinal de lactantes que se alimentan de leche materna frente a

lactantes que se alimentan a través de preparados alimenticios (Balmer y col 1989). Existe

así un predominio de bifidobacterias y lactobacilos en los niños alimentados con leche ma-

terna frente a un predominio de enterobacterias, E.coli, bacteroides y estafilococos en los

alimentados con fórmula infantil (Balmer y col 1989). Se hablará detenidamente de la mi-

crobiota de la leche humana en el capítulo 4.

Figura 1.3 Componentes inmunológicos de la leche materna

celulareshumorales

No específicosLactoferrinaNucleótidos

OligosacáridosPoliaminas

Específicosinmunoglobulinas

No específicosmacrófagos

Específicoslinfocitos

Componentes inmunológicos

Introducción

15

1.2. Lactancia artificial

La nutrición en el primer año de vida es sumamente importante ya que deberá sat-

isfacer todas las necesidades en cuanto al crecimiento y desarrollo de los tejidos y órganos.

Por ello, debe ser una alimentación equilibrada, completa y que haga que se completen

todas las funciones tanto digestivas como metabólicas y renales. Numerosos estudios han

relacionado una mala nutrición en esta etapa de la vida con posteriores enfermedades y

patologías de tipo crónico en muchos casos, por lo que este no es sino otro factor a tener

en cuenta de la importancia de una correcta alimentación en este primer estadío de la vida.

La leche materna es el mejor alimento para el lactante, ya que le aporta todos los

nutrientes para un correcto desarrollo debido a su compleja composición, como ya hemos

comentado en el capítulo 1. La recomendación actual de la OMS (Organización Mundial de

la Salud) basada en la evidencia científica, es que la lactancia materna exclusiva tenga una

duración de 6 meses, seguida de la introducción de alimentos complementarios, mante-

niendo la primera, si es posible, hasta los dos años o más. Sin embargo existen casos en los

que la lactancia materna se ve impedida por una serie de obstáculos que son atribuibles a

circunstancias maternas desfavorables o en otros casos son propias del lactante.

- Maternos: pueden dificultar la consecución de una lactancia materna con éxito

alteraciones en la mama, como lo son la inversión o pseudoinversión del pezón,

grietas del pezón e infecciones (mastitis, linfagitis, galactoforitis).También algu-

nas afecciones generales de la madre, ya que cuando la madre se ve obligada

a la administración de determinados fármacos se presenta obstáculo en la lac-

tancia. Todos los medicamentos tienen cierto grado de transferencia desde el

plasma hacia la leche, y las concentraciones que alcanzan en esta última son

extremadamente variables en función de la molécula considerada.

- Lactante: los obstáculos más importantes son las anomalías anatómicas (labio

leporino, fisura palatina, hipoplasia maxilar inferíor, atresia de coanas, macro-

glosia, anomalía de Pierre-Robin); se han considerado, también las infecciones

respiratorias de las vías aéreas superiores, la aversión al pecho, y trastornos

neurológicos y/o psicológicos. Desarrollo de intolerancia a la lactosa o mala ab-

sorción, al igual que casos de galactosemia.

Introducción

16

Debido a todos estos problemas y contraindicaciones, en los casos en los que la

lactancia natural sea imposible se recurre a la alimentación por medio de las fórmulas in-

fantiles. Una fórmula infantil es un producto elaborado a partir de leche de vaca y que lleva

adicionados ingredientes que han sido probados como aptos y necesarios para la alimen-

tación y desarrollo del lactante (ver tabla 1.3). Se deben realizar estudios de seguridad

en los que queden reflejados los efectos beneficiosos aportados por el consumo de una

fórmula infantil y que no posea efectos adversos además de ser bien tolerada por parte del

lactante (Koletzko y col. 2005).

Para la elaboración de una fórmula infantil, se toma como modelo la leche materna,

intentando asemejar lo máximo posible su composición y de esta forma intentar adquirir al

menos en parte los beneficios de la lactancia natural. De hecho en los últimos años se han

publicado numerosos estudios sobre los benefizcios de los probióticos en el lactante. Por

ello hay un interés creciente en la adición de estas bacterias a las fórmulas infantiles, ase-

mejándose de esta forma aún más a la leche materna debido a que se encuentran de forma

natural en ésta. En los siguientes capítulos se abordará con más detalle el uso de los pro-

bióticos en la alimentación infantil. En cuanto a la composición de una fórmula infantil, los

probióticos están dentro de un grupo de componentes denominados bioactivos. Estos com-

ponentes bioactivos han demostrado ser seguros y beneficiosos para el lactante, además

de estar presentes en la leche materna. El objetivo de adicionarlos a las fórmulas infantiles

es el de conseguir imitar, al menos en parte, los beneficios demostrados para la lactancia

natural. Ejemplos de estos componentes bioactivos serían los ácidos grasos poliinsatura-

dos, prebióticos y nucleótidos. Por otro lado estarían los macronutrientes compuestos por

grasas, hidratos de carbono y proteínas y los micronutrientes formados por los minerales y

las vitaminas (ver figura 1.4).

Introducción

17

Tabla 1.3 Ingredientes de una fórmula infantil

Inicio (0-6 meses) Continuación (6-12 meses)

Energía (Kcal/dl) 60-70 60-70

Proteínas (g) 1,8-3 1,8-3,5

Grasas (g) 4,4-6 4,0-6

Ácido linoléico (g) 0,3-1,2 0,3-1,2

Carbohidratos (g) 9-14 9-14

Vitamina A (UI) 200-600 200-600

Vitamina D (UI) 40-100 40-120

Vitamina E (UI) 0,7-7,5 0,7-7,5

Vitamina K (µg) 4-25 4-25

Tiamina (µg) 60-300 60-300

Riboflavina (µg) 80-400 80-400

Vitamina B6 (µg) 35-175 35-175

Vitamina B12 (µg) 0,1-5 0,1-5

Niacina 80-400 80-400

Ácido fólico (µg) 10-50 10-50

Ácido pantoténico (µg) 400-2000 400-2000

Biotina (µg) 1,5-7,5 1,5-7,5

Vitamina C (mg) 8-30 10-30

Calcio (mg) 50-140 50-140

Fósforo (mg) 25-90 25-90

Magnesio (mg) 5-15 5-15

Hierro (mg) 0,3-1,3 0,6-2,0

Cinc (mg) 0,5-1,5 0,5-1,5

Cobre (µg) 35-80 35-100

Yodo (µg) 10-50 10-50

Sodio (mg) 20-60 20-60

Potasio (mg) 60-160 60-160

Cloruro (mg) 50-160 50-160

*Los valores están basados en las recomendaciones del Comité de Nutrición de ESPGHAN (So-

ciedad Europea de Gatroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica) publicados en el 2005.

Introducción

18

Figura 1.4 Componentes de las fórmulas infantiles

Componentes de las fórmulas infantiles

Macronutrientes(grasas,

proteínas e hidratos de

carbono)

Micronutrientes (vitaminas y minerales)

Componenetesbioactivos

(probióticos, prebióticos,

AGPI, nucleótidos)

Introducción

19

2. La microbiota del tracto gastrointestinal.

2.1 Composición y distribución

El aparato digestivo humano está compuesto por cinco partes bien diferenciadas: la

cavidad oro-faríngea, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso. Las

tres últimas partes conforman el tracto gastrointestinal (TGI), con funciones de digestión,

absorción, secreción y de barrera. Además, cada vez se reconoce más su importancia como

órgano endocrino y constituye el mayor órgano del sistema inmunitario humano.

La mucosa del TGI humano está colonizada por una comunidad microbiana extrem-

adamente compleja. De hecho, se estima que contiene aproximadamente 1014 células proc-

ariotas, cifra diez veces mayor que la suma de todas las células eucariotas del cuerpo huma-

no. Toda la comunidad microbiana junto con las células humanas conforman un complejo

ecosistema que interactúa de manera global a través de diversos procesos biológicos.

La diversidad taxonómica de las bacterias intestinales ha sido objeto de numerosas

investigaciones durante las últimas décadas. En los años 70 y 80, el estudio de la microbiota

intestinal dependía de la continua mejora en los procedimientos de enriquecimiento y en

los sistemas para la generación de ambientes anaerobios. Los aislados se identificaban y

caracterizaban mediante combinación de diversos ensayos fenotípicos. En un estudio pi-

onero, Moore y Hodelman (1974) analizaron la microbiota fecal de 20 personas y, a pesar

de que únicamente pudieron identificar 113 especies, estimaron que el número real podría

ser superior a 400.

Efectivamente, los estudios subsiguientes revelaron la gran diversidad bacteriana

existente en el TGI, y confirmaron la existencia de más de 400 especies. Los grupos domi-

nantes identificados en esos estudios iniciales pertenecían a los géneros Bacteroides, Bif

idobacterium,Clostridium,Eubacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus,

Ruminococcus y Streptococcus (que incluía entonces el género Enterococcus) . El empleo de

técnicas de cultivo, las únicas disponibles hasta hace pocos años, parecía sugerir que entre

el 85 y el 99 % de los microorganismos del TGI pertenecía a un máximo de unas 40 especies

( Drasar y Barrow 1985; Moore y Holdeman 1974).

El interés por el estudio de la microbiota asociada a distintas mucosas se ha vis-

to reforzado con la aparición de técnicas moleculares que facilitan la caracterización y el

Introducción

20

seguimiento de una enorme variedad de grupos microbianos, incluyendo poblaciones no

cultivables. Con estas nuevas herramientas se pueden llegar a conocer incluso los compo-

nentes individuales de diversos grupos y su estado fisiológico de actividad (Vaughan y col

2000; Zoetendal y col. 2004). Mediante el análisis del rADN 16S amplificado directamente

de heces humanas y su comparación con secuencias cultivables, se ha estimado que sólo

un 30% de las especies detectadas se corresponden con especies previamente aisladas e

identificadas con las técnicas clásicas de cultivo (Amann y col. 1995; Hayashi y col. 2002,

Suau y col. 1999; Wilson y Blitchington 1996).

Recientemente las nuevas técnicas de biología molecular han acelerado el proceso,

permitiendo un análisis más rápido y complejo de comunidades microbianas culminando

con el uso de la metagenómica (Flint y col. 2010; Qin y col. 2010). Sin embargo, la idea de

que muchas bacterias de la microbiota son intrínsecamente incultivables, puede que no

sea del todo exacta, ya que se ha determinado que bacterias reconocidas y aisladas por

métodos moleculares a partir de heces corresponden a especies que sí se pueden cultivar

(Walker y col. 2010). Por ello en el futuro se requerirán combinaciones tanto de técnicas

genómicas, estudios de ecología microbiana y también estudios a partir de microorgan-

ismos cultivables. Los recientes avances en el campo de la metagenómica han permitido

crear bases de datos con información genética de distintas poblaciones bacterianas superi-

ores en más de 200 veces a las existentes hasta el momento, revelándose de esta forma el

enorme potencial de este campo dentro de la microbiología (Vacharaksa y col. 2010; Qin y

col. 2010) (ver figura 2.1).

La microbiota aumenta en cantidad y complejidad a medida que avanzamos por el

TGI. Así, en individuos sanos, la marcada acidez del ambiente estomacal ( pH-3) únicamente

permite el desarrollo de estreptococos y lactobacilos (103-104ufc/g) y de algunas levaduras

(Macy y col. 1978; Rastall 2004; Tannok 1995). Además, Helicobacter pylori también colo-

niza la mucosa gástrica de un porcentaje considerable de individuos, si bien se necesita la

concurrencia de diversos factores para que cause manifestaciones clínicas (Lee y col. 1993).

En el intestino delgado, los principales factores limitantes para el establecimiento de los

microorganismos son los movimientos peristálticos y la secreción de jugos pancreáticos y

biliares. Aquí, los niveles aumentan progresivamente, desde 104-105 ufc/g en el duodeno,

donde nuevamente son mayoritarios los lactobacilos y los estreptococos (Rastall 2004; Sino

y Gorbach 1984), hasta más de 108 ufc/g en la región distal del íleon. Las especies cultivables

Introducción

21

más numerosas en esta región son las bifidobacterias, enterobacterias, bacteroides y fuso-

bacterias (Croucher y col. 1983; Nord y Kager 1984).

Figura 2.1 Metodología de los experimentos en metagenómica

Extraído de Shelswell 2004

En el intestino grueso, el pH está más próximo a la neutralidad, la velocidad de trán-

sito es mucho más lenta y las secreciones biliar y pancreática están mucho más diluidas.

Por ello, no es de extrañar que el mayor número de bacterias en el TGI humano resida

precisamente en este segmento, donde constituyen entre el 35 y el 55% del volumen del

contenido sólido (Stephen y Cummings, 1980). Además, existe un ambiente muy reductor

y desprovisto de oxígeno por lo que la mayoría de las poblaciones son anaerobias estrictas

y constituyen lo que se denomina la microbiota dominante, caracterizada por concentra-

ciones del orden de 109-1012 ufc/g. Dentro de esta microbiota, el género Bacteroides es uno

de los más abundantes (Tannock 1995). También son dominantes otros microorganismos

Gram positivos no esporulados pertenecientes a los géneros Eubacterium, Bifidobacterium,

Peptostreptococcus y Ruminicoccus (Conway 1995). Los bacilos Gram-positivos esporulados

están representados esencialmente por los clostridios. En concentraciones inferiores apa-

recen poblaciones de bacterias anaerobias facultativas como enterobacterias, enterococ-

cos, lactobacilos y estreptococcos, que constituyen la microbiota subdominante, con tasas

comprendidas entre 105 y 106 ufc/g (Hasiage 1994; Holzapfel y col. 1998) y que, a pesar de

su menor número, pueden resultar esenciales para la homeóstasis microbiana en el intes-

Introducción

22

tino grueso. Algunas levaduras también se encuentran formando parte de esta microbiota,

aunque en concentraciones relativamente bajas (102-104- ufc/g). (Rastall, 2004; Satokari y

col. 2001; Tannock 1995).

La composición de la microbiota está influida por diversos factores que pueden ser

internos, propios del hospedador, o externos como son el uso de medicamentos o la propia

dieta que en los últimos años ha demostrado un papel determinante (De Filippo y col. 2010;

Olivares y col. 2006b).

Figura 2.2 Distribución de las poblaciones bacterianas en el tracto gastrointestinal

2.2. Funciones de la microbiota intestinal humana

En los últimos años, se ha incrementado notablemente el interés por el estudio

del complejo ecosistema microbiano del tubo gastrointestinal humano. Esto se debe a que

las poblaciones microbianas ejercen una gran influencia sobre muchas características bio-

químicas, fisiológicas e inmunológicas del hospedador en el que residen (Gill y col. 1998;

Parodi y col.1999; Salminen y col. 1998), existiendo una relación cada vez más clara entre

la microbiota intestinal y la salud (Guarner y Malagelada, 2002; Hart y col.2002; Noverr y

Huffnagle 2004; ; Parodi 1999; Tannock y col. 1999).

Introducción

23

Como ya se ha comentado, la introducción de técnicas moleculares ha revelado que

aún no se conocen con precisión todos los microorganismos que integran las poblaciones

intestinales, ni la importancia ni el papel biológico con los que cada tipo contribuye a la

salud del hospedador. Tampoco se conoce la importancia y el papel fisiológico de las pobla-

ciones minoritarias que, sin duda, pueden ser determinantes en posiciones específicas o en

algunas situaciones (Cummings 1997).

En general, la microbiota intestinal ejerce tres funciones básicas: metabólicas, inter-

viniendo en la asimilación de nutrientes de la dieta; protectoras, contribuyendo al efecto

barrera y al desplazamiento de microorganismos patógenos; y tróficas, interviniendo en el

desarrollo y la proliferación celular.

2.2.1. Función metabólica

Un papel fundamental de la microbiota del TGI es la degradación de carbohidratos,

como es el caso del almidón y otras fibras. Estos carbohidratos provienen de nuestra dieta y

por diversas razones no han podido ser digeridos por la acción de las amilasas pancreáticas.

En su defecto pueden ser digeridos por la acción de enzimas bacterianas gracias a procesos

de fermentación. La mayoría de estos carbohidratos son de origen vegetal, como por ejem-

plo algunos almidones, la celulosa, las hemicelulosas, pectinas, inulina, oligosacáridos que

no son digeridos, azúcares y alcoholes no absorbidos (Cummings y col. 1987;1996).

La degradación de los carbohidratos es un proceso en el que participan activamente

muchas poblaciones de la microbiota. De esta forma, se liberan como productos de la fer-

mentación bacteriana lactato, etanol, piruvato y succinato cuya concentración baja rápida-

mente ya que vuelven a ser utilizados de nuevo por las bacterias y convertidos en ácidos

grasos de cadena corta entre los que se encuentran el propionato, acetato y el butirato

(Chaia y col 2003).

Los ácidos grasos de cadena corta actúan directa e indirectamente sobre las células

del epitelio intestinal y participan en el control de varios procesos metabólicos (Cummings y

col. 2001). Existen estudios in vitro donde se demuestra cómo además el butirato aumenta

la expresión del transportador de glucosa Glut2 en células del epitelio intestinal, mejorando

la absorción de monosacáridos (Mangian y col. 2009). El butirato es metabolizado rápida-

mente por los enterocitos del colon, sirviéndoles como fuente de energía. Además, esta

Introducción

24

molécula es capaz de estimular la diferenciación celular y de disminuir el riesgo de cáncer

de colon mediante la inducción de apoptosis de células tumorales (Avivi-Green y col. 2000;

Buommino y col. 2000; Chai y col. 2000; Rowland 1995). De hecho, se ha observado una

relación entre microbiota y la incidencia de enfermedades de carácter tumoral (O´Keefe y

col. 2009).

Por otro lado, el acetato y el propionato llegan intactos al hígado a través de la vena

porta. El acetato se incorpora a los procesos de colesterogénesis y lipogénesis en el hígado,

mientras que el propionato actúa como inhibidor competitivo del acetato hacia el interior

de los hepatocitos. Este fenómeno parece contribuir a la disminución de la lipogénesis y

colesterogénesis hepática (Delzeme y Williams 2002) . De hecho, el propionato además de

inhibir la producción de ácidos grasos en el hígado, es posible que ejerza una acción rela-

cionada con la inhibición de las lipasas y la inducción de la adipogénesis en adipocitos del

tejido graso (Al-Lahhan 2010; Ge y col. 2008; Hong y col 2005).

La microbiota intestinal posee también un papel clave a la hora de la eliminación de

las sales biliares que llegan a la zona del colon. En un principio, las sales biliares son secreta-

das y reabsorbidas en el intestino delgado por la zona del íleon, pero existe una parte que

no se llega a reabsorber y que llega al intestino grueso donde se produce la eliminación por

las heces. En el colon estas sales biliares se modifican de dos formas a través de la acción de

la microbiota. Primero gracias a un proceso de desconjugación de las formas conjugadas de

los ácidos biliares primarios por acción de hidrolasas bacterianas, y segundo mediante un

proceso de deshidroxilación de los ácidos biliares que da lugar a los llamados ácidos biliares

secundarios. En cuanto a la desconjugación mediada por hidrolasas, existen muchos grupos

bacterianos que son capaces de realizar este proceso, incluyendo los lactobacilos (Lundeen

y Savage, 1990) y las bifidobacterias (Grill y col. 1995; Kim y col. 2004), mientras que en cu-

anto a la deshidroxilación de los ácidos biliares primarios para convertirlos en secundarios,

se ha descrito principalmente en bacterias de los géneros Clostridium y Eubacterium (Wells

y Hylemon 2000). Un exceso de ácidos grasos secundarios en el intestino grueso incre-

menta el riesgo de padecer cáncer de colon (Nagengast y col. 1995) y una excesiva descon-

jugación puede conducir a una malabsorción de grasas y vitaminas liposolubles, mientras

que los ácidos biliares secundarios formados por deshidroxilación parecen estar implicados

en la formación de cálculos biliares.

Introducción

25

Otra de las funciones de tipo metabólico de la microbiota intestinal sería la de la

producción de vitaminas, como es el caso de la vitamina K, la vitamina B12, la biotina, el

ácido fólico y el pantoténico y la síntesis de aminoácidos a partir del amoníaco y de la urea

(Hooper y col. 2002).

2.2.2. Función protectora frente a infecciones

La microbiota vive en el tubo gastrointestinal formando un determinado nicho

ecológico el cual crea una especie de barrera, imposibilitando de esta forma la entrada o la

implantación de bacterias extrañas al ecosistema, que pueden ser patógenas o patógenas

oportunistas. De hecho, la microbiota constituye la primera línea de defensa frente a infec-

ciones. Existen diferentes mecanismos que contribuyen a esta protección, entre los cuales

se incluyen la producción de sustancias antimicrobianas, como bacteriocinas o peróxido de

hidrógeno, y la competición por los nutrientes y por la adhesión a las mucinas (competición

por el espacio) (Brook y col. 1999; Lievin y col. 2000).

A la hora de colonizar la superficie gastrointestinal, cada cepa bacteriana depende

exclusivamente de su poder de adhesión, que varía entre cada tipo de bacteria ya que por

un lado depende de mecanismos de interacción inespecíficos (como por ejemplo las inter-

acciones electrostáticas o hidrofóbicas) y por otro lado de interacciones específicas (como

por ejemplo las interacciones ligando-receptor mediante polisacáridos , proteínas y/o áci-

dos lipoteicoicos) (Charles y col. 1998). Además, una vez en la mucosa intestinal existe una

competición por la utilización de los nutrientes que se encuentran en el lumen intestinal

proliferando más rápidamente aquellas especies que son capaces de utilizar más rápida y

eficientemente los substratos.

2.2.3. Función inmunológica y efectos sobre la maduración del sistema inmune

La inmunología estudia las respuestas de defensa de nuestro organismo frente a es-

tímulos endógenos o exógenos y las alteraciones patológicas de estos sistemas de defensa.

En relación con el sistema gastrointestinal, el tejido inmunológico asociado a la mucosa

intestinal es a lo que se le llama GALT (del inglés Gut Associated Lymphoid Tissue) y consti-

tuye la parte más extensa y compleja del sistema inmunitario, siendo capaz de discriminar

de forma eficaz entre patógenos invasivos y antígenos inocuos.

Introducción

26

Estructuralmente, el GALT está dividido en dos compartimentos:

- Un compartimento organizado que posee numerosos folículos linfáticos o placas

de Peyer, además de nódulos linfáticos mesentéricos y que sería el inductor de

la respuesta inmunitaria (ver figura 2.3).

- Un compartimento difuso, que es el gran efector de la respuesta inmune, for-

mado por poblaciones linfocitarias intercaladas entre las células epiteliales (los

llamados linfocitos intraepiteliales) o en la lámina propia (los llamados linfocitos

de la lámina propia) (ver figura 2.3).

Las placas de Peyer están formadas por agregados linfoides y se encuentran situadas

en la mucosa intestinal. El tejido linfoide se encuentra separado del lumen intestinal por

una monocapa de células, denominadas FAE, donde nos encontramos células columnares

también llamados enterocitos, las células M y las células globet, estas últimas responsables

de la secreción de mucus.

Las células M forman parte de la FAE. Son un tipo celular implicado en la captación

y presentación de antígenos y microorganismos al tejido linfoide presente en la lámina

propia, siendo este punto el inicio de la respuesta inmunitaria (Neutra y col 2001). Ci-

tológicamente comparten similitudes con los enterocitos ya que poseen zonas de oclusión,

desmosomas e interdigitaciones en sus membranas laterales, aunque su superficie apical

es diferente ya que no posee glycocalix, existiendo sólo microvellosidades. Este tipo celular

juega un papel fundamental a la hora de la presentación de antígenos en la luz intestinal. Su

citología presenta una serie de invaginaciones en las superficies vasolaterales donde se pu-

ede llevar a cabo el contacto entre los antígenos y los linfocitos o macrófagos que puedan

encontrarse alojados en dichas invaginaciones. El acceso de las células del sistema inmuni-

tario a estas invaginaciones se produce en respuesta a señales producidas por las células M

ante la presencia de ciertas macromoléculas o de microorganismos (Neutra 1998; Regoli y

col. 1995). Por lo tanto, las células M facilitan el contacto entre los antígenos y microorgan-

ismos presentes en el lumen intestinal y el sistema inmunitario.

Introducción

27

Fig 2.3 Representación de los elementos que componen el GALT, tanto el GALT de tipo

difuso como el organizado.

IEL: linfocitos intraepiteliales; LPL: linfocitos de la lámina propia. M Cell: célula M, adap-

tado de Ramiro y col. (2008)

Por debajo de la FAE, tenemos una zona subepitelial en la que nos encontramos

con células dendríticas y algunos macrófagos. Existen también otras áreas en los folículos

linfáticos en los que predominan linfocitos T, principalmente del tipo T helper, células den-

dríticas maduras y macrófagos. Por otro lado en las placas de Peyer se localizan folículos

compuestos por linfocitos B precursores celulares de la producción de IgA.

Formando parte del GALT difuso, se localizan los linfocitos IEL (del inglés intraepi-

thelial lymphocytes). Estos linfocitos se encuentran situados entre los enterocitos, justo

por debajo de las uniones formadas por proteínas de estrecha unión (del inglés tight junc-

tion proteins) y bajo la membrana basal. La unión entre los enterocitos y los linfocitos IEL

no está del todo definida existiendo una relación de unos 20 IELS por cada 100 enterocitos

existentes en la mucosa intestinal. Si se considera que la superficie intestinal correspondi-

ente a la mucosa es de unos 400 metros cuadrados podremos darnos cuenta de la elevada

tasa de linfocitos presentes en la mucosa y de que éstos representan una elevada población

dentro de nuestro sistema inmune. En cuanto sus propiedades histoquímicas, casi todos los

Introducción

28

IELS son de tipo CD3+ (células pan-t). Un 5-15 % de estas células expresan CD4 (fenotipo

inductor) mientras que las restantes expresan CD8 (fenotipo supresor). Esta proporción es

distinta a la que encontramos en otras zonas, ya que en sangre y lámina propia el fenotipo

CD4+ es mayoritario (Jarry y col. 1990)

Además de estos componentes, en la lámina propia se localizan poblaciones de cé-

lulas plasmáticas productoras de IgA, también linfocitos T y otras células incluyendo mac-

rófagos y células dendríticas, todas ellas situadas entre el epitelio y la capa muscular mu-

cosa (Lefrancois y col. 2006).

La respuesta inmune celular y humoral en el recién nacido difiere cualitativa y cuan-

titativamente de la respuesta en adultos. De hecho, la infancia temprana se caracteriza por

una mayor vulnerabilidad a las infecciones resultado de una reducción en la funcionalidad

y en el número de leucocitos (linfocitos T y B, Células NK, línea mieloide) (Holladay y col.

2000). La capacidad de respuesta del sistema inmune de los neonatos está influenciada

por su sensibilización a antígenos en el útero y durante el periodo postnatal. Teniendo en

cuenta la dimensión tanto cualitativa como cuantitativa que supone la presencia de antí-

genos procedentes de la microbiota intestinal, su efecto va a marcar la maduración de la

respuesta inmunológica del niño. Este efecto se pone claramente manifiesto al comparar

la respuesta inmunológica de animales libres de gérmenes (germ-free) con la respuesta de

animales con una microbiota convencional.

Los animales germ-free son animales mantenidos en condiciones de esterilidad que

no han tenido contacto ninguno con microorganismos ni siquiera durante el periodo de

gestación. En estos animales se ha observado que la ausencia de microbiota tiene un mar-

cado efecto no sólo sobre la fisiología del intestino, incluyendo morfología, secreción de

mucus, digestión y metabolismo, sino también sobre la función del sistema inmune (Falk y

col. 1998). En los animales germ-free la respuesta inmune de las mucosas está poco desar-

rollada presentando placas de Peyer hipoplásicas que contienen pocos centros germinales

así como un reducido número de células plasmáticas productoras de IgA y células T CD4+

en la lámina propia (Macpherson y col. 2004a). Pero la disfunción del sistema immune no

se restringe únicamente a las mucosas sino que se extiende a nivel sistémico afectando al

bazo y nódulos linfáticos que aparecen desestructurados con zonas de células T y B pobre-

mente formadas (Bauer y col. 1963). A nivel sistémico también se detectan bajos niveles de

Introducción

29

inmunoglobulinas (Benveniste y col. 1971). La función anómala de las células del sistema

immune pueden ser revertidas en pocas semanas tras la colonización de los animales germ-

free con bacterias comensales procedentes de los animales normales. De hecho la coloni-

zación de estos animales conduce al incremento en el número de células T CD4+, la induc-

ción de IgA secretada (sIgA), immunoglobulinas séricas y al desarrollo del tejido linfoide

asociado a intestino (GALT) correctamente organizado (Hooper y col. 2001; Macpherson

y col. 2004b; Moreau y col. 1978). Por tanto la colonización intestinal se revela como un

punto clave en la maduración del sistema inmunológico. Aunque estos modelos de coloni-

zación experimental se llevan a cabo en animales, el proceso en neonatos es muy similar

siendo un buen modelo para estudiar los mecanismos involucrados en la maduración del

sistema inmunológico (Mackie y col.1999).

Un aspecto importante a tener en cuenta es el hecho de que no todas las bacterias

comensales ejercen el mismo efecto sobre el sistema inmune, por ejemplo grupos bacte-

rianos como Bacteroides y Escherichia parecen tener un efecto muy potente (Karlsson y

col. 2004; Grönlund y col. 2000). El hecho de que una bacteria sea gram-positiva o gram-

negativa influye también de forma importante a la hora de inducir un determinado perfil de

citokinas indicando que la composición de la microbiota va a determinar la modulación de

la respuesta inmune (Hessle y col. 2000; Karlsson y col. 2002) .

Además de los aspectos cualitativos y cuantitativos, los tiempos en los que se pro-

duce la colonización parecen jugar también un papel importante. En animales de experi-

mentación se ha demostrado que el mecanismo de tolerancia oral frente a antígenos ali-

mentarios solamente se estructura de forma correcta si la microbiota se instaura durante

el periodo neonatal pero no si la colonización se lleva a cabo más tarde (Sudo y col. 1997).

2.2.4. Interacción de las bacterias comensales con el sistema inmune.

Las células presentadoras de antígeno como monocitos, macrófagos y células den-

dríticas son las responsables de detectar agentes extraños presentando las estructuras an-

tigénicas a las células T activando de esta manera la respuesta inmune específica. Además,

los monocitos y macrófagos internalizarán los microorganismos mediante fagocitosis ac-

tivándose la producción de citokinas proinflamatorias. Las células dendríticas son las célu-

las presentadoras más potentes con capacidad para presentar a los linfocitos T naïve nue-

vas proteínas antigénicas (Banchereau y col. 1998). Las células dendríticas también podrían

Introducción

30

contribuir a la diferenciación de las células T hacia células T supresivas que regulan la respu-

esta (Steinman y col. 2003; Sun y col. 2007)

Una característica importante de las células dendríticas es que mientras que en

los macrófagos las bacterias comensales son eliminadas rápidamente, en el caso de las

dendríticas las bacterias pueden sobrevivir incluso horas pudiendo acompañar a la célula

dendrítica a los nódulos linfáticos mesentéricos (Macpherson y col. 2004b; Karlsson y col.

2002).

Los monocitos y las células dendríticas reconocen motivos conservados en las bac-

terias a través de los receptores TLR (Toll Like Receptors), junto con otros receptores de

reconocimiento. La activación de las células presentadoras de antígenos a través de los

TLRs inicia una cascada de señales que culmina en la activación de factores de transcrip-

ción tales como NF-κB, lo que finalmente conducen a la secreción de citokinas y moléculas

coestimuladoras (Akira y col. 2001). Para estudiar la especificidad de los receptores TLR se

han utilizado componentes aislados de microorganismos observándose que por ejemplo

el lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas es reconocido por el TLR4. Otros

compuestos microbianos como peptidoglicanos y lipoproteínas de la pared bacteriana de

bacterias gram-positivas y gram-negativas son reconocidos por TLR2. El ADN bacteriano,

caracterizado por frecuentes zonas de dinucleótidos CG no metilados, también es recono-

cido por uno de estos receptores, el TLR-9 (ver figura 2.4).

Figura 2.4 Toll Like Receptors

Figura sacada de Janssen y col. 2003

Introducción

31

La comunidad microbiana que habita el tracto gastrointestinal se caracteriza por su

alta densidad de población, gran diversidad y complejidad de interacciones (Tannock 2001).

Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas el sistema inmune no reacciona de forma agresi-

va frente a las bacterias comensales. Este mecanismo que impide que el sistema inmune

reaccione frente a antígenos de bacterias comensales e incluso antígenos alimentarios se

denomina tolerancia oral. Para explicar este fenómeno existen tres teorías que intentan ex-

plicar cómo el sistema inmune es capaz de discriminar entre microorganismos patógenos o

comensales. La primera teoría propone que las células del sistema imnune podrían discrim-

inar los dos tipos de microorganismos a través del reconocimiento de los receptores que

reconocen diferentes patrones en las membranas bacterianas. La segunda teoría involucra

a las células del epitelio intestinal que distinguirían entre ambos tipos de microorganismos

transmitiendo la información a las células presentadoras de antígeno tales como las células

dendríticas. Por último se postula que las células presentadoras de antígeno podrían estar

programadas dependiendo del tejido de origen de éstas. Así, los macrófagos o células den-

dríticas que residen en la mucosa intestinal y que habitualmente se enfrentan a bacterias

comensales son tolerogénicas mientras que las células que son reclutadas al intestino en

respuesta a un patógeno activan una respuesta inmune agresiva (Iliev y col. 2007). Un fallo

en la inducción de tolerancia oral conduce a la susceptibilidad a antígenos alimentarios o

bacterianos en el tracto gastrointestinal desarrollándose enfermedades tales como la aler-

gia alimentaria o la enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedades que en los últimos

años han incrementado significativamente su prevalencia en los países desarrollados.

En un intento de explicar el incremento en la prevalencia de estas enfermedades se

propuso la hipótesis de la higiene. Esta hipótesis mantiene que el desarrollo de las enfer-

medades alérgicas es prevenido por las infecciones durante la infancia. En los países desar-

rollados los niños están menos expuestos a las infecciones lo que se traduce en un mayor

riesgo de alergias (Strachan 2000). Durante el periodo prenatal y neonatal predomina una

respuesta inmunológica de tipo Th-2. El creciente contacto con microorganismos y la in-

stauración de la población bacteriana en el intestino estimula el desarrollo de la respu-

esta Th1 (Adkins y col. 2001). Finalmente estos mecanismos conducen a un equilibrio entre

ambos tipos de respuesta inmunológica, un balance Th1/Th2. Sin embargo no solo estas

respuestas están involucradas pues otros subgrupos de células T con potente capacidad

inmunomodulatoria son capaces de controlar ambas respuestas Th1 y Th2. Es el caso de

Introducción

32

las células T reguladoras y Th3 que han surgido como factores clave en la homeostasis del

sistema inmunológico (Akbari y col. 2003).

La desregulación de la respuesta inmunológica es la causa de enfermedades tales

como alergia, enfermedades autoinmunes e incluso cáncer. En el tracto gastrointestinal se

produce la principal interacción entre el sistema inmune del hospedador y los microorgan-

ismos ya sean comensales o patógenos. Es por tanto en esta mucosa intestinal donde el

sistema inmunológico aprende a distinguir entre los microorganismos comensales y pató-

genos y cómo reaccionar ante ellos. De hecho, se ha relacionado un patrón de microbiota

alterado con una desregulación de la respuesta inmunológica que conduce a desórdenes

como alergia, enfermedad inflamatoria intestinal e incluso recientemente se ha relacio-

nado con obesidad (Mai y col. 2009; Round y col. 2009).

Introducción

33

3. Origen de la microbiota

3.1 Adquisición de la microbiota intestinal humana

Los procesos por los cuales se produce el establecimiento de las poblaciones mi-

crobianas dentro del tracto gastrointestinal son muy complejos y variados, dando lugar a

distintas poblaciones a lo largo del tubo digestivo. Durante los primeros días de vida la mi-

crobiota es dominada por bacterias facultativas tales como Escherichia coli y otras entero-

bacterias, enterococos y estafilococos que debido a la falta de competición con otros mi-

croorganismos anaerobios llegan a alcanzar altos niveles en la microbiota. A medida que el

número de bacterias aerobias y facultativas aumenta se consume el oxígeno permitiendo la

colonización por parte de las bacterias anaerobias. Las bacterias anerobias que se pueden

encontrar en la microbiota intestinal de niños de 1 semana de vida incluyen bifidobacterias,

lactobacilos, y veillonella (Adlerberth y col. 2000).

Hasta hace 10 años se pensaba que el feto era estéril y que la colonización en el niño

comenzaba durante el parto por contaminación por la flora fecal y vaginal de la madre. En

el caso de los partos por cesárea la microbiota presente en el recién nacido provendría con

mayor probabilidad del medio ambiente que le rodea, ya sea el propio equipo del hospital,

otros niños, etc. Sin embargo, diferentes estudios no han mostrado que la microbiota del

niño esté tan íntimamente ligada al tipo de parto (Ahrné y col. 2005; Martín y col 2003;

Martín y col. 2007; Matsumiya y col 2002; Tannok y col. 1990).

De hecho, estudios realizados en la última década han demostrado que los prim-

eros contactos del niño con bacterias comensales se producirían aún antes del parto, en

su etapa fetal, puesto que se han detectado bacterias de este tipo en el cordón umbilical

y en el meconio de recién nacidos (Jiménez y col 2005; Jiménez y col. 2008) (Ver figura

3.1). Además, estudios en animales han demostrado la existencia de grupos bacterianos

en el líquido amniótico de ratonas gestantes y en el intestino de sus correspondientes fetos

(Bearfield y col. 2002; Buduneli y col. 2005; Jiménez y col. 2005; Martín y col. 2003; Martín

y col. 2004).

Tras el nacimiento, aunque el estrecho contacto del niño con la madre favorece la

transferencia de bacterias de la cavidad oral y piel de la madre al hijo (Mackie y col. 1999),

es la leche materna la que va a tener un papel fundamental en el establecimiento de la mi-

Introducción

34

crobiota del niño. Así, la leche materna no solo aporta componenetes bifidogénicos como

los oligosacáridos que favorecen la instauración de determinados grupos bacterianos (Kunz

y col.1993) sino que también aporta directamente bacterias comensales procedentes del

propio intestino de la madre (Martín y col. 2003).

3.2. La leche materna como fuente de bacterias comensales.

La leche humana es uno de los factores clave en la iniciación y el desarrollo de la mi-

crobiota intestinal del neonato ya que este fluido garantiza un aporte continuo de bacterias

durante todo el periodo de lactancia. De hecho, posiblemente se trate de la principal fuente

de bacterias para el recién nacido ya que se estima que un lactante que ingiera aproximada-

mente 800 ml de leche al día recibe entre 105 y 107 bacterias (Heikkilä y Saris, 2003; Martín

y col. 2003). Por lo tanto, no es de extrañar que la microbiota intestinal del lactante refleje

la existente en la leche materna. Así, el bajo número de especies bacterianas encontradas

en la leche concuerda con el reducido espectro bacteriano del que se compone la micro-

biota intestinal de los lactantes y que va seguido de un aumento de la variedad de la micro-

biota con el final de la lactancia y el inicio del destete. Entre las bacterias predominantes en

la leche materna destacan diversas especies de los géneros Staphylococcus, Streptococcus,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Weisella y Leuconostoc (Collado

y col. 2009; EiderLan y col. 1979; Gavin y col. 1977; Gueimonde y col. 2007; Heikkila y col.

2003; Martin y col. 2003) (ver tabla 3.1).

Diversos estudios evidencian el papel fundamental que juega la lactancia materna

en la colonización del intestino del niño, mostrando diferencias significativas entre la mi-

crobiota de los niños alimentados con leche materna y los alimentados con fórmula infantil.

Así, en los niños alimentados con leche materna se suele observar una menor presencia de

enterobacterias, estreptococos, bacteroides y clostridios, en beneficio de una mayor can-

tidad de bifidobacterias, al revés de lo que sucede en los alimentados con fórmulas infan-

tiles (Favier y col. 2002; Fuller 1991; Martín y col. 2000). Por otra parte, se ha descrito una

mayor concentración de bacterias del grupo Coriobacterium (Coriobacterium y Collinsella)

en heces de niños alimentados con fórmulas infantiles ( Harmsen y col 2000b).

Introducción

35

Tabla 3.1 Especies bacterianas detectadas en leche materna

Estas diferencias entre la microbiota de los niños dependiendo de si reciben o no

leche materna tienen unas repercusiones importantes en la salud del niño que serán co-

mentadas en el capítulo 4.

Al inicio de la fase de destete, se van introduciendo progresivamente alimentos sóli-

dos y paralelamente se va reduciendo la ingesta de leche materna hasta su completa susti-

tución. Estas circunstancias producen grandes cambios en la composición de la microbiota

intestinal infantil, de tal manera que, en poco tiempo, desaparecen las diferencias entre la

microbiota de los lactantes y la de los alimentados con fórmulas infantiles (Mackie y col.

1999; Stak y Lee 1982). En general, se estima que los grupos microbianos dominantes en

la microbiota intestinal de los niños de 2 años son similares a los de los adultos, aunque

todavía existen diferencias en cuanto a las especies presentes (Favier y col. 2002).

3.3 Mecanismos de transferencia bacteriana madre-hijo.

Aunque todavía se desconocen muchos aspectos de cuál es el mecanismo exacto a

través del cual las bacterias comensales pueden atravesar el epitelio intestinal y alcanzar la

glándula mamaria, diversas evidencias señalan al sistema inmunológico como clave en esta

transferencia. La hipótesis que se plantea es que el transporte de bacterias de la microbiota

Lactobacillus Otras bacterias lácticas Bifidobacterium Staphylococcus Streptococcus Otras bacterias Gram positivas Bacterias Gram-negativas

L. fermentum Enterococcus faecalis B. breve S. epidermidis S. bovis Actinomices odontolyticus Acinobacter johnsonii

L. gasseri Enterococcus faecium B. bifidum S. aureus S. mitis Arthrobacter cumminsii Bacteroides sp.

L. gastricus Lactococcus lactis B. longum S. hominis S. oralis Bacillus vietnamiensis Burkholdeira multivorans

L. plantarum Leuconostoc citreum B. adolescentIs S. xylosus S. parasanguis B. pumilus Citrobacter freundii

L. reuteri Leuconostoc fallax B. dentium S. haemolyticus S. salivarius Corynebacterium aurimucosum Escherichia coli

L. rhamnosus Leuconostoc mesenteroides B. catenulatum S. lugdunensis S. infants C. coyleae Klebsiella milletis

L. salivarius Pediociccous pentosaceus S. peroris C. pseudogenitalium K. oxytoca

L. vaginalis Weisella cibaria Gemella haemolysans K. pneumoniae

Weisella confusa Kocuria kristinae Kluyvera cryocrescens

K. rhizophila Pseudomonas aeruginosa

Micrococcus luteus P. pseudoalcaligenes

Paenibacillus amylolyticus P. synxanthia

Propionibacterium acnes Serratia proteamaculans

P.granulosum

Rothia mucilaginosa

Introducción

36

intestinal de la madre a la leche materna se lleva a cabo a través de la misma ruta entero-

mamaria mediante la cual células del sistema inmune de origen intestinal son transporta-

das a glándula mamaria (Roux y col. 1977; Salmon y col. 1984). Este mecanismo implicaría

una íntima relación entre la microbiota y el sistema inmune durante el transporte.

Las células dendríticas localizadas en el epitelio intestinal son capaces de proyectar

sus dendritas hacia la luz intestinal abriéndose paso a través de las uniones intercelulares

con el objetivo de captar microorganismos (Rescigno y col 2001). Se ha demostrado que si

bien los macrófagos destruyen de forma rápida a las bacterias comensales, en el caso de

las células dendríticas las bacterias permanecen viables incluso durante días (Macpherson

y col. 2004). La fisiología y organización del epitelio intestinal incluye una larga y entra-

mada red de folículos linfoides por donde circula el sistema linfático y existe una continua

circulación de células del sistema inmune por dichos folículos (Martín y col 2003; Roiit y col

1994). Una vez dentro, las células dendríticas pueden diseminarse por el sistema linfático

hasta otras localizaciones como las glándulas mamarias (Roiit y col 1994), y de esta forma

también se trasportarían los microorganismos que viajan con estas células desde la zona

del epitelio intestinal hasta las glándulas mamarias. Además, en el periodo de lactancia ex-

iste una colonización por parte de numerosas células del sistema inmune gracias a procesos

selectivos regulados por hormonas lactogénicas (Bertotto y col 1991). Este proceso, respon-

sable de la abundancia de estás células del sistema inmune en la leche, sería utilizado para

la translocación de las bacterias comensales. Pérez y colaboradores demostraron que el

proceso de translocación bacteriana es un proceso fisiológico que se ve incrementado du-

rante el embarazo y lactancia. En su trabajo demuestran la presencia de material genético

de una gran diversidad de bacterias intestinales en células sanguíneas y de la leche (Pérez

y col. 2007). Por tanto, la translocación de bacterias comensales a glándula mamaria no es

una transferencia pasiva sino un proceso activo en el que el sistema inmune juega un papel

clave (ver figura 3.1).

Introducción

37

Figura 3.1 Modelo hipotético de transferencia de bacterias desde la madre al feto y al tracto gas-

trointestinal del recién nacido

*Basado en el modelo expuesto por Martín y col. 2004.

Abreviaturas : GUM (tracto genitalurinario); LMGM (mucosa de la glándula mamaria);

MLN (nódulo linfático mesentérico); PP ( placas de Peyer); RM (mucosa del tracto respira-

torio); SLGM( mucosa de las glándulas salivares y lacrimales)

Introducción

39

4. Enfermedades relacionadas con alteraciones de la microbiota

En las últimas décadas se ha puesto de manifiesto la importancia de la microbiota

en el mantenimiento de la salud habiéndose relacionado ciertos cambios en la microbiota

con patologías muy diversas. Enfermedades derivadas de la desregulación del sistema in-

mune como la Enfermedad Inflamatoria Intestinal y alergia o enfermedades metabólicas

como la diabetes e incluso la obesidad han sido relacionadas con patrones de microbiota

distintos a los encontrados en los individuos sanos.

En cuanto a la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) su etiología no se conoce

claramente y aunque se relaciona en muchas ocasiones con una susceptibilidad a diversos

factores genéticos, también se ha comprobado que se asocia a una alteración de la micro-

biota intestinal. De hecho es importante señalar que los animales germ-free que carecen de

microbiota no desarrollan esta enfermedad. Además, tratamientos antibióticos modulan

la progresión de la enfermedad evidenciando el papel de los microorganismos en el desar-

rollo de la misma. Por último se han detectado polimorfismos genéticos relacionados con

la EII que afectan a genes implicados en el reconocimiento de las bacterias.. En este sentido

numerosos trabajos muestran en enfermos de EII una disbiosis por parte de las poblaciones

de bacterias protectoras frente a bacterias patógenas oportunistas que pueden llegar a ser

más agresivas, demostrándose además una reducción en cuanto a la diversidad bacteriana

así como inestabilidad en el ecosistema intestinal (Manichanh y col. 2006; Sartor 2011).

Una reducción de la variedad bacteriana afecta a todo el ecosistema intestinal,

como es el caso de una reducción del filo Firmicutes, que puede conllevar una bajada en

los recuentos de Clostridium leptum y Clostridium cocoides (Manichanh y col 2006). Ambos

grupos de bacterias son fundamentales en el ecosistema intestinal ya que son producto-

ras de grandes cantidades de butírico, un ácido graso de cadena corta que es la principal

fuente de energía de las células epiteliales intestinales contribuyendo al mantenimiento de

la integridad del intestino. Además, el ácido butírico posee una actividad antiinflamatoria

al inhibir la expresión en la mucosa del factor de transcripción NFkB, promotor de citokinas

proinflamatorias además de inhibir la degradación del inhibidor IkB (Segain y col. 2000).

Otros estudios han revelado interesantes resultados en la diversidad de la microbio-

ta en enfermos de Crohn, mostrándose un aumento en cuanto a niveles de enterobacterias

fecales en pacientes de dicha enfermedad, comparados con personas sanas (Mangin y col.

Introducción

40

2004; Seksik y col. 2003; Walker y col. 2011).

Por tanto, la actividad metabólica de la microbiota y su carácter inmunomodulador

podrían estar relacionados con el inicio y/o progresión de la enfermedad

Otra enfermedad en la que la microbiota parece jugar un papel importante es la

alergia. En los últimos años se ha producido un incremento en el desarrollo de alergias a

nivel mundial. En la actualidad existen dos hipótesis para explicar este suceso, existiendo

por un lado la ya mencionada teoría de la higiene, la cual se centra en que la falta de contac-

to en los primeros meses de vida entre el niño y los microorganismos del medio ambiente

que le rodea, fomenta una elevada respuesta del sistema inmune frente a numerosos antí-

genos inocuos, respuesta que se seguirá dando en las siguientes etapas de la vida (Strachan

y col. 1989; Wils Karp y col. 2001). La otra hipótesis se basa en el consumo de antibióticos

que, unido a un cambio drástico en la dieta, produce una alteración de la microbiota a nivel

general, reduciéndose la carga microbiana además de los mecanismos que dan consigo una

tolerancia inmunológica, con lo que aumenta el riesgo de padecer alergias (Blaser 2006;

Noverr y col. 2005).

En 1999 Bjorksten y colaboradores observaron que la presencia de lactobacilos, bi-

fidobacterias y bacteroides en las heces de niños alérgicos era menor a la encontrada en

niños sanos. Por el contrario, las poblaciones de aerobios, entre ellos coliformes y Staphy-

lococcus aureus estaba aumentada (Bjorksten y col 1999). Posteriores estudios han corrob-

orado esta relación entre un menor número de géneros como bifidobacterias y lactobacil-

lus y alergia (Bjorksten y col. 2001; Källiomaki y col.2001a; Källiomaki y col.2001b; Sjögren

y col.2009; Songjinda y col. 2007).

Además también se observan diferencias en cuanto al predominio de especies. En

niños sanos, normalmente existe un predominio de Bifidobacterium bifidum, seguida de

valores más bajos de las especies Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium breve mientras

que en niños alérgicos predomina claramente la especis Bifidobacterium adolescentis (Ou-

wehand y col. 2001). Estas diferencias se observan en edades muy tempranas, a las tres

semanas de edad, antes de que se empiecen a manifestar los primeros síntomas caracter-

ísticos de la alergia, demostrando que las alteraciones de la microbiota se producen previas

a la manifestación de una alergia evidenciando su papel en la enfermedad (Källiomaki y col.

2001a; Källiomaki y col. 2001b).

Introducción

41

Aunque los mecanismos por los que la microbiota podría ejercer un papel benefi-

cioso en el transcurso de una posible alergia no están del todo aclarados, probablemente

estén relacionados con el carácter inmunomodulador que presentan los distintos grupos

bacterianos. Durante el periodo prenatal y neonatal predomina una respuesta inmunológi-

ca de tipo Th-2 característico de una respuesta alérgica. El creciente contacto con microor-

ganismos y la instauración de la población bacteriana en el intestino del niño estimula el

desarrollo de la respuesta Th1 (Adkins y col. 2001). En el tracto gastrointestinal se produce

la principal interacción entre el sistema inmune del hospedador y los microorganismos ya

sean comensales o patógenos. Finalmente estos mecanismos conducen a un equilibrio en-

tre ambos tipos de respuesta inmunológica, un balance Th1/Th2. Sin embargo no solo estas

respuestas están involucradas pues otros subgrupos de células T con potente capacidad

inmunomodulatoria son capaces de controlar ambas respuestas Th1 y Th2. Es el caso de

las células T reguladoras y Th3 que han surgido como factores claves en la homeostasis del

sistema inmunológico (Akbari y col. 2003). Por tanto es en esta mucosa intestinal donde el

sistema inmunológico aprende a distinguir entre los microorganismos comensales y pató-

genos y cómo reaccionar ante ellos siendo la base de un correcto funcionamiento del siste-

ma inmunológico a lo largo de la vida del niño.

Pero la microbiota no sólo se ha relacionado con enfermedades de base inmunológi-

ca sino que también se ha relacionado con enfermedades metabólicas como la obesidad.

La obesidad es una enfermedad crónica que se caracteriza por un aumento de la masa grasa

y en consecuencia por un aumento de peso. Existe, pues, un aumento de las reservas ener-

géticas del organismo en forma de grasa.

La primera evidencia del papel de la microbiota en la obesidad proviene de experi-

mentos en animales que mostraban cómo animales que carecían de microbiota (germ-free)

eran resistentes a la inducción de obesidad por dieta hipercalórica. La colonización de éstos

revertía el proceso lo cual se explicaba no sólo por el papel de la microbiota en el aprove-

chamiento de la energía sino también por el papel promotor de determinadas bacterias

en la entrada de los triglicéridos circulantes en el tejido adiposo a través de la supresión

de factor FIAF (del inglés: fasting-induced adipose factor), factor que inhibe la lipoprotein

lipasa necesaria para la entrada de la grasa en el adipocito. Además la microbiota también

induce la beta-oxidación de la grasa mediada por su acción sobre la protein kinasa activada

por AMP (Bäckhed y col. 2004; Bäckhed y col. 2007).

Introducción

42

Posteriores estudios en modelos genéticos de obesidad mostraron cómo se fa-

vorecía en estos una microbiota que trasladada después a animales normales inducía en

ellos la obesidad. Es decir se empezaba a hablar de una microbiota pro-obesogénica car-

acterizada por un aumento en Firmicutes en detrimento de la población de bacteroides.

Esta dieta pro-obesogénica es además más rica en enzimas hidrolíticas que le permiten

aprovechar mejor los substratos de la dieta dando lugar a mayor producción de energía en

forma de ácidos grasos de cadena corta que son aprovechables por el individuo (Ley y col

2006; Turnbaugh y col. 2006).

Estudios en humanos han evidenciado que efectivamente existen estas diferencias

entre la microbiota de individuos obesos respecto a la de individuos normopeso. De hecho

la microbiota de individuos obesos se modifica durante los periodos de dieta asemejándose

más a la de los individuos normopeso (Ley y col. 2006; Santacruz y col. 2009).

Introducción

43

5. Probióticos

5.1 Definición

A lo largo de la historia la fermentación ha sido usada con fines de conservación de

los alimentos pero no fue hasta principios del siglo XX cuando se empezó a relacionar la

presencia de bacterias en esos alimentos con ciertos efectos beneficiosos para la salud de

los hospedadores, especialmente cuando padecían infecciones intestinales (Moro, 1900;

Beijerinck, 1901; Cahn, 1901; Cohendy, 1906a; 1906b; Tissier, 1906). Por aquel entonces, se

publicó “Prolongation of Life” (Metchnikoff, 1907), un libro que ejerció una gran influencia

en la comunidad científica y en el que se postulaba que las bacterias que intervenían en la

fermentación del yogur contribuían al mantenimiento de la salud mediante la supresión de

las “fermentaciones de tipo putrefactivo” de la microbiota intestinal y que ésta era la causa

de la longevidad de los campesinos búlgaros, grandes consumidores de yogur. Ya en 1919,

Isaac Carasso empezó la fabricación comercial de yogur en Barcelona, un producto que

pronto consiguió tanto prestigio entre la clase médica como aceptación social. Inicialmente,

sólo se podía adquirir en farmacias y con receta médica y se empleaba para prevenir o

aliviar trastornos tan diversos como diarrea, estreñimiento, dispepsia, colitis mucosa, colitis

ulcerativa crónica, disbiosis por antibioterapia, cistitis o dermatitis. Desde entonces, se han

descrito, desarrollado y comercializado numerosos productos con bacterias probióticas.

A lo largo del siglo XX se empezó a utilizar el término de probiótico para denominar

a estas bacterias. Numerosas definiciones fueron surgiendo durante décadas hasta que fi-

nalmente un comité conjunto FAO/OMS (2002) los ha definido como “organismos vivos que

ingeridos a dosis definidas ejercen efectos beneficiosos para la salud”. Esta última defin-

ición es más amplia y tiene en cuenta los resultados de recientes investigaciones que de-

muestran la existencia de efectos probióticos que no se restringen al ámbito intestinal. No

podemos descartar que esta definición siga evolucionando a medida que se avanza en la

investigación en este campo pues por ejemplo ya hay numerosos trabajos científicos que

demuestran que para ciertos efectos beneficiosos no es esencial la viabilidad de la cepa.

Entre los microorganismos empleados con fines probióticos, las bacterias lácticas y

las bifidobacterias ocupan, con diferencia, el lugar más destacado pero también se utilizan

bacterias que pertenecen a otros géneros, como Esche richia coli y Bacillus cereus, o levadu-

ras, principalmente Saccharomyces cerevisiae (Shortt, 1999; Vaughan y col. 2002) (Tabla 5.1).

Introducción

44

Tabla 5.1 Especies bacterianas utilizadas como probióticos.

Lactobacillus Otras bacterias lácticas Bifidobacterium Otros microorganismosL. acidophilus Enterococcus faecalis B. animalis Bacillus cereus var. toyoi

L. amylovorus Enterocuccus faecium B. adolescentis Escherichia coli

L.casei freundereichi Lactococcus lactis B. bifidum Propionibacterium

L. crispatus Leuconostoc mesenteroides B. breve Sacharomices cerevisae

L. delbruecki Pediococcus acidilactici B. infantis Streptococcus boulardi

L. fermentum Streptococcus termophilus B. longum

L. helveticus Sporolactobacillus inulinus

L. gallinarum

L. gasseri

L. jonhsonii

L. paracasei

L. plantarum

L. reuteri

L rhamnosus

Además de los probióticos, existen dos términos íntimamente relacionados, los

prebióticos y los simbióticos. Los prebióticos son aquellos carbohidratos no digeribles que

favorecen de forma selectiva el crecimiento de ciertas bacterias consideradas como benefi-

ciosas para el hospedador, como las bifidobacterias entre otras. Finalmente la combinación

de al menos un probiótico y un prebiótico se denomina “simbiótico”. Es interesante seña-

lar que la combinación de probiótico y prebiótico en un mismo producto puede tener un

efecto sinérgico y conferir beneficios mayores que los que cada uno de los componentes

del simbiótico por separado (Gallaher y Khil 1999; Grimoud y col. 2010; Romeo y col. 2010;

Rowland y col. 1998).

5.2 Seguridad del uso de bacterias probióticas en nutrición humana.

El Comité Científico de la EFSA elaboró una lista de microorganismos considera-

dos seguros basados en su historial de uso en alimentación a los que se les ha concedido

la condición de QPS (Qualified Presumption of Safety) (EFSA 2010). Esta lista, además de

incluir especies de levaduras, incluye 74 especies de microorganismos que incluyen 33

especies de Lactobacillus y 5 de Bifidobacterium (tabla 5.2). Estas especies a las que se le

ha atribuido la condición de QPS no necesitan la realización de estudios de seguridad que

avalen su uso seguro. Sin embargo a la hora de seleccionar nuevas cepas, sobre todo si

contamos con especies no contempladas en la lista QPS, es necesario realizar una serie de

pruebas que nos permitan asegurar a priori que las cepas seleccionadas son seguras.

Introducción

45

Tabla 5.2 Lista de microorganismos gram+ con la cualificación de QPS otorgada por la EFSA.

Tabla sacada de la EFSA 2010

Los aspectos que se tienen en cuenta a la hora de valorar la seguridad de una cepa

están relacionados con su origen, actividades metabólicas, y resistencia a antibióticos.

5.2.1 Origen

Tradicionalmente se ha recomendado que las cepas probióticas sean aisladas de muestras

de la misma especie a la que se vayan a aplicar con el fin de que sean cepas que se pueden encon-

trar de forma natural en el organismo. Por otra parte, existen ciertas evidencias de que las cepas de

origen humano se implantarían y colonizarían con mayor facilidad que las aisladas de otras fuentes

(Holzapfel y col 1998; Ouwehand y col. 1999). Sin embargo este hecho no está todavía demostrado

pues otros trabajos señalan que la capacidad de las cepas probióticas para adherirse al epitelio del

hospedador es independiente de su origen ( Johansson y col . 1993; Rinkinen y col. 2003).

Bacterias gram positivas no esporuladas Cualificaciones*EspeciesBifidobacterium adolescentis Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium longumBifidobacterium animalis Bifidobacterium breveCorynebacterium glutamicum ** Sólo producción de aminoácidosLactobacillus acidophilus Lactobacillus farciminis Lactobacillus paracaseiLactobacillus amylolyticus Lactobacillus fermentum Lactobacillus paraplantorumLactobacillus alimentarius Lactobacillus gallinarum Lactobacillus pentosusLactobacillus aviaries Lactobacillus gasseri Lactobacillus plantorumLactobacillus brevis Lactobacillus helveticus Lactobacillus pontisLactobacillus buchneri Lactobacillus hilgardii Lactobacillus reuteriLactobacillus casei *** Lactobacillus johnsonii Lactobacillus rhamnosusLactobacillus cellobiosus Lactobacillus collinoides Lactobacillus sakeiLactobacillus coryniformis Lactobacillus kefiri Lactobacillus salivariusLactobacillus crispatus Lactobacillus mucosae Lactobacillus sanfranciscensisLactobacillus curvatus Lactobacillus panisLactobacillus delbrueckii Lactobacillus kefiranofaciensLactococcus lactisLeuconostoc citreumLeuconostoc lactisLeuconostoc mesenteroides

Oenococcus oeniPediococcus acidilacticiPediococcus dextrinicusPediococcus pentosaceusPropionibacterium freudenreichiiPropiobacterium acidopropioniciStreptococcus thermophilus

BacillusEspecies Cualificaciones*Bacillus amyloliquefaciens Bacillus lentus Bacillus pumilus Ausencia de actividad toxigénicaBacillus atrophaeus Bacillus licheniformis Bacillus subtilisBacillus clausii Bacillus megaterium Bacillus vallismortisBacillus coagulans Bacillus mojavensis Geobacillus stearothermophilusBacillus fusiformis* Característica para todas las cepas bacterianas QPS: las cepas no debe den albergar genes de resistencia a antibióticosclínicamente relevantes ** Brevibacterium lactofermentum es sinónimo de Corynebacterium glutamicum*** La especie nombrada anteriormente como Lactobacillus zeae ha sido incluida en la especie Lactobacillus casei

Introducción

46

5.2.2 Identificación de cepas

En el campo de las bacterias probióticas se trabaja fundamentalmente con cepas de

probióticos pertenecientes a los géneros, Lactobacillus y Bifidobacterium pero se trabaja

también con otra serie de bacterias, como es el caso de Enterococcus faecium o Streptococ-

cus thermophilus e incluso bacterias no pertenecientes al grupo de las llamadas bacterias

ácido lácticas, como es el caso de Escherichia coli Nissle1917. La identificación de la cepa

determinará si esta pertenece a alguna de las especies autorizadas por la EFSA para uso

alimentario (lista QPS) o si se trata de una especie que requiera llevar a cabo estudios de

seguridad específicos que aseguren que su uso en humanos es totalmente seguro.

Para una correcta identificación y clasificación, la FAO y la OMS recomiendan que las

cepas probióticas sean nombradas de acuerdo con el Código Internacional de Nomencla-

tura además de ser depositadas en colecciones de cultivos internacionales. La cepa deberá

ser caracterizada fenotípicamente y genéticamente, incluyendo métodos de hibridación

ADN/ARN o secuenciación de la región genómica perteneciente al 16S, pudiéndose incluir

dicha secuenciación en bases de datos específicas que pueden ser consultadas para la iden-

tificación de una cepa problema ( FAO/ WHO Expert consultation 2001).

El avance de la tecnología hace además a día de hoy más accesible la secuenciación

total del genoma bacteriano permitiendo estudiar la existencia de genes que puedan deri-

var en un carácter patógeno de la cepa en cuestión.

5.2.3 Resistencia a antibióticos

En la actualidad la resistencia a antibióticos por parte de microorganismos es un

hecho problemático que también se puede presentar en microorganismos probióticos

(Salminem y col. 1998). La resistencia a antibióticos puede estar relacionada con factores

genéticos de múltiples clases, como por ejemplo los plásmidos de resistencia. La posible

transferencia de factores de resistencia a antibióticos de cepas probióticas a cepas poten-

cialmente patógenas podría acarrear un problema de salud grave al conferir a estas bacte-

rias patógenas herramientas para defenderse frente a los tratamientos antibióticos pudi-

endo resultar en infecciones de difícil resolución. Se han comprobado por ejemplo casos de

transferencia entre cepas pertenecientes al género Enterococcus a otras cepas bacterianas

patógenas y Gram+ como lo son cepas pertenecientes al género Listeria y Staphylococcus

Introducción

47

aureus (Leclerq y col. 1989; Noble y col. 1992). Además es interesante conocer el perfil de

resistencias a antibióticos que posee una cepa para poder desarrollar tratamientos pro-

bióticos que puedan ser administrados conjuntamente con ciertos tratamientos antibióti-

cos lo que puede ser de utilidad por ejemplo para prevenir diarreas asociadas a tratamien-

tos antibióticos. Por último aunque los casos de infecciones causadas por cepas probióticas

son contados y están generalmente asociados a condiciones patológicas del consumidor, es

importante que la cepa probiótica sea susceptible a antibióticos que puedan ser utilizados

ante una eventual infección.

Entidades internacionales formadas por expertos de la OMS y de la FAO han mani-

festado que es necesario realizar más investigaciones en cuanto al poder de resistencia de an-

tibióticos por parte de lactobacilos y bifidobacterias (FAO/WHO Expert consultation 2001).

De esta forma, los expertos recomiendan que las bacterias probióticas no debieran poseer

resistencia frente a antibióticos u otras drogas y plantea el requisito de que ningún probiótico

posea la capacidad de albergar en su genoma genes relacionados con la resistencia a antibióti-

cos, que puedan ser transferidos. Para valorar el fenómeno de resistencia se propuso la técni-

ca de los MIC (concentración mínima inhibitoria) basada en determinar la concentración más

baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después

de incubarlo. Gracias a esta técnica se obtienen valores correspondientes a la sensibilidad de

una cepa a un determinado antibiótico. Se han definido así los valores de resistencia a los que

se deben ajustar distintas cepas bacterianas, algunas correspondientes a probióticos, como

es el caso de los lactobacilos y enterococos. En el caso de superar estos valores, demostrando

una cualidad de resistencia frente a un determinado antibiótico, se deberían realizar experi-

mentos que probasen la transferibilidad de esta resistencia a otras bacterias, o en su defecto

una búsqueda de genes relacionados con la resistencia en el genoma de la cepa (Bhardwaj y

col. 2010; Eaton y col 2001) (ver tabla 5.3).

Introducción

48

Tabla 5.3 Valores MIC de resistencia a antibióticos

5.2.4 Actividades metabólicas

La microbiota intestinal juega un importante papel en cuanto a la actividad metabóli-

ca que realiza, influyendo en la digestión de hidratos de carbono, en el metabolismo lipídico

y en la homeostasis de la glucosa (Backed y col. 2006). Pero en algunos casos, las activi-

dades realizadas por la microbiota pueden ser perjudiciales, como es el caso de una ex-

cesiva deconjugación de sales biliares, degradación de mucinas, producción de amonio o

resistencia a antibióticos. El análisis de estas actividades metabólicas es preciso hacerlo con

cada una de las cepas con el fin de evaluar la seguridad de los probióticos.

Algunas cepas probióticas son capaces de producir aminas biógenas, compuestos

orgánicos alcalinos que se producen debido a la actividad amino-descarboxilasa de algu-

nos microorganismos. Aunque es cierto que las aminas biógenas son necesarias para cier-

tas funciones fisiológicas, una alta concentración de estos compuestos puede derivar en

graves problemas toxicológicos. La histamina y la tiramina tienen propiedades vasoactivas

am

pici

lina

van

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gen

tam

icin

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Lactobacillus homofermentativo obligado 1 2 16 16 16 1 1 4 4Lactobacillus helvericus 1 2 16 16 16 1 1 4 4Lactobacillus acidophilus 1 2 16 16 16 1 1 4 4Lactobacillus delbrueckii 1 2 16 16 16 1 1 4 4Lactobacillus heterofermentativo obligado 2 s.r. 16 16 64 1 1 8 4Lactobacillus reuteri 2 s.r. 8 16 64 1 1 16 4Lactobacillus fermentum 1 s.r. 16 32 64 1 1 8 4Lactobacillus heterofermentativo facultativo * 4 s.r. 16 64 64 1 1 8 4Lactobacillus plantarum 2 s.r. 16 64 s.r. 1 1 32 8Lactobacillus rhamnosus 4 s.r. 16 64 32 1 1 8 4Lactobacillus paracasei 2 s.r. 32 64 s.r. 1 1 4 4

Bifidobacterium 2 2 64 s.r. 128 0,5 0,25 8 4Enterococcus 4 4 32 512 128 4 4 2 8Pediococcus 4 s.r. 16 64 64 1 1 8 4Leuconostoc 2 s.r. 16 16 64 1 1 8 4Lactococcus lactis 2 4 32 64 64 2 4 4 8Streptococcus thermophilus 2 4 32 64 64 2 2 4 4Bacillus sp s.r. 4 4 8 8 4 4 8 8Propionibacterium 2 4 64 64 64 0,5 0,25 2 2Otras Gram + 1 2 4 16 8 0,5 0,25 2 2

Escherichia colis.r. Sin requerimientos* incluyendo Lactobacillus salivarius** posible interferencia con el medio de cultivo

4444

0,50,5

4

144

44444

qui

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isti

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rist

ina

44444

Introducción

49

y psicoactivas, mientras que la cadaverina y la putrescina potencian los efectos de las ante-

riores además de ser precursores de nitrosaminas carcinogénicas en alimentos (Bover-Cid

y col.1999). Dado que algunos lactobacilos tienen capacidad de producir estas sustancias

(Coton y col.1998; de las Rivas y col. 2005) resulta conveniente evaluar esta propiedad en

cualquier cepa que pretenda utilizarse con fines probióticos.

5.3 Funcionalidad

Durante las últimas décadas diversos trabajos han señalado determinadas caracter-

ísticas de las cepas que están directamente relacionadas con la actividad beneficiosa de las

cepas probióticas y que deberían valorarse a la hora de determinar el potencial probiótico

de una cepa determinada (Collins y col. 1998; Holzapfel y col. 1998; Mattila- Sandholm y

col.1999; Ouwehand y col. 1999; Tuomola y col. 2001).

Según su definición, para que una cepa sea considerada probiótica tiene que cumplir

la premisa de alcanzar viva la mucosa intestinal. Aunque ya hay diversa bibliografía que de-

muestra que ciertas bacterias inactivadas poseen efectos beneficiosos (He y col. 2002;2005;

Murosaki y col. 1998) se considera todavía un criterio de selección el hecho de que la cepa

sea capaz de resistir la digestión y colonizar el intestino para lo cual es fundamental que se

adhiera al epitelio intestinal.

5.3.1 Resistencia durante el tránsito por el aparato digestivo

La resistencia a la acidez gástrica y a las sales biliares es una característica esencial

a la hora de elegir un probiótico ya que son condiciones de estrés que constituyen una bar-

rera limitante para su supervivencia en el ecosistema.

Con el fin de demostrar si una cepa es capaz de aguantar estas condiciones, se reali-

zan estudios in vitro que simulan de alguna forma las condiciones de acidez producidas por

las secreciones gastrointestinales en individuos sanos (Charteris y col. 1998; Dunne y col.

2001; Fernández y col 2003; Martins y col. 2009), o el uso de modelos que simulan procesos

in vivo, como es el empleado y desarrollado por el TNO (Netherlands Organisation for Ap-

plied Scientific Research) en Holanda (Marteu y col. 1997). Tales modelos proporcionan los

datos con un mayor valor predictivo sobre la supervivencia de las bacterias probióticas que

los obtenidos con las técnicas in vitro mencionadas anteriormente.

Introducción

50

En humanos numerosos estudios demuestran que especies de lactobacilos y bifido-

bacterias son capaces de resistir las condiciones del proceso digestivo recuperándose vivas

en las heces (Jiménez y col. 2008; Olivares y col. 2007).

5.3.2. Adhesión y colonización intestinal

Este es un criterio fundamental ya que para la correcta acción de los probióticos es

indispensable que pasen un periodo de tiempo dentro del tubo digestivo. Este periodo por

lo general no suele ser muy largo, ya que su detección en heces es de unos días a semanas,

desapareciendo gradualmente, lo que indica una colonización transitoria en ausencia de

dosis repetidas (Johanson y col. 1993; Link-Amster y col. 1994).

Por lo tanto, la adherencia al mucus y a las células epiteliales se consideran propie-

dades que los probióticos deben poseer para ejercer efectos inmunomoduladores (Kotza-

manidis y col. 2010; Link – Amster y col. 1994; Martins y col. 2009; Schiffrin y col. 1995) y

para excluir la adhesión de patógenos (Bernet y col 1994).

Para probar la capacidad de adhesión y colonización en el intestino, se utilizan estu-

dios in vitro utilizando líneas celulares de enterocitos con mayor o menor grado de diferen-

ciación (Bernet y col. 1994; Dunne y col. 2001; Preising y col. 2010).

5.3.3 Propiedades beneficiosas

En cuanto a su actividad, los efectos beneficiosos de los probióticos se han relacio-

nado con su capacidad antibacteriana e inmunomoduladora (figura 5.1 y 5.2). Por ello para

valorar el potencial probiótico de una cepa se evalúan características tales como la capaci-

dad para producir sustancias antibacterianas, para competir por la adhesión a la mucosa

intestinal o para modular la respuesta inmunológica. Otras características intrínsecas de

las cepas como puede ser la producción de vitaminas, compuestos con capacidad antioxi-

dante como el glutatión, producción de oligosacáridos, etc son características que pueden

suponer un efecto beneficioso para la salud.

Introducción

51

Figura 5.1 Mecanismos de acción de los probióticos

Figura sacada de Lara-Villoslada y col. 2007a.

5.3.3.1. Propiedades antimicrobianas

Existen dos mecanismos por las cuales los probióticos desempeñan una función an-

timicrobiana, por una parte a través de la producción de sustancias antimicrobianas como

el ácido láctico y otros ácidos de cadena corta, bacteriocinas y metabolitos como el peróx-

ido de hidrógeno y por otra parte a través de fenómenos de competición por adhesión y

por substratos.

Existen numerosas bacteriocinas producidas por los probióticos y cada una tiene

espectros de inhibición particulares. Existen numerosos tipos distintos de bacteriocinas,

entre las que destacan la nisina, la pediocina y las plantaricinas entre otras.

El modo de acción es muy distinto si hablamos de un tipo de bacteriocina o de otro.

Por ejemplo la nisina y la pediocina actúan destruyendo la integridad de la membrana ci-

toplasmática a través de la formación de poros, lo que provoca la salida de compuestos

pequeños o altera la fuerza motriz de protones necesaria para la producción de energía

y síntesis de proteinas o ácido nucléicos (Montville y col. 1998). En un estudio se com-

Introducción

52

probó cómo los sobrenadantes de cultivos de probióticos pertenecientes a Lactobacillus

rhamnosus GG, Lactobacillys reuteri DSM 17938 inhibieron el crecimiento de Salmonella

entérica 1344, viéndose una clara reducción del crecimiento del patógeno en condiciones

de anaerobiosis (Keersmacker y col. 2006;Martinelli y col. 2010). Por otra parte estudios in

vitro realizados con 4 cepas aisladas de leche materna demostraron la capacidad de inhibir

el crecimiento de Staphilococus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella cholerasuis,

Escherichia coli y Clostridium así como de interferir en la adhesión de patógenos intestina-

les (Olivares y col. 2006a).

5.3.3.2. Inmunomodulación

El efecto de las bacterias probióticas sobre el sistema inmune es uno de los más

interesantes pues les permite actuar sobre una amplia variedad de patologías relacionadas

con desequilibrios de la respuesta inmunológica que van desde las enfermedades alérgicas

a las inflamaciones crónicas y de tipo autoinmune. Además, el posible papel de estos gru-

pos bacterianos en la maduración del sistema inmune del niño abre un campo de aplicación

muy interesante en el área de la prevención de este tipo de enfermedades.

En la regulación del sistema inmune por parte de bacterias comensales no sólo in-

tervienen las células del sistema inmune sino que también es importante la interacción

entre las bacterias y las células que forman el epitelio intestinal, los enterocitos (Iliev y col.

2007). Experimentos in vitro han demostrado cómo distintas cepas de probióticos modu-

lan la respuesta inmune induciendo a la expresión de un tipo u otro de citokinas, viéndose

como el Lactobacillus sakei induce a una mayor expresión de IL-1β, IL-8 Y TNFα mientras

que el Lactobacillus johnsonii estimula la producción de TGF β en células Caco 2 (Haller y

col. 2000). En otros estudios se analiza el carácter de tipo antiinflamatorio que puede po-

seer una cepa de probiótico por la reducción de la secreción de IL-8 por parte de células

Caco 2 o T 84 (Preising y col. 2010). El perfil de citokinas y otros mediadores inducido en los

enterocitos actuará sobre las células del sistema inmune diferenciándolas hacia un tipo de

respuesta determinada (figura 5.2).

Introducción

53

Figura 5.2 Probióticos e inmunomodulación

En esta figura se representan células del sistema inmune de la mucosa intestinal en situación normal (izquierda) y durante

infección (derecha). En condiciones normales las células dendríticas en contacto con bacterias comensales del lumen

intestinal segregan TSLP y TGFβ, dándose una condición de tipo no inflamatoria. Estas células permiten una presentación

de bacterias comensales y están envueltas en el conocido proceso de tolerancia. Por ello es posible que se desarrolle una

respuesta no inflamatoria, de tipo Th2 o Treguladora. En caso de infección los patógenos invasivos inducen a la liberación

de mediadores de la inflamación, incluyendo IL-8 y CCL20. Para iniciar una eficaz protección por parte del sistema inmune

es necesaria la actuación de las células dendríticas que responden rápidamente frente a estas bacterias patógenas. En

este caso las células dendríticas desencadenarán un tipo de respuesta Th1. (Figura extraída de Iliev y col. 2007).

Introducción

54

Además de ejercer su acción por medio del contacto con los enterocitos, las bacterias

son reconocidas por macrófagos y células dendríticas activando la respuesta inmunológica

(ver capítulo 2). Son numerosos los trabajos que demuestran que la activación varía cuali-

tativa y cuantitativamente entre unas cepas y otras. Además, si bien se han caracterizado

cepas con un perfil más antiinflamatorio y otras con un mayor perfil inmunoestimulante,

lo cierto es que en general presentan características inmunomoduladoras más o menos

potentes capaces de responder de diferente forma dependiendo del grado de activación

de las células del sistema inmune. De esta forma, en ausencia de estímulos, ciertas cepas

probióticas pueden actuar como agentes inmnoestimulantes produciendo un aumento de

la expresión de citokinas Th1 y mediadores inflamatorios, como lo son el TNFα, IL-12 e IL-2.

Sin embargo, estas mismas cepas son capaces de producir un efecto contrario en el caso

de que las células del sistema inmune se encuentren previamente activadas, reduciendo la

expresión de las citokinas inflamatorias a través de la inducción de citokinas de carácter

regulador como IL-10 (Díaz-Ropero y col.2006).

Existen estudios in vitro en los que se trabaja con modelos celulares distintos, como

lo son las células dendríticas, las células Natural Killer, linfocitos T o con células Kúpffer

(Dong y col.2010L; Martins y col. 2009; Pérez y col 2010; Verbeek y col.2009). En todos los

casos, se puede ver la respuesta que ejerce el probiótico en el sistema inmune y analizar

la respuesta tanto por medio de la activación celular como por el perfil de citokinas que se

segregan.

5.4. Aplicaciones de los probióticos. Probióticos y salud

Se han descrito numerosas aplicaciones de los probióticos (ver tabla 5.3) algunas de

las cuales están ya muy sustentadas por numerosos estudios clínicos y otras requieren de

más estudios que corroboren los resultados obtenidos hasta el momento.

Introducción

55

Tabla 5.3 Aplicaciones de los probióticos en patologías médicas

5.4.1. Intolerancia a la lactosa

La lactosa (galactosa-β-1,4-glucosa) es el carbohidrato predominante en la leche.

Su digestión requiere de un enzima intestinal específica, la lactasa, que hidroliza la lactosa

dando lugar a los monosacáridos galactosa y glucosa que son absorbidos en el intestino. En

individuos con deficiencia en los niveles de lactasa la lactosa no hidrolizada es fermentada

por la microbiota intestinal produciendo gases que junto con el aumento de la carga os-

mótica por la lactosa se traduce en síntomas como dolor abdominal, flatulencia, malestar

general e incluso diarreas moderadas o severas tras la ingestión de este azúcar. Esta alter-

ación afecta sobre todo a las personas mayores en las que los niveles de este enzima son

menores aunque puede aparecer desde niño por un defecto en la producción o actividad

de este enzima. Las bacterias ácido lácticas producen beta-galactosidasas capaces de hi-

drolizar este azúcar ayudando al organismo a la digestión del mismo. Numerosos estudios

Intolerancia a la lactosaGastroenteritis Aguda Asociada a antibióticos Gastroenteritis asociada a Clostridium difficile Diarrea del viajeroReacciones alérgicasInfecciones respiratorias en niños y en adultosCariesEnfermedad Inflamatoria Intestinal Enfermedad de Crohn Colitis ulcerosaOtras patologías intestinales Colon irritable Enterocolitis necrotizanteTratamiento en infecciones por Helicobacter pylori

Artritis reumatiodeCancerEnfermedades hepáticas inducidas por ethanolDiabetesMastitisObesidad

Aplicaciones clínicas en el presente

Posibles aplicaciones en el futuro

Introducción

56

demuestran un efecto beneficioso tras el consumo de probióticos en yogures, viéndose una

mayor digestión y posterior absorción de la lactosa (He y col. 2008; Kim y col. 1983; Kolars

y col. 1984; Lerebours y col. 1989 ; Ojetti y col. 2010).

A pesar de estas evidencias un meta análisis llevado a cabo en el 2005 concluyó que

la combinación de bacterias probióticas con productos lácteos no fermentados no mejora

la sintomatología de la intolerancia a la lactosa en adultos (Levri y col. 2005).

Más recientemente una guía publicada sobre el impacto de los probióticos sobre

la función digestiva concluye que si bien hay evidencias de efectividad de los probióticos

sobre la intolerancia a la lactosa ésta es dependiente de la cepa. Se sugiere además que

harían falta más estudios utilizando técnicas más específicas para evaluar el efecto (Rabot

y col. 2010).

5.4.2. Infecciones gastrointestinales

Diarreas agudas

Se han realizado muchos estudios en los que se demuestra un efecto beneficioso

en el consumo de probióticos en cuanto a su aplicación en las diarreas agudas, tanto en el

tratamiento como en la prevención de esta patología (Allen y col. 2003; Guandalini y col.

2000; Shornikova y col. 1997). La mayoría de los estudios hacen referencia a estudios con

niños, debido a la mayor incidencia de esta patología en la población infantil (Mastretta y

col. 2002; Szajewska y col. 2001) (ver capítulo 6). Una de las cepas de probióticos que más

se ha utilizado es el Lactobacillus rhamnosus GG (Guandalini y col. 2000; Shornikova y col.

1997; Mastretta y col. 2002; Szajewska y col. 2001). Diversos meta análisis demuestran que

hay datos consistentes de que el uso de ciertas cepas probióticas tiene efectos beneficiosos

en este tipo de diarreas (Allen y col. 2004; Szajewska y col. 2001; Van Niel y col. 2002).

El uso de probióticos en casos de diarrea infecciosa en pediatría es una terapia

aceptada en Europa (Wolvers y col. 2010). De hecho la ESPGHAN (Sociedad Europea de

Gastroenterología Pediátrica, Hepatología y Nutrición) junto con el Comité de expertos de

la Sociedad Europea de Enfermedades Infecciosas Pediátricas, concluyó que ciertas cepas

probióticas de las que se tienen ya datos de eficacia suficientemente sustentados pueden

ser usados como adyuvantes junto con la terapia de rehidratación en el tratamiento de ni-

ños con gastroenteritis aguda (Guarino y col. 2008).

Introducción

57

Diarreas asociadas a tratamientos antibióticos.

La diarrea asociada al consumo de antibióticos se define como aquella diarrea vin-

culada a la administración de antibióticos y sin otra causa evidente. Se ha demostrado un

beneficio preventivo en poblaciones de niños (Johnston y col. 2006;2007; Szajewska y col.

2006;) (ver capítulo 6). Existen evidencias clínicas que demuestran una eficacia en la pre-

vención y tratamiento de esta patología, viéndose una reducción de la sintomatología di-

arreica tras el consumo de probióticos como el Lactobacillus rhamnosus GG (Armuzzi y

col. 2001A;2001B; Arvola y col. 1999; Cremonini y col. 2002; Vanderhoof y col. 1999). Las

revisiones sistemáticas llevadas a cabo en los últimos años (D’Souza y col. 2002; Johnston y

col. 2007; Rajkumar y col. 2002; Wenus y col. 2008) muestran que ciertas cepas probióticas

tienen efectivamente la propiedad de reducir el riesgo de diarreas asociadas a tratamientos

antibióticos.

Una de los patógenos oportunistas que se asocia a las diarreas por tratamiento anti-

biótico es Clostridium difficile, productor de toxinas y responsable de gastroenteritis. Estu-

dios realizados en estos casos muestran que los probióticos poseen la capacidad de restau-

rar el balance microbiano y de esta forma bloquear la proliferación del C. difficile actuando

tanto a nivel preventivo como de tratamiento (Mc Farland y col. 1994; Plumer y col. 2004;

Porchapin 2000; Surawicz y col. 2000). Sin embargo hay pocos trabajos hechos y en algunos

de ellos los resultados son contradictorios (Lawrence y col. 2005; Wullt y col. 2003).

Diarrea del viajero.

Un tipo de diarrea en la que también se ha demostrado el efecto beneficioso de los

probióticos es la llamada diarrea del viajero. Se trata de una patología frecuente en viajeros

que se desplazan a climas más húmedos, calurosos y a países subdesarrollados. El agente

etiológico más común es el microorganismo Escherichia coli de tipo enterotoxigénica. Se

ha demostrado una reducción de las diarreas ocasionadas por esta patología gracias al uso

profiláctico de L. rhamnosus GG y S. boulardi (Young y col. 2003; Rolfe 2000). Además en

dos estudios se demostró una reducción de entre el 25% y el 50% en la incidencia de esta

enfermedad al consumir la cepa Lactobacillus rhamnosus GG (Hilton y col. 1997; Oksanen y

col. 1990). Recientemente un meta análisis concluyó que otras cepas como el Sacharomices

boulardii y la mezcla de Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium bifidum son efectivas en

la prevención de esta enfermedad (Mc Farland 2007). Sin embargo, la heterogeneidad en

Introducción

58

el diseño de los estudios tanto a nivel de cepa, dosis y duración del tratamiento hace que

sean necesarios más estudios que evidencien el efecto preventivo de los probióticos frente

a estas diarreas (Wolvers y col. 2010).

5.4.3. Prevención y tratamiento de reacciones alérgicas

La prevalencia de enfermedades atópicas, eczema atópico, rinoconjunivitis alérgica

y asma ha aumentado en los últimos años. Hasta la fecha, los estudios clínicos realizados

con probióticos en enfermedades alérgicas se han desarrollado principalmente en pedi-

atría, en casos de dermatitis común o dermatitis atópica, viéndose eficacia tanto en su

tratamiento como a nivel de prevención (ver capítulo 6).

También se han empleado los probióticos en otras patologías alérgicas como la rini-

tis alérgica y el asma en adultos, viéndose una mejora de la calidad de vida (Ichida y col.

2005; Pong y col. 2005; Xiao y col. 2006; Wong y col. 2004) al igual que una reducción en los

episodios de rinitis en niños (Gionnini y col. 2007). Una revisión sistemática del año 2008

recogió datos de 12 estudios clínicos controlados aleatorizados que evaluaban el efecto de

los probióticos sobre la rinitis alérgica y 4 sobre asma. La revisión concluye que si bien no

se observan efectos beneficiosos sobre el asma sí que se observa cierta efectividad en el

tratamiento de la rinitis alérgica (Vliagoftis y col. 2008).

5.4.4.Infecciones respiratorias en adultos y en niños

El número de estudios realizados en el tratamiento de enfermedades respiratorias

en adultos y en niños es limitado (ver capítulo 6). La utilización de probióticos ha sido eficaz

en cuanto a la reducción del tiempo de resfriado en adultos tras el consumo de una mezcla

probiótica compuesta por L. gasseri PA 16/8; B. longum SP 07/3 y B. bifidum MF 20/5 (de

Vrese y col. 2005; Wrinkler y col. 2005). El consumo de L.rhamnosus GG redujo también el

riesgo de padecer infecciones respiratorias en niños (Hatakka y col. 2001), aunque en otro

estudio no se corroboraron los resultados en adultos (Kekkonen y col. 2007). La mayoría

de los estudios llevados a cabo en los que se observa un efecto a este nivel argumentan la

efectividad en un aumento de la respuesta inmune, sin embargo muy pocos de ellos han

analizado la respuesta inmunológica de los sujetos para relacionarlo con la efectividad. El

limitado número de estudios junto con la alta variedad de cepas utilizadas hace necesaria

la realización de más estudios de investigación en este campo de aplicación. Además los

Introducción

59

estudios deberían incluir un análisis de la respuesta inmunológica con el fin de explicar los

mecanismos implicados en la actividad.

5.4.5. Prevención de caries

Las caries son perforaciones o daño estructural en los dientes. Suelen aparecer en

los niños y en los adultos jóvenes, pero pueden afectar a cualquier persona y son la causa

más importante de pérdida de los dientes en las personas más jóvenes.

Las bacterias presentes en la boca convierten todos los alimentos, especialmente

los azúcares y almidones, en ácidos. Los ácidos disuelven la superficie del esmalte del di-

ente y crean orificios en el diente (caries). Entre los microorganismos más cariogénicos

en humanos destaca Streptococcus mutans y también algunas especies de Lactobacillus.

El efecto antibacteriano de algunas cepas probióticas podrían actuar sobre el S. mutans

evitando el inicio o progresión de la caries. Un estudio realizado con niños demostró que

el consumo de Lactobacillus rhamnosus GG se tradujo en la reducción de la incidencia de

caries dental además de reducir la población de Streptococcus mutans en la cavidad oral

(Nase y col. 2001). Recientemente se ha comprobado como el consumo de Lactobacillus

rhamnosus LB21 unido a un aporte de flúor reduce la incidencia de caries en niños de 1 a 5

años de edad (Stecksén-Blicks y col. 2009). La aplicación de especies probióticas en la pre-

vención y/o tratamiento de la caries es todavía un campo muy poco explorado que requiere

de más estudios para su sustentación.

5.4.6. Tratamiento y prevención de la enfermedad inflamatoria intestinal y otras enfer-

medades intestinales.

Uno de los campos en los que se está trabajando mucho en los últimos años es el

uso de los probióticos en el tratamiento y prevención de enfermedades inflamatorias intes-

tinales tales como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa u otras patologías intestinales

como el síndrome del colon irritable y la enterocolitis necrotizante.

Se han realizado varios estudios con pacientes que cursaban la enfermedad de Crohn

en distintas fases de remisión o tras intervención quirúrgica. Se emplearon las cepas Sacha-

romices boulardi (Guslandi y col. 2000), Lactobacillus johnsonii LA1 (Martreau y col.2006;

Van Gossum y col. 2007) y Lactobacillus rhamnosus GG (Prantera y col. 2002; Schultz y col.

2004; Bousvarus y col. 2005). Sólo se manifestaron efectos positivos en el estudio realizado

Introducción

60

por Guslandi y colaboradores. Una revisión sistemática llevada a cabo en el año 2008 con-

cluye la ausencia de efectividad de los probióticos en esta patología (Rahimi y col. 2008). Sin

embargo dado que los estudios realizados hasta el momento son poco comparables entre

sí los resultados no son concluyentes.

En una revisión reciente se recogen las conclusiones acerca del uso de probióticos

en pacientes que sufren colitis ulcerosa (Ballesteros y col. 2010) tanto a nivel de admin-

istración en fase activa como eficacia en el tratamiento de remisión. Un estudio muestra

efectos beneficiosos del consumo de leche fermentada con bifidobacterias en pacientes

de colitis ulcerosa (Kato y col. 2004). También ha dado buenos resultados el uso de un

simbiótico formado por Bifidobacterium longum en asociación con un prebiótico, demost-

rando mejoría en sólo un mes (Furrie y col. 2005). Se han probado otras cepas en la colitis

ulcerosa activa, como el Saccharomyces boulardii viéndose resultados positivos (Guslandi y

col. 2003). Otro probiótico estudiado en colitis ulcerosa activa, VSL#3, mezcla probiótica de

cuatro lactobacilos, tres bifidobacterias y Streptococcus thermophilus, durante 6 semanas,

demostró una remisión en un 53% y respuesta parcial en un 24% (Bibiloni y col 2005).

Existen estudios que evalúan el efecto en el mantenimiento de la remisión, com-

parándose en muchos casos el efecto del probiótico con el del fármaco que se utiliza habit-

ualmente. Escherichia coli Nissle 1917 ha demostrado resultados similares a la mesalazina

(Kruis y col. 1997; 2004; Rembacken y col 1999). Dos estudios han evaluado el efecto de

una leche fermentada con bifidobacterias y lactobacilos (Bifidobacterium bifidum YIT 4007,

Bifidobacterium breve YIT 4065 y Lactobacillus acidophilus YIT 0168) añadido al tratamiento

convencional con mesalazina observándose un efecto beneficioso a la hora de mantener la

remisión (Kato y col. 2004; Ishikawa y col. 2003). Un estudio publicado con VSL#3 ofrece in-

teresantes tasas de remisión de hasta un 75% en un año en pacientes en remisión (Venturi

y col. 1999). La balsalacida (profármaco de mesalazina) asociada a VSL#3 en pacientes con

colitis ulcerosa activa, demostró un ligero beneficio en cuanto a mayor rapidez de acción

que la balsalacida sola (Tursi y col. 2004). Por último, se ha publicado recientemente un en-

sayo con Lactobacillus rhamnosus GG solo o en combinación con mesalazina y parece que

es efectivo en prolongar el tiempo de remisión (Zocco y col. 2006).

Como conclusión, en la colitis ulcerosa activa se ha sugerido que E. coli Nissle podría

ser equivalente a la mesalazina en la inducción de la remisión, observándose también una

Introducción

61

mejoría clínica en estudios con bifidobacterias. Otros probióticos como el Saccharomices

boulardii y el VSL#3 parecen poseer efectos prometedores aunque es necesaria la real-

ización de más estudios controlados. Una vez conseguida la remisión, Escherichia coli Nissle

1917, bifidobacterias y Lactobacillus rhamnosus GG parecen ser tan eficaces como la me-

salazina en el mantenimiento de la remisión en los pacientes con colitis ulcerosa, siendo

VSL#3 también similar a la balsalacida (Ballesteros y col. 2010).

El síndrome de colon irritable se caracteriza por dolor abdominal, flatulencia, dis-

tensión abdominal, cambios en la frecuencia de defecación y consistencia de las heces.

Estos síntomas se pueden producir de manera individual o combinados. En una revisión

reciente se repasan los estudios realizados en los que se evalúa el efecto de los probióticos

en pacientes que sufren esta enfermedad (Haller y col. 2010). Existen evidencias de efectos

beneficiosos como es el caso del Lactobacillus rhamnosus GG en niños, mejorándose la sin-

tomatología (Bausserman y col. 2005; Gawronska y col. 2007). También se han visto efectos

positivos en la mejora de la sintomatología producida por esta patología tras el consumo

de Bifidobacterium infantis en mujeres adultas (Whorwell y col. 2003), Bifidobacterium ani-

malis DN-173 010 (Guyonnet y col 2007) y una mezcla de Escherichia coli DSM 17252 y En-

terococcus faecalis DSM 16440 (Enck y col. 2008). También se demostró una mejora en la

sintomatología de pacientes de colon irritable tras el consumo de Lactobacillus paracasei

B21060 junto con un prebiótico (Andriulli y col. 2008).

Como conclusión se postula que cepas de bifidobacteria, Latobacillus, E. coli, En-

terococcus faecalis y mezclas de distintas cepas de probióticos han demostrado ser efecti-

vas en la mejora de la sintomatología típica de esta enfermedad, aunque el mecanismo de

acción sigue sin conocerse (Haller y col. 2010).

En la última década se han estudiado los efectos que producen los probióticos en

niños prematuros con el fin de ver si existe una efectividad en prevenir los casos de entero-

colitis necrotizante, viéndose interesantes resultados que serán comentados con mayor

detalle en el capítulo 6.

5.4.7. Tratamiento en infecciones por Helicobacter pylori

Las infecciones debidas a Helicobacter pylori son una de las principales causas de

gastritis crónicas y úlceras gástricas además de estar vinculadas a patologías como el cánc-

Introducción

62

er de estómago. Existen varios trabajos en los que se evalúan los posibles efectos de los

probióticos en la reducción de esta infección y mejoras en su sintomatología. Para ello es

necesario una mejora en el tratamiento de erradicación del patógeno para prevenir así

una mayor progresión de la patología gástrica y por consiguiente un posible desarrollo de

cáncer gástrico. En el futuro, el tratamiento contra este patógeno se verá dificultado por

la tolerancia y resistencia a antibióticos que posee esta bacteria junto con los efectos no

deseados y la falta de eficacia que en algunas ocasiones provoca el tratamiento (Deltene

y col. 1998; Perri y col. 2003). Por ello, los probióticos se presentan como una interesante

alternativa como tratamiento de la infección causada por H. pylori.

Algunos probióticos han demostrado ser eficaces en la eliminación de la bacteria

además de producir efectos beneficiosos en la tolerancia del tratamiento. Un ejemplo de

ello sería el caso de Lactobacillus acidophilus LB que mejoró la eliminación de H. pylori

(Canducci y col. 2000). Por otro lado, la toma de probióticos ejerce un beneficio en trastor-

nos asociados al tratamiento, como pueden ser diarreas asociadas al consumo de anti-

bióticos, como se ha comentado anteriormente. Estudios han demostrado un aumento en

la eliminación del patógeno y en la calidad de vida de los pacientes tras el consumo de L.

rhamnosus GG (Armuzzi y col. 2001 A; Armuzzi y col. 2001 B), Saccharomices boulardi (Cre-

monini y col. 2002a) o la combinación de L. acidophilus con B. lactis (Cindoruk y col. 2007).

La mezcla de distintos probióticos como el L. rhamnosus GG, L rhamnosus LC705,

Propionibacterium freidenreichii subespecie shermanii JS y Bifidobacterium breve 99 ha

mejorado la tolerancia y la calidad de vida en pacientes bajo terapia contra la infección por

H. pylori además de mejorar en la eliminación del patógeno (Myllyluoma y col. 2005) al

igual que la combinación de B. animalis Bb12 y L. acidophilus LA5 (Sheu y col. 2002; 2006).

Existen estudios en los que se ha analizado la capacidad del probiótico en atenuar

los cambios en la microbiota gastrointestinal tras un tratamiento contra H. pylori. De hecho,

la combinación de 2 cepas de L. acidophilus (CLT60 Y CUL 21) y otras dos cepas de Bifido-

bacterium bifidum (CUL17 y Rhodia) ha demostrado inhibir los cambios en la microbiota

típicos tras el tratamiento, como lo son un incremento de anaerobios facultativos al igual

que un aumento de enterococos resistentes a antibióticos (Madden y col. 2005; Plummer

y col. 2005). La combinación de L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LC705, Propionibacterium

freidenreichii subespecie shermanii JS y Bifidobacterium breve 99, además de los efectos

Introducción

63

beneficiosos comentados anteriormente, en un estudio posterior se demostró cómo tam-

bién la mezcla de probióticos ayudó en la estabilización de la microbiota tras el tratamiento

antibiótico contra el patógeno (Myllyluoma y col. 2007).

Por otro lado, se ha demostrado una reducción en la inflamación gástrica produ-

cida por este patógeno tras el consumo de Lactobacillus acidophilus La1 (Pantoflickova y

col. 2003; Gotteland y col. 2008). Varios estudios demuestran que el consumo de L. gas-

seri OLL2716, L. casei y L reuteri ATCC 55730 produce una reducción en la colonización del

patógeno, erradicándolo al mismo tiempo que reduce la inflamación gástrica (Cats y col.

2003; Francavilla y col. 2008; Sakamoto y col. 2001).

Por el contrario existen estudios clínicos en los que no se ven efectos positivos tras

el consumo de probióticos como en el estudio presentado por Wendakon y colaboradores

utilizando L. acidophilus, L. bulgaricus y Stretococcus thermophilus (Wendakon y col. 2002).

En una reciente revisión se analizan todos los estudios nombrados en este apartado y se

concluye que no existen claras evidencias en cuanto a la eficacia de los probióticos en la in-

fección por Helicobacter pylori aunque existen estudios con resultados prometedores, pero

es necesaria la realización de más estudios para confirmar un posible efecto beneficioso

(Wolvers y col. 2010).

5.4.8. Aplicaciones médicas de los probióticos en el futuro.

Los resultados preliminares en humanos junto con resultados obtenidos en ensayos

in vitro y con animales de experimentación hacen pensar en nuevas áreas de aplicación con

probióticos.

Estas nuevas áreas poseen un bajo número de estudios y requieren de la realización

de múltiples estudios de investigación en el futuro para así poder confirmar el posible

efecto del consumo de un determinado probiótico en una determinada patología. Existen

varios ejemplos, como es el caso de la artritis reumatoide, en la cual parece que podrían

haber efectos beneficiosos aliviando los síntomas de esta enfermedad (Baharav y col. 2004;

Hatakka y col. 2003), o enfermedades de origen cancerígeno, donde existen estudios con

animales de experimentación que muestran una inhibición o progresión del cáncer de co-

lon y de vejiga, (Goldin y col. 1996; Lim y col. 2002), y un efecto preventivo en el cáncer de

hígado (Lathinen y col. 2004; Haskard y col. 2000).

Introducción

64

Recientemente se han realizado estudios preliminares con pacientes de cáncer de

colon viéndose como la administración de probióticos puede ser una alternativa efectiva al

modificar la flora intestinal y activar el sistema inmune (Gianotti y col. 2010; Ohara y col.

2010).

Por otro lado existen estudios con animales de experimentación que han demostra-

do una posible utilidad de los probióticos en la mejora de la tolerancia a la glucosa en mod-

elos de diabetes (Tabuchi y col. 2003) al igual que en modelos de daño hepático producido

por etanol (Nanji y col. 1994).

Recientemente se ha demostrado cómo los probióticos pueden ejercer un efecto

beneficioso en mujeres en época de lactancia que sufren mastitis. Los probióticos se per-

filan como una interesante alternativa ya que en muchos casos el tratamiento con anti-

bióticos no es eficaz, probablemente debido a la resistencia a antibióticos desarrollada por

los patógenos. Existen muy pocos estudios clínicos realizados en esta área y los resultados

obtenidos son prometedores beneficiando a las mujeres tras el consumo del probiótico,

mejorando la sintomatología y su calidad de vida (Arroyo y col. 2010; Jiménez y col. 2008).

La microbiota intestinal se considera un nuevo factor implicado en la regulación del

peso corporal y en enfermedades metabólicas como puede ser la obesidad (ver capítulo 5).

La microbiota posee una relación directa con el metabolismo y se ha estudiado su

relación con enfermedades metabólicas como es el caso de la obesidad (ver capítulo 5). La

aplicación de los probióticos en este campo es un área de investigación muy novedosa y se

plantea como una estrategia que podría ayudar a controlar trastornos metabólicos. Existen

estudios realizados en animales de experimentación que muestran un posible efecto frente

a la obesidad. El empleo de una leche fermentada por Lactobacillus gasseri SBT2055 redujo

el tamaño de los adipocitos y los niveles de leptina en suero en ratas, lo que sugiere un

efecto en la regulación del crecimiento del tejido adiposo y, posiblemente en la obesidad

(Sato y col. 2008). En otro estudio el producto VSL#3, que es una mezcla de géneros Lacto-

bacillus, Bifidobacterium, Streptococcus produjo también un efecto beneficioso en ratones

a nivel metabólico mejorando la esteatosis y la resistencia a insulina inducida en ratones

por una dieta rica en grasas además de evaluarse un posible efecto antiinflamatorio (Ma y

col. 2008).

Introducción

65

Otros estudios han demostrado efectos positivos en la administración de algunos

probióticos en el metabolismo de lipoproteínas y colesterol tras el empleo L. acidophilus en

ratas con hipercolesterolemia inducida por la dieta (Park y col. 2007) y L. paracasei NCC2461

junto con L. rhamnosus NCC4007 en ratones (Martín y col. 2008).

En cuanto a ensayos clínicos en humanos son muy pocos los estudios realizados

hasta el momento, viéndose en algunos de ellos efectos positivos como una reducción de

la presión arterial sistólica, la leptina y el fibrinógeno en suero y por tanto, del riesgo cardio-

vascular tras el consumo de L. plantarum 299v en personas hipercolesterolémicas y fuma-

doras (Naruszewicz y col. 2002). Por el contrario en otros estudios no se manifestaron efec-

tos beneficiosos tras el consumo de probióticos como el L. acidophilus DSS-1 y B. longum

UABL-14 unidos a un prebiótico en sujetos normocolesterolémicos (Greany y col. 2008).

En una reciente revisión en la que se trata la influencia de la microbiota en la obesi-

dad y las alteraciones del metabolismo se concluye con que las diversas evidencias científi-

cas demuestra una relación entre la composición de la microbiota intestinal y la obesidad.

Aunque esta línea de investigación está tan sólo en su inicio, las investigaciones efectuadas

están aportando una información clave para conocer nuevos factores implicados en el de-

sarrollo de la obesidad y de otras enfermedades metabólicas, así como para mejorar las

estrategias de intervención nutricional para prevenirlas (Sanz y col. 2009).

Introducción

67

6. Probióticos en la alimentación infantil.

La leche materna es el mejor alimento para los bebés durante sus fases de rápido

desarrollo, puesto que no sólo aporta todos los nutrientes necesarios, sino que además

contiene importantes factores funcionales implicados en el desarrollo y la maduración del

sistema inmunitario neonatal, así como en la protección frente a infecciones. Entre estos

factores se incluyen también las bacterias comensales de la leche materna. Entre los efec-

tos que se han sugerido para dichas bacterias cabe resaltar su papel antimicrobiano, antiin-

flamatorio y/o modulador de la respuesta inmunitaria. La demostración de la existencia de

bacterias en la leche materna y los efectos beneficiosos potencialmente ejercidos por éstas

en el lactante ofrecen nuevas alternativas para la sustentación de las propuestas dirigidas a

la inclusión de determinadas cepas probióticas en las fórmulas infantiles.

En numerosos estudios se ha demostrado cómo la microbiota intestinal de niños

alimentados por medio de leche materna es distinta a la de los alimentados por fórmulas

infantiles, predominando los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium en los niños que con-

sumen leche materna, mientras que los que se alimentan por medio de fórmulas infantiles

predominan otros grupos bacterianos como los del género Clostridia. Entre los géneros a

destacar en la microbiota infantil existen los Bacteroides, Bifidobacterium, Staphylococcus,

Lactobacillus además de Escherichia coli y Clostridia (Harmsen y col. 2000a; Heine y col.

1992; Rubalelli 1998). Esta diferencia en la microbiota probablemente esté relacionada con

la presencia de bacterias ácido lácticas en la leche materna además de otros compuestos

bifidogénicos tales como los oligosacáridos (Kunz y col. 1993). La microbiota presente en

los niños alimentados con leche materna es más rica en ciertos géneros bacterianos que

podrían ser responsables de algunos de los beneficios de la lactancia materna en los niños.

Así, los niños alimentados con formula infantil tienen 17 veces más de riesgo de ser hospi-

talizados por neumonía que los niños que han sido exclusivamente alimentados con leche

materna (Cesar y col. 1999). De igual forma, el riesgo de muerte por diarrea se incrementa

14,4 veces en niños alimentados con fórmula infantil (Victoria y col. 1987). La lactancia

materna también se ha relacionado con una menor incidencia en otitis media (Duncan y

col 1994), infecciones del tracto urinario (Pisacane y col. 1992) y meningitis causadas por

Haemophilus influenzae (Sifverdal y col. 1999). Por último la lactancia materna exclusiva

durante los primeros meses de vida se ha relacionado con menor incidencia de asma y der-

matitis atópica aunque todavía se tendrán que realizar más estudios que confirmen estas

Introducción

68

observaciones pues otros estudios han encontrado resultados contradictorios (Gdalevich y

col. 2001a; Gdalevich y col. 2001b; Mihrshahi 2007).

Las bacterias con propiedades probióticas que son transferidas al niño a través de la

leche materna podrían estar contribuyendo a estos beneficios a través de sus efectos tanto

a nivel de inhibición del crecimiento de patógenos como por la capacidad de modificar la

microbiota del tracto gastrointestinal junto con las propiedades de tipo inmunomodulado-

ras que poseen. Con el objetivo de que los niños alimentados con fórmula infantil adqui-

eran una flora beneficiosa similar a la de los niños alimentados con leche materna, en los

últimos años se están incorporando a las fórmulas infantiles ingredientes que promuevan

esta microbiota bien a través de la adición de componentes prebióticos como oligosacári-

dos o bien añadiendo directamente cepas bacterianas probióticas (ver tabla 7.1). El descu-

brimiento reciente de bacterias probióticas en la leche humana apoya la adición de estas

bacterias a las fórmulas infantiles.

La legislación por la que se regula la composición de las fórmulas se valora en primer

lugar por comités de expertos. Un ejemplo sería el comité de nutrición de la ESPGHAN (So-

ciedad Europea de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica) y la NASPGHAN

(Asociación Norteamericana de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica).

Las recomendaciones de ambos comités son evaluadas por la Comisión Europea, la cual

crea una serie de leyes en donde viene recogida la posibilidad de incluir determinados

ingredientes en las fórmulas o en caso contrario su prohibición. De hecho, la ESPGHAN

recomienda que la adición de probióticos a una fórmula infantil debería proponerse tras

la realización de una serie de estudios donde se demuestren las propiedades beneficiosas

de los probióticos a utilizar, además de especificar la dosis a la cual se debe administrar,

junto con la seguridad de la bacteria probiótica (ESPGHAN Comittee on Nutrition 2004).

Similares conclusiones son aportadas por la NASPGHAN, además de centrarse en que cada

probiótico ejerce un efecto concreto y que por ello a la hora de incluirse en un alimento se

debe especificar cuál es y si se encuentra de forma viable o no viable. Además este Comité

recoge una serie de estudios en los cuales se ven los efectos demostrados de los probióticos

en fórmulas infantiles tales como diarreas o infecciones respiratorias (NASPGHAN 2006).

Introducción

69

Tabla 6.1 Ejemplos de fórmulas infantiles del mercado español con probióticos añadidos.

Introducción

70

Recientemente ha sido publicado un nuevo documento redactado por el Comité de

Nutrición de la ESPGHAN que sistemáticamente revisa las publicaciones relacionadas con la

seguridad y efectos beneficiosos de la administración de fórmulas infantiles con prebióticos

y/o probióticos en comparación con fórmulas infantiles no suplementadas (ESPGHAN Com-

mittee on Nutrition 2011). En este apartado se expondrán algunas de las conclusiones ob-

tenidas por este comité de expertos además de mencionar y repasar otros estudios científi-

cos que abordan el tema de la alimentación infantil y los probióticos y del efecto que puede

tener el consumo de estos microorganismos frente a una serie de patologías comunes en

pediatría (ver tabla 6.2).

6.1. Infecciones gastrointestinales

Las infecciones gastrointestinales son una afección común en la infancia, especial-

mente en los tres primeros años de vida. En los países industrializados la mortalidad de-

bida a este tipo de infecciones es escasa, pero todavía sigue siendo causa importante de

morbilidad, llegando, aunque cada vez en menor frecuencia, a motivar deshidratación, que

puede poner en peligro la vida del niño. En los países en vías de desarrollo, la diarrea se

considera la primera causa de mortalidad, favorecida por el binomio infección-malnutrición

(Cruz 2006).

Los virus están considerados en el momento actual como los principales respon-

sables de gastroenteritis, sobre todo en el lactante. En general, originan la destrucción de

los enterocitos, que son sustituidos por células más jóvenes, con mayor capacidad secre-

tora, produciendo una diarrea de tipo osmótico. Aproximadamente el 40% de los casos

de diarrea aguda en niños menores de 5 años es provocada por rotavirus mientras que el

30 % son causadas por otros virus, principlamente norovirus y adenovirus. Agentes bacte-

rianos (Campilobacter jejuni, Yersinia, Salmonella, Shigella, E coli patogénica o Clostridium

difficile) son los responsables del 20% de los casos (Koletzo y col. 2009). Las diarreas por

parásitos son menos frecuentes y entre los parásitos que con mayor frecuencia motivan la

diarrea infecciosa son Giardia lamblia o intestinalis y Crystosporidium. Motivan alteración

de las vellosidades intestinales en sentido de atrofia con malaabsorción secundaria, princi-

palmente de azúcares (Cruz 2006).

En España, los datos correspondientes al año 2007 muestran como de todas las hos-

pitalizaciones debidas a agentes infecciosos, más del 50% del total se producen en niños

Introducción

71

menores de un año (Regidor y col. 2009). Como se ha comentado anteriormente uno de

los efectos beneficiosos más demostrado de las bacterias probióticas es su capacidad para

reducir la incidencia y severidad de infecciones gastrointestinales por lo que una acción

preventiva en niños de baja edad con bacterias probióticas de actividad demostrada sería

una alternativa eficaz en la prevención de este tipo de patologías.

En niños menores de 6 meses se han realizado muy pocos estudios con fórmulas

infantiles adicionadas con probióticos que además no han mostrado efectividad. En estos

estudios se han utilizado cepas como B. lactis, o de B. longum BL999 y L. rhamnosus LPR

(Velaphi y col. 2008; Chouraqui y col. 2008). Sin embargo en niños a partir de 6 meses se

han realizado más estudios, algunos de los cuales han obtenido resultados positivos. Con B.

lactis varios estudios muestran que esta cepa sola o en combinación con otras cepas tiene

efectos beneficiosos reduciendo el número de días de duración de la diarrera así como la

incidencia de diarrea (Correa y col. 2005; Saavedra y col. 1994; Weizman y col. 2005). Sin

embargo en otro estudio utilizando la misma mezcla de probióticos no se observa efecto

(Phuapradit y col. 1999). Otros estudios en niños con Lactobacillus GG revelan resultados

también contradictorios en cuanto a la prevención de diarreas infecciosas ya que existen

estudios en los que se observa una reducción del riesgo de padecer gastroenteritis por ro-

tavirus (Szajewska y col. 2001) mientras que en otros no se vieron diferencias significativas

tras el empleo del Lactobacillus GG (Mastretta y col.2002).

El Comité de Nutrición de la ESPGHAN concluye en su revisión que la efectividad de

los probióticos en la reducción de las infecciones gastrointestinales se tiene que demostrar

con la realización de más estudios. Existen muy pocos estudios a edades inferiores a 6 me-

ses y aunque es posible que exista una evidencia de una reducción en la incidencia de infec-

ciones de tipo gastrointestinal en niños mayores de 6 meses ésta necesita ser corroborada

con más estudios (ESPGHAN Committee on Nutrition 2011). Además, es necesario tener en

cuenta un análisis detallado del diseño del estudio realizado, al igual que la dosis y la cepa

de probiótico utilizada debido al carácter único de cada cepa.

6.2. Infecciones respiratorias

Las infecciones respiratorias son una de las patologías más frecuentes en pediatría.

Los virus son los principales agentes de las infecciones respiratorias, teniendo en

el resfriado común a un gran número de virus como agentes etiológicos, entre los que se

Introducción

72

encuentran los Rinovirus, Coronavirus, Adenovirus, entre otros. La laringitis es producida

principalmente por el virus parainfluenciae, mientras que la neumonía y la bronquitis pu-

eden deberse a una etiología vírica o bacteriana por la presencia del Pneumococo o el

Streptococcus pyogenes (Machuca y col 2011).

Existen muy pocos estudios realizados con niños de edades menores de 6 meses

en los que se tenga en cuenta la incidencia en infecciones respiratorias. En un estudio en

el que se utilizaron las cepas Lactobacillus rhamnosus GG y Bifidobacterium lactis Bb12

se demostró que el consumo de ambas cepas en una fórmula infantil reducía el riesgo de

padecer una enfermedad respiratoria en niños menores de 6 meses (Rautava y col. 2009).

En cambio en otros estudios en los que se emplearon fórmulas infantiles enriquecidas con

B. lactis, L. reuteri ATCC 55730 y L. johnsonii La1 no se vieron diferencias ni una reducción

de la incidencia en las infecciones respiratorias (Brunser y col. 2006; Velaphi y col. 2008;

Weizman y col. 2005).

De nuevo son necesarios más estudios para poder evaluar el posible efecto de los

probióticos en cuanto a infecciones respiratorias, ya que el número de estudios es muy

limitado y variable y los resultados no son concluyentes.

6.3. Desórdenes intestinales menores

Los desórdenes de tipo gastrointestinal como son los cólicos o el estreñimiento son

desórdenes comunes en el niño que podrían ser mejorados con el tratamiento probiótico.

No se han visto diferencias ni reducciones en la incidencia de cólicos con respecto a niños

menores de seis meses a la hora de incluir probióticos en su alimentación, ni tampoco diferencias

en cuanto a la frecuencia en deposiciones en los estudios realizados utilizando los probióticos

B. lactis o L. reuteri ATCC 55730 (Weizman y col. 2006), B. longum BL 999 ni tampoco con la

utilización de L. rhamnosus LPR (Chouraqui y col. 2008). En cambio, en el estudio realizado por

Vendt y colaboradores empleando el probiótico Lactobacillus rhamnosus se produce un aumento

en la frecuencia de deposiciones pero no existe una reducción en cuanto a la incidencia a cólicos

(Vendt y col. 2006). Similares resultados se obtuvieron en cuanto a la consistencia de la materia

fecal, viéndose que sólo en el caso del empleo del probiótico LGG se vieron diferencias aumen-

tándose la facilidad en las deposiciones (Vendt y col. 2006) y de igual forma con la utilización de

L. reuteri ATCC 55730 y B. lactis (Weizman y col. 2006).

Introducción

73

En niños de más de cuatro meses de edad se han dado similares resultados aunque

existe un estudio en el que si se aprecia una reducción en la incidencia de cólicos emple-

ando los probióticos B. lactis y S. thermophilus (Saavedra y col. 2004).

Un estudio publicado en 2010 y que no ha sido incluido en la revisión de la ESPGHAN

(Savino y col. 2010) muestra que la administración de L. reuteri DSM 17938 mejoró consid-

erablemente los síntomas en niños que sufrían de cólico infantil.

Es necesario realizar más estudios sobre todo en edades inferiores a seis meses

sobre los cuales el número de estudios es todavía demasiado bajo. Estos nuevos estudios

deberían además profundizar más en los mecanismos a través de los cuales se produce el

efecto.

6.4. Alergias

Como ya he comentado en capítulos anteriores, en la actualidad existe un aumento

en el porcentaje de la población que sufre algún tipo de alergia. El por qué de este aumento

es motivo de controversia y de discusión. En un proceso alérgico existe un desequilibrio

de las respuestas inmunológicas Th1 y Th2, predominando la respuesta de tipo Th2. Una

hipótesis muy plausible es la denominada “hipótesis de la higiene”, la cual se basa en que

una menor exposición en los primeros años de vida a antígenos hace que se desarrollen con

mayor facilidad patologías alérgicas en el futuro (ver capítulo cinco).

Se han encontrado diferencias en al microbiota de los niños alérgicos respecto a los

no alérgicos (Bjorksten y col. 2001; Källiomaki y col. 2001a; 2001b; Wang y col. 2008). Este

hecho junto con el carácter inmunomodulador de ciertas cepas probióticas ha argumen-

tado la evaluación de los posibles efectos de los probióticos sobre la alergia.

Curiosamente en el campo de las enfermedades atópicas y de tipo alérgico la pre-

vención en niños se ha abordado desde el tratamiento de la madre durante el embarazo. El

objetivo del tratamiento de la madre durante el embarazo es modular la respuesta inmune

de la madre modificando así los factores inmunológicos que son transferidos a través de

la leche materna. Un estudio llevado a cabo en el año 2002 mostró que el tratamiento de

la madre con una cepa probiótica durante el embarazo y lactancia incrementó la concen-

tración de TGFβ2 en la leche materna y disminuyó el riesgo de eczema atópico en los niños

(Rautava y col. 2002). Este estudio no contemplaba el tratamiento de los niños. El estudio

Introducción

74

se inició antes de las primeras publicaciones sobre la presencia de bacterias ácido lácticas

en la leche materna por lo que no preveía que además del efecto sobre el sistema inmune

de la madre, se pudiera producir la transferencia de la cepa probiótica desde la madre al

niño a través de la leche materna.

Otros estudios incluyeron además del tratamiento de la madre, el tratamiento del

niño durante los primeros meses de vida. Un estudio cuyos primeros resultados se pub-

licaron en el año 2001, mostró una reducción significativa en la incidencia de dermatitis

atópica en los niños a los 2 y a los 4 años de edad utilizando Lactobacillus GG (Kalliomaki

y col. 2001;2003). También se han manifestado reducciones en la incidencia de alergias

en otros estudios tras el consumo de una mezcla de probióticos, B. lactis, B. bifidum y L.

acidophilus por parte de la madre y del niño (Kim y col. 2010) así como tras el uso de una

mezcla de probióticos y prebióticos (Kukkonen y col. 2007) o tras el consumo de Lactobacil-

lus reuteri ATCC 5730 (Abrahamsson y col. 2007).

Estos resultados positivos contrastan con otros estudios en los cuales no se demues-

tra actividad. En general, aunque se han realizado casi 20 estudios en niños que analizan

el efecto de los probióticos sobre enfermedades alérgicas ocho de ellos fueron realizados

con L. rhamnosus LGG de los cuales sólo 4 obtuvieron resultados positivos. El resto de los

estudios incluyen resultados de más de 20 cepas diferentes con resultados muy variables

por lo que es muy difícil obtener conclusiones sólidas (Kalliómaki y col. 2010).

6.5. Diarrea asociada al consumo de antibióticos

La diarrea asociada a antibióticos (DAA) se define como aquella diarrea vinculada a

la administración de antibióticos y sin otra causa evidente. Entre el 11 y el 40% de los niños

tratados con antibiótico sufren diarreas asociadas al tratamiento (Turck y col. 2003). Puede

desarrollarse desde pocas horas después de iniciar una terapia con antibióticos o hasta 6-8

semanas tras su suspensión. La DAA suele ser consecuencia de alteraciones en la ecología

de la flora intestinal inducidas por la toma de antibióticos (Cristian 2007).

Existen estudios en los que se ha evaluado la eficacia de los probióticos en las diar-

reas producidas tras la ingesta de antibióticos. Se ha demostrado una reducción de hasta el

60% en los casos de diarreas por antibióticos al emplearse Saccharomices Boulardii en adul-

tos y Lactobacillus GG en niños (Cremonini y col.2002b; D´Souza y col. 2002). Otros estudios

Introducción

75

señalan la efectividad de los probióticos Bifidobacterium lactis, Streptococcus thermophi-

lus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis reduciendo significativamente los

casos de DAA (Jirapinyo y col.2002 ;Saavedra y col. 2004). Por el contrario una combinación

de Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus acidophilus no fue efectiva en la prevención de

diarrea en niños que recibían un tratamiento con amoxicilina (Tankanow y col. 1990).

6.6. Enterocolitis necrotizante

La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad grave que afecta a recién

nacidos, en especial a prematuros, con una incidencia y morbilidad elevadas. Comprende

síntomas variados y variables como por ejemplo sangre en heces, intolerancia a la aliment-

ación y sepsis entre otros. El resultado final es una cascada inflamatoria que se desencade-

na en recién nacidos con determinados factores de riesgo y que lleva a una necrosis de la

pared intestinal (Jiménez y col. 2006).

En los últimos años se está empezando a recurrir al uso de probióticos en niños pre-

maturos. Este es un tema muy delicado ya que el intestino de los niños prematuros es un

órgano inmaduro, muy frágil y sensible. Hay que tener en cuenta que los niños prematuros

son un grupo de riesgo, por lo que se debe tener especial cuidado. Presentan una microbi-

ota distinta a la de niños no prematuros al igual que una colonización distinta, caracterizada

por un retraso y una baja diversidad bacteriana (Gewolb y col. 1999) en la que parecen pre-

dominar especies Gram negativas aerobias y una baja proporción de anaerobias (Hoy 2000;

Hoy y col. 2001). La etiología exacta de la enfermedad no se conoce con exactitud, aunque

esta atípica flora intestinal unida a la antibioticoterapia que se emplea en muchas ocasiones

parece predisponer a los niños a padecerla (Kliegman y col. 2004).

Algunos estudios han mostrado que tratamientos preventivos con probióticos reducen la in-

cidencia a padecer esta enfermedad (Alfaleh y col. 2008; Deshpande y col. 2007). Se han conseguido

prometedores resultados, reduciéndose la incidencia en el número de casos con enterocolitis necro-

tizante tras el consumo de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus (Hung-Chin Lin y col.

2008), y similares efectos tras el consumo de una mezcla de probióticos compuesta por Bifidobacte-

ria infantis, Streptococcus thermophilus y Bifidobacterium bifidus (Bin Nun y col. 2005) y así como con

una combinación de Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium infantis (Lin y col. 2005).

Aunque los resultados obtenidos en estudios con niños prematuros, midiendo los

Introducción

76

efectos obtenidos en cuanto a la prevención de la enfermedad de la enterocolitis necroti-

zante parecen ser una buena alternativa, es necesario realizar más estudios ya que existen

muy pocos en la actualidad.

En resumen, la adición de probióticos a las fórmulas infantiles es bien tolerada, sin

efectos adversos y gracias a los estudios realizados hasta el momento se han podido recoger

evidencias acerca de la efectividad de los probióticos en las fórmulas infantiles (tabla 6.2)

Sin embargo, como se ha podido ver a lo largo de este capítulo, el número de estu-

dios es todavía bajo, implicando un bajo número de niños. Los estudios además presentan

una gran variabilidad en cuanto a cepas utilizadas, dosis, población y diseño. Esto dificulta

mucho la obtención de conclusiones consistentes. Además la mayoría de los estudios no

contemplan analizar los mecanismos a través de los cuales las cepas probióticas han podido

ejercer su efecto.

Por tanto, la conclusión general es que es todavía pronto para hacer una recomen-

dación sobre el uso de probióticos en fórmulas infantiles y que hace falta llevar a cabo más

estudio rigurosos que aumenten el grado de evidencia.

Introducción

77

Tabla 6.2 Probióticos utilizados en patologías clínicas pediátricas y grado de evidencia.

*En niños nacidos prematuros

A: Convincente

B: Probable

C: Posible

Extraído del tratado de nutrición de Ángel Gil Tomo IV. Capítulo 43

Entidad clínica Microorganismo Grado de evidenciaTratamiento de diarrea

infecciosa no enteroinvasiva

LGG , Lactobacillus reuteri A

Prevención de diarrea asociada a antibióticos

S. boulardi , LGG, L. casei, L bulgaricus, S thermophilus

A

Prevención de diarrea infecciosa

S. boulardi, LGG B

Prevención de enterocolitis necrotizante*

L. acidophilus, B. infantis, S. thermophilus, B. bifidum

B

Prevención de dermatitis atópica

LGG , B. lactis B

Tratamiento de dermatitis atópica

LGG, B. lactis B

Prevención de enfermedades respiratorias

LGG, B lactis B

Introducción

79

7 Caracterización del carácter probiótico de las cepas aisladas de leche materna Lactobacillus salivarius CECT 5713 y Lactobacillus fermentum CECT 5716.

Como se ha mencionado en anteriores capítulos de esta tesis, la leche materna con-

tiene una importante cantidad de bacterias que son transferidas al bebé a través de la

lactancia para iniciar su propia microbiota intestinal (Martín y col. 2003; Hekkilä y col.

2003; Martín y col. 2006; Martín y col. 2007). Entre las bacterias comúnmente aisladas de la

leche materna se encuentran representantes de los géneros estafilococos, estreptococos,

lactococos, enterococos y lactobacilos (Hekkilä y col. 2003; Martín y col. 2003; Martín y col.

2007). De todas ellas, los lactobacilos son aquellos que han despertado un mayor interés al

ser considerados potencialmente probióticos.

Nos encontramos por tanto con una fuente excelente de bacterias, que nos pareció

ideal para la búsqueda de nuevas cepas que, por sus propiedades probióticas, pudieran

ejercer funciones beneficiosas sobre la salud, aplicables tanto a nutrición infantil como a

adultos. Partimos de 3.000 aislados bacterianos de muestras de leche de mujeres sanas.

Para seleccionar aquellas con mayor potencial probiótico nos basamos en ensayos in vitro

que habían sido previamente descritos como ideales para valorar la capacidad probiótica

de cepas bacterianas y que son descritos en el capítulo 6 de la presente tesis. Estos crite-

rios se resumen en: origen humano, comportamiento no patogénico, resistencia a procesos

tecnológicos, resistencia a las condiciones de digestión, producción de sustancias antimi-

crobianas e inmunomodulación. Estas directrices nos sirvieron como base para diseñar un

sistema de selección que valora diferentes aspectos de seguridad, funcionales y tecnológi-

cos a través de hasta 40 ensayos in vitro que se resumen en la tabla 7.1.

Introducción

80

Tabla 7.1 Criterios de selección.

Los primeros criterios que se aplicaron son los de seguridad para descartar desde

el principio aquellas cepas de dudosa seguridad. Así se seleccionan cepas que sean Gram

positivas, catalasa y oxidasa negativas. También se deben tener en cuenta en las primeras

fases del proceso los aspectos tecnológicos, pues aunque una cepa tenga muy buenas

propiedades probióticas, si tecnológicamente su aplicación no es viable debería ser elimi-

nada del proceso. Es en estas fases donde se descartaron la mayor cantidad de aislados.

El siguiente paso fue la identificación de las especies pues sólo se seleccionaron especies

que son comúnmente usadas en nutrición humana por su potencial probiótico y que son

consideradas como seguras.

Los siguientes criterios que se aplicaron son aquellos que valoran el potencial pro-

biótico de las cepas. En esta fase se comenzó midiendo las propiedades que aseguren que

A. Criterios de seguridad

·Taxonomía : Bioquímica (API CH50, SDS-proteína) y genética (16S, RAPD, AFLP, TGGE)

·Producción de aminas biógenas : tyramida, histamina, cadaverina, putrescina

·Actividades enzimáticas : degradación mucinas, actividad proteolíticas, glucuronidasa

·Resistencia a antibióticos : MIC values

·Otros : infectividad, determinantes de virulencia

B. Criterios Funcionales

·Resistencia a digestión : pH ácido, sales bil iares, modelo de digestión global

·Capacidad fermentativa : azúcares, oligosacáridos, azúcar complejos y fibras

·Colonización intestinal : adhesión a células intestinales (caco-2, HT-29), competición

·Producción de metabolitos : SCFA, cobalamine, glutathione, oligosacáridos, PUFAs

·Sustancias antimicrobianas : actividad bactericida, reuterina, bacteriocinas, H2O2

·Parámetros inmunológicos : citocinas, activación l infocitaria, fagocitosis

·Otros : estimulación de mucinas, supervivencia en leche

C. Criterios Tecnológicos

·Crecimiento : medios mínimos, velocidad de generación, producción de biomasa

·Resistencia : calor, sales, pH ácido, presión osmótica

Introducción

81

la cepa llegará viva al intestino descartándose aquellas que por su baja resistencia a las

condiciones de digestión o baja capacidad de adhesión a la mucosa intestinal, pudiera in-

dicar su ineficacia para alcanzar viables el intestino. En nuestra experiencia con los aislados

de leche materna, al final de esta fase solo continuaron en el proceso aproximadamente el

1% de las cepas que lo iniciaron.

El último paso en el proceso de selección es la valoración de la funcionalidad de una

cepa. Se valoran las funcionalidades más demostradas en probióticos como son la actividad

antimicrobiana y la capacidad inmunomoduladora aunque se incluyeron también criterios

de selección que pueden suponer un beneficio para la salud como por ejemplo la produc-

ción de vitaminas, moléculas anti-oxidantes como el glutation, oligosacáridos, etc.

Una vez finalizado el proceso de selección se obtuvo una puntuación para cada una

de las cepas que hizo posible la comparación entre ellas. En el caso de los aislados de leche

materna hubo 4 cepas que destacaron por sus propiedades potencialmente probióticas, (L.

salivarius CECT5713, L. gasseri CECT5714, L. gasseri CECT5715, L. fermentum CECT5716). En

conjunto estas cepas se han comercializado bajo el nombre genérico HEREDITUM®.

Con estas 4 cepas se inició una extensa tarea de investigación destinada a la carac-

terización de las cepas como tal, de su tolerancia y ausencia de efectos perjudiciales, de

su potencial probiótico y por supuesto de su capacidad para inducir efectos beneficiosos

en la salud del consumidor. Toda esta labor implica una gran cantidad de ensayos in vitro,

experimentación animal y estudios de intervención nutricional en humanos. Seguidamente

se procede a describir los resultados correspondientes a las cepas Lactobacillus salivarius

CECT5713 y Lactobacillus fermentum CECT5716, cuya validación clínica es objeto de la pre-

sente tesis.

7.1. Estudios de tolerancia y seguridad

El Comité Científico de la EFSA elaboró una lista de microorganismos considerados

seguros basados en su historial de uso en alimentación a los que se les ha concedido la

condición de QPS (Qualified Presumption of Safety). Esta lista incluye 74 especies de micro-

organismos que incluyen 33 especies de Lactobacillus y 5 de Bifidobacteria (EFSA 2008) en-

tre las cuales están las especies a las que pertenecen las cepas Lactobacillus salivarius CECT

5713 y Lactobacillus fermentum CECT 5716. Estas especies a las que se les ha atribuido la

Introducción

82

condición de QPS no necesitan la realización de estudios de seguridad que avalen su uso

seguro. Sin embargo se han detectado casos aislados de bacteremia (Bayer y col. 1978) y

ocasionalmente endocarditis y abscesos (Aguirre y Collins 1993) relacionados al consumo

de otras cepas consideradas también seguras como Lactobacillus rhamnosus. La mayoría

de estos casos se han producido asociados con otras patologías y no se han considerado

agente causal (Boyle y col. 2006). Si bien no hay todavía una normativa clara que regule

la seguridad de las cepas probióticas para su uso en humanos, sí que existe un consenso

acerca de ciertos criterios como son el largo historial de uso y la ausencia de mecanismos

patogénicos, que ya se contempla en las condiciones QPS, o los test de toxicidad oral en

animales de experimentación (Adams y Marteau 1995). Por tanto si bien la normativa Euro-

pea exime de la realización de estudios que demuestren la seguridad del consumo de estas

cepas se decidió llevarlos a cabo con el fin de demostrar la seguridad y tolerancia de las

cepas L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713 objeto de esta tesis.

7.1.1. Características genéticas

Ambas cepas han sido recientemente secuenciadas (Jimenez y col.2010a; 2010b).

No se han detectado genes que codifiquen proteínas que pudieran tener un potencial efec-

to negativo sobre la salud de los consumidores ni material genético que permitiera la trans-

ferencia de resistencias a antibióticos con otros géneros bacterianos.

7.1.2. Ausencia de actividades potencialmente perjudiciales

Se han descrito diversas actividades bacterianas que podrían ser potencialmente

perjudiciales por su toxicidad por lo que se recomienda descartar aquellas cepas que las

posean. Se incluyen así ciertas actividades enzimáticas bacterianas que actúan sobre sub-

stratos que se encuentran en el lumen intestinal dando lugar a compuestos tóxicos como

son las aminas biógenas formadas a partir de la descarboxilación de los aminoácidos. Otra

actividad enzimática habitual en la flora intestinal es la actividad beta-glucuronidasa que al

desconjugar el glucurónico unido a compuestos tóxicos impide su eliminación permitiendo

la absorción de éstos.

Los integrantes de la flora intestinal han desarrollado un complejo sistema de glico-

hidrolasas que les permite la utilización de hidratos de carbono complejos que aportados

por la dieta constituyen el principal nutriente para su supervivencia en el tracto intestinal.

Introducción

83

Sin embargo este complejo sistema enzimático podría degradar las mucinas que consti-

tuyen la mucosa pudiendo afectar a la integridad de la mucosa intestinal. Aunque todas

estas actividades son intrínsecas a la flora intestinal debe existir un equilibrio para evitar la

posible aparición de efectos tóxicos. Por ello se recomienda la caracterización de estas ac-

tividades en los potenciales probióticos para evitar promover el incremento de estas activi-

dades en el intestino. Sencillos ensayos enzimáticos permitieron valorar estas actividades

que en el caso de las cepas L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713 resultaron

negativos (Martín y col 2005; Martín y col. 2006).

Otro aspecto importante a tener en cuenta en el uso de cepas bacterianas es el

patrón de resistencia a antibióticos. El uso indiscriminado de antibióticos tanto en medicina

humana como en veterinaria y alimentación animal ha contribuido a la expansión de resis-

tencias a antibióticos entre los microoganismos que está ya provocando un problema de

salud importante al generarse microorganismos patógenos multiresistentes de muy difícil

tratamiento. Como cualquier microorganismo, las bacterias ácido lácticas poseen también

resistencias a antibióticos que podrían ser potencialmente transmitidas. Cuando las cepas

probióticas llegan al intestino están en contacto tanto con la flora intestinal común en el

intestino como con los posibles patógenos que puedan llegar. Se debe descartar que la cepa

probiótica posea mecanismos que permitan la transferencia de resistencia a antibióticos.

Esto implica estudiar el material genético de la cepa para descartar la presencia por ejem-

plo de plásmidos que codifiquen genes de resistencia. Algunos autores han señalado que el

uso de cepas probióticas resistentes a una amplia gama de antibióticos pudiera suponer un

beneficio al poder ser usadas durante tratamientos antibióticos que alteran la flora intesti-

nal. Sin embargo es necesario un equilibrio puesto que aunque los casos de bacteremia rel-

acionadas con el consumo de bacterias probióticas han sido aislados, en el caso excepcional

de que se produjera una infección causada por la cepa probiótica, se debe poder controlar

fácilmente con un tratamiento antibiótico habitual. En el caso de las cepas que nos ocupan

no se detectaron resistencias a antibióticos anormales para las especies a las que pertene-

cen las cepas ni genes de resistencia a antibióticos (Martín y col. 2005; Lara-Villoslada y col.

2007b;2009). Por todo ello a este nivel todas se consideraron seguras.

Introducción

84

7.1.3 Estudios de tolerancia y seguridad en animales de experimentación.

El test de toxicidad oral aguda se considera un test fundamental para ensayar la

seguridad de cepas probióticas (Stine y Brown 1996). Se trata de administrar a los animales

cantidades exageradas de probiótico muy superiores a las que podrían ser consumidas por

los humanos y estudiar la posible aparición de efectos adversos.

En el caso de las cepas procedentes de leche materna se han ensayado en ratones

dosis diarias de bacterias hasta 10.000 veces superiores a la dosis consumida normalmente

por los humanos durante periodos de hasta 4 semanas. En estos estudios no se observa-

ron efectos adversos sobre el consumo de alimento, ganancia de peso, comportamiento y

aspectos de los ratones. Tampoco se detectó incremento en la translocación bacteriana a

órganos como el bazo o el hígado. Marcadores bioquímicos de función renal y hepática, así

como marcadores de sepsis y estrés oxidativo como glutation y malondialdehido, indicaron

la ausencia de bacteremia o patologías asociadas al consumo del probiótico (Lara-Villoslada

et al 2007b; 2009). En definitiva el consumo de elevadas dosis de las cepas probióticas es

bien tolerado y totalmente seguro.

7.1.4 Tolerancia en humanos

En cuanto a la tolerancia en humanos ya se tienen datos previos en humanos de la

cepa L. fermentum CECT5716 (Olivares y col 2007). Estos datos corresponden a estudios en

humanos en los que además de valorar parámetros de eficacia se demostró la seguridad y

tolerancia del consumo de la cepa. En la presente tesis se presentarán estudios en los que

se valoró la seguridad del consumo de ambas cepas.

7.2. Colonización

Existe un cierto consenso acerca de que la colonización de forma estable del in-

testino depende de que la cepa alcance viva el intestino y después se una activamente

al epitelio intestinal. Ambas actividades fueron evaluadas mediante ensayos in vitro que

simulan por una parte las condiciones de digestión y por otra la superficie del epitelio in-

testinal mediante el uso de líneas celulares de enterocitos. En cuanto a la resistencia a las

condiciones de digestión las cepas objeto de esta tesis alcanzaron niveles de supervivencia

altos que oscilaban entre el 74,37% en el caso de L. fermentum CECT5716 y un 55,31% en

el caso de L. salivarius (Martín y col. 2005 y 2006). Ambas cepas presentaron también gran

Introducción

85

capacidad para adherirse tanto a enterocitos como a mucinas porcinas (Martín y col. 2005;

2006; Olivares y col. 2006a).

En el caso de L. fermentum CECT 5716 un estudio realizado en humanos mostró que

la cepa se mantiene metabólicamente activa tras el paso por el tracto gastrointestinal pudi-

endo recuperarse viva de las heces de los voluntarios que consumieron dicha cepa (Olivares

y col. 2007).

La demostración de la colonización en humanos debería realizarse mediante biop-

sias, pero pocos estudios incluyen esta técnica dadas las dificultades que la obtención de la

muestra plantea. Por ello, hoy por hoy, la mayoría de los estudios se basan en la presencia

de la cepa administrada en las heces (Bezkorovainy, 2001).

7.3. Efectos a nivel gastro-intestinal

La microbiota intestinal es de gran importancia en el mantenimiento de la salud y

del bienestar. Además de la función nutritiva que la microbiota ejerce al metabolizar nutri-

entes que la maquinaria enzimática humana no puede, a nivel local la microbiota también

influye de forma muy importante en la funcionalidad intestinal estando involucrada en los

procesos de regeneración de la mucosa y epitelio intestinal, motilidad y protección frente a

infecciones (Falk y col. 1998). En lo que respecta a las bacterias probióticas el aspecto más

estudiado es su efecto protector frente a las infecciones que ha sido ampliamente dem-

ostrado, sin embargo otros aspectos implicados en la función intestinal son también de vital

importancia para el mantenimiento de la salud y bienestar del consumidor.

7.3.1. Potencial antimicrobiano

En cuanto al papel antimicrobiano de los probióticos se relaciona con diferentes me-

canismos que incluyen la producción de sustancias antimicrobianas como bacteriocinas o

peróxido de hidrógeno, competición por nutrientes y por adhesión a mucinas.

Producción de sustancias antimicrobianas

No se ha detectado producción de bacteriocinas en las cepas L. fermentum CECT5716

ni L. salivarius CECT5713. Sin embargo sí que la producción de ácido láctico y la correspon-

diente bajada de pH producida fruto de su actividad metabólica tiene la capacidad de inhi-

bir el crecimiento de bacterias patógenas per se.

Introducción

86

Mediante un ensayo de difusión en agar en el que se mide la capacidad del so-

brenadante de los cultivos de Lactobacillus para inhibir el crecimiento de agentes patóge-

nos se puso de manifiesto que las cepas L. salivarius CECT5713 y L. fermentum CECT5716

fueron muy eficientes inhibiendo el crecimiento de diversos patógenos intestinales tales

como Salmonella choleraesuis , E. coli, Staphylococcus, Listeria o Clostridium (Olivares y col.

2006a).

Interferencia de la unión del patógeno al epitelio intestinal

Otro mecanismo a través del cual L. salivarius CECT5713 y L. fermentum CECT5716

ejercerían un efecto antibacteriano es interfiriendo la unión de bacterias patógenas al epi-

telio intestinal. Ambas cepas inhibieron significativamente la adhesión del patógeno Salmo-

nella marcado con fluoresceína a una capa de mucina intestinal (Olivares y col. 2006a). La

cepa más efectiva en este mecanismo de inhibición de la adhesión de patógenos a mucinas

intestinales fue L. salivarius CECT5713.

Todas las cepas están por tanto dotadas en mayor o menor medida de una capa-

cidad antimicrobiana que se lleva a cabo a través de diversos mecanismos y que podrían

tener mucha importancia a la hora de prevenir o atenuar determinadas infecciones. Pero

estos fenómenos que se miden de forma aislada in vitro podrían variar in vivo afectados por

múltiples factores como son el flujo peristáltico que continuamente lava el epitelio intesti-

nal y que podría afectar a la capacidad de adhesión de las bacterias. Por eso, para compro-

bar que las actividades antagonistas de los probióticos observadas in vitro se reproducen in

vivo son necesarios estudios en animales.

En un modelo de infección por Salmonella en ratón se observó que de acuerdo con

los resultados obtenidos in vitro, el consumo de las cepas L. salivarius CECT5713 ó L. fer-

mentum CECT5716 aumentaba significativamente la supervivencia de los ratones infecta-

dos con el patógeno intestinal, alcanzándose en el caso del L. salivarius una supervivencia

del 80% respecto al 10% observado en el grupo control (Olivares y col. 2006a). Se dem-

uestra así que las propiedades anti-infectivas de las cepas se traducen en un efecto real de

protección frente a infecciones intestinales.

Introducción

87

7.4. Efectos inmunomoduladores

Como se ha comentado en anteriores capítulos la microbiota intestinal está en es-

trecho y continuo contacto con células epiteliales y del sistema inmunitario, resultando en

una estimulación esencial para el correcto funcionamiento de la respuesta inmunitaria. De

hecho, el tipo de bacterias que colonizan el intestino de los recién nacidos va a determinar

la modulación de su sistema inmunitario pues actúan como importantes estímulos antigé-

nicos en el proceso de maduración de la respuesta. Los Lactobacillus son un componente

importante de la microbiota y numerosos estudios tanto en animales como en humanos

han demostrado su capacidad para modular la respuesta inmunitaria (Cross 2002a; Cross

2002b; Gill 1998, Salminen y col. 2000).

Las cepas L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713 fueron capaces también

de modificar la respuesta de macrófagos de ratón derivados de médula ósea tanto en condi-

ciones basales como en presencia de un activador como el LPS. Los resultados muestran

cómo el efecto producido es de nuevo dependiente de la cepa, observándose efectos dis-

pares. Así, L. salivarius CECT5713 destaca por su capacidad para activar los macrófagos

induciendo una respuesta en la que predomina la producción de IL-10 respecto a citokinas

pro-inflamatorias como IL-12 y TNFα incluso tras la estimulación con LPS. La respuesta indu-

cida por L. fermentum CECT5716 tiene sin embargo un mayor carácter inmunoestimulante,

aunque en presencia de LPS es capaz también de atenuar la respuesta inflamatoria inducida

por este compuesto en los macrófagos (Díaz-Ropero y col. 2007; Verbeek y col. 2009). Esta

capacidad de modular la respuesta inmunitaria de forma diferente según el estado de acti-

vación ya ha sido descrito anteriormente en otras cepas probióticas en las que se han ob-

servado efectos contrapuestos en individuos sanos y enfermos (Isolauri y col. 2001; Roess-

ler y col. 2008). Un estudio recientemente publicado que utiliza células mononucleares de

sangre periférica ha mostrado además que estas cepas aisladas de leche materna podrían

tener propiedades singulares respecto a cepas de igual especie pero aisladas de otras fuen-

tes (Pérez-Cano y col. 2010). En dicho estudio se comparan las propiedades inmunomodu-

ladoras de L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713 con cepas de la misma especie

pero aisladas de saliva. Aunque todas las cepas fueron capaces de incrementar significati-

vamente la expansión de células T reguladoras sólo L. salivarius CECT5713 incrementó de

Introducción

88

forma significativa la expresión de CD25 en células T CD4+. Además las cepas originarias

de leche materna fueron particularmente potentes a la hora de inducir la producción de

la citocina inmunoreguladora IL-10 sugiriéndose que las cepas de leche materna tienen un

mayor carácter inmunoregulador que podría promover la tolerancia durante la lactancia

materna (Pérez-Cano y col. 2010).

7.4.1 Inmunomodulación en animales.

Los estudios en animales permiten estudiar la respuesta global del organismo al

contacto con la bacteria tanto en condiciones de salud como en condiciones patológicas

utilizando modelos de alergia, inflamación crónica o infección. Estudios con animales sa-

nos, confirmaron que, coincidiendo con el perfil observado in vitro, en efecto L. salivarius

CECT5713 tiene un carácter anti-inflamatorio/regulatorio mediado por el incremento sig-

nificativo de la citocina reguladora IL-10 (Díaz-Ropero y col. 2007). En un modelo de in-

flamación intestinal en ratas provocada por TNBS se observó una atenuación importante en

la respuesta inflamatoria provocada por el TNBS (Perán y col. 2005). La capacidad de esta

cepa para inducir la producción de IL-10 será probablemente la responsable del efecto ya

que en este tipo de enfermedad el papel de IL-10 es muy importante para intentar atenuar

la fuerte respuesta inflamatoria y de hecho es una de las terapias biológicas que se están

estudiando en la actualidad (Li y He 2004).

Por otro lado, L. fermentum CECT5716, actuó como un agente inmunoestimulante

en ratones sanos evidenciado por un incremento tanto en la respuesta innata como en la

específica (Díaz-Ropero y col. 2007). Curiosamente, en el modelo de inflamación intestinal,

donde tiene lugar un claro predominio de citokinas proinflamatorias, la cepa mostró un

carácter anti-inflamatorio previniendo en gran medida la respuesta inflamatoria provocada

por el TNBS (Perán y col. 2006). Probablemente el efecto de esta cepa sea consecuencia de

la capacidad inmunomoduladora de L. fermentum CECT5716 que en situación de sobre-

estimulación al contrario que en situación basal, reduce la respuesta inflamatoria. La ca-

pacidad antiinflamatoria de esta cepa se ha puesto de manifiesto también en un modelo

de shock séptico en el cual dicha cepa redujo considerablemente la respuesta inflamatoria

(Arribas y col. 2008). A su carácter antiinflamatorio se podría sumar la habilidad de esta

cepa para producir glutation, un antioxidante natural importante en el mantenimiento de

la integridad de las mucosas y que jugaría un papel fundamental en prevenir el daño pro-

Introducción

89

ducido por las especies reactivas de oxígeno que se producen en este modelo y que son

responsables del daño en los tejidos.

Estos estudios demuestran la singularidad de cada cepa indicando la necesidad de

estudiar en profundidad las características propias de cada cepa de forma que la selección

de una cepa para una determinada aplicación esté basada en las propiedades particulares

de cada cepa y en las condiciones de salud del consumidor al que vaya dirigido su con-

sumo.

La presencia en leche materna de bacterias con diferentes perfiles podría tener

además un papel interesante en el proceso de maduración de la respuesta inmunitaria del

niño muy influenciado por la flora presente en su intestino y que requiere una fina regu-

lación para la correcta maduración del sistema inmunológico.

7.4.2 Evidencias en humanos.

Aunque a partir de los dos años la microbiota es más estable, esto no quiere decir

que no cambie, es decir, se trata de una proceso continuo en el que se produce un flujo mi-

crobiano influenciado tanto por factores externos como internos propios del hospedador.

Entre estos factores externos, la importancia de la dieta queda claramente reflejada en un

estudio que demuestra el efecto que ejerce sobre el sistema inmunitario de adultos sanos la

eliminación en la dieta de alimentos fermentados por un periodo tan solo de dos semanas

y cómo éste se restablece tras el consumo de probióticos (Olivares y col. 2007). Desafor-

tunadamente, en la dieta occidental se está produciendo un descenso en el consumo de

alimentos fermentados que podría dar lugar a deficiencias que podrían ser compensadas

con el aporte en la dieta de cepas con demostrada eficacia sobre la salud.

En la actualidad no está todavía definido cómo evaluar que un determinado ingredi-

ente o cepa probiótica mejora la respuesta inmune y cómo eso se traduce en un beneficio

para el consumidor. Recientemente la EFSA consideró que un buen modelo para evaluar

este tipo de efecto es trabajar en protocolos de vacunación. Se llevó a cabo un estudio

de intervención en un protocolo de vacunación frente a la gripe con la cepa L. fermentum

CECT5716. Los resultados demostraron que dicha cepa es capaz de potenciar la respuesta

inmunológica desencadenada en un proceso de vacunación frente a la gripe aportando así

al individuo una mayor protección frente a esta infección vírica (Olivares y col. 2007).

Introducción

90

7.5. Efecto de L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713 sobre la mastitis.

La mastitis es una patología que afecta a las mujeres en el período de lactancia. Su

incidencia comprende entre el 3 y el 33% de las mujeres y entre el 75-95% se produce en

los primeros 12 meses. Su origen es de tipo infeccioso, teniendo como principales agentes

de la enfermedad a bacterias del género , principalmente de las especies Staphylococcus

aureus y Staphylococcus epidermidis. Las mujeres que presentan esta patología poseen al-

tos niveles de estas bacterias en la leche y en cuanto a la sintomatología, existe dolor en la

zona mamaria, al igual que grietas, fisuras y heridas en toda la zona mamaria además de

poder padecer estados febriles.

En un estudio realizado por Jiménez y colaboradores, se captaron voluntarios que

padecían dicha patología, y se les suministró oralmente una cepa de probiótico, en este

caso Lactobacillus salivarius CECT5713 o Lactobacillus gasseri CECT5714. Se realizó la cu-

antificación de estafilococos al principio del estudio, y a los 30 días. En ambos grupos se

produjo una reducción de los estafilococos en la leche y clínicamente los síntomas se redu-

jeron aportando mayor bienestar a las pacientes. Además, tras los 30 días de tratamiento se

aislaron ambas cepas de probióticos de la leche, en los dos grupos independientemente, y

se determinó gracias a técnicas de biología molecular que eran las mismas que habían sido

consumidas oralmente, lo que sugiere que se produjo el fenómeno de transferencia, mig-

rando estas bacterias desde el tracto gastrointestinal hasta la glándula mamaria (Jimenez y

col.2008).

En otro estudio realizado por Arroyo y colaboradores, se analizaron los efectos produ-

cidos en tres grupos de mujeres que sufrían de mastitis, suministrándole a un grupo Lactoba-

cillus salivarius CECT 5713, a otro Lactobacillus fermentum CECT 5716 y el tercero que seguía

un tratamiento compuesto por antibióticos. Al igual que en el anterior estudio, se cuantific-

aron las poblaciones de estafilococos en la leche. En el caso de los dos grupos probióticos, el

número de estafilococos se redujo significativamente para las tres especies, S. Aureus, S epi-

dermidis y S. mitis. Por el contrario el grupo que tomaba antibióticos experimentó una reduc-

ción mucho menor. En este estudio se evaluó el dolor que sufría cada una de las voluntarias

reclutadas y en los grupos probióticos, se produjo una gran remisión del dolor, mucho mayor

que en el grupo que consumía antibióticos. Además en el grupo que consumía antibióticos

se produjeron recurrencias de la enfermedad en mayor grado que en los grupos probióticos.

Introducción

91

Al igual que en el anterior estudio, se aislaron lactobacilos de la leche materna de

los tres grupos. Lactobacillus salivarius CECT5713 y Lactobacillus fermentum CECT5716 se

aislaron e identificaron de las muestras de leche de las madres que los habían consumido,

demostrándose una vez más el fenómeno de transferencia (Arroyo y col. 2010).

Los mecanismos a través de los cuales estas cepas son capaces de mejorar la mas-

titis estarían muy relacionados con su capacidad antibacteriana que ejercerían al alcanzar

los conductos de la glándula mamaria no descartándose que el efecto sobre la respuesta

inmune ayudara también a resolver la patología.

Objetivos

Objetivos

95

La leche materna es el mejor alimento para los bebés durante sus fases de rápido

desarrollo, puesto que no sólo aporta todos los nutrientes necesarios, sino que además

contiene importantes factores funcionales implicados en el desarrollo y la maduración del

sistema inmunitario neonatal, así como en la protección frente a infecciones. Entre estos

factores se incluyen también las bacterias comensales de la leche materna algunas de ellas

con un fuerte potencial probiótico. La adición de cepas probióticas a las fórmulas infantiles

es una práctica que se está extendiendo en los últimos años con el fin de conseguir que los

niños alimentados con fórmula infantil desarrollen una microbiota más parecida a la desar-

rollada por los niños alimentados con leche materna. De esta forma se pretende que los

niños alimentados con fórmula infantil se beneficien también de las ventajas sobre la salud

a corto y largo plazo que tiene una microbiota más saludable. En este sentido, y tras el des-

cubrimiento de que la leche materna contiene bacterias con potencial probiótico, parece

razonable que para la suplementación de las fórmulas infantiles de inicio y continuación se

utilicen cepas que ya están presentes de forma natural en la leche materna y que han dem-

ostrado propiedades beneficiosas sobre la salud.

Las cepas Lactobacillus salivarius CECT 5713 y Lactobacillus fermentum CECT 5716

fueron originariamente aisladas de leche materna de mujeres sanas. Numerosos estudios

in vitro e in vivo han puesto de manifiesto las características probióticas de estas dos cepas

por lo que dado su origen y su fuerte potencial probiótico serían excelentes candidatas para

su aplicación en nutrición infantil.

El objetivo general de esta Tesis es demostrar la seguridad del uso de Lactobacillus

salivarius CECT 5713 y Lactobacillus fermentum CECT 5716 en nutrición infantil así como

caracterizar los posibles efectos beneficiosos que el consumo de fórmulas infantiles que

contengan estas cepas probióticas puedan ejercer sobre la salud de los niños.

Por ello, se propusieron una serie de objetivos desarrollados en la presente Tesis

Doctoral:

1. Evaluar en adultos sanos la tolerancia y los efectos sobre la función intestinal y el

sistema inmune del consumo oral de la cepa Lactobacillus salivarius CECT 5713 .

2. Evaluar la seguridad, tolerancia y efectos beneficiosos de una fórmula de continu-

ación que contiene la cepa Lactobacillus salivarius CECT 5713 en niños de seis meses.

Objetivos

96

3. Evaluar la seguridad, la tolerancia y efectos beneficiosos de una fórmula de con-

tinuación que contiene la cepa Lactobacillus fermentum CECT 5716 en niños de

seis meses.

Resultados

1. Tolerancia del consumo de Lactobacillus salivarius CECT5713 en adultos sanos y efectos sobre la función intestinal y respuesta inmune.

Resultados

103

RESUMEN

Lactobacillus salivarius CECT5713 es una cepa originariamente aislada de leche ma-

terna. Estudios in vitro y en animales de experimentación demuestran que esta cepa posee

un fuerte potencial probiótico destacando por su capacidad antibacteriana y su marcado

carácter inmunomodulador.

El objetivo de este estudio es evaluar en adultos sanos la tolerancia y los efectos

sobre la función intestinal y el sistema inmune del consumo oral de la cepa Lactobacillus

salivarius CECT5713 .

Se realizó un estudio de intervención en adultos, aleatorio, doble-ciego y compara-

do con un placebo, que involucró a 40 adultos sanos distribuidos aleatoriamente en dos

grupos, un grupo control que consumió un placebo y otro grupo probiótico que consumió

una dosis de 2x 108 ufc de L. salivarius CECT5713 al día. El periodo de intervención duró

4 semanas. Para la valoración de la función intestinal y respuesta inmune se recogieron

muestras fecales y sanguíneas además del seguimiento del hábito intestinal a través de

encuestas.

La cepa fue perfectamente tolerada no refiriéndose ningún efecto adverso relacio-

nado con su consumo. La cepa fue recuperada viva en heces en el 90% de los sujetos que

la consumieron además el consumo de la cepa se relacionó con un incremento significativo

en los recuentos de lactobacilos (7.9±0.1 en el grupo probiótico versus 7.05±0.2 log ufc/g

heces en el grupo control, p=0.001). Los cambios en la microbiota observados en el grupo

probiótico se tradujeron en una mayor concentración de ácidos grasos de cadena corta y

con un aumento significativo en la frecuencia de defecación (9.7±1.13 en el grupo probióti-

co versus 6.6±0.5 en el grupo control, p<0.05).

Respecto a la función intestinal el consumo de la cepa probiótica indujo un aumento

significativo en la población de células NK y monocitos, al igual que en la secreción de cito-

kinas como el TNFα y la IL-10 y de las inmunoglobulinas IgG, IgM e IgA.

Resultados

104

CONCLUSIÓN

El consumo oral de la cepa probiótica Lactobacillus salivarius CECT5713 es seguro

y bien tolerado en adultos sanos e induce efectos beneficiosos tanto a nivel de la función

intestinal como de la respuesta inmunológica que podrían ayudar al mantenimiento de la

salud de los individuos.

Resultados

105

Clinical Medicine

Intestinal and immunological effects of daily oral administrationof Lactobacillus salivarius CECT5713 to healthy adults

Saleta Sierra, Federico Lara-Villoslada, Lluis Sempere, Mónica Olivares*, Julio Boza, Jordi XausNutrition and Health Department, Puleva Biotech SA, Camino de Purchil 66, 18004 Granada, Spain

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 23 February 2009Received in revised form7 January 2010Accepted 1 February 2010Available online 14 February 2010

Keywords:Lactobacillus salivariusImmune responseGutProbioticsHuman clinical trialMicrobiota

a b s t r a c t

There is an increasing interest in the intestinal and immunological effects of probiotics. The aim of thepresent study is to evaluate the tolerance and beneficial effects in healthy adults of the strain, Lacto-bacillus salivarius CECT5713 isolated from breast milk. A phase II, randomized, double-blinded, placebo-controlled human clinical trial was carried out in 40 healthy adults. The Probiotic group received a dailydose of 2� 108 CFU of L. salivarius CECT5713 in capsules during 4 weeks while volunteers of the controlreceived only a placebo. Gastrointestinal and immunological parameters were analyzed. Resultsshowed that L. salivarius CECT5713 was well tolerated and no adverse effects were detected.Consumption of the probiotic strain increased fecal lactobacilli counts (7.9� 0.1 vs. 7.05� 0.2 CFU/gfeces, P¼ 0.001). Also, an improvement in the frequency of defecation (P¼ 0.04) was observed. Pro-biotic treatment induced significantly the percentage of NK cells and monocytes, as well as the plas-matic levels of immunoglobulins M, A and G, and the regulatory cytokine IL-10 (72.3� 11.7 in probioticgroup vs. 27.3� 6.4 pg/mL in control group, P< 0.01). Thus, it can be concluded that daily adminis-tration of L. salivarius CECT5713 to healthy adults is safe and improve gut microbiota and differentparameters related to immune response.

� 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

The intestinal microbiota is composed of a wide diversity ofbacteria with relevant roles for the host such as nutrition, intestinalfunction and maturation and modulation of the immune system.

The processes involved in the establishment of microbialpopulations are complex, involving microbial succession as well asmicrobial and host interactions which eventually results in dense,stable populations inhabiting specific regions of the gut. The processis initiated after an initial exposure to mother's bacteria duringlabour and lactation period or even during gestation [1e4]. It hasbeen broadly demonstrated that breast milk is a potent source fora healthy microbiota in neonates. In addition to the presence ofspecific prebiotic components favoring the development ofa healthy microbiota, breast milk supports initial neonate micro-biota providing certain bacteria species including Lactobacillusspecies which may have probiotic properties that could explainsome of the beneficial effects observed in breast fed infants [2,5,6].

In the last decades it has been demonstrated that the gutmicrobiota is involved in the development and prevention of

several human pathologies. In fact, singular changes in microbiotapatterns have been identified in allergic children [7,8], in peoplesuffering Intestinal Bowel Disease (IBD) [9,10], and is even relatedto metabolic disturbances such as obesity [11].

Amongst the bacterial groups found in breast milk, lactobacilliconstitute an important group. One of the Lactobacillus strainsisolated from breast milk with an important probiotic potential isLactobacillus salivarius CECT5713 [5]. This strain is endowed witha powerful antibacterial activity able to strongly protect mice froma Salmonella infection [12]. Moreover, it modulates the immuneresponse in animal models showing an anti-inflammatory char-acter able to prevent colonic inflammation in a rat model of colitis[13,14]. The absence of pathogenic mechanisms or deleteriousenzymatic activities, together with a safety assessment in micewith doses 500e10,000 times higher (per gram of body weight)than those normally consumed by humans [15], have demon-strated that L. salivarius CECT5713 fulfils the safety criteriarecommended for probiotic strains aimed to be incorporated intofood products [16].

The probiotic potential of this strain and their special originmakes this strain especially suitable for infant applications and itsuse in human nutrition (for infants or adults) or supplements withthe aim to exert beneficial effects in their consumers. However,although preclinical studies show the health-promoting actions of

* Corresponding author. Biomedicine Department, Puleva Biotech SA, Camino dePurchil 66, 18004 Granada, Spain. Tel.: þ34958240396; fax: þ34958240160.

E-mail address: molivares@puleva.es (M. Olivares).

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Anaerobe

journal homepage: www.elsevier .com/locate/anaerobe

1075-9964/$ e see front matter � 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.anaerobe.2010.02.001

Anaerobe 16 (2010) 195e200

Resultados

106

this probiotic strain, it is necessary to perform clinical studies toconfirm the safety and beneficial effect of this strain and justify itsuse in humans. Therefore, we have carried out a phase II study inorder to analyze the gastrointestinal and immunological effects ofthe consumption of the breast-milk lactic acid bacteria L. salivariusCECT5713 in healthy adults.

2. Materials and methods

2.1. Design of the trial

A total of 40 healthy adult volunteers (20 females and 20 males)between 23 and 43 years-old (33.0� 7.9) were included in thestudy. Exclusion criteria were lactose intolerance, recent antibiotictreatment (during the last month previous to the study), frequentgastrointestinal disorders or metabolic disorders such as diabetesor disorders that disrupt normal metabolism of proteins, carbohy-drates or lipids. The study was carried out according to the Helsinkideclaration and informed written consent was obtained from allthe subjects. During the whole 6 weeks of the trial volunteers wereasked to eliminate from their diets any kind of fermented productsuch as fermented milk and dairy products including cheese,fermented meat and cured vegetables such as olives, in order toavoid the possible interferences of the different habits in theconsumption of fermented products of the volunteers.

After a two weeks wash-out period, volunteers were randomlydistributed into two groups (n¼ 20 per group): a control groupwhich received daily two capsules containing maltodextrins asplacebo (Glucidex 39, La Roquette) for four weeks, and a probioticgroupwhich ingesteddaily, two capsuleswith 108 cfu/capsule of thestrain L. salivarius CECT5713 (2�108 cfu/day) withmaltodextrins asvehicle for the same period of time. Blood and faeces were collectedat the beginning (week 0) and after 2 and 4 weeks of the treatment.

Physical exams including inspection, palpation, percussion andauscultation were carried out by medical staff of Puleva Biotech SA.Haemograms were also revised by medical staff and volunteerswere required to fill in a questionary about gastrointestinaldiscomfort symptoms (diarrhea, constipation, dyspepsia by lowstomach acidity, flatulency, maldigestion, stomach ache) and alsosystemic symptoms (fever, head ache, muscular or bone ache, flusymptoms).

2.2. Collection and analysis of the blood samples

After overnight fasting, blood samples were taken from eachvolunteer using EDTA-containing vacutainers (S-Monovette,Sarstedt, Germany). The hemogram analyses were performed ina SYMEX F-800 system at Laboratorios Luis Lara (Granada, Spain).Major leukocyte subset phenotypes were counted in EDTA-treatedwhole-blood samples by flow cytometry on a FACScalibur (BectonDickinson, Oxford, United Kingdom) system by using the followingfluorochrome-conjugated monoclonal antibodies (BectonDickinson): anti-CD3þ, -CD19þ, -CD4þ, -CD8þ, -CD56þ, -CD25þ,-CD14þ. The results were expressed as the percentage of mono-nuclear cells positively stained.

The rest of the blood was centrifuged at 3500 rpm for 10 minand aliquots of plasma were frozen at �80 �C.

2.3. Collection and analysis of fecal samples

Four simultaneous fresh fecal samples were collected fromevery volunteer at the beginning and after 2 and 4 weeks oftreatment, preserved at 4 �C and processed in 24 h. Three of thesamples were used to evaluate the different parameters analyzed,and the remaining samplewas stored at�80 �C and held in reserve.

2.4. Counts of fecal bacterial groups

Fecal samples of each volunteer were individually homoge-nized in a peptoneesaline solution (100 mg/mL). To estimate theselected concentration of bacterial groups, appropriate dilutionswere spread in quadruplicate onto plates of MRS agar for lacto-bacilli, MRS agar supplemented with 0.5 mg/L dicloxaciclin, 1 g/LLiCl and 0.5 g/L L-cysteine hydrochloride for bifidobacteria, Rein-forced Clostridial Agar containing 10 mg/mL of polimixin for clos-tridia and Bile Aesculin Agar for bacteroides. All media wereobtained from Oxoid (Basingstoke, UK) whereas antibiotics andother supplements were obtained from Sigma Chemical Co. (StLouis, Mo). Culture plates were incubated in absence of oxygen at37 �C for 24e48 h. Similarly, 1 mL of suitable dilutions werespread onto specific Count Plates Petrifilm (3 M St Paul, MN) fortotal aerobes and for enterobacteria enumeration. Plates wereincubated at 37 �C for 24 h After the incubation, the specificcolonies grown on the selective culture media were counted andthe number of viable microorganism per gram of faces (CFU/g)was calculated. The mean and standard error per group werecalculated from the log values of the CFU/g. The remainingsupernatants were stored at �80 �C to measure fecal IgAconcentration. Colonies grown on MRS agar-plates were collectedand identified by PCR using specific primers recognizing specifi-cally L. salivarius CECT5713 (50-GAT CGC TAT TTT TTT ATT AGG TATC-30 and 50-TGG CTA ACT TGT TTT TTT ACT TC-30).

2.5. Quantification of short chain fatty acids

The concentration of short chain fatty acids (SCFAs) in the fecalsamples was quantified as previously reported [17]. Briefly, faecalsamples were homogenized with 150 mM NaHCO3 (pH 7.8) (1:5,wt/v) in an argon atmosphere. Samples were incubated for 24 h at37 �C and stored at�80 �C until the extraction. To extract the SCFAs,50 mL of 100 mM 2-methylvaleric acid (internal standard), 10 mL ofsulfuric acid and 0.3 mL of ethyl acetate were added to 1 mL of thehomogenate. The mix was centrifuged at 10,000�g for 5 min at4 �C. The supernatants were dehydrated with sodium sulphate(anhydrous) and centrifuged 10,000�g for 5 min at 4 �C. Later, thesample (0.5 mL) was splitless inoculated into a gas chromatograph(mod. CP-3800, Varian, Lake Forest, CA) equipped with an ID(CPWAX 52CB 60 m� 0.25 mm), and connected to a FID detector(Varian). Heliumwas used as the carrier and the make-up gas, witha flow rate of 1.5 mL/min. The injection temperature was 250 �C.Acetate, propionate and butyrate concentrations were automati-cally calculated from the areas of the resulting peaks using the StarChromatography WorkStation program (version 5.5), which wasconnected on-line to the FID detector.

2.6. Quantification of water content

Fecal samples were weighed and heated for 72 h at 60 �C toeliminate remaining water. Water content of the feces was calcu-lated by difference between fresh and dried sample. Percentages ofwater content of the samples were calculated [18].

2.7. Total immunoglobulin and cytokines measurements

Total IgA, IgG, IgM and IgE concentrations in plasma and totalIgA concentration in faeces were measured by ELISA quantitationkits (Bethyl, Montgomery, TX). Cytokine concentrations in plasmawere measured by ELISA quantitation kits (CytoSets, Biosource,Camarillo, CA) following manufacturer's recommendations inboth cases.

S. Sierra et al. / Anaerobe 16 (2010) 195e200196

Resultados

107

2.8. Stool frequency

A note book was supplied to each volunteer to document thenumber of bowel movements in order to calculate the frequency ofdefecation (stools/week).

2.9. Statistical analysis

The data were analyzed using SPSS software (version 12.0,Chicago, USA). Data are expressed as means� SEM. P values <0.05were considered significant. For the gaussian variables, the longi-tudinal effect of the probiotic treatment at the different time pointsof the study was analyzed by one-way repeated measures ANOVAfollowed by paired t test (within-group comparison). Two-wayrepeated measured ANOVA was used to analyze statistical differ-ences produced by the consumption of the capsules followed byindependent t test to assess at which time points the groupsdiffered.

3. Results

3.1. Stability of the probiotic in capsules

The viability of the probiotic in the capsules was determined atthe beginning (6.23�109 CFU/g) and at the end of the study, after 4weeks of conservation at room temperature (6.30�109 CFU/g).

3.2. Clinical observations and blood analysis

Throughout the entire study, none of the volunteers droppedout the study. Volunteers belonging to either the placebo or theprobiotic groups reported no adverse effects associated to the dailyconsumption of the capsules or to diet restriction. Clinical exami-nation by the medical staff of Puleva Biotech S.A. revealed that thehealth condition of all the participants was normal during thestudy.

Hematological analysis performed before and after the treat-ment period showed that all the parameters assayed were withintheir respective ranges of normality. No statistically significantchanges were observed between groups or along the time in thesame group (Table 1).

3.3. Fecal microbial population

Results of the analysis of faecal bacteria concentrations areincluded in Table 2. During the treatment, the consumption ofL. salivarius CECT5713 led to a significant increase (P¼ 0.001) in thenumber of faecal lactobacilli while in the control group, valuesremained unchanged. On the other hand, faecal bifidobacteriacounts of the control group decreased along the treatment period.In contrast, there were no significant differences in the bifidobac-teria counts throughout the study in the probiotic group and thus,faecal bifidobacteria content was significantly higher in the pro-biotic treated group compared to control group (P< 0.05). Othercomponents of the microbiota, such as bacteroides, clostridia, totalaerobes or enterobacteria were not significantly altered by thetreatment with the probiotic strain. However, we observeda decrease of clostridia probably due to diet restriction in bothgroups, although it only reaches statistical significance in thecontrol group.

In order to detect the presence of L. salivarius CECT5713 in thefaecal samples, bacterial DNA was isolated from colonies grown onMRS plates and PCR reactions were performed. L. salivariusCECT5713 was not detected in faeces from control volunteers.However, in 18 out of 20 volunteers (90%) of the probiotic group theadministered strainwas detected (data not shown), thus suggestingthe capability of L. salivarius CECT5713 to survive through thegastrointestinal tract. It also assures the compliance with theprotocol of the study.

3.4. Other faecal parameters

The ability of the faecal microbiota to produce SCFAs such asbutyric, propionic and acetic acids was tested. A significantdecrease in the production of all these SCFA was observed in thecontrol group, which was probably due to diet restriction (Table 3).However, in the probiotic group the levels of butyric, propionic and

Table 1Hematologic parameters of volunteers in control (n¼ 20) and probiotic (n¼ 20)groups at the beginning (week 0) and at the end (week 4) of the trial.a

Hematologicparameter

Control group Probiotic group

Week 0 Week 4 Week 0 Week 4

Red cells (millions/ml) 4,82� 0.09 4,86� 0.1 4,79� 0.14 4,79� 0.13Hemoglobin (%) 88� 2.6 89� 2.6 88� 2.9 87� 2.8Hematocrit (%) 42� 0.9 42� 0.9 42� 1.2 42� 1.2MCV (m c) 87� 1.3 87� 1.3 87� 1.3 87� 1.5MCH (pg) 30� 0.6 30� 0.6 30� 0.5 29� 0.5MCHC (%) 34� 0.3 34� 0.6 34� 0.3 33� 0.3Leucocytes

(thousands/ml)5,90� 0.2 5.9� 0.2 6.1� 0.2 5.9� 0.3

Segmentedneutrophils (%)

58� 2.1 57� 2.1 61� 1.4 60� 1.9

Eosinophils (%) 4� 0.3 4� 0.3 4� 0.4 4� 0.4Basophils (%) nd nd nd ndLymphocytes (%) 33� 2.0 33� 2.0 29� 1.4 31� 1.7Platelets

(thousands/ml)224.0� 8.6 213.9� 9.6 201.0� 8.3 210.3� 12.4

MCV¼Mean Corpuscular Volume.MCH¼Mean Corpuscular Hemoglobin.MCHC¼Mean Cell Hemoglobin Concentration.

a Values are mean� SEM; nd: not detectable.

Table 2Fecal microbiota of volunteers in control (n¼ 20) and probiotic (n¼ 20) groups at the beginning (week 0), in the middle (week 2) and at the end of the trial (week 4).a

Bacterial group Control group Probiotic group

Week 0 Week 2 Week 4 Week 0 Week 2 Week 4

Lactobacillus spp. 7.02� 0.31 7.56� 0.22 7.05� 0.25 7.12� 0.28 7.54� 0.25 7.9� 0.13*,y,#

Bifidobacterium spp. 7.65� 0.21 7.5� 0.2 6.9� 0.25*,y 7.93� 0.26 7.65� 0.26 8.1� 0.11y,#

Clostridium spp. 6.1� 0.24 6.14� 0.33 5.3� 0.3*,y 6.17� 0.25 6.01� 0.37 5.6� 0.28Bacteroides spp. 6.47� 0.24 6.68� 0.31 6.18� 0.2 6.73� 0.29 6.34� 0.29 6.25� 0.26Total aerobes 7.01� 0.21 6.91� 0.24 6.7� 0.21 7.18� 0.29 6.92� 0.25 6.72� 0.23Enterobacteria spp. 6.13� 0.25 5.8� 0.3 5.9� 0.25 6.37� 0.34 5.91� 0.26 5.8� 0.30

*P< 0.05 vs. week 0 in the same group.yP< 0.05 vs. week 2 in the same group.#P< 0.05 vs. the same week of control group.

a Values are mean (logarithm of CFU/g feces)� SEM.

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total SCFA were maintained and only a statistically significantdecrease was observed in the concentration of acetic acid. At theend of the trial, total SCFA concentration in the fecal samples wassignificantly higher in the probiotic group compared to the controlgroup.

Differences in the fecal moisture of the samples were notdetected (data not shown), however, the stool frequency wassignificantly higher in the probiotic group at the end of the trial incomparison with the control group (6.6� 0.5 vs. 9.7�1.13 stools/week, P< 0.05), whereas the stool frequency of the controlparticipants decreased significantly along the study probably due tothe diet restriction (7.2� 0.5 vs. 6.6� 0.5 stools/week, P< 0.05).Stools were normal since differences in fecal moisture were notdetected and volunteers did not report any diarrhea event.

3.5. Immunological effects of L. salivarius CECT573

All the leukocyte populations analyzed by flow cytometryshowed values into the ranges of those for healthy Caucasianadults. No differences were observed in the proportion of totallymphocytes and cells positively staining for CD3þ (T lympho-cytes), CD8þ (Cytotoxic T lymphocytes), CD4þ (T-helper lympho-cytes), CD19þ (B lymphocytes) and CD4þ CD25þ (Suppresor Tlymphocytes) related to the probiotic treatment (Table 4). However,the analysis revealed a significant increase in the proportion of NKcells (CD3þ CD56þ) and monocytes (CD14þ cells) after 4 weeks ofconsumption of L. salivarius CECT5713 (Table 4).

The consumption of the probiotic strain increased plasmaconcentration of the Th1 cytokine TNF-a and the concentration ofregulatory cytokines IL-10 and also TGF-b (Table 5). The [IL-12]/[IL-10] and [TNFa]/[IL-10] ratios significantly decreased at week 4 inthe probiotic group since the activation of Th1 cytokines produc-tion is compensated by the production of the regulatory IL-10cytokine.

The humoral response was also evaluated through measure-ment of immunoglobulin production. Data show a significantincrease in the plasma concentrations of IgA, IgG and IgM after

probiotic treatment, although differences were not statisticallysignificant with respect to the control group. No differences weredetected in IgA in fecal supernatants (Table 6).

4. Discussion

L. salivarius CECT5713 is a breast-milk derived strain that hasshown a strong probiotic potential in previous in vitro assays and inanimal studies [5,12e14]. The objective of this study was to eval-uate the gastrointestinal and immunological effects of theconsumption of this strain in healthy adults. Moreover, althoughthe strain fulfils the safety requirements for probiotic strains[15,16], the objective of this studywas also to evaluate the toleranceand beneficial effects of a continuous consumption of this Lacto-bacillus strain in humans.

Volunteers belonging to the probiotic group reported noadverse effects associated to the daily consumption of the capsules.Clinical examination by the medical staff of Puleva Biotech S.A.revealed that the health condition of all the participants wasnormal during the study demonstrating the tolerance and safety ofthe strain in adult humans.

The oral intake of L. salivarius CECT5713 for 4 weeks was asso-ciated with a slight modification of the intestinal microbiota ofvolunteers. Probiotic consumption increased faecal lactobacillicounts.

The increase in fecal lactobacilli count after probiotic treatmentcould be explained by the presence of the administered strain sincelive L. salivarius CECT5713 was detected by PCR assays after culti-vation of the faecal samples of volunteers. These results are in linewith previous data obtained from animal models [14] and confirmthe presence of this metabolically active strain in the gastrointes-tinal tract.

A decrease in faecal bifidobacteria was observed in the controlgroup probably due to dietary deprivation of fermented foods.However, the effect of the dietary deprivation on bifidobacteria wascounteracted by the administration of L. salivarius CECT5713. Themetabolic activity of this strain in the gut may induce changes in

Table 3Effects of probiotic treatment on fecal concentration of short chain fatty acids (SCFA).a

SCFA Control group(n¼ 20) Probioticgroup(n¼ 20)

Week 0 Week 2 Week 4 Week 0 Week 2 Week 4

Butyric acid 3.3� 0.4 3.0� 0.4 2.4� 0.3* 3.3� 1.5 2.1� 0.9 3.1� 1.4Propionic acid 4.4� 0.5 3.3� 0.3* 3.2� 0.5* 4.5� 0.5 3.2� 0.4* 4.0� 0.5Acetic acid 9.5� 0.9 3.3� 0.6* 6.7� 0.8* 9.9� 1.1 4.2� 0.5* 8.0� 0.8*Total SCFAs 17.1� 1.6 9.3� 1.1* 11.3� 1.5* 17.7� 1.8 10.5� 1.1* 15.1� 1.5#

*P< 0.05 vs. week 0 in the same group.yP< 0.05 vs. week 2 in the same group.#P< 0.05 vs. the same week of control group.

a Values are mean (mg/g feces)� SEM.

Table 4Effects of probiotic treatment on the proportions of immune system cells.a

White blood cell subsets Control group(n¼ 20) Probiotic group (n¼ 20)

Week 0 Week 2 Week 4 Week 0 Week 2 Week 4

T lymphocytes (%) 58.5� 2.7 59.6� 2.1 55.7� 2.6 59.5� 2.9 60.9� 2.7 56.5� 2.4B lymphocytes (%) 8.7� 0.7 8.1� 0.6 8.2� 0.7 9.4� 0.6 9.6� 0.8 9.4� 0.8Helper T lymphocytes(%) 38.5� 1.3 34.1� 1.6* 37.7� 2 35.4� 1.3 35.4� 1.6 34.6� 2Cytotoxic T lymphocytes (%) 23.5� 0.7 24.6� 0.9* 23.3� 1.4 21.2� 1.2# 23.2� 1.2 22.1� 1.8Suppressor T lymphocytes (%) 20.9� 1.2 22.3� 1.1 22.7� 1.3 22.2� 1.7 23.2� 1.3 21.8� 1.1Natural killer (%) 14.1� 1.7 14.6� 1.4 16.6� 1.4 13.9� 1.4 15.3� 1.8 19.1� 1.5*Monocyte (%) 6.1� 0.5 5.7� 0.3 6.1� 0.5 5.4� 0.4 5.2� 0.4 7.1� 0.7*,y

*P< 0.05 vs. week 0 in the same group.yP< 0.05 vs. week 2 in the same group.#P< 0.05 vs. the same week of control group.

a Values are mean� SEM.

S. Sierra et al. / Anaerobe 16 (2010) 195e200198

Resultados

109

the concentration of SCFA or substrates which may favor thegrowth of other bacterial groups such as bifidobacteria.

Deficient or compromised microbiota has been related tonumerous alterations of health such as intestinal tract infections,constipation, irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease,food-allergies, and antibiotic-induced diarrhea [9e11]. Although theconsumption of L. salivarius CECT5713 induced a mild effect onnormal microbiota, specific studies should be carried out to prove ifthe administration of this strain could contributes to the restorationof a healthier microbiota in cases of compromised microbiota.

The better bowel functioning is one the most common andattractive effects attributed to probiotic consumption [19,20]. Bowelfunction is mostly dependent on SCFA, which are considered one ofthemost importantmetabolites derived from themetabolic activityof gut microbiota. These fatty acids are the main energy source forcolonocytes and contribute to several gut functions includingcarbohydrate and lipid metabolism, control of the colonic pH,maintenance of the integrity of the colonic mucosa, intestinalmotility or absorption [21e23]. As it has been previously reported,a drastic reduction in the consumption of fermented products indiet decreases the fecal concentration of SCFA [24]. In this study weobserved the same phenomenon in the control group whichmaintained a restricted diet throughout the study. However, in thegroup consuming the probiotic strain the decrease was notobserved, evidencing the capability of the bacteria to compensatethese effects of the deficient diet. L. salivarius CECT5713 alsoincreased the frequency of defecation in volunteers, suggesting itsusefulness to ameliorate constipation. A faster transit can reduceexposure of the gut mucosa to the potential cancer-inducing agentsthatmay be found among the intestinal content [25,26]. In addition,the maintenance of butyrate is also important since it is usuallylinked to anti-neoplastic activities such as increased apoptosis,lower proliferation rate or down regulation of angiogenesis [27].

Regarding immunological effects, both innate and specificimmune responses were affected by the consumption of L. sali-varius CECT5713. The probiotic treatment during 4 weeks inducedan increase in the proportion of Natural Killer cells and monocytes.

Monocytes and macrophages, together with dendritic cells, playa crucial role in the innate immune response against microbialantigens, which in turn leads to activation of the adaptive immunesystem [28]. These cells recognize conserved molecular patterns ofbacterial components through toll-like receptors (TLR) leading toactivation of a variety of transcription factors, which triggers theproduction of cytokines [29]. The ability of these cells to recognizeconserved structures present in large groups of bacteria help themto detect higher numbers of pathogens and in a more effective way,even when the increase in phagocytic function is induced by non-pathogen bacteria. Innate immunity is activated very quickly afterinfection when acquired immunity has not yet been developed.Thus the improvement of this response would improve theresponse against infections.

The activation of the innate response triggers the production ofcytokines that modulates the specific response. In the present workthe activation of the immune system by the probiotic strain wasevidenced by the increase of the Th1 cytokine TNF-a and theincrease of regulatory cytokines, such as IL-10 or TGF-b. Theseregulatory cytokines emerged as potential key factors in immunesystem homeostasis, since they are involved in the T-regulatory andTh3 response, which counterbalance both Th1 and Th2 responses[30]. IL-10 and TGF-b have been related to the phenomenon oftolerance and the control of different immune processes includinginflammation, infection or allergy [31,32,33].

The high induction of IL-10 led to a reduction in the TNF-a/IL-10and IL-12/IL-10 ratios. These results are in agreement with thosepreviously published in animal models and in vitro assays [13]. Theincrease in regulatory cytokines has been related to the immuno-modulatory effect of probiotic strains in pathologies such as allergyor IBD [34e36]. The immunomodulatory capabilities of L. salivariusCECT5713 was previously demonstrated in a rat model of colitiswhere this strain was able to counteract the colonic inflammation,characteristic of this model [14].

In addition, plasma concentrations of IgG, IgM and IgA slightlyincreased at the end of the treatment in volunteers of the probioticgroup although differences between the groups were not

Table 5Plasma concentrations of different cytokines in control and probiotic groups at the beginning (week 0), in the middle (week 2) and at the end (week 4) of the trial.a

Cytokines Control group(n¼ 20) Probiotic group(n¼ 20)

Week 0 Week 2 Week 4 Week 0 Week 2 Week 4

[TNFa] pg/ml 95.5� 17.1 72.8� 13.4 91.9� 13.8 71.6� 11 87.1� 10.9 114.3� 13.1*, y

[IL-12] pg/ml 108.9� 19.5 87.3� 13 90.1� 14 101.1� 22.3 77.9� 7 111.5� 18.5[IL-10] pg/ml 55� 17.4 27.2� 6.5 27.3� 6.4 54.9� 11.6 49.5� 9.6 72.3� 11.7*,y.#

[TGFb] pg/ml 483.7� 109.3 539.3� 110.8 504.6� 112.7 503.6� 92.5 718.2� 142.1* 610.1� 111.6[IL-4] pg/ml 31.5� 12.2 33.6� 12.5 40.5� 12.5 18.1� 5.4 17.7� 5 20.8� 4.7[IL-12]/[IL-10] 13.9� 10.1 10.06� 6.9 3.8� 0.5 10.6.�6.04 4.1� 1.5 2.1� 0.4*,#

[TNFa]/[IL-10] 4.2� 2.6 2.8� 5.7 3.6� 0.7 3.2� 1.01 3.3�.1.04 1.8� 0.2*,#

*P< 0.05 vs. week 0 in the same group.yP< 0.05 vs. week 2 in the same group.#P< 0.05 vs. the same week of control group.

a Values are mean� SEM.

Table 6Plasma concentrations of immunoglobulins in control (n¼ 20) and probiotic (n¼ 20) groups at the beginning (week 0), in the middle (week 2) and at the end (week 4) of thetrial.a

Immunoglobulins Control group Probiotic group

Week 0 Week 2 Week 4 Week 0 Week 2 Week 4

[IgE] ng/ml 140.8� 30.3 125.3� 26.8 122.8� 26.9* 206.7� 51.8 206.8� 52.5 210.2� 52.9[IgG] mg/ml 1148.2.5� 139.4 1015.4� 123.1 1016.6� 196.9 1050.1� 190.4 891.6� 210.3 1829.9� 491.4*[IgM] mg/ml 362.2� 80.5 279.4� 21.8 261.1� 14.9 351.5� 87.2 305.1� 51.8 540.2� 165*[IgA] mg/ml 1032.8� 310.8 936.4� 265.3 907� 209.1 1036.2� 213.2 923.6� 209.3 1681.5� 471.0*[IgA] ug/g faeces 20.4� 4.7 21.0� 3.5 19.3� 3.3 28.0� 5.2 31.9� 9.5 33.6� 9.6

*P< 0.05 vs. week 0 in the same group.a Values are mean� SEM.

S. Sierra et al. / Anaerobe 16 (2010) 195e200 199

Resultados

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statistically significant. This increase may provoke an activation ofthe specific immune response that may improve the defenseagainst infections. The increase of IgA has been related to the anti-infectious properties of probiotics in diarrhoeal disease [37,38].

Therefore, L. salivarius CECT5713 is endowed with immuno-modulatory properties that induce the activation of both innate andspecific immune responses that may enhance the defense againstpathogens, but also induce the production of immune-modularorycytokines involved in important mechanisms such as tolerance.Future trials are needed to study the impact of this probiotic strainin the prevention or treatment of infections or diseases caused bydysfunction of the immune system, such as allergy or IBD.

Acknowledgements

This study was supported by Puleva Biotech S.A.

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S. Sierra et al. / Anaerobe 16 (2010) 195e200200

2. Seguridad, tolerancia y efectos beneficiosos del consumo de una fórmula de continuación suplementada con la cepa probiótica aislada de leche materna Lactobacillus salivarius CECT5713 en niños de 6 meses.

Resultados

115

RESUMEN

Numerosos estudios demuestran que la lactancia materna proporciona una mayor

protección frente a infecciones comparado con la lactancia artificial. El descubrimiento de

la presencia de probióticos en la leche materna sugiere que la adición de estas bacterias a

las leches infantiles podría ser una alternativa para imitar algunos de los efectos beneficio-

sos de la lactancia natural. Lactobacillus salivarius CECT5713 es una cepa originariamente

aislada de leche materna que ha demostrado en modelos animales y en humanos adultos

su capacidad para mejorar la función intestinal y modular el sistema inmune. Dado que

esta cepa se encuentra de forma natural en la leche humana y dado su potencial probiótico

parece ser una cepa de elección para su uso en nutrición infantil.

El objetivo de este estudio es evaluar la seguridad, la tolerancia y efectos beneficio-

sos de una fórmula de continuación que contiene la cepa Lactobacillus salivarius CECT5713

en niños de seis meses.

Antes de iniciar el estudio se comprobó que la cepa no poseía resistencias a anti-

bióticas impropias de su especie y que pudieran ser transferibles.

Se llevó a cabo un estudio de intervención en niños de 6 meses, aleatorio, doble-

ciego y comparado con un placebo, que involucró a 80 niños sanos. Los niños fueron dis-

tribuidos en dos grupos, un grupo control que consumió una fórmula infantil estándar sin

probióticos y un grupo probiótico que consumió la misma fórmula infantil adicionada de

la cepa probiótica L.salivarius CECT5713 a una concentración media de 2x106 ufc/g de fór-

mula. Los niños consumieron la fórmula durante seis meses (desde los 6 a los 12 meses de

vida). Para valorar la seguridad del consumo de la cepa probiótica se hizo seguimiento del

crecimiento de los niños durante los meses de intervención. Con el fin de evaluar los efec-

tos del consumo de la cepa sobre la microbiota intestinal se recogieron muestras de heces

al inicio del estudio y a los 3 y 6 meses de intervención.

El consumo de la fórmula infantil probiótica fue seguro y perfectamente tolerado

por los niños no refiriéndose ningún efecto adverso relacionado con el consumo de la cepa

probiótica. El crecimiento de los niños fue equivalente en ambos grupos tanto a nivel de

ganancia de peso como de otros parámetros antropométricos.

Se observó un incremento significativo del género Lactobacillus en las heces de los

Resultados

116

niños del grupo probiótico detectándose la cepa de L. salivarius administrada en las heces

del 90% de los niños del grupo probiótico. Los cambios en la microbiota se correspondieron

con un aumento en las heces dela concentración de butírico, ácido graso de cadena corta

que desempeña un papel esencial en el mantenimiento de la integridad y función intestinal.

El consumo de la fórmula probiótica se relacionó con una disminución significativa

en la incidencia de infecciones intestinales y respiratorias.

CONCLUSIÓN

La adición de la cepa probiótica Lactobacillus salivarius CECT 5713 a fórmulas in-

fantiles de continuación es segura y bien tolerada por niños de 6 a 12 meses. El consumo

de la fórmula de continuación que contiene esta cepa ejerce efectos beneficiosos sobre

la salud del niño reduciendo la incidencia de infecciones gastrointestinales y respiratorias

durante el periodo de consumo.

Resultados

117

Applied nutritional investigation

Safety and tolerance of the human milk probiotic strain Lactobacillussalivarius CECT5713 in 6-month-old children

Jose Maldonado Ph.D., M.D. a, Federico Lara-Villoslada Ph.D. b, Saleta Sierra Ph.D. b,Lluis Sempere M.Sc. b, Marta Gomez Ph.D. c, Juan Miguel Rodriguez Ph.D. c, Julio Boza Ph.D. b,Jordi Xaus Ph.D. b, Monica Olivares Ph.D. b,*aDepartment of Pediatrics, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, SpainbDepartment of Nutrition and Health, Puleva Biotech S.A., Granada, SpaincDepartment of Nutrition and Food Science, Universidad Complutense, Madrid, Spain

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 6 May 2009Accepted 17 August 2009

Keywords:SafetyProbioticsIntestinal functionFollow-on formulaIntestinal microbiota

a b s t r a c t

Objective: Intestinal microbiota plays an important role in the prevention of certain diseases duringthe pediatric years. Thus, there is an increasing interest in the addition of probiotics to infantformulas. The aim of this study was to evaluate the safety of a follow-on formula with Lactobacillussalivarius CECT5713 in 6-mo-old children.Methods: The antibiotic susceptibility of L. salivarius CECT5713 was analyzed by a dilution method.A double-blinded, randomized, placebo controlled study was performed. Children (n ¼ 80) weredistributed in two groups and consumed the formula supplemented or not with probiotics (2 � 106

colony-forming units [cfu]/g) during 6 mo. Fecal samples were collected at enrollment, at 3 mo,and at the end of trial. Clinical and anthropometric evaluations were performed. Depending on thevariable, one-way or two-way repeated measures analysis of variance were used for the statisticalanalysis.Results: The antibiotic susceptibility profile of the strain resulted as safe. No adverse effects asso-ciated with the consumption of the probiotic formula were reported. In addition, clinical param-eters did not differ between groups. Consumption of the probiotic supplemented formula led to anincrease in the fecal lactobacilli content (7.6 � 0.2 versus 7.9 � 0.1 log cfu/g, P < 0.05). Lactobacillussalivarius CECT5713 was detected in the feces of volunteers from the probiotic group. Probioticconsumption induced a significant increase in the fecal concentration of butyric acid at 6 mo.Conclusion: Thus, a follow-on formula with L. salivarius CECT5713 is safe and well tolerated in6-mo-old infants.

� 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.

Introduction

Human milk is a complex species-specific biological fluidadapted to perfectly satisfy the nutritional needs of the infant.Moreover, it has been demonstrated that breast milk confersprotection against different diseases because the incidence ofthese disorders is lower in breast-fed than in formula-fed infants[1,2]. Different bioactive components of human milk, such as

immunoglobulins, oligosaccharides, immune cells, lactoferrin,lysozymes, etc., could be responsible for this beneficial effect.

In addition to these compounds, it has been demonstratedthat human milk constitutes an excellent and continuous sourceof commensal bacteria for the infant gut [3,4]. These bacteriacould play a key role in the initial establishment of the intestinalmicrobiota of breast-fed infants, which has been reported to bemore favorable than that of formula-fed infants [5].

In recent years, there has been an increasing number ofreports about the effect of probiotic bacteria in infants. Thus, ithas been demonstrated that the use of probiotic compared withplacebo reduces the risk of diarrhea lasting longer than 3 d [6].Probiotics have also been demonstrated to be effective in theprevention of atopic dermatitis, reducing the risk to halfcompared with placebo [7]. Among bacteria isolated from

This work was supported by Puleva Biotech. Federico Lara-Villoslada receivedfinancial assistance from the Torres Quevedo Program of Spanish Ministry ofScience and Technology.* Corresponding author. Tel.: þ349-5824-0396; fax: þ349-5824-0160.

E-mail address: molivares@pulevabiotech.es (M. Olivares).

0899-9007/$ – see front matter � 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.nut.2009.08.023

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Nutrition

journal homepage: www.nutr i t ionjrnl .com

Nutrition 26 (2010) 1082–1087

Resultados

118

human milk, species of Lactobacillus with probiotic propertieshave been found [3,4,8]. These data suggest that probioticsnatively found in breast milk could also be involved in some of itsdemonstrated beneficial effects.

Due to the health-promoting effects reported for probioticbacteria, many strains are being isolated and incorporated intofood and pharmaceutical markets. Although probiotics aregenerally considered safe in infants, there are different reports ofbacteremia with lactobacilli, especially in infants who areimmunocompromised or have indwelling catheters [9,10]. Thosereports have resulted in concern about the safety of the probioticbacteria and safety assessments, including antibiotic suscepti-bility tests, are recommended, especially for those strains thataimed to be incorporated into the human food chain.

Recently, the strain Lactobacillus salivarius CECT5713 has beenisolated from infant feces and breast milk of a mother–childpair [8]. Concerning its probiotic characteristics, L. salivariusCECT5713 has been shown to survive in gastrointestinal tractconditions, to adhere to intestinal cells [8], and to have antimi-crobial activity in vitro and in a mouse model of infectiousdiarrhea [8,11]. It has been reported that this strain does notproduce D-lactic acid [10], which, together with its probioticpotential, makes L. salivarius CECT5713 a good candidate forapplication in infant nutrition. This strain fulfills the recom-mended safety criteria for probiotic bacteria, such as humanorigin and the absence of deleterious enzymatic activities [8]. Inaddition, in a recent report L. salivarius CECT5713 has beendemonstrated to be safe in mice at a dose 500–10 000 timeshigher (per gram of body weight) than that normally consumedby humans [12]. In this report it was demonstrated that, even insuch doses, L. salivarius CECT5713 was not able to translocatefrom the gut to other tissues.

Despite these safety data, we decided to evaluate the oraltolerance of a follow-on formula with L. salivarius CECT5713 in6-mo-old children and to analyze the gastrointestinal effects ofthis strain. As part of the safety evaluation, the antibiotic sensi-tivity profile of the strain was also analyzed.

Materials and methods

Sensitivity to antibiotics

Minimum inhibitory concentrations of 12 antimicrobial agents were deter-mined by microdilution using the newly developed and standardized lactic acidbacteria susceptibility test medium broth formulation essentially consisting ofa mixture of Iso-Sensitest (Oxoid, Basingstoke, UK) broth (90%) and Man RogosaSharpe (MRS) broth (10%) adjusted to pH 6.7 as previously described [13]. Theprobiotic strain was grown under anaerobic conditions. Ten of the antimicrobialstested (ampicillin, gentamicin, streptomycin, quinupristin/dalfopristin, erythro-mycin, clindamycin, oxytetracycline, chloramphenicol, kanamycin) were thosefor which the panel on additives and products or substances used in animal feed(FEEDAP) of the European Food Safety Authority (EFSA) has established micro-biological breakpoints (cutoff values) that enable the distinction between lac-tobacilli strains harboring acquired antimicrobial resistances and susceptiblestrains [14]. Minimum inhibitory concentrations of three additional antimicro-bials agents for which tentative cutoff values for lactobacilli have been suggested[14] were also determined. The antimicrobials were tested in the concentrationranges shown in parentheses: penicillin G (0.032–64 mg/L), ampicillin (0.032–64mg/L), gentamicin (1–2048 mg/L), streptomycin (2–4096 mg/L), quinupristin/dalfopristin (tested as 30:70 ratio, 0.032–64 mg/L), erythromycin (0.016–32 mg/L), clindamycin (0.032–32 mg/L), oxytetracycline (0.063–128 mg/L), fusidic acid(0.063–128 mg/L), linezolid (0.016–32 mg/L), chloramphenicol (0.125–256), andkanamycin (1–256 mg/L).

Design of the trial

The recruitment was carried out in the Department of Pediatrics of HospitalUniversitario San Cecilio (Granada, Spain). Eighty children in the sixth month oflife were included in the study, which was carried out according to the

Declaration of Helsinki, and the protocol was approved by the ethical committeeof Fundacion Hospital Universitario San Cecilio. Informed written consent wasobtained from all the children’s parents. The trial is registered in the registrysponsored by the US Library of Medicine (www.clinicaltrial.gov) with thenumber NCT00724204. Only 6-mo-old children who were fed exclusively withformula at the moment of recruitment were included in the trial. The exclusioncriteria were frequent gastrointestinal disorders (frequent diarrhea, constipationepisodes, gastroesophageal reflux), gastrointestinal surgery, cow’s milk proteinallergy, metabolic diseases (diabetes or lactose intolerance), antibiotic treatmentduring the trial, and/or recent (within the preceding 3 wk) exposure toantibiotics.

In a double-blind trial, children were randomly distributed in two groups,a control group that received a follow-on formula without probiotics and a pro-biotic group that consumed the same follow-on formula with L. salivariusCECT5713 at a concentration of at least 2� 106 colony-forming units (cfu)/g. Bothgroups consumed the formula during 6 mo and fecal samples were taken atrecruitment, at 3mo, and at the end of the trial (6mo). Viability of the probiotic inthe follow-on formula was analyzed every 2 mo. Follow-on formulas wereprovided by Puleva Food S.A. (Granada, Spain).

Clinical supervision of the children

Clinical and physical evaluations of the children were performed by thepediatrician every month throughout the trial. Weight, length, head circumfer-ence, spitting up, vomiting, night awakenings, irritability, severe crying, and theincidence of deleterious effects were recorded in every visit to the pediatrician.

In addition the incidence of diarrhea (defined as loose or watery stools atleast four times per day) and respiratory infections (defined as the presence ofabundant mucus and/or cough for at least 2 consecutive days with or withoutfever or the presence of wheezing and/or roaring with or without fever) was alsorecorded in every pediatrician visit.

Fecal bacteria quantitation

Fecal microbiota was analyzed as previously described [15]. Fecal sampleswere homogenized individually in a peptone-saline solution (100 mg/mL). Toestimate the concentration of bacterial groups, appropriate dilutions were spreadin quadruplicate onto plates of MRS agar for lactic acid bacteria, MRS agarsupplementedwith 0.5mg/L of dicloxacillin,1 g/L of LiCl, and 0.5 g/L of L-cysteinehydrochloride for bifidobacteria, Reinforced Clostridial Agar containing 20 mg/mLof polymyxin for clostridia, and Bile Aesculin Agar for bacteroides. All mediawereobtained from Oxoid, whereas antibiotics and other supplements were obtainedfrom Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Culture plates were incubated inanaerobiosis at 37�C for 24 to 48 h. Similarly, 1 mL of each suitable dilution wasspread onto specific Count Plates Petrifilm (3 M, St. Paul, MN, USA) for totalaerobes and for Enterobacteriaceae. Petrifilms were incubated in aerobiosis at37�C for 24 h. After incubation, colonies grown on the selective culture mediawere counted and the logarithm of the numbers of viable micro-organisms pergram of feces (colony-formin units per gram) were calculated and represented asthe average � standard error of the mean.

Short-chain fatty acid quantitation

The concentration of short-chain fatty acids in the fecal samples was quan-tified according to the methods previously described by Olivares et al. [16].Briefly, fecal samples were homogenized with 150 mM NaHCO3 (pH 7.8, 1:5,wt/v) in an argon atmosphere. Samples were incubated for 24 h at 37�C andstored at �80�C until extraction. To extract the short-chain fatty acids, 50 mL of100 mM 2-methylvaleric acid (internal standard), 10 mL of sulfuric acid, and 0.3mL of ethyl acetate were added to 1 mL of the homogenate. The mix wascentrifuged at 10 000 � g for 5 min at 4�C. The supernatants were dehydratedwith sodium sulphate (anhydrous) and centrifuged at 10 000� g for 5min at 4�C.Later, the sample (0.5 mL) was split-less inoculated into a gas chromatograph(mod. CP-3800, Varian, Lake Forest, CA, USA) equipped with CPWAX 52CB (innerdiameter 60 m � 0.25 mm), and connected to a flame ionization detector (FID)(Varian). Heliumwas used as the carrier and the make-up gas, with a flow rate of1.5 mL/min. The injection temperature was 250�C. Acetate, propionate, andbutyrate concentrations were automatically calculated from the areas of theresulting peaks using the Star Chromatography WorkStation program (version5.5) (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA), which was connected online to the FIDdetector.

Quantification of water content of fecal samples

Fecal samples with a knownweight were introduced into a heater during 72h at 60�C to eliminate the remaining water. Percentages of water content of thesamples were calculated.

J. Maldonado et al. / Nutrition 26 (2010) 1082–1087 1083

Resultados

119

Identification of L. salivarius CECT5713 in fecal samples

To detect the presence of L. salivarius CECT5713 in the feces, polymerasechain reaction was directly performed from MRS agar colonies, obtained fromculture of fecal samples, using the following specific primers: 50-GAT CGC TATTTT TTT ATT AGG TAT C-30 and 50-TGG CTA ACT TGT TTT TTT ACT TC-30 .Polymerase chain reaction conditions were as follows: 96�C for 5 min (1 cycle),96�C for 30 s, 46�C for 30 s, and 72�C for 30 s (30 cycles), and a final extension at72�C for 2 min. A fragment of 180 bp was amplified.

Statistical analysis

Data were analyzed using SPSS 12.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). For thegaussian variables, the longitudinal effect of the treatment within each group atthe different time points of the study was analyzed by one-way repeatedmeasures analysis of variance followed by paired t test (within-group compar-ison). Two-way repeated measures analysis of variance was used to analyzestatistical differences produced by the treatment followed by independent t testto asses at which time points the groups differed. Non-parametric variables wereanalyzed using the Mann-Whitney U test.

Results

Sensitivity to antibiotics

Antibiotic susceptibility profiles showed that the strains weresensitive to all antibiotics tested (Table 1). Minimum inhibitoryconcentrations demonstrated that the strains were sensible tob-lactam antibiotics such as penicillin G and ampicillin, toaminoglycosides such as gentamicin, to macrolides such aserythromycin, and to other broad-spectrum antibiotics such aschloramphenicol or tetracycline.

Baseline data of children

As presented in Table 2, there were no statistically significantdifferences between the control and probiotic groups in baselinedemographic data. In addition, time of breast-feeding beforeinclusion in the trial was similar in both groups.

Compliance with the protocol

All children in the trial carried out the protocol correctly andthere were no exclusions due to poor compliance. The meandaily formula volume consumed was similar in the control andprobiotic groups (Table 3). Furthermore, there were no signifi-cant changes in the viability of the probiotic throughout the trial.

Clinical and physical examinations

None of the volunteers dropped out of the study or reportedany adverse effect related to consumption of the formulas tested.Physical examination by the pediatrician showed no statisticallysignificant differences in children’s growth between the controland probiotic groups (Table 4). There were no statisticallysignificant differences in the digestive tolerance, behavioralcharacteristics, and milk intake between the control andprobiotic groups (Table 3).

Effect of probiotic on fecal microbiota

As presented in Table 5, lactobacilli counts significantlydecreased in the control group at 3 and 6 mo. In contrast, lac-tobacilli content of fecal samples from the probiotic group didnot statistically differ throughout the study. Thus, after 6 mo ofconsumption of the follow-on formula containing L. salivariusCECT5713, lactobacilli content in the probiotic group wassignificantly higher than that in the control group. Bifidobacteria,clostridia, bacteroides, and enterobacteria counts did not statis-tically differ between the control and probiotic treated groups,although a significant decrease in clostridia and enterobacteriawas observed in both groups at the end of the trial. At 6 moa significantly increased content of total aerobes was alsoobserved in the probiotic group compared with the controlgroup.

In addition, L. salivarius CECT5713 was detected by poly-merase chain reaction in the fecal samples of 90% (36 of 40) ofthe probiotic group, whereas this strain was not detected in thefecal samples of any of the children who consumed the controlformula (data not shown).

Effect of probiotic on fecal moisture

The percentage of water in fecal samples was analyzed. Therewere no statistically significant changes throughout the study inthe same group or between groups. Thus, the percentages ofwater at the end of the trial were 81.5 � 2.2% for the controlgroup and 80.9 � 3.4% for the probiotic group (P > 0.1).

Table 1MICs and breakpoint values (micrograms per milliliter) of antimicrobial agentstested against Lactobacillus salivarius CECT5713

Antibiotic MIC values Breakpoint 1* Breakpoint 2y

Ampicillin 1 1Penicillin G 0.5 d 1Streptomycin 4 64Gentamicin 0.5 16Kanamycin 1 32Oxytetracycline 2 8Erythromycin 0.128 1Clindamycin 0.128 1Fusidic acid 0.25 d 1Linezolid 2 d 2Quinupristin/dalfopristin 1 4Chloramphenicol 2 4

MIC, minimum inhibitory concentration* Klare et al. [13].y European Food Safety Authority [14].

Table 2Baseline demographic data and time of breast-feeding of children

Control (n ¼ 40) Probiotic (n ¼ 40)

Boys/girls 18/22 21/19Weight at birth (g) 3065 � 376 3250 � 501Length at birth (cm) 49.1 � 1.4 49.7 � 1.7Head circumference

at birth (cm)34.2 � 1.3 34.8 � 1.8

Gestational age (wk) 39.1 � 1.3 39.0 � 1.4Time of breast-feeding (mo) 2.9 � 2.4 2.9 � 2.0

Table 3Digestive tolerance and behavioral characteristics of children after 6-mo intake ofa follow-on formula with (probiotic) or without (control) Lactobacillus salivariusCECT5713

Control (n ¼ 40) Probiotic (n ¼ 40)

Spitting up 2/40 1/40Night awakenings 3/40 1/40Irritability 1/40 0/40Severe crying 0/40 0/40Constipation 6/40 4/40Daily formula intake (mL) 680 � 12 670 � 8Daily depositions 1.4 � 0.2 1.9 � 0.3

J. Maldonado et al. / Nutrition 26 (2010) 1082–10871084

Resultados

120

Effect of probiotic on fecal concentration of short-chain fatty acids

Acetate, propionate, and butyrate concentrations weremeasured in the fecal samples. There were no statisticallysignificant differences in the acetate and propionate contentbetween groups or in the same group throughout the trial (datanot shown). In contrast, butyrate content was significantlyhigher after 6 mo of consumption of the probiotic formula(Fig. 1). However, this difference was not observed in the controlgroup, because the butyrate concentration was similar at thebeginning of the trial and after 6 mo.

Effect of probiotic on the incidence of infectious diseasesin children

Although it was not the main outcome of the trial, the inci-dence of diarrhea and respiratory infections was recorded underpediatrician supervision. The number of episodes of diarrheawassignificantly lower in the probiotic group than in the controlgroup (26 versus 7, P< 0.05). In addition, the number of episodesof respiratory infections was significantly lower in the probioticgroup (53 versus 36, P < 0.05). Statistical analysis revealed thatthe episodes of diarrhea and respiratory infections were nor-mally distributed in both groups, thus suggesting that the largernumber of episodes in the control group was not due to a subjectwith many episodes for any cause.

Discussion

Intestinal microbiota has been reported to be a key factor inthe prevention of several pathologies, such as allergy or infec-tious diseases, especially during the first years of life [17,18]. Forthis reason, there is an increasing interest in the addition ofprobiotic bacteria to infant formula to modulate gut microbiota,with the final objective of achieving beneficial effects for infanthealth. In fact, it has been reported that humanmilk is a source ofprobiotic bacteria for the infant gut [4] and these bacteria couldplay a role in the beneficial effects observed in breast-fedcompared with formula-fed children.

The verification that probiotic strains lack acquired antimi-crobial resistance properties is an important requisite beforeconsidering them safe for animal consumption. Antimicrobialsusceptibility testing of lactobacilli can be performed by severalmethods, but, in general, dilution methods provide a more reli-able indication of the intrinsic or acquired nature of a givenresistance phenotype [13]. All strains of lactobacilli tested in thisstudy were safe according to the EFSA guidelines that enable thedistinction between strains of lactobacilli harboring acquiredantimicrobial resistance and susceptible strains [14].

Safety of probiotics has been the subject of active discussionandoral tolerance assessments are recommended [19]. In a recentreport from the North American Society for Pediatric Gastroen-terology and Nutrition (NASPGHAN) Nutrition Committee [20], itis stated that probiotics are generally considered safe in children,but the need for further studies, especially in neonates, is alsostated. Recently, different reports have demonstrated thatadministration of different strains of probiotics to healthynewborns is safe and well tolerated, and it has been associatedwith intestinal [21] and immunologic [22] benefits. However, it iswidely known that each probiotic strain has its own propertiesand safety has to be analyzed on a strain-by-strain basis.

Lactobacillus salivarius CECT5713 is a breast milk strain thathas been reported, in vitro and in animal models, to have pro-biotic properties [8,11], which, together with the fact that thisstrain does not produce D-lactic acid [8], makes L. salivariusCECT5713 a good candidate for infant nutrition. Although thisstrain fulfills safety criteria for probiotic bacteria [8] and it hasbeen demonstrated to be safe in animal models [11,12], wedecided to perform an oral tolerance trial in 6-mo-old children.

The results of this randomized, double-blind, placebo-controlled trial suggest the safety of the supplemented formula,because all children successfully completed the study and therewere no deleterious effects related to the consumption of theformula with L. salivarius CECT5713. Physical examination ofinfants by the pediatrician revealed that probiotic consumptiondid not affect the growth rate, which was similar in both groupsand within the range of normality.

Consumption of L. salivarius CECT5713 caused an increase infecal lactobacilli at 6 mo. This result is in agreement with

Table 4Growth parameters of 6-mo-old children receiving a follow-on formula with (probiotic) or without (control) Lactobacillus salivarius CECT5713 at t0, t3, and t6

Control Probiotic

t0 t3 t6 t0 t3 t6

Weight (g) 7579 � 870 9002 � 1011 9895 � 1134 7840 � 1041 9283 � 1332 10 341 � 1391Length (cm) 65.8 � 2.3 71.1 � 2.3 74.6 � 2.4 66.35 � 2.3 71.2 � 2.4 75.0 � 2.8Head circumference (cm) 43.7 � 1.3 45.8 � 1.3 47.1 � 1.3 44.0 � 1.1 46.2 � 1.3 47.6 � 1.2

t0, at recruitment; t3, at 3 mo; t6, at 6 mo

Table 5Intestinal microbiota counts in fecal samples (log colony-forming units per gram) of children receiving a follow-on formula with (probiotic) or without (control)Lactobacillus salivarius CECT5713 at t0, t3, and t6

Control ProbioticBacterial group

t0 t3 t6 t0 t3 t6

Lactobacilli 8.2 � 0.1 7.7 � 0.1* 7.6 � 0.2* 8.0 � 0.1 8.1 � 0.1 7.9 � 0.1y

Bifidobacteria 7.9 � 0.1 7.9 � 0.1 7.8 � 0.1 7.9 � 0.1 7.7 � 0.1 7.7 � 0.1Enterobacteria 6.2 � 0.2 5.7 � 0.2 4.8 � 0.2* 5.8 � 0.3 5.7 � 0.2 5.2 � 0.2*

Clostridia 7.8 � 0.1 7.6 � 0.1 7.1 � 0.2* 7.8 � 0.2 7.5 � 0.1 7.3 � 0.1*

Bacteroides 7.7 � 0.1 7.6 � 0.1 7.3 � 0.1 7.8 � 0.1 7.3 � 0.1 7.3 � 0.1*

Total aerobes 8.1 � 0.1 7.6 � 0.2 7.1 � 0.2 7.8 � 0.2 7.5 � 0.1 7.5 � 0.1*,y

t0, at recruitment; t3, at 3 mo; t6, at 6 mo* P < 0.05 versus t0.y P < 0.05 versus the same time point in control group.

J. Maldonado et al. / Nutrition 26 (2010) 1082–1087 1085

Resultados

121

previous studies reporting an increase in lactobacilli afterconsumption of different strains of probiotics in adults [18,23]and in children [15]. In contrast, in another trial, probioticadministration to newborns during 4–6 mo, through theirmothers or in infant formulas, did not cause changes in gutmicrobiota [24]. Moreover, L. salivarius CECT5713was detected in90% of children in the probiotic group, thus suggesting thesurvival of the bacteria through the gastrointestinal tract andcompliance with the protocol. These results are in agreementwith those previously published reporting that L. salivariusCECT5713 is able to survive the transit through an in vitro modelof the gastrointestinal tract and to adhere to intestinal cells [8].

Children from the probiotic group also showed an increase inthe fecal concentration of butyric acid after 6 mo of consumptionof the supplemented formula. The increase in fecal butyratecontent after administration of lactobacilli has been previouslyreported in healthy adults [16] and recently in patients withClostridium difficile–associated diarrhea [25], but to our knowl-edge, this is the first report of a similar effect in 6-mo-old children.Butyric acid plays a key role in intestinal function by reducing thecolonic pH and increasing peristalsis, which promotes a morefavorable environment for commensal bacteria against potentialpathogenic micro-organisms [26]. In addition, butyrate isconsidered themain energy source for colonocytes [27,28], whichsuggests that it could be involved in intestinal maturation.

Although it was not the main outcome of the trial, dataregistered by the pediatrician revealed a lower incidence ofdiarrhea and respiratory infections in the probiotic groupcompared with the control group. Although more studiesspecially designed to evaluate the incidence of infections areneeded, this result suggests a protective effect of L. salivariusCECT5713 against infection. This is in agreement with in vitroassays, reporting a production of antimicrobial compounds bythis strain [8], and is in accord with the result reported in ananimal model of Salmonella infection [11]. The protective role ofan infant formula containing probiotics against diarrhea hasbeen previously reported in children [22,29]. Future studies willelucidate this anti-infective role of L. salivarius CECT5713 and thepossible mechanisms involved.

Conclusion

A follow-on formula with L. salivarius CECT5713 is safe andwell tolerated by 6-mo-old children. In addition, this probiotic

modulates the intestinal microbiota and exerts gastrointestinaleffects that could be beneficial for children’s health.

Acknowledgments

The authors are grateful to the infants and parents for theirkind co-operation in making this study possible.

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0,2

0,3

0,4

76543210

[B

utiric

acid

] m

g/g

shtnoM

lortnoC citoiborP

*

Fig. 1. Fecal concentration of butyric acid after consumption of the control orprobiotic formula. Data are means � SEMs (bars; n ¼ 40). * P < 0.05 versus time0 (at recruitment).

J. Maldonado et al. / Nutrition 26 (2010) 1082–10871086

Resultados

122

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J. Maldonado et al. / Nutrition 26 (2010) 1082–1087 1087

3. Seguridad, tolerancia y efectos beneficiosos del consumo de una fórmula de continuación suplementada con la cepa probiótica aislada de leche materna Lactobacillus fermentum CECT5716 en niños de 6 meses.

Resultados

127

RESUMEN

Numerosos estudios demuestran que la lactancia materna proporciona una mayor

protección frente a infecciones comparado con la lactancia artificial. El descubrimiento de

la presencia de probióticos en la leche materna sugiere que la adición de estas bacterias a

las leches infantiles podría ser una alternativa para imitar algunos de los efectos beneficio-

sos de la lactancia natural. Lactobacillus fermentum CECT5716 es una cepa originariamente

aislada de leche materna que ha demostrado en modelos animales y en humanos adultos

su capacidad para mejorar la función intestinal y modular el sistema inmune. Dado que

esta cepa se encuentra de forma natural en la leche humana y dado su potencial probiótico

parece ser una cepa de elección para su uso en nutrición infantil.

El objetivo de este estudio es evaluar la seguridad, la tolerancia y efectos ben-

eficiosos de una fórmula de continuación que contiene la cepa Lactobacillus fermentum

CECT5716 en niños de seis meses.

Se realizó un estudio de intervención en niños, aleatorio, doble-ciego y controlado

por placebo, que involucró a 215 niños sanos de seis meses de edad. La variable principal

de respuesta de este estudio fue la reducción en la incidencia de infecciones gastrointes-

tinales. Los niños fueron distribuidos en dos grupos, un grupo control que consumió una

fórmula infantil estándar sin probióticos y un grupo probiótico que consumió una fórmula

infantil suplementada con Lactobacillus fermentum CECT 5716 a una concentración media

de 2x106 ufc/g. Los niños consumieron la fórmula durante seis meses (desde los 6 a los 12

meses de vida). Para valorar la seguridad del consumo de la cepa probiótica se hizo segui-

miento del crecimiento de los niños durante los meses de intervención. Con el fin de evalu-

ar los efectos del consumo de la cepa sobre la microbiota intestinal se recogieron muestras

de heces al inicio del estudio y a los 3 y 6 meses de intervención. El seguimiento de la salud

de los niños se llevó a cabo a través de las visitas al pediatra.

El consumo de la fórmula infantil probiótica fue seguro y perfectamente tolerado

por los niños no refiriéndose ningún efecto adverso relacionado con el consumo de la cepa

probiótica. El crecimiento de los niños fue equivalente en ambos grupos tanto a nivel de

ganancia de peso como de otros parámetros antropométricos.

Se observó un incremento significativo del género Lactobacillus en las heces de los

Resultados

128

niños del grupo probiótico que se acompañó de una subida también significativa en los

niveles del género Bifidobacterium.

El consumo de la fórmula probiótica se relacionó con una disminución significativa

del 46% (p=0.032) en la incidencia de infecciones intestinales y del 26% (p=0.026) en la

incidencia de infecciones respiratorias.

CONCLUSIÓN

La adición de la cepa probiótica Lactobacillus fermentum CECT5716 a fórmulas in-

fantiles de continuación es segura y bien tolerada por niños de 6 a 12 meses. El consumo

de la fórmula de continuación que contiene L. fermentum CECT5716 ejerce efectos bene-

ficiosos sobre la salud del niño reduciendo la incidencia de infecciones gastrointestinales

y respiratorias durante el periodo de consumo.

Resultados

129

Editorial Manager(tm) for Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition Manuscript Draft Manuscript Number: Title: The human human milk probiotic Lactobacillus fermentum CECT 5716 reduces the incidence of gastrointestinal and respiratory infections in infants. A Randomised Controlled Trial comparing a prebiotic containing follow-on formula vs the same formula plus probiotic. Article Type: Original Article Section/Category: Nutrition Keywords: Lactobacillus fermentum, Probiotics, Infection, infants, follow-on formula Corresponding Author: Federico Lara-Villoslada, PhD Corresponding Author's Institution: Puleva Food First Author: José Maldonado Order of Authors: José Maldonado;Francisco Cañabate;Lluis Sempere;Francisco Vela;Ana Rosa Sánchez;Eduardo Narbona;Eduardo López-Huertas;Arjan Geerlings;Antonio David Valero;Mónica Olivares;Federico Lara-Villoslada, PhD Manuscript Region of Origin: SPAIN Abstract: Objectives: To examine the effects of a follow-on formula containing Lactobacillus fermentum CECT5716 (L.fermentum) on the incidence of infections in infants between the ages of 6 to 12 months. Methods: A randomized double blinded controlled study including infants at the age of 6-months was conducted. Infants were assigned randomly to either follow-on formula supplemented with L.fermentum plus GOS (experimental group, EG), or the same formula supplemented with only GOS (control group, CG). The main outcome was the incidence of infections for the 6-months duration of the study. Results: The EG showed a significant 46% reduction on the incidence rate (IR) of gastrointestinal infections, (EG: 0.196±0.51, CG: 0.363±0.53, IR ratio = 0.54, 95% CI: 0.307-0.950, P=0.032), 27% reduction on the incidence of upper respiratory tract infections (EG: 0.969±0.96, CG: 1.330±1.23, IR ratio = 0.729, 95% CI: 0.46-1.38, P=0.026), and 30% reduction in the total number of infections (EG: 1.464±1.15, CG: 2.077±1.59, IR rate ratio = 0.70, 95% CI: 0.46-1.38, P=0.003), at the end of the study period compared with CG. Conclusions: Administration of a follow-on formula with L.fermentum CECT5716 may be useful for the prevention of community-acquired GI and upper respiratory infections.

Resultados

130

1

The human milk probiotic Lactobacillus fermentum CECT 5716 reduces the incidence of 1

gastrointestinal and respiratory infections in infants. A Randomised Controlled Trial 2

comparing a prebiotic containing follow-on formula vs the same formula plus probiotic. 3

José Maldonado (1) MD/PhD, Francisco Cañabate (2) MD, Lluis Sempere (3) MSc, Francisco 4

Vela (2) MD, Ana Rosa Sánchez (2) MD, Eduardo Narbona (4) MD, Eduardo López-Huertas (5) 5

PhD, Arjan Geerlings (3) PhD, Antonio D. Valero (3) AST, Mónica Olivares (3) PhD, Federico 6

Lara-Villoslada (6)* PhD. 7

(1) Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Ribera del Beiro s/n, 18014 Granada Spain 8

(2) Hospital Poniente de El Ejido, Carretera de Almerimar, 04700 El Ejido (Almería) 9

(3) Biosearch Life SA, 66, Camino de Purchil, 18004 Granada (Spain) 10

(4) Hospital Universitario San Cecilio, Avenida Dr. Olóriz 16, 18012 Granada (Spain) 11 12 (5) Estación Experimental Zaidín, Consejo Superior Investigaciones Científicas. C/Profesor 13 Albareda 1, 18008 Granada (Spain) 14 15 (6) Department of Food Safety and Nutrition, Puleva Food SL. 66, Camino de Purchil, Granada 16 18004 (Spain) 17 18 This work has been supported by Puleva Food S.L. own founds. 19 20 21 * Corresponding author: Federico Lara Villoslada 22

Telephone: 34958240356 23

FAX: 34958240160 24

E-mail address: flara@puleva.es 25

This work has been supported by Puleva Food own founds. 26

27

28

Key words: Lactobacillus fermentum, Probiotics, Infection, infants, follow-on formula. 29

Manuscript (All Manuscript Text Pages, including Title Page, References and Figure Legends)

Resultados

131

2

ABSTRACT 30

Objectives: To examine the effects of a follow-on formula containing Lactobacillus fermentum 31

CECT5716 (L.fermentum) on the incidence of infections in infants between the ages of 6 to 12 32

months. 33

Methods: A randomized double blinded controlled study including infants at the age of 6-months 34

was conducted. Infants were assigned randomly to either follow-on formula supplemented with 35

L.fermentum plus GOS (experimental group, EG), or the same formula supplemented with only 36

GOS (control group, CG). The main outcome was the incidence of infections for the 6-months 37

duration of the study. 38

Results: The EG showed a significant 46% reduction on the incidence rate (IR) of gastrointestinal 39

infections, (EG: 0.196±0.51, CG: 0.363±0.53, IR ratio = 0.54, 95% CI: 0.307-0.950, P=0.032), 40

27% reduction on the incidence of upper respiratory tract infections (EG: 0.969±0.96, CG: 41

1.330±1.23, IR ratio = 0.729, 95% CI: 0.46-1.38, P=0.026), and 30% reduction in the total number 42

of infections (EG: 1.464±1.15, CG: 2.077±1.59, IR rate ratio = 0.70, 95% CI: 0.46-1.38, P=0.003), 43

at the end of the study period compared with CG. 44

Conclusions: Administration of a follow-on formula with L.fermentum CECT5716 may be useful 45

for the prevention of community-acquired GI and upper respiratory infections. 46

47

Resultados

132

3

INTRODUCTION 48

Infectious diseases are the most common type of illness for infants worldwide. In Spain, data from 49

2007 shows that of all hospital admissions due to infectious diseases, the admission of infants 50

below 1-year of age represent more than 50% of the total, with an average of 2174 cases per 51

100.000 people (1). Breastfeeding has been shown to reduce the incidence of infectious diseases 52

probably mediated in part through modulation of the intestinal microflora (2). Indeed, breastfed 53

infants seem to develop a probiotic-rich gut microflora with reduced pathogenic bacteria compared 54

with formula-fed infants (3). Due to its many benefits, breastfeeding for the first six months of life 55

is the recommended way of feeding infants (4). However, when breastfeeding is not possible or 56

insufficient, infant formula represents an alternative aimed to partially imitate the effects of breast 57

milk. In the last decade, the manipulation of the intestinal microbiota of infants through the 58

administration of probiotic strains has been recognized as a potential application for the treatment 59

and prevention of infectious diseases. As an example, a number of randomized controlled trials 60

(RCTs) have shown evidence of clinical benefits of probiotics in the treatment of acute infectious 61

diarrhea in children; therefore its use is an accepted therapy in Europe (5 and references therein). 62

However, the scientific evidence supporting the use of probiotics for the prevention of infectious 63

diseases is only emerging. The efficacy of probiotics in the prevention of community-acquired 64

infections in children has been investigated in several RCTs but the results shown are mostly 65

contradictory (6,7). In addition to the variability seen between study populations, designs and 66

methodologies, overall the results suggest that effects observed by one probiotic strain cannot be 67

extrapolated to others. 68

Prebiotics such as galactooligosaccharides (GOSs) are indigestible nutrients found in human breast 69

milk, that stimulate the growth and metabolic activity of beneficial bacteria in the gut flora which 70

may also produce a direct immunologic effect (8,9). 71

Resultados

133

4

Recently, it has been described that human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant 72

gut, which may play an important role in infant protection against infectious agents (10, 11). We 73

identified and selected Lactobacillus fermentum CECT5716 (L.fermentum) from human breast 74

milk and characterized the safety and the probiotic properties of the strain using in vitro, animal 75

models and RCT in human adults (12-15). Since this probiotic strain is naturally present in human 76

breast milk, we hypothesized that its use in a follow-on formula could benefit the bottle-fed infant. 77

In this RCT we evaluate the effect produced by a follow-on formula containing L.fermentum and 78

GOS in comparison to a control follow-on formula with only GOS on the incidence of infections 79

in infants between the age of 6 to 12 months. 80

81

METHODS 82

Study design and protocol 83

A randomized double blinded controlled study with two study groups was carried out in 84

collaboration with the Pediatrics Department of three Spanish hospitals: University Hospital San 85

Cecilio (Granada, Spain), University Hospital Virgen de las Nieves (Granada, Spain) and 86

“Poniente” Hospital of El Ejido (Almería, Spain). Families that lived in the proximity of the 87

hospitals whose mothers had delivered their babies at the hospital and/or attended regular visits to 88

the pediatrician were considered for the study and contacted by the research nurse during 89

scheduled visits to the hospital. Before the inclusion, infants received a physical examination and 90

their clinical records were consulted for previous diseases and pharmacological treatments. 91

Healthy, 6 month old infants who were exclusively formula-fed were recruited into the study 92

between May 2008 to July 2009 after informed written consent was obtained from the parents or 93

tutors. The exclusion criteria included gastrointestinal disorders (history of chronic diarrhoea or 94

constipation, gastroesophageal reflux), gastrointestinal surgery, cow’s milk protein allergy, 95

Resultados

134

5

metabolic disorders (diabetes, lactose intolerance), immune deficiency, antibiotic prescription 1-96

week prior to inclusion and previous use of formula containing prebiotics or probiotics. 97

Sample size was estimated based upon the effects on GI infections. Based on previous data 98

regarding incidence of diarrhea (29), the study was designed to have sufficient power (85%) to 99

detect a 20% difference between the groups with a 0.05 significance level. The number of infant 100

necessary in each group was 83 infants. However, we recruited 30% more infants to allow for 101

dropouts. 102

Two hundred and fifteen infants were selected and distributed into two study groups according 103

with a randomization list generated by a computer program (SIGESMU®). The formulas 104

administered were standard powdered follow-on with a nutritional composition in accordance with 105

current EU regulations, supplemented with GOS (0.4 g/100 mL) in the case of control group (CG), 106

and with the same amounts of GOS plus L.fermentum CECT5716 (Lactobacilus fermentum 107

Hereditum®, Biosearch Life, Granada, Spain) at a concentration dose of 2x108 cfu per day in the 108

case of the experimental group (EG). The concentration of the probiotic in the formula was 109

analysed and confirmed every two months. Both formulas were consumed during the 6 month 110

intervention period. The follow-on formulas were provided by Puleva Food SL (Granada, Spain) in 111

identical containers labelled in plain white with a code number that referred to the study groups. 112

The paediatricians prescribed the amounts of formula per day to be administered to the infants. 113

Parents received general guidelines for complementary feeding according with current ESPGHAN 114

guidelines (16). Infants were scheduled to receive a clinical evaluation at baseline at the age of 6 115

month (T0), after 3 months at the age of 9 month (T3) and after 6 months at the age of 12 months 116

(T6). Faecal samples were also collected at T0, T3 and T6. The formulas of the study were home-117

delivered every two months and the emptied containers were also collected. Exclusion criteria 118

Resultados

135

6

during the study were lack of compliance with the study protocol, adverse effects derived from the 119

consumption of any of the formulas of the study and do not attend scheduled visits to the hospital. 120

This study was carried out according to the Helsinki declaration, and the protocol was approved by 121

the Regional Ethics Committee of the Sistema Andaluz de Salud based in Seville (Spain). The trial 122

is registered in the registry sponsored by the US Library of Medicine (www.clinicaltrial.gov) with 123

the number NCT01215656. 124

125

Study Outcomes and data collection 126

The primary outcome of the trial was the incidence of infections, including gastrointestinal, 127

respiratory, otitis, urinary and other less common infections. Secondary outcomes were evolution 128

of weight, length and head circumference, fever episodes, antibiotic prescriptions, and 129

concentrations of short chain fatty acids (SCFA), IgA and microbiota composition in feces. The 130

incidence of recurrent (defined as three or more events) respiratory infections was also considered 131

a secondary outcome. 132

The diagnosis of infectious diseases was made by the paediatrician in every visit based on specific 133

symptoms and standardized definitions. Gastrointestinal infection was defined as loose or watery 134

stools at least four times per day with or without fever or vomiting. Upper respiratory tract 135

infections were defined as the presence of abundant mucosity and/or cough during two or more 136

consecutive days with or without fever, including common cold, laryngitis, pharyngitis/tonsillitis, 137

laringotracheitis, acute rhinitis and acute rhinosinusitis. Lower respiratory tract infections were 138

defined as mucosity and/or cough during two or more consecutive days with or without fever and 139

presence of wheezing and/or crepitants, including acute bronchitis, bronchiolitis and pneumonia. 140

Under other infections we included chickenpox, conjunctivitis, oral candidiasis, Epstein Barr virus, 141

Herpes virus, and fever episodes of unknown origin. 142

Resultados

136

7

Three types of questionnaires were used in the study: 1) scheduled visit questionnaire, completed 143

by the paediatricians during the scheduled visits (T0, T3, T6), included study parameters and 144

events related to the health behaviour of the infant; 2) parents diary and 15-day questionnaires, 145

completed by the parents, where information regarding daily number of depositions, respiratory 146

symptoms, unscheduled visits to the doctor, diagnosed infections, sleeping and crying habits, 147

changes in sleeping pattern, fever episodes, gastrointestinal discomfort and prescription of 148

antibiotics were recorded. The diaries were used as a reference to fill the 15-day questionnaires in 149

which the relevant information from the dairies was summarised. The parents were given 150

instructions on completing the questionnaire and were encouraged to contact the research staff if 151

necessary; 3) occasional questionnaires, completed by the paediatricians during unscheduled visits 152

due to a suspected infection or a health problem. In the case of an emergency room visit a copy of 153

the patient´s report was sent to the pediatrics for inclusion in the research file. 154

155

Faecal bacteria quantitation 156

Faecal samples were homogenized individually in a peptone-saline solution (100 mg/mL). To 157

estimate the concentration of bacterial groups, appropriate dilutions were spread in quadruplicate 158

onto plates of MRS agar for lactic acid bacteria, MRS agar supplemented with 0.5mg/L 159

dicloxacilin, 1 g/L LiCl and 0.5 g/L L-cysteine hydrochloride for bifidobacteria, Reinforced 160

Clostridial Agar containing 20 g/mL of polimixina for clostridia and Bile Aesculin Agar for 161

bacteroides. All media were obtained from Oxoid (Basingstoke, UK) whereas antibiotics and other 162

supplements were obtained from Sigma Chemical Co. (St Louis, Mo). Culture plates were 163

incubated in anaerobiosis at 37 oC for 24 to 48 h. Similarly, 1mL of each suitable dilution was 164

spread onto specific Count Plates Petrifilm (3M St Paul, MN) for total aerobes. Petrifilms were 165

incubated in aerobiosis at 37oC for 24 h. After incubation, colonies grown on the selective culture 166

Resultados

137

8

media were counted and logarithm of the numbers of viable microorganisms per gram of feces 167

(cfu/g) were calculated and represented as the average ± SEM. 168

169

Short chain fatty acids quantitation 170

Faecal samples were homogenized with 150 mM NaHCO3 (pH 7.8) (1:5, wt/v) in an argon 171

atmosphere. Samples were incubated for 24 h at 37ºC and stored at -80ºC until the extraction. To 172

extract the SCFAs, 50 L of 100 mM 2-methylvaleric acid (internal standard), 10 L of sulfuric 173

acid and 0.3 mL of ethyl acetate were added to 1 mL of the homogenate. The mix was centrifuged 174

at 10,000 × g for 5 min at 4oC. The supernatants were dehydrated with sodium sulphate 175

(anhydrous) and centrifuged 10,000 × g for 5 min at 4oC. Later, the sample (0.5 mL) was splitless 176

inoculated into a gas chromatograph (mod. CP-3800, Varian, Lake Forest, CA) equipped with an 177

ID (CPWAX 52CB 60 m × 0.25 mm), and connected to a FID detector (Varian). Helium was used 178

as the carrier and the make-up gas, with a flow rate of 1.5 mL/min. The injection temperature was 179

250oC. Acetate, propionate and butyrate concentrations were automatically calculated from the 180

areas of the resulting peaks using the Star Chromatography WorkStation program (version 5.5), 181

which was connected on-line to the FID detector. 182

183

Faecal IgA quantitation 184

Faecal samples were homogenized individually in a peptone-saline solution (100 mg/mL) and 185

centrifuged at 10,000xg during 5 minutes at 4ºC. IgA concentration was measured in the 186

supernatants by ELISA quantitation kits, following manufacturer’s instructions (Bethyl, 187

Montgomery, TX). 188

189

190

Resultados

138

9

Statistical analysis 191

Data were analysed with statistical package STATA 11.1 (Stata Corp LP, College Station, Texas) 192

by a blinded statistician. Poisson multilevel regression analysis used the scheme of fixed 193

effects/random intercept considering two levels of data organization: the fixed effects factors were 194

the group (control and experimental) and the period (0-3months, 3-6 months) and the random 195

effect factor were the child nested in the group and the measures of the period nested in each child. 196

The incidence rate ratios were computed as measures of the effect when used number of events as 197

the dependent variable. All the data about infections occurred during the period 0-6 months were 198

pooled and analysed by classical Poisson regression and classical logistic regression were 199

computed for the corresponding dependent variables. Incidence rates were computed as the 200

number of diagnoses (numerator) divided by the person-time contributed. The Incidence Rate 201

Ratios (IRRs) with 95% confidence intervals and p values were the outputs of the analysis. 202

When the variables were numeric the multilevel linear regression model was used as in the case of 203

previous one. 204

205 206 207 RESULTS 208

Population 209

Of the 215 infants randomized in two study groups, 27 were excluded from the trial: 7 in the 210

control group and 20 in the experimental group for the following reasons: three infants moved out 211

of the study area (1 in CG and 2 in EG), seven infants did not receive the probiotic experimental 212

formula and the mistake was detected after they did not attend first medical visit, 7 infants were 213

excluded after study termination due to incomplete data collection (2 in group CG and 5 in group 214

EG) and 10 infants did not attend baseline medical visits (4 in group CG and 6 in group EG). Thus, 215

Resultados

139

10

the total number of volunteers analyzed (per protocol) was 188, of whom 91 were in the group CG 216

and 97 in the experimental group EG. A flow chart of participants in the study is shown in Figure 217

1. No statistically significant differences were observed between the groups in any of the baseline 218

parameters analyzed (Table 1). 219

Formula intake and tolerance and growth. 220

Both study formulas were well tolerated and compliance was good. No adverse effects related with 221

the consumption of the formulas were reported and none of the volunteers abandoned the trial 222

during the intervention period. No significant differences were found between the study groups 223

regarding daily intake of formula (CG: 741 ± 146 mL/day vs. EG: 732 ± 150 mL/day, Table 1). 224

Baseline values showed significant differences between groups for length (P=0.047) and head 225

circumference (P=0.029) as a result of the randomization. However, no differences were found for 226

weight, length, head circumference and growth rate between the study groups at times T3 and T6, 227

indicating that the consumption of the study formula was safe (Table 2). 228

229

Infants’ health. 230

During the 6 months intervention, 72.5% of the infants suffered from respiratory infections, 15.7% 231

from GI infections, 5.7% otitis, 1.8% urinary infections and 4.2% from other infections as defined 232

in the methods section (Table 3). 233

The experimental group showed a significant 46% reduction on the incidence rate (IR) of GI 234

infections (IR: 0.196±0.51) compared to control (IR: 0.363±0.53) at the end of the study period (IR 235

ratio = 0.54, 95% CI: 0.307-0.950, P=0.032). Regarding total respiratory infections, the 236

experimental group showed a significant 26% reduction (P=0.022) on the incidence rate (IR: 237

1.093±1.09) compared with the control (IR: 1.473±1.31) at the end of the period (IR ratio = 0.74, 238

95% CI: 0.580-0.957, P=0.022). 90% of the total respiratory infections were infections of the 239

Resultados

140

11

upper respiratory tract. We observed a 27% reduction on the incidence of upper respiratory 240

infections in the experimental group compared to controls (IR ratio = 0.729, 95% CI: 0.46-1.38, 241

P=0.026), with no significant difference regarding the rate of lower respiratory infections. The 242

experimental group also reduced the incidence of recurrent respiratory infections by 72%. 243

244

No significant differences were found for the incidence rates of otitis, urinary tract and other 245

infections possibly due to the low number of events obtained in both study groups. When the total 246

number of infections were analyzed, the experimental group showed a significant 30% reduction 247

on the incidence rate (IR: 1.464±1.15) compared with the control (IR: 2.077±1.59) at T6 (IR rate 248

ratio = 0.70, 95% CI: 0.46-1.38, P=0.003). 249

Regarding antibiotic treatment and the number of fever episodes, no significant differences 250

between study groups were observed. Events of diarrhea associated with antibiotic treatments were 251

detected in 17.5% of control infants vs. 9.6% of infants in the experimental group (not significant, 252

P=0.234). 253

Faecal parameters. 254

Faecal samples from only 145 infants (80%) at T0, T3 and T6 reached the laboratory in good 255

conditions and were analyzed. Regarding the intestinal microbiota (Table 4), bacterial counts of 256

both lactobacilli and bifidobacteria were significantly higher (P=0.008 and P=0.022, respectively) 257

in the experimental group compared to controls at the end of the study. However, within-group 258

comparisons T0 vs. T6 only showed increasing trends in the experimental group for both 259

lactobacilli and bifidobacteria and decreasing trends in the control group. No significant 260

differences were observed for the other bacterial groups analyzed, and, also, no significant 261

differences were observed between both groups in faecal SCFAs such as butyric, propionic and 262

Resultados

141

12

acetic acids. Finally, the concentration of IgA in faecal samples did not change throughout the 263

study in either group. 264

265

Resultados

142

13

DISCUSSION 266

We have shown that infants receiving a follow on formula enriched with L.fermentum had a 267

reduction of gastrointestinal and respiratory infections. The study of the effects of L.fermentum 268

administered to infants has been carried out for the first time. L.fermentum was used due to its 269

natural presence in human breast milk (10). This strain is also able to colonise the mammary gland 270

when administered to lactating mothers in a capsule, compared with controls (15). The presence of 271

L.fermentum in breast milk involves a selection of the strain among many other bacterial species in 272

the gut and further transportation to the mammary gland, a process likely to be carried out by 273

dendritic cells (17). Apart from the origin of L.fermentum and its ability to colonise the human gut 274

(14), this strain was selected due to its safety (18,19), anti-infectious (20) and immunomodulatory 275

(21) properties. In addition, two RCTs in adults have shown the ability of L.fermentum to reduce 276

the incidence of episodes associated with influenza when administered prior and after vaccination 277

(14), and to be an efficient alternative to the use of antibiotics for the treatment of infectious 278

mastitis during lactation (15). To investigate the health benefits of L.fermentum in healthy children 279

we designed this trial. A standard follow-on formula containing moderate amounts of GOS for 280

both groups were used, aiming to theoretically enhance the effects of the probiotic strain, knowing 281

that GOS has been described to stimulate the growth and activity of beneficial gut flora (22, 23). 282

Results indicate that the infants receiving the experimental formula containing L.fermentum had a 283

reduced incidence of gastrointestinal infections, respiratory infections including upper respiratory 284

infections and fewer infectious diseases overall at the completion of the study, compared with the 285

infants fed the control formula. 286

The intervention lasted 13 months thus including those seasons during which the rates of 287

respiratory and GI infections are high. The definition used to qualify for a GI infection (loose or 288

watery stools ≥ 4 times/day) was stricter but in line with the WHO definition of diarrhea (24) or 289

Resultados

143

14

the ESPGHAN definition of acute gastroenteritis (25) and has been extensively used in clinical 290

trials investigating prevention of diarrhea (26). Using this definition, the GI infection rates 291

obtained in both study groups are in agreement with the incidence rates reported for infants of this 292

age group in the south of Spain which vary between 0.4-0.6, with an average of 0.47 episodes/year 293

(27). The rates obtained in the trial for respiratory infections were also in agreement with reported 294

values for infants of this age (1). 295

The rate of reductions in GI infection observed in the experimental group is comparable to other 296

trials that reported a successful prevention of community-acquired GI infections or diarrhea 297

episodes using a probiotic infant formula. For example, the administration of a formula containing 298

either 107 cfu/g of Bifidobacterium lactis or 107cfu/g of Lactobacillus reuteri to children of 4-10 299

months of age over a 3-month period reduced the numbers of diarrhea episodes compared to the 300

control by 58% and 92%, respectively (7). In another study using a formula containing 2x107 cfu/g 301

of Bifidobacterium lactis and 14 mg/g of a prebiotic blend, the rate of diarrhea was reduced by 302

20% compared with a control (28). A recent large trial showed that the administration of 107 cfu/g 303

of Bifidobacterium longum, 106 cfu/g Streptococcus thermophilus and 28 mg/g FOS over a period 304

of 3 months reduced the incidence of GI infections by 50% (29). Two other studies carried out 305

with probiotic strains in India and in Perú with undernourished children also reported reductions of 306

diarrhea episodes of 60% and 13%, respectively (30, 31). 307

This trial showed a modest 26% reduction in the total number of respiratory infections. This 308

finding applies only to upper respiratory tract infections, perhaps due to the low number of 309

infections affecting the lower respiratory tract (12 in experimental group and 13 in control group). 310

Three studies have also shown reductions of respiratory infections with the administration of 311

probiotic strains to infants. A RCT with 571 children between 1 to 6 years of age, administration of 312

Lactobacillus GG over a period of 7-months resulted in a 17% reduction in the number of children 313

Resultados

144

15

suffering from respiratory tract infections with complications (32). Another RCT with 281 children 314

(age range 1-7 years), administration of Lactobacillus GG for 3-months resulted in a 33% risk 315

reduction in upper respiratory tract infections compared with the control (33). Results of a recent 316

RCT with 69 newborn infants indicate that the administration of Bifidobacterium animalis BB-12 317

reduced the numbers of respiratory infections by approximately 30% compared with the control 318

(6). Additional studies reported either trends (34) or no effects at all (7, 28, 29-31). 319

Feces samples were analyzed to investigate the possible mechanism responsible for the reduction 320

in GI infections. Although the production of SCFA and IgA did not change during the study, the 321

intake of the experimental formula resulted in a 78% increase of lactobacillus and 70% in 322

bifidobacteria at the end of the study. These changes in the gut´s flora could at least in part explain 323

the reductions in the number of GI episodes observed in this group. 324

Interestingly, the population of Bifidobacteria significantly increased in the experimental group in 325

spite of the supplementation with Lactobacilli only. This phenomenon has been observed for other 326

probiotic strains (35, 36). It has been suggested that an increase in Bifidobacteria may be the result 327

of the metabolic activity, nutrient competition and gut cell adhesion rates of Lactobacilli, which 328

may favour the growth of Bifidobacteria. Using in vitro and in vivo studies we have previously 329

shown that L.fermentum presents a high cellular adhesion rate, produces a number of antimicrobial 330

substrates, releases significant amounts of the antioxidant glutathione, and is able to synthesise 331

bifidogenic carbohydrates under certain conditions (11, 20). In addition, in vitro studies have 332

shown that L.fermentum inhibit the adhesion of certain pathogens bacteria to intestinal mucus and 333

increase the expression of mucines, which could also be involved in the antiinfective effect shown 334

by this probiotic strain (20). Although previous studies have demonstrated that L.fermentum is able 335

to colonise the gut (14), L.fermentum was not quantified during this trial, thus limiting the 336

Resultados

145

16

interpretation of the results. Another limitation was that the feces of the infants diagnosed for GI 337

infections were not analyzed for single pathogens. 338

Regarding the mechanism for the effects on respiratory infections, a previous RCT in adults 339

carried out with L.fermentum in combination with a flu vaccine showed a significant reduction of 340

influenza-like illness (including respiratory symptoms) in the experimental group. The reduction 341

was explained by the significant increases in the proportions of Natural Killer cells, T-helper and 342

T-cytotoxic lymphocytes measured in the experimental group compared with the control (14). As 343

no blood samples were obtained from the infants of the study, we can only speculate a stimulation 344

of the immune response as a possible mechanism responsible for the reductions of the respiratory 345

infections. Furthermore, another limitation of this study was the absence of a group exclusively 346

breast fed for comparison. 347

The efficacy of probiotics in the prevention of community-acquired infections in children has been 348

investigated in several RCT but the results shown are mostly contradictory. Apart from the 349

heterogeneity of the designs, and the difference in probiotic strains administered, it is worth 350

mentioning that those trials reporting reductions of respiratory infections (or symptoms) have 351

failed to show effects on prevention of diarrhea and vice versa. In addition, the use of biomarkers 352

along side with clinical endpoints to explain underlying mechanisms is lacking in the majority of 353

studies. 354

It has been reported that human milk contains oligosaccharides having anti-inflammatory and anti-355

infectious properties (37). Since both formulas contained GOS (0.5g/100Kcal), the effects 356

observed in this study cannot be attributed to its GOS content. However, L.fermentum and GOS 357

together may have a synergic effect that could be superior to the health benefits of the individual 358

components. It was, however, outside the scope of this study to investigate the potential synergistic 359

effects of the combination of L fermentum and GOS which should be investigated in future studies. 360

Resultados

146

17

361

In conclusion, considering the significant decrease in the number of infections, the administration 362

of a follow-on formula containing enriched with L.fermentum may be useful for the prevention of 363

community-acquired GI and upper respiratory infections in infants. Additional controlled clinical 364

studies investigating the effects of L.fermentum in different settings, using biomarkers and infants 365

of different age groups are needed before recommendations can be made. 366

Human breast milk contains a wide variety of bacterial strains which are transferred to the infant 367

gut through breastfeeding (10,15). The probiotic potential and clinical effects of breast milk 368

strains, perhaps in combination, are an interesting area of research with a perspective for the 369

future. 370

Acknowlegdements 371

Authors are very grateful to Juan de Dios Luna (PhD) from the Biostatistics Department of the 372

Universidad de Granada for his helpful contribution to the statistical analysis of data and to 373

randomization of the infants to the different interventions groups. 374

Authors are also grateful to Puleva Food as supplier of the follow on formula used in the trial and 375

to Biosearch Life S.A. (former Puleva Biotech S.A.) as supplier of the probiotics. 376

377

Resultados

147

18

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463

464

Resultados

151

22

465 Table 1: Baseline characteristics of the subjects participating in the study. 466

Control group

(n=91)

Experimental group

(n=97)

Male/female, n (%) 40/51 (44/56) 54/43 (56/44)

Age at enrolment (months), mean±SD 6.5±1.3 6.5±1.2

Delivery by cesarean (%) 45 45

Gestational age (weeks) mean±SD 38.9±1.4 38.8±1.4

Breastfed before the study period (%) 71% 69

Total duration breastfeeding (months-range) 2.8 (0.5-6.5) 3.0 (0.5-6.5)

Daily volume of follow-on formula

prescribed (mL) mean±SD 741±146 732±150

Complementary feeding (%) 100 100

Rotavirus vaccination (%) 75 74

Day care or child minder (%) 25 27

Pets at home (%) 13 16

Smoking during pregnancy or lactation (%) 21 21

Smoking in the household (%) 37 38

467

468

469

470

471

472

Resultados

152

23

Table 2: Anthropometric measurements at baseline, T3 and T6 months and gain T0-T6 of infants 473

receiving either control or probiotic formula. Values are means ± SEM. *, p<0.05 versus control 474

475

Control group Experimental group

Growth parameters T0 T3

months T6

months Gain T0 T3 months

T6 months Gain

Weight (kg) 7.8±1.0 9.2±1.58 9.9±1.5 2.3±0.7 7.4±1.0 8.8±1.1 9.7±1.5 2.4±0.7

Length (cm) 66.6±3.2 71.5±2.8 75.2±3.0 8.8±2.4 65.6±3.3* 70.2±4.0 74.3±3.8 8.7±2.3

Head circumference (cm) 43.7±1.4 45.7±1.4 47.1±1.4 3.4±0.9 43.2±1.4* 45.4±1.4 46.6±1.6 3.5±1.0

476

477

478

479

480

481

482

483

484

485

486

487

488

Resultados

153

24

Table 3: Incidence of infectious disease, febrile episodes and antiobiotic treatment during the 489

intervention period. 490

Control group(n=91) Experimental group(n=97)

Nº

events Incidence Rate

(SD) Nº

events Incidence Rate (SD)

Incidence Rate Ratio (95% CI) Incidence rate

decrease (%) p

value

Gastrointesinal infections 33 0.363 (0.53) 19 0.196 (0.51)* 0.54 (0.31-0.95) 46 0.032

Respiratory infection 134 1.470 (1.31) 106 1.093 (1.00)* 0.74 (0.58-0.96) 26 0.022

Upper Respiratory 121 1.330 (1.23) 94 0.969 (0.96)* 0.73 (0.56-0.95) 27 0.021

Lower Respiratory 13 0.143 (0.35) 12 0.124 (0.33) 0.87 (0,40-1.90) 13 0.719

Otitis 12 0.132 (0,34) 7 0.072 (0.26) 0.55 (0.22-1.32) 45 0.177

Urinary tract infections 5 0.055 (0.22) 1 0.010 (0.10) 0.19 (0.02-1.56) 81 0.083

Other infectionsa 5 0.055 (0.22) 9 0.093 (0.29) 1.69 (0.50-1.85) -69 0.326

Total infections 189 2.08 (1.59) 142 1.46 (1.16)* 0.70 (0.57-0.88) 30 0.002

Febrile episodes 78 0.857 (0.90) 67 0.690 (0.88) 0.81 (0.68-0.94) 19 0.203

Antibiotic treatments 57 0.626 (0.90) 52 0.536 (0.70) 0.86 (0.59-1.24) 14 0.445 491

a Other infections include chickenpox, Epstein barr, Herpes virus, oral candidiasis, conjunctivitis and 492

febrile episodes of unknown origin 493

494

495

496

Resultados

154

25

Table 4. Intestinal microbiota counts in faecal samples of infants (as logarithm of cfu/g), faecal 497

concentration of short chain fatty acids (SCFA, as mg/g feces) and IgA (as µg/g feces). Values are 498

means ± SEM. *, P<0.05 vs Control. 499

Control group (n=70) Experimental group (n=75)

Bacterial group T0 T3 month T6 month T0 T3 month T6 month

Lactobacillus spp. 7.85±0.1 7.72±0.1 7.68±0.1 7.81±0.1 7.86±0.1 8.06±0.1* Bifidobacterium spp. 8.07±0.1 7.84±0.1 7.81±0.1 7.93±0.1 8.06±0.1 8.16±0.1* Clostridium spp. 7.77±0.1 7.57±0.1 7.54±0.1 7.74±0.1 7.64±0.1 7.61±0.1 Bacteroides spp. 7.64±0.1 7.65±0.1 7.61±0.1 7.86±0.1 7.86±0.1 7.65±0.1

SCFA (mg/g feces) Acetate 10.7±0.8 10.0±1,3 10.1±0.8 9.9±1.03 9.6±0.5 11.3±1.1 Propionate 1.85±0.1 2.17±0.2 2.17±0.2 2.20±0.4 2.30±0.4 2.35±0.3 Butyrate 2.15±0.2 2.76±0.4 2.94±0.2 2.53±0.5 3.05±0.3 2.92±0.3

IgA (g/g feces) 328±244 ND 322±212 329±170 ND 316±242 500

501

502

503

504

505

506

507

508

509

510

511

512

513

Resultados

155

26

514

Figure 1 legend. Flow chart of participants. 515

516

Discusión

Discusión

159

La microbiota gastrointestinal es un ecosistema complejo y dinámico que desem-

peña un papel muy importante en el desarrollo del ser humano. Está compuesta por una

amplia variedad de microorganismos los cuales en conjunto realizan funciones muy im-

portantes de tipo intestinal, nutricional e inmunitario. Estas funciones son desempeñadas

durante toda la vida del ser humano.

Desde comienzos del siglo XIX se conoce que la microbiota juega un papel impor-

tante en la salud del ser humano, pero ha sido en la última década cuando se ha estudiado

de manera más intensa este papel. De hecho, el 85% de los artículos sobre “microbiota”

que existen en la base de datos MedLine han sido publicados entre 2000 y 2011, y este por-

centaje es del 90% cuando nos referimos a artículos sobre “probióticos”. Esto nos dice que

el estudio de la influencia de la microbiota sobre la salud humana es relativamente reciente

y que en los últimos diez años se ha producido un interés creciente en la manipulación de

dicha microbiota, por ejemplo con probióticos, con el objetivo de obtener algún beneficio

para la salud.

De especial interés resulta el estudio de la evolución de la microbiota intestinal du-

rante los primeros años de vida, ya que es conocido que una vez que dicha microbiota se

establece en esta primera etapa, la composición en la edad adulta es mucho más constante

(Hooper y col. 2001). Por tanto, parece razonable pensar que el establecimiento de una

microbiota intestinal más favorable durante la infancia va a tener un papel importante en

la salud no sólo del niño sino también del adulto. Así se demuestra en estudios recientes

en los que se ha encontrado una relación entre la microbiota del niño, e incluso de la mujer

embarazada, y la incidencia posterior de desórdenes metabólicos como la obesidad infantil

(Ajslev y col. 2011; Collado y col. 2010).

1 Administración de Lactobacillus salivarius CECT5713 en adultos sanos. Efectos en el

sistema inmune y en el sistema gastrointestinal.

Lactobacillus salivarius CECT5713 es una cepa aislada en su origen de leche materna.

Se trata de una cepa que ha demostrado un fuerte potencial probiótico en anteriores en-

sayos in vitro y en animales de experimentación. Por sus características pone de manifiesto

su idoneidad para ser utilizada como probiótico en alimentación humana especialmente

en nutrición infantil dado su origen de leche materna. Para justificar su uso en humanos

se hace necesaria la realización de estudios de intervención en humanos que validen las

Discusión

160

propiedades beneficiosas que se observaron en los modelos animales.

Como paso previo a su uso en nutrición infantil nos pareció importante hacer un

estudio en adultos sanos con dos objetivos: primero, comprobar la seguridad de la cepa y

segundo, valorar sus efectos sobre la función intestinal y la respuesta inmune.

Algunos casos publicados de patologías asociadas al consumo de cepas probióticas,

como ciertos casos aislados de bacteremia (Bayer y col. 1978) endocarditis y abscesos (Agu-

irre y Collins 1993) relacionados al consumo de otras cepas consideradas seguras (como

Lactobacillus rhamnosus), han despertado una cierta inquietud en torno a la seguridad de

los probióticos. La mayoría de estos casos se han producido asociados con otras patologías

y en ninguno de ellos la bacteria administrada se ha considerado agente causal (Boyle y col.

2006), pero a pesar de ello se considera necesario evaluar la seguridad de cada cepa que

vaya a ser destinada al consumo humano.

Como se ha comentado anteriormente, L.salivarius se encuentra en la lista de mi-

croorganismos con la cualificación QPS publicada por la EFSA. Además, la cepa CECT5713,

objeto de este trabajo, ha sido exhaustivamente analizada para descartar la presencia de

actividades potencialmente patógenas y se ha demostrado su seguridad en modelos ani-

males de administración crónica. El presente trabajo tiene por objetivo demostrar la segu-

ridad de L.salivarius CECT5713 en adultos sanos. Aunque en individuos sanos no es esper-

able la manifestación de efectos adversos, consideramos este tipo de estudios como un

paso necesario antes de estudiar los efectos en niños o en otros sectores de la población

con algún tipo de patología (Sierra y col. 2010).

El estudio demuestra que el consumo diario de Lactobacillus salivarius CECT 5713

durante 4 semanas es perfectamente tolerado no observándose efecto adverso alguno rel-

acionado con el consumo de esta cepa.

En cuanto a la funcionalidad de la cepa, el estudio se centró en los dos efectos más

demostrados de los probióticos, su efecto sobre la función intestinal y sobre el sistema

inmune. Es importante resaltar que durante todo el estudio, incluidas las 2 semanas pre-

vias a la intervención, los individuos siguieron una dieta en la que se restringió el consumo

de productos fermentados. En estudios previos (Olivares y col. 2006b) se demostró que

los alimentos fermentados de la dieta habitual (lácteos fermentados, quesos, encurtidos,

Discusión

161

carnes fermentadas, etc…) suponen un aporte importante de bacterias que afecta tanto a

parámetros intestinales como del sistema inmune. Por ello, y al tratarse de un estudio que

involucra pocos voluntarios (20 por grupo), nos pareció importante homogeneizar la dieta

de todos los voluntarios para evitar interferencias provocadas por las bacterias con poten-

cial probiótico de la dieta que pudieran enmascarar el efecto de la cepa de Lactobacillus

administrada durante el estudio.

La administración de L. salivarius CECT5713 produjo cambios significativos en la mi-

crobiota fecal de los voluntarios, observándose un aumento significativo en la población de

lactobacilos en las heces. Aunque no se cuantificó la presencia de la cepa probiótica en las

heces sí que se demostró que la cepa administrada se encontraba en forma activa en el 90%

de los voluntarios que recibieron el probiótico. Parece por tanto probable que el aumento

de lactobacilos en las heces sea consecuencia de la representación de dicha cepa en las

heces o al menos que la cepa administrada esté contribuyendo a éste. Es importante rese-

ñar que la detección de la cepa se hizo sobre aquellas bacterias que se recuperan activas en

las heces, demostrándose que L. salivarius CECT5713 sobrevive al paso a través del tracto

gastrointestinal alcanzado viva su lugar de acción. Esto ya había sido demostrado anteri-

ormente mediante estudios in vitro en los que se sometió la cepa a unas condiciones que

asemejaban las del tracto gastrointestinal, obteniéndose un 55% de supervivencia (Martín

y col. 2006).

Por otro lado el aumento en lactobacilos se vio acompañado de un aumento en

el género bifidobacteria. En este caso se observó que el grupo control, debido probable-

mente a la dieta restringida en productos fermentados, sufrió un descenso significativo en

el recuento de este género en las heces. Sin embargo, en el grupo probiótico no sólo no

se observó dicho descenso, sino que además se produjo un incremento significativo re-

specto al inicio de la intervención. Este efecto de los lactobacilos sobre las bifidobacterias

ha sido también observado con otras cepas como Lactobacillus rhanmnosus LGG o, como

se discutirá más adelante, en el estudio llevado a cabo en niños de 6 meses con la cepa L.

fermentum CECT5716.

Los mecanismos por los cuales una cepa puede modular la microbiota intestinal son

varios, entre ellos se encuentra los fenómeno de competición por el espacio a colonizar,

la competición por los recursos, la producción de sustancias antimicrobianas que pueden

afectar a unos grupos bacterianos favoreciendo la proliferación de otros e incluso la pro-

Discusión

162

ducción de metabolitos que pueden ser utilizados de forma más eficiente por determinadas

especies bacterianas. En el caso de Lactobacillus salivarius CECT5713 estudios in vitro de-

muestran la capacidad antimicrobiana que posee, inhibiendo el crecimiento de patógenos,

además de ser capaz de producir peróxido de hidrógeno y ácido láctico, sustancias que

ayudan a mantener bajo el pH produciendo un efecto inhibidor del crecimiento de pató-

genos (Martín y col.2006; Olivares y col. 2006a). Además, en modelos in vitro ha mostrado

ser capaz de competir con diferentes grupos bacterianos enteropatógenos por la unión a

la mucosa (Olivares y col. 2006a). Microbiotas deficientes o comprometidas se han rela-

cionado con numerosas alteraciones de la salud como Enfermedad Inflamatoria Intestinal,

alergias, diarreas infecciosas o inducidas por antibióticos e incluso alteraciones metabólicas

como puede ser la obesidad (Bjorksten y col. 2001; Kalliomaki y col.2001; Ley y col. 2006;

Manichanh y col. 2006; Santacruz y col. 2009; Sartor 2011; Sjögren y col.2009; Songjinda y

col. 2007;; Turnbaugh y col. 2006). Es por esto que en los últimos años se está trabajando

mucho en cómo se puede modular la microbiota como alternativa para prevenir o paliar

este tipo de alteraciones.

En modelos animales de infección se ha comprobado que efectivamente L. salivar-

ius CECT5713 posee un efecto antibacteriano que se traduce en una mayor protección de

los animales frente a la infección por Salmonella (Olivares y col. 2006a). Por otra parte se

ha demostrado también su eficacia como preventivo en modelos animales de Enfermedad

Inflamatoria Intestinal en los que, junto con la atenuación de la inflamación, se contrar-

restaron en parte las deficiencias en la microbiota características del modelo (Perán y col.

2005).

Se hacen necesarios nuevos estudios en individuos enfermos o susceptibles de su-

frir este tipo de enfermedades para demostrar que la cepa es efectiva para prevenir y/o

tratar ese tipo de enfermedades relacionadas con desequilibrios de la microbiota.

En cuanto a los efectos sobre la función intestinal, el consumo de L. salivarius

CECT5713 indujo un incremento significativo en la frecuencia de defecación respecto al ini-

cio de la intervención y respecto al grupo control que no se relacionó con una disminución

en la consistencia de las heces.

Los cambios en la motilidad podrían estar directamente relacionados con la presen-

cia de la bacteria probiótica en el intestino y/o con los cambios inducidos en la microbiota.

Discusión

163

La concentración de ácidos grasos de cadena corta (AGCC), producto de la fermentación de

carbohidratos por bacterias ácido lácticas y otras bacterias intestinales, fue significativa-

mente más alta en el grupo que consumió la cepa probiótica. Estos ácidos grasos de cadena

corta, además de ser la principal fuente de energía de los enterocitos, contribuyen a diver-

sas funciones intestinales incluyendo la motilidad intestinal, que se podría ver afectada por

cambios en la concentración de estos metabolitos (Mortensen y col. 1996). Un aumento en

la velocidad de tránsito intestinal reduciría el tiempo de contacto de sustancias de tipo car-

cinogénico con la mucosa intestinal ejerciendo un efecto preventivo a este nivel (Koebnick

y col. 2003; Cummings y col. 1992). Además, el butirato impide la proliferación excesiva que

pueda llevar a patologías cancerígenas a través de la inducción de apoptosis en las células

del epitelio intestinal (DÁrgenio y col 2003).

Sin embargo, aunque la concentración de AGCC fue mayor al final de la intervención

en el grupo probiótico respecto al grupo control, no hubo diferencias significativas en el

grupo probiótico entre el inicio de la intervención y el final por lo que debe haber otros

factores que durante la intervención han contribuido al cambio en la motilidad intestinal.

Puesto que la medida de los AGCC es indirecta, al medirse la producción por la microbiota

fecal, ésta podría no representar la realidad en el intestino donde además se producen

otros ácidos como lactato y succinato que afectarían al pH y por tanto a la motilidad in-

testinal. Este hecho se ha observado en otros trabajos donde se han demostrado cambios

significativos en la motilidad intestinal pero no han podido relacionarse con cambios en las

concentraciones de AGCC en heces (Stewart y col. 2010). El efecto de los probióticos sobre

la motilidad intestinal es a día de hoy una de las declaraciones de salud más extendida en

el mercado. Una revisión sistemática recientemente publicada (Chmielewska y col. 2010)

recopiló aquellos estudios controlados y aleatorizados destinados a evaluar el efecto de

tratamientos probióticos sobre el estreñimiento. Efectivamente numerosas cepas probióti-

cas como Bifidobacterium lactis DN-173010, Lactobacillus casei Shirota, Escherichia coli

Nissle 1917 y L. rhamnosus LGG mostraron efectos beneficiosos sobre el estreñimiento. Sin

embargo la revisión concluye que se necesitan más estudios a mayor escala para corroborar

resultados.

A nivel de la respuesta inmunológica el estudio con adultos sanos mostró cómo el

consumo de Lactobacillus salivarius CECT5713 aumenta la respuesta inmune innata, como

evidencia el aumento en la proporción de la población celular correspondiente a Natural

Discusión

164

Killer (NK) y monocitos que se observa en los voluntarios que consumieron el probiótico y

no en los del grupo control. Las células NK son una tercera población de linfocitos, diferen-

tes a los linfocitos B y linfocitos T y pertenecen al sistema inmune innato. Este mecanismo

defensivo, que es previo a la participación de la respuesta inmune específica, tiene la ca-

pacidad no sólo de iniciar la respuesta defensiva contra los microorganismos patógenos,

sino también la de guiar a la respuesta específica posterior. Son muchos los elementos

participantes; células como macrófagos, neutrófilos y células NK, y los mediadores libera-

dos por éstas células. Estos mediadores, especialmente las denominadas citokinas innatas,

producidas por el sistema inmune innato, son las principales encargadas de estimular la

respuesta inicial y la posterior respuesta específica. La importancia de esta respuesta in-

nata e inmediata radica en que, aún cuando este sistema puede ser incapaz de eliminar

a los patógenos, logra por un lado atenuar su proliferación y por otro generar las señales

de peligro adecuadas que permitan la participación de la respuesta inmune específica, y

ambos en conjunto, erradicar al patógeno. Los mismos monocito-macrófagos productores

de las citokinas pro-inflamatorias, producen también las citokinas antiinflamatorias como

IL-10, TGF-ß e IL-6. Estas citokinas en general atenúan la respuesta del macrófago activado,

oponiéndose a la acción de las citokinas pro-inflamatorias. El éxito por lo tanto de la respu-

esta inmune, dependerá del resultado del balance entre la producción de citokinas pro-

inflamatorias y antiinflamatorias. En el estudio con L. salivarius CECT5713 efectivamente el

aumento en la respuesta innata se vio acompañadao por un incremento en la producción

de citokinas proinflamatorias como TNF-α. Esta capacidad de L.salivarius CECT5713 para

inducir la producción de TNF-α por macrófagos ya había sido previamente demostrada en

estudios in vitro, en los que la incubación de la cepa con macrófagos indujo la produc-

ción de esta citoquina. Sin embargo, cuando los macrófagos se estimulaban previamente

con LPS la bacteria producía el efecto contrario, inhibiendo parcialmente la producción de

TNF-α (Díaz-Ropero y col. 2007). Estos resultados sugieren que L.salivarius CECT5713 tiene

propiedades inmuno-moduladoras y que sus efectos sobre la respuesta inmune dependen

del estímulo al que estén sometidas las células del sistema inmune, lo que explicaría que la

misma cepa pueda estimular la respuesta inmunitaria innata en individuos sanos e inhibir

la respuesta inflamatoria en modelos animales de IBD (Perán y col. 2005).

Este efecto inmuno-modulador podría explicarse por la producción de citokinas

reguladoras del tipo IL-10 y TGB-β, que son claves en la regulación de la respuesta a través

Discusión

165

de las poblaciones linfocitarias de tipo Th3 y Treguladoras. Concretamente, en los volun-

tarios que consumieron L.salivarius CECT5713 se observó un aumento significativo en la

concentración plasmática de IL-10 y una tendencia, aunque en este caso no significativa, de

aumento de la concentración plasmática de TGB-β. Estos resultados tienen especial interés

pues las respuestas reguladoras son claves en los fenómenos de tolerancia, regulan los pro-

cesos inflamatorios evitando la cronificación de la inflamación y están involucrados también

en la respuesta alérgica. En estudios in vitro previos también se observó que L.salivarius

CECT5713 induce la producción de IL-10 tanto en macrófagos como en linfocitos.

Por otra parte, el incremento en la respuesta innata está probablemente relacio-

nado con el aumento en la respuesta específica que se evidenció a través de un aumento

en IgG y también en IgA. Esto sugiere que el consumo de L.salivarius CECT5713 induce una

mejora en la capacidad de respuesta de los voluntarios que podría traducirse en una respu-

esta más eficaz frente a posibles infecciones.

En este sentido, existe cierta controversia sobre qué se considera inmunoestimu-

lación y qué repercusiones reales puede tener a la hora de prevenir o atenuar procesos in-

fecciosos. Recientemente EFSA ha publicado unas guías sobre qué parámetros deben estu-

diarse a la hora de llevar a cabo un estudio para demostrar que un probiótico o compuesto

tiene capacidad de mejorar la respuesta inmune (EFSA 2010). En esta guía se proponen es-

tudios en protocolos de vacunación que demuestren la mejor respuesta inmunitaria frente

al antígeno/s utilizados como vacuna o estudios que relacionen un aumento de la respuesta

inmune con una disminución significativa en la carga de bacterias potencialmente patóge-

nas, todo ello relacionado con una reducción en la incidencia de infecciones.

El efecto coadyuvante de bacterias probióticas ha sido demostrado para ciertas

cepas probióticas (Soh y col. 2010; Isolauri y col. 1995; de Vrese y col. 2005b). En este

sentido la cepa L. fermentum CECT5716, objeto también de esta tesis, demostró en un es-

tudio realizado en un protocolo de vacunación frente a la gripe, que dicha cepa era capaz

de potenciar el efecto de la vacuna (Olivares y col. 2007). En este estudio, L. fermentum

CECT5716 potenció la respuesta innata a través de actividades como el incremento en la

población NK que se tradujeron en un incremento de la respuesta específica evidenciada

por un aumento significativo en la respuesta de anticuerpos específicos frente a los antíge-

nos de la vacuna. Además, el aumento de la respuesta se acompañó de una reducción en la

Discusión

166

incidencia de enfermedades con sintomatología similar a la gripe.

En definitiva, la cepa L.salivarius CECT5713 ha demostrado efectos sobre la micro-

biota, la función intestinal y la respuesta inmunitaria de adultos sanos. De la misma forma,

en estudios previos se había demostrado que también L.fermentum CECT5716 presenta

propiedades inmuno-reguladoras.

La relación entre la microbiota y el sistema inmune es especialmente interesante en

lactantes, cuyo sistema inmune está en proceso de maduración. A esto hay que unir que las

propiedades inmuno-reguladoras parecen ser características de las cepas procedentes de

leche materna respecto a cepas obtenidas a partir de otras fuentes (Pérez-Cano y col.2010).

Por tanto, la manipulación de la microbiota intestinal del lactante mediante el uso de pro-

bióticos aislados de leche materna se presenta como una alternativa interesante para fa-

vorecer la maduración inmunológica del lactante, lo que va a ser clave en la prevención de

enfermedades en la edad infantil y también en la edad adulta. Esto podría suponer un paso

más en la evolución de las fórmulas infantiles con el objetivo de conseguir mediante la lac-

tancia artificial algunos de los efectos sobre la salud demostrados para la lactancia natural.

2 Bacterias probióticas de leche materna en nutrición infantil.

Por las razones comentadas anteriormente, el uso de probióticos en alimentación

infantil ha adquirido un interés creciente en los últimos años. De hecho, existen ya en el

mercado una gran cantidad de fórmulas infantiles de continuación, y algunas de inicio, que

contienen probióticos. Probablemente por este auge de los probiótics en nutrición infantil,

el comité de nutrición de ESPGHAN ha publicado en los últimos 5 años 2 revisiones sobre

este tema.

En la primera de ellas (ESPGHAN Comitee on Nutrition, 2005), los autores concluy-

eron que, aunque determinadas cepas habían mostrado resultados interesantes en el trata-

miento y prevención de la diarrea infecciosa, no había datos suficientes para llegar a con-

clusiones sobre la eficacia de los probióticos. En cuanto a seguridad, el Comité tenía pocas

dudas sobre la seguridad de los probióticos en niños a partir de 6 meses, sin embargo, sí

que puso de manifiesto que faltaban datos sobre seguridad de los probióticos en recién

nacidos y a largo plazo.

En un artículo más reciente sobre fórmulas infantiles adicionadas de probióticos, el

Discusión

167

Comité de Nutrición de ESPGHAN (ESPGHAN Commitee on Nurition 2011) llega a la con-

clusión de que no hay razones para dudar de la seguridad de estas fórmulas. Sin embargo,

y aunque reconoce que ciertos estudios apuntan hacia una eficacia clínica de ciertas cepas

en infecciones gastrointestinales, cólico y reducción del uso de antibióticos, concluye que

siguen faltando datos que permitan hacer una recomendación general sobre el uso de pro-

bióticos en las fórmulas infantiles.

En todo caso, en ambas revisiones queda claro que los efectos de seguridad y efica-

cia son específicos de cepa y no pueden extrapolarse los efectos de una de ellas al resto. Por

tanto, cada compañía que pretenda incluir una cepa probiótica en sus productos infantiles

debe llevar a cabo los estudios pertinentes de eficacia y seguridad de esa cepa concreta.

Una vez demostrado que L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713 es seguro

en adultos y posee un potencial probiótico que podría ser de aplicación infantil se plant-

earon dos estudios en bebés de 6 a 12 meses con dos objetivos fundamentales: demostrar

la seguridad del uso de estas cepas probióticas en fórmulas infantiles y además analizar las

repercusiones del consumo de estas cepas sobre la salud del niño.

El correcto crecimiento de los niños es un parámetro de seguridad habitualmente

utilizado en estudios de intervención nutricional, ya que en los primeros meses de vida

la velocidad de crecimiento es muy alta y cualquier cambio en la salud del niño afecta de

manera importante a su crecimiento. Es por ello que hemos considerado en nuestros estu-

dios la ganancia de peso en los niños como la principal variable de respuesta en cuanto a se-

guridad. Otros estudios similares también han utilizado este parámetro como principal en

estudios de seguirdad con probióticos (Chouraqui y col. 2008) y el comité de Nutrición de

ESPGHAN considera el crecimiento como uno de los parámetros a evaluar en todos los estu-

dios que se lleven a cabo en niños no sólo como parámetro de seguridad sino también como

parámetro principal (Aggett y col. 2003). En los estudios presentados se demuestra que tras

6 meses de intervención con una fórmula infantil que contenía L. fermentum CCT5716 o L.

salivarius CECT5713 a una dosis aproximada de 2x108ufc/día no hubo cambios en la ganan-

cia de peso de los niños con respecto a la fórmula control. Tampoco hubo diferencias en

otros parámetros antropométricos como talla y perímetro craneal ni se produjeron efectos

adversos relacionados con el consumo de ambas fórmulas infantiles probióticas. Por tanto

las fórmulas infantiles de continuación suplementadas con L. fermentum CECT5716 o L.

salivarius CECT5713 fueron seguras y perfectamente toleradas por los niños.

Discusión

168

Los procesos involucrados en el establecimiento de la microbiota son muy comple-

jos e implican la sucesión de microorganismos así como interacciones entre el huésped y

los microorganismos que al final culminan en una población bacteriana densa y estable en

el tracto gastrointestinal. Anteriormente se ha comentado que los niños que reciben leche

materna tienen un microbiota más favorable que los alimentados con fórmulas infantiles, lo

cual probablemente esté relacionado con la presencia de bacterias ácido lácticas en la leche

materna además de otros compuestos bifidogénicos tales como los oligosacáridos (Koletzo

y col. 1998). Esta microbiota más favorable en los niños alimentados con leche materna se

ha relacionado con un menor riesgo de padecer infecciones en estos niños así como con

la menor incidencia en enfermedades relacionadas con desregulaciones de la respuesta

inmune como pueden ser la alergia o ciertas enfermedades inflamatorias crónicas (Alarcon

y col. 1996; Newburg y col. 2005). El papel de la microbiota intestinal en el proceso de

maduración del sistema inmunológico del niño, así como el papel protector por sí mismo

frente a patógenos intestinales explicaría, al menos en parte, estas diferencias. El objetivo

de la adición de bacterias probióticas a las fórmulas infantiles es por tanto conseguir que la

microbiota de los niños alimentados con lactancia artificial se asemeje más a la microbiota

de un niño alimentado con leche materna con el fin de beneficiarse de los efectos positivos

que esta microbiota tiene sobre la salud del niño.

En los dos estudios llevados a cabo con niños, el consumo de las fórmulas suplemen-

tadas con L. salivarius CECT5713 o con L. fermentum CECT5716 indujo tras 6 meses de inter-

vención una mayor concentración de bacterias ácido lácticas en las heces con respecto a los

alimentados con la fórmula control estándar. Curiosamente en ambos estudios se observó

una bajada significativa de este género bacteriano en el grupo control tras los 6 meses de

intervención. Este fenómeno lo relacionamos con el hecho de que los niños a partir de los

6 meses de vida varían mucho su dieta y , concretamente, los niños que participaron en el

estudio no recibieron leche materna a partir del 6º mes, por lo que dejaron de consumir

los factores bifidogénicos de ésta así como la microbiota propia de la leche materna. La

adición de L. salivarius CECT5713 o L. fermentum CECT5716 a la fórmula infantil compensó

dicha caída resultando en una microbita fecal más rica en lactobacilos. Además, en el grupo

que consumió la fórmula suplementada con L. fermentum CECT5716 se observó un mayor

nivel de bifidobacterias en las heces con respecto al grupo control. Este efecto, similar al

observado en el estudio llevado a cabo en adultos con la cepa de L. salivarius, podría de-

Discusión

169

berse a fenómenos de competición por el espacio a colonizar, competición por los recursos,

producción de sustancias antimicrobianas que pueden afectar a unos grupos bacterianos

favoreciendo la proliferación de otros e incluso a la producción de metabolitos que pueden

ser utilizados de forma más eficiente por determinadas especies bacterianas. Considera-

mos que este efecto sobre la concentración de bifidobacterias es muy positivo puesto que

se fomenta en el niño la proliferación de este género que está altamente representado en

la microbiota de los niños alimentados con leche materna. Además este hecho demuestra

que la cepa de Lactobacillus es metabólicamente activa en la mucosa intestinal afectando

ya no sólo a proporción de Lactobacillus sino al conjunto de la microbiota, fomentando así

un perfil más saludable.

Tal y como se había observado en el estudio con voluntarios adultos sanos, L. sali-

varius CECT5713 pudo ser recuperada activa en las heces del 90% de los niños que con-

sumieron la fórmula infantil suplementada con esta cepa, lo que de nuevo demuestra que

esta cepa es capaz de sobrevivir en un porcentaje a la digestión. La cepa L. fermentum

CECT5716, aunque había sido recuperada activa de las heces de voluntarios adultos que la

tomaron durante 4 semanas (Olivares y col. 2007), no pudo ser identificada en las heces de

los niños por problemas tecnológicos. En estudios que se han realizado posteriormente en

bebés de 1 a 6 meses con la misma fórmula suplementada con esta cepa de L. fermentum

sí que se ha detectado la presencia de la bacteria probiótica en las heces de los bebés (re-

sultados no publicados).

Respecto a la producción de AGCC, sólo se observaron diferencias en los niveles

de butirato en las heces de los niños alimentados con la fórmula que contenía L. salivarius

CECT5713. El mantenimiento de unos niveles adecuados de butirato en el intestino es de

gran importancia pues, como se ha mencionado anteriormente, intervienen en diversos

procesos tales como la motilidad, aporte de energía de los enterocitos, mantenimiento de

la integridad del intestino, etc. Además intervienen en el proceso de diferenciación celular

clave para la correcta maduración del intestino del niño (Roy y col. 2006).

Como se ha mencionado anteriormente, la microbiota de los niños alimentados con

leche materna es más rica en los géneros Bifidobacteria y Lactobacillus en comparación con

los alimentados con fórmulas infantiles y esto se ha relacionado con una mayor protección

de los niños a padecer infecciones o enfermedades derivadas de desregulaciones de la re-

Discusión

170

spuesta inmune e incluso enfermedades metabólicas (Alarcón y col. 1996; Newburg y col.

2005). En los estudios presentados en esta tesis se muestra cómo las fórmulas infantiles con

L. fermentum CECT5716 o L. salivarius CECT5713 son capaces de influir sobre la microbiota

del bebé fomentando una microbiota más rica en lactobacilos e incluso bifidobacteria. El

siguiente paso es determinar si estos cambios en la microbiota se relacionan con una me-

jora en la salud del niño.

Efecto de las cepas probióticas de leche materna L. fermentum CECT5716 o L. salivarius

CECT5713 sobre la salud del niño.

Los episodios diarreicos, junto con las infecciones respiratorias son las patologías

más frecuentes en los primeros años de vida. La microbiota juega un papel clave en la

prevención de estas patologías durante los primeros años de vida, primero por su capa-

cidad para estimular la maduración del sistema inmunitario del niño y segundo porque

determinadas bacterias de la microbiota pueden inhibir el crecimiento y/o impedir la ad-

hesión de bacterias potencialmente patógenas a la mucosa intestinal. Diferentes estudios

in vitro (Olivares y col. 2006a; Díaz-Ropero y col. 2007) e in vivo, como los presentados en

la presente memoria, demuestran el carácter antiinfeccioso e inmunomodulador de L. fer-

mentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713. Por ello, nos pareció de gran interés evaluar el

posible efecto del consumo de la fórmula infantil con una u otra cepa sobre la incidencia

de infecciones en los niños.

En España la incidencia de infecciones gastrointestinales en niños durante el primer

año de vida varía entre 0,4 y 0,6 con una media de 0,47 episodios al año (Calderón 1990). El

consumo de la fórmula suplementada con L. fermentum CECT5716 ó L. salivarius CECT5713

redujo la incidencia de diarreas con respecto a la fórmula control en un 46% y un 62% re-

spectivamente. Hay que señalar que, si bien en el estudio con L. fermentum CECT5716 el

número de niños en el estudio (188 niños) es suficiente como para que las diferencias ob-

servadas tengan una potencia estadística del 85%, en el estudio con la cepa de L. salivarius

CECT5713, aunque las diferencias fueron significativas, el número de niños (40 niños por

grupo) está por debajo del tamaño muestral necesario para que las diferencias observadas

tengan suficiente potencia estadística. Por tanto se deberán llevar a cabo más estudios con

un número suficiente de niños para corroborar los resultados.

Los niveles de reducción en la tasa de diarreas son similares a los observados en

Discusión

171

estudios de intervención realizados con otras cepas probióticas. Por ejemplo, la adminis-

tración de Bifidobacterium lactis o Lactobacillus reuteri a niños entre 4 y 10 meses de edad

se tradujo en una reducción en la incidencia de diarreas y en la duración de la patología

(Weizman y col. 2005). En este estudio el tiempo de intervención y de seguimiento de los

niños fue sólo de 3 meses. Otro estudio llevado a cabo con una fórmula infantil destinada a

lactantes desde el primer mes de vida que contenía una mezcla de Bifidobacterium longum

BL999 y Lactobacillus rhamnosus LPR mostró también una reducción importante en la in-

cidencia de diarreas (Chouraqui y col. 2008). En este estudio el tiempo de intervención fue

de 4 meses pero el seguimiento alcanzó el año. Este seguimiento es muy importante para

vislumbrar los efectos a largo plazo que puede tener el uso de bacterias probióticas en los

bebés. Otros estudios muestran el potencial del uso de determinadas cepas probióticas en

nutrición infantil para la prevención de diarreas (Correa y col. 2005; Picaud y col. 2010; Saa-

vedra y col. 1994; Weizman y col. 2006;). En la revisión sistemática publicada por el Comité

de Nutrición de la ESPGHAN sobre el uso de probióticos en nutrición infantil (ESPGHAN

comitee on Nutrition 2011) se concluye que hay evidencias de que la suplementación de

las fórmulas infantiles con ciertas cepas, como B. lactis, está asociada con una reducción en

el riesgo de infecciones gastrointestinales. Sin embargo, y en este caso incluyen el estudio

realizado con L. salivarius CECT5713, alegan que hay todavía pocos estudios y los datos

que hay son muy limitados por lo que hace falta realizar más estudios que corroboren los

resultados.

En cuanto a los mecanismos a través de los cuales las cepas probióticas procedentes

de leche materna ejercen su papel protector sugerimos que la capacidad antibacteriana,

su capacidad para competir por la adhesión al epitelio intestinal así como sus efectos in-

munomoduladores podrían ser los responsables de forma conjunta del efecto (Olivares y

col. 2006a; Díaz-Ropero y col. 2006; Olivares y col. 2007; Pérez-Cano y col. 2010). Además,

estudios in vitro llevados a cabo recientemente en nuestro laboratorio demuestran cómo

ambas cepas, L. fermentum CECT5716 y L. salivarius CECT5713, son capaces de mejorar

la permeabilidad intestinal incrementando la expresión las proteínas de unión entre los

enterocitos (Tight Junction Proteins) y contrarrestando incluso la capacidad de ciertos pató-

genos enteroinvasivos para aumentar la permeabilidad intestinal y permitir así su entrada

(Sempere y col. 2010). Esta capacidad ha sido ya descrita para otras cepas probióticas (Qim

y col. 2009) pero cobra especial interés en el caso de la nutrición infantil y de probióticos

que son naturalmente administrados por la madre a través de la leche materna pues no

Discusión

172

sólo ayuda a prevenir la entrada de microorganismos sino también la entrada de antígenos

alimentarios que pudieran provocar una reacción alérgica (para resumen ver tabla 2.1 y

figura 2.1) .

En el caso de las infecciones gastrointestinales de origen viral no se han evaluado

los mecanismos de estas cepas para ejercer su efecto protector, pero estudios realizados

con cepas de otros orígenes sugieren que ciertas bacterias probióticas podrían atrapar de

alguna manera el virus impidendo el acceso de éste al enterocito, producen sustancias an-

tivirales e interaccionan con las células del epitelio intestinal y sistema inmune (Botić y col.

2007; Wen y col. 2009).

Tabla 2.1 Resumen actividades beneficiosas de las cepas L. fermentum CECT5716 y L. salivarius

CECT5713 demostradas in vitro y en modelos animales de experimentación.

Cepa Efecto beneficioso Referencia

L. salivarius CECT5713

Colonización intestino Martin y col.2006

Producción de antibacterianos Martin y col. 2006

Efecto antimicrobiano Olivares y col. 2006

Efecto inmuno-modulador Díaz Ropero y col. 2006

Efecto antiinflamatorio Perán y col. 2005

Efecto inmunomodulador Perez Cano y col. 2010

L. fermentum CECT5716

Colonización intestino Martin y col. 2005

Producción de antibacterianos Martin y col.2005

Efecto anmi-microbiano Olivares y col. 2006

Efecto permeabilidad Sempere y col. 2010

Efecto inmuno-modulador Díaz -Ropero y col. 2006

Efecto inmuno-modulador Olivares y col. 2007

Efecto antiinflamatorio Perán y col. 2006

Efecto antiinflamatorio Arribas y col. 2008

Efecto inmunomodulador Pérez-Cano y col. 2010

Discusión

173

Figura 2.1 Mecanismos de acción de los probióticos

Figura extraída de Lara- Villoslada y col 2007a

Sería necesario poder relacionar la reducción en la incidencia con la mejora en al-

guno de los factores de riesgo de las infecciones gastrointestinales. La EFSA, en la guía sobre

los requerimientos científicos para alegaciones de salud relacionadas con la función intes-

tinal e inmune (EFSA 2010), propone el uso de marcadores como pueden ser la concen-

tración de bacterias potencialmente patógenas en el intestino o de toxinas procedentes de

patógenos. Los análisis de la microbiota fecal de los niños que participaron en los estudios

con las cepas probióticas de leche materna sólo mostraron diferencias a nivel de grupos

bacterianos beneficiosos (bifidobacterias y lactobacilos) pero no en otros grupos bacteria-

nos que pudieran ser potencialmente patógenos como clostridios y enterobacterias. Sin

embargo, hay que tener en cuenta que en los niños por debajo del año el origen de las diar-

reas suele ser en un alto porcentaje vírico, fundamentalmente por rotavirus, seguido de

diarreas por el género Campylobacter agentes que no han sido evaluados en estos estudios.

En futuros estudios sería interesante identificar el agente causal para valorar si el

efecto protector de las bacterias probióticas de leche materna sobre infecciones gastroin-

Discusión

174

testinales varía si se trata de infecciones de origen bacteriano o vírico y poder relacionar el

efecto con un patógeno o patógenos concretos. Para ello podría ser de utilidad llevar a cabo

estudios en niños que sufren diarrea aguda, ya que estos niños suelen ser hospitalizados y,

generalmente, el agente causal de la diarrea suele ser identificado. Otra posibilidad podrían

ser los pacientes con diarrea asociada a antibióticos, ya que en este caso Clostridium dif-

ficile suele ser el agente causal en un porcentaje elevado de los casos.

Además de un efecto sobre infecciones gastrointestinales, tanto en el estudio ll-

evado a cabo con L. salivarius CECT5713 como con el llevado a cabo con L. fermentum

CECT5716, se observó también una reducción en la incidencia de infecciones respiratorias

del 32% y 26% respectivamente. La protección frente a infecciones del tracto respiratorio

estaría relacionada con una mejora en la respuesta inmune que eliminaría a los posibles

patógenos más eficientemente del organismo. La ausencia de datos sobre la respuesta in-

munológica en sangre del niño no nos permite relacionar la reducción en la incidencia con

una mejora en la respuesta inmunológica, sin embargo estos resultados concuerdan con los

obtenidos en adultos sanos donde el consumo de L. fermentum CECT5716, en individuos

sometidos a un protocolo de vacunación frente a la gripe, se tradujo en el incremento de la

respuesta inmune frente a los antígenos del virus de la gripe y en la reducción en la inciden-

cia de enfermedades del tracto respiratorio con síntomas similares a la gripe (Olivares y col.

2007). Este efecto se explicó por un incremento en la respuesta inmune innata y específica

evidenciada por el aumento en la proporción de Natural Killer, de citokinas relacionadas

con la respuesta Th1 y la producción de anticuerpos específicos. El incremento en la respu-

esta inmune innata y específica fue también observado en el estudio llevado a cabo con L.

salivarius CECT5713 con adultos sanos en el que, como ya se ha comentado anteriormente,

se observó un aumento en la proporción de Natural Killer y monocitos, y en la producción

de citokinas e inmunoglobulinas (Sierra y col. 2010).

Al igual que ocurre con la infecciones gastrointestinales, los principales agentes cau-

santes de las infecciones respiratorias son de origen viral. En las infecciones virales tiene

una especial importancia el IFN-γ producido por linfocitos de tipo Th1 y por Natural Killer.

Esta citocina ejerce efectos antivirales directos protegiendo a las células del organismo de

la infección por las partículas virales pero también potencia la respuesta inmune estimu-

lando macrófagos y células Natural Killer que reconocerán las células infectadas por virus

destruyéndolas, además de producir citokinas que estimularán el desarrollo de la respuesta

Discusión

175

específica. Si bien los estudios llevados a cabo en humanos con L. salivarius CECT5713 y L.

fermentum CECT5716 no mostraron diferencias en los niveles plasmáticos de IFN-γ, sí que

estudios realizados in vitro demostraron que L. fermentum CECT5716 incrementa de forma

muy significativa la producción de esta citokina por células sanguíneas (Pérez-Cano y col.

2010). Curiosamente la reducción en la incidencia de infecciones respiratorias en los estu-

dios llevados a cabo con las fórmulas infantiles suplementadas con las cepas de leche ma-

terna se debió fundamentalmente a una reducción en las infecciones de repetición (datos

no mostrados en el artículo) lo que podría ser indicativo de una más rápida recuperación

del sistema inmune tras una primera infección, o a una mejora en el desarrollo de la respu-

esta específica encargada de que un segundo encuentro con el antígeno sea rápidamente

solventado.

Hay pocos estudios donde se analice el efecto de probióticos sobre infecciones res-

piratorias y los que hay se han enfocado desde el punto de vista de la prevención pero no

del tratamiento. Aunque se han observado resultados prometedores para algunas de las

cepas estudiadas es necesario que se lleven a cabo más estudios que incluyan además

las medidas de biomarcadores relacionados con la respuesta inmune (para revisión ver

Wolvers y col. 2010). En niños la información es aún más limitada y sólo algunos estudios

describen efectos positivos (Kukkonen y col. 2008). Curiosamente estudios realizados con

cepas que mostrado una reducción de infecciones gastrointestinales en niños no han dem-

ostrado sin embargo efecto sobre infecciones respiratorias. Es el caso de B. lactis (Velaphi

y col. 2008; Weizman et al 2005), L. reuteri ATCC55730 (Weizman et al 2005) o L johnsoni

La1 (Brunser y col. 2006).

El hecho de que ambas cepas de leche materna, Lactobacillus fermentum CECT5716

y Lactobacillus salivarius CECT5713, hayan ejercido un efecto positivo reduciendo la inci-

dencia de infecciones tanto a nivel del tracto gastrointestinal como del tracto respiratorio

pone de manifiesto el potencial de estas cepas frente a otras presentes en el mercado.

Los cambios en los parámetros inmunes plasmáticos observados en los estudios

de intervención en adultos sanos (Olivares y col. 2007; Sierra y col. 2010), así como la re-

ducción en la incidencia de enfermedades infecciosas del tracto respiratorio observados

en niños demuestran que el efecto de las bacterias probióticas de leche materna sobre la

respuesta inmune tras su administración oral no sólo afecta al sistema inmune del tejido

Discusión

176

linfoide asociado a la mucosa intestinal sino que se trata de una respuesta sistémica que

se extiende por todo el organismo hacia otras mucosas como la del tracto respiratorio. La

baja incidencia de otras enfermedades de origen infeccioso en los niños que participaron

en el estudio no permite detectar el efecto sobre otro tipo de infecciones como pueden ser

las de tracto urinario, pero es probable que también ejerciera efecto en otras mucosas. De

hecho un estudio realizado en mujeres con mastitis a las que se les administró Lactobacil-

lus fermentum CECT5716 o Lactobacillus salivarius CECT5713 demostró que estas cepas,

además de alcanzar la glándula mamaria, mejoraban considerablemente la patología in-

cluso en mayor grado que los tratamientos antibióticos (Arroyo y col 2010).

Tal y como se ha comentado en anteriores capítulos, la instauración de la microbiota

en el niño es esencial para el correcto proceso de maduración del sistema inmunológico. Un

fallo en la inducción de tolerancia oral conduce a la susceptibilidad frente a antígenos ali-

mentarios o bacterianos en el tracto gastrointestinal, desarrollándose enfermedades tales

como la alergia alimentaria o la enfermedad inflamatoria intestinal. La prevalencia infantil

de estas enfermedades se ha incrementado significativamente en los últimos años en los

países desarrollados. El carácter inmunomodulador de las cepas, Lactobacillus fermentum

CECT5716 y Lactobacillus salivarius CECT5713, así como su efecto sobre la permeabilidad

intestinal sugiere que podrían tener un efecto preventivo también sobre la alergia o incluso

enfermedades inflamatorias crónicas. Se necesitarán más estudios que aporten más datos

sobre las posibles aplicaciones de estas cepas probióticas.

La adición de cepas probióticas a las fórmulas infantiles es una práctica que se está

extendiendo en los últimos años con el fin de conseguir que los niños alimentados con

fórmula infantil desarrollen una microbiota más parecida a la desarrollada por los niños ali-

mentados con leche materna. De esta forma se pretende que los niños alimentados con fór-

mula infantil se beneficien también de las ventajas sobre la salud a corto y largo plazo que

tiene una microbiota más saludable. En este sentido parece razonable que Lactobacillus

fermentum CECT5716 y Lactobacillus salivarius CECT5713, que ya están presentes de forma

natural en la leche materna y que han demostrado propiedades beneficiosas sobre la salud

(resumen en tabla 2), sean probióticos de elección a la hora de suplementar una fórmula

infantil. Sin embargo los datos recopilados hasta ahora son todavía limitados y habrá que

llevar a cabo más estudios en los que se evalúen los efectos a largo plazo de la suplemen-

tación de las fórmulas con estas cepas y se profundice en los mecanismos de acción bus-

Discusión

177

cando biomarcadores que permitan relacionar la reducción en la incidencia de infecciones

con mecanismos concretos. Por las razones comentadas anteriormente, los recién nacidos

son los que se podrían beneficiar más del consumo de probióticos, ya que su microbiota no

está todavía totalmente instaurada y es más fácil modificarla. Por otra parte, el Comité de

Nutrición de ESPGHAN ha recomendado que se lleven a cabo estudios sobre los efectos de

los probióticos a largo plazo, ya que estos estudios escasean en la bibliografía actual. Estos

estudios permitirán argumentar de forma científica y consistente la recomendación del uso

de estas bacterias probióticas en los alimentos infantiles.

Tabla 2.2 Resumen estudios llevados a cabo en humanos con las cepas L. salivarius CECT5713 y L.

fermentum CECT5716.

Población(n=nº sujetos)

L. fermentum (CECT5716)

Adultos (vacunación frente gripe)

↑NK

(n=50) ↑TNF-a

↑IgG, IgM

↑IgA específica

Niños 6-12 meses

↑lactobacilos

(n=188) ↑bifidobacterias

↓46% incidencia diarrea

↓26% incidencia infecciones

respiratorias

L salivarius ↑lactobacilos

(CECT5713) ↑bifidobacterias

↑total AGCC

↑NK

↑IL-10

↑IgG, IgA

Niños 6-12 meses

↑lactobacilos

(n=80) ↑butirato

↓62% incidencia diarrea

↓32% incidencia infecciones

respiratorias

Referencia DosisDuración

intervención EfectosOlivares et al

20071010cfu/día 4 semanas

Maldonado y col. 2011

2x108cfu/día 6 meses

Sierra y col. 2010

2x108cfu/día Adultos (n=40) 4 semanas

Maldonado y col. 2010

2x108cfu/día 6 meses

Conclusiones

Conclusiones

181

Tras el análisis de los resultados obtenidos en los estudios llevados a cabo en esta

Tesis se llega a las siguientes conclusiones:

1.- El consumo oral de la cepa probiótica Lactobacillus salivarius CECT5713 es segu-

ro y bien tolerado en adultos sanos e induce efectos beneficiosos tanto a nivel de la función

intestinal como de la respuesta inmunológica que podrían ayudar al mantenimiento de la

salud de los individuos.

2.- La adición de la cepa probiótica Lactobacillus salivarius CECT5713 a fórmulas

infantiles de continuación es segura y bien tolerada por niños de 6 a 12 meses. El consumo

de la fórmula de continuación que contiene esta cepa ejerce efectos beneficiosos sobre

la salud del niño reduciendo la incidencia de infecciones gastrointestinales y respiratorias

durante el periodo de consumo.

3.- La adición de la cepa probiótica Lactobacillus salivarius CECT5716 a fórmulas

infantiles de continuación es segura y bien tolerada por niños de 6 a 12 meses. El consumo

de la fórmula de continuación que contiene L. fermentum CECT5716 ejerce efectos benefi-

ciosos sobre la salud del niño reduciendo la incidencia de infecciones gastrointestinales y

respiratorias durante el periodo de consumo.

Como conclusión final, los resultados obtenidos en la presente Tesis demuestran que

las cepas de leche materna Lactobacillus fermentum CECT5716 y Lactobacillus salivarius

CECT5713 reúnen una serie de características tales como su origen, seguridad y efectos

beneficiosos que los hace candidatos ideales a la hora de suplementar una fórmula infantil.

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Universidad de Granada Departamento de Bioquímica y BiologíaMolecular