TEMA3 TECNICAS HISTOLOGICASSe denomina tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de que sea posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observacin de estructuras no visibles al ojo humano.

PASOS GENERALES DE LAS TECNICAS HISTOLOGICAS

1. Obtencin del material histolgico para estudiar: Los tejidos se pueden obtener de diferentes formas:

Biopsia

Abiopsia

Necropsia (llamada vulgarmente autopsia)

2. Proceso de fijacin: En este paso el tejido obtenido se coloca en una sustancia fijadora para evitar los cambios post-mortem Unos de los fijadores mas usado es el Formol al 10% (Formaldehido). En el caso de que utilicemos ms adelante el microscopio electrnico, usaremos glutaraldehido (protenas) u osmio (lpidos).

3. Lavados: Se debe lavar el tejido para quitar exceso de fijador

4. Deshidratacin: Suena incoherente que se deba lavar el tejido y despus deshidratarlo, entonces para que lavarlo? El exceso de fijador al momento de la infiltracin, incluso en la microtomia, podra afectar los cortes, por eso se debe lavar. La deshidratacin se hace con el uso de alcohol de una menor concentracin a una mayor.

5. Aclaramiento: En este paso el se sustituye el alcohol por un disolvente de parafina lo mas usado es el Xilol (Xileno) ya que como esta deshidratado el xilol entrara hasta la mas profundo del tejido. Tambin el tejido pierde color hasta un tono acaramelado

6. Infiltracin: En este paso la muestra se coloca en parafina liquida, cabe mencionar que se debe usar parafina histolgica, como se ha dicho en el paso anterior el tejido esta completamente lleno de xilol, ahora debido a osmosis sale el xilol y entra la parafina. La Deshidratacin, Aclaramiento e Infiltracin se pueden realizar manualmente pero hoy en da existe una maquina que lo puede realizar.

7. Inclusin: Aqu se forman bloques de parafina y dentro de estos bloques estn las muestras a estudiar. hay maquinas especializadas para la inclusin en parafina de tejidos Despus que se incluyeron los bloques y por consecuente se dejaron secar, estos se deben poner a enfriar en un congelador para su posterior corte8. Microtoma: Se realizan cortes muy delgados que van de acuerdo a lo requerido o costumbre del laboratorio donde se realice la tcnica, los cortes van desde .5 micras hasta 8 u 10 micras. Los cortes se echan al bao de flotacin y se pescan con un portaobjetos, se marca con la fecha, el tejido que es y con que tincin se va a procesar. El ngulo de corte entre el cuchillo y el bloque ha de ser entre 10 y 15. Una vez realizado el corte se da un bao de agua destilada, para que la parafina se estire. Un buen corte histolgico debe tener un grosor en torno a 3-5 micras.9. Tincin: Hay muchos tipos de tinciones para diferenciar en los tejidos diferentes estructuras o sustancias; La tincin mas usada o tambin llamada "De Rutina" es la de Hematoxilina y Eosina (HyE) esta usa un colorante llamado Hematoxilina en su composicin segn Harris que tie las sustancias cidas o que las contengan, como el ncleo que contiene el cido Desoxirriboncleico (ADN) La Eosina Amarillenta tie las estructuras bsicas como el citoplasma y dems organelosFIJADORESSon sustancias que se utilizan para preservar la estructura del tejido semejante a la que tenan en vida; ya que los fijadores detienen la autolisis celular. La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas

Condiciones que debe tener un fijador:

Alto poder de penetracin, para fijar las capas mas profundas

Actuar con rapidez, matando y fijando las clulas

No provocar estructuras artificiales

No retraer el tejido, ni volverlos quebradizos

No debe dificultar la coloracin y ejecucin de cortes.

Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban vivos.

TIPOS DE FIJADORESFIJADORES QUIMICOS SIMPLES:a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos.b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica.c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.).d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares.

FIJADORES QUIMICOS COMPUESTOS:

a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica.

b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica.

c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol.

d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica.

FIJADORES FSICOS:

a) Desecacin: Se lo utiliza en extendidos de sangre, lquidos de puncin. Si se efecta rpidamente detiene los procesos de post mortem y permite el empleo posterior de fijadores qumicos o calor seco para completar la fijacin.

b) Calor seco: Es utilizado a menudo en bacteriologa sobre extendidos desecados, poco empleado en histologa.

c) Calor hmedo: En forma de agua hirviente es utilizado en algunas investigaciones microqumicas o para fijar invertebrados.

d) Fro: No es un verdadero fijador, pero detiene los procesos vitales y los cadavricos de necrosis y autolisis, pero en cuanto deja de actuar, se reanudan las actividades vitales si la clula no ha muerto, o se desarrollan los procesos de post mortem.

e) Congelacin desecacin

REGLAS DE LA FIJACIN:

El material debe ser cortado en trozos pequeos y no demasiado grueso, para facilitar la penetracin del fijador.

La relacin del volumen entre el objeto a fijar y el fijador, vara segn el fijador empleado, pero como mnimo la relacin debe ser de 1 a 20.

El lquido fijador se debe verter primero en el frasco y luego se introducen los trozos de tejido; en caso contrario quedan stos pegados en el fondo y no se fijan por ese lado. Si son tejidos que tienden a ir al fondo (hgado, msculo, glndulas), se debe agitar el frasco durante unos minutos. Los tejidos que flotan (pulmn, grasas), se recubren con un trozo de algodn o papel de filtro para que se pongan totalmente en contacto con el fijador.

La duracin del tiempo de fijacin vara segn el fijador utilizado, el tamao y la textura del tejido. El general y como promedio, 24 horas es suficiente, pero puede quedar en el lquido fijador, sobre todo con el formol taponado durante varios aos.

la osmoralidad es un factor importante y debe en lo posible tener una concentracin inica en el fijador similar al tejido que se va a fijar. Las variaciones de la osmoralidad se logran por la adicin de cloruro de sodio, sacarosa o dextrn.COLORACION

Colorantes: Son todas aquellas sustancias que pueden comunicar su color a otros cuerpos, sea el mismo color que ellas tienen (colorantes ortocromticos), o bien teir de un color distinto (colorantes metacromticos, ejemplo: Azul de Toluidina, tie de rojo determinados grupos qumicos de las clulas y azul todo lo dems).

Coloracin es el proceso por el cual un cuerpo toma color bajo la accin de un colorante y no desaparece con lavados de la misma sustancia en que se disolvi el colorante.Las estructuras contenidas en las preparaciones histolgicas, poseen poco contraste o carecen de l completamente, por lo que no van a poder ser distinguidas al microscopio. Este inconveniente queda salvado por la propiedad que tienen los distintos componentes celulares y tisulares de incorporar con variable intensidad sustancias colorantes. La coloracin puede ser: Sustancias basfilas: Son los componentes de las estructuras que se tien con colorantes bsicos.

Sustancias acidfilas: Son los componentes de las estructuras que se tien con colorantes cidos.

Sustancias neutrfilas: Son los componentes de las estructuras que se tien con colorantes neutros.

Sustancias azurfilas: Son los componentes de las estructuras que se tien con azul de metileno.

Sustancias osmifilas: Son los componentes de las estructuras que se tien con tetrxido de osmio.

Sustancias argirfilas: Son los componentes de las estructuras que se tien con sales de plata.

CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES SEGN SU ORIGENColorantes naturales: Animales ( carmn ) Vegetales ( hematoxilina, orcena, azafrn )Colorantes artificiales o sintticos cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos. Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata).La coloracin puede ser:

Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante empleada.

Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un color diferente al del colorante empleado.COLORANTES MAS UTILIZADOS EN HISTOLOGIA

Hematoxilina

Colorante vegetal, bsico

Tiene afinidad por los componentes cidos de la clula, los tie de color azul violceo

Tie los componentes nucleares.

Se denomina basfilosEosina

Colorante artificial, acido

Tiene afinidad por los componentes bsicos de la clula, los tie de color rosado

Tie citoplasma y organelos

Se denomina acidfilos.La Hematoxilina: es un colorante nuclear, est cargado positivamente y es por lo tanto un colorante bsico. Se deposita en los grupos fosfatos del ADN y ARN que tienen carga negativa. Es el colorante nuclear ms utilizado. Se lo obtiene a partir de la extraccin del palo de campeche (hematoxilon campechianum). La sustancia es incolora y ha de ser transformada primero por oxidacin en hematena que es el autntico colorante. La hematena es un colorante indirecto, por lo que requiere el uso de un mordiente, que en la prctica el ms usado es el Hemalumbre de Mayer, que forma parte de la coloracin hematoxilina eosina, y que est compuesto por hematena, alumbre de potasio y cido ctrico. Colorea al ncleo de color violeta. Es una coloracin progresiva. La Eosina: es un colorante artificial, dbilmente cido que pertenece al grupo de las fluorescenas. Es fcilmente soluble en agua. Colorea al citoplasma, tejido conjuntivo, fibras colgenas de rosado intenso. Qumicamente es un eosinato de potasio, siendo el cido eosnico el que acta en la coloracin. Es una coloracin regresiva y directa.ALGUNOS METODOS UTILIZADOS EN LAS TECNICAS HISTOLOGICAS1. METODOS EN VIVO O INMEDIATO

a) Cultivo de tejidos: es un importante mtodo para el estudio de poblaciones celulares vivas fuera del organismo, el mtodo se le denomina a menudo in vitro. Las condiciones para llevar a cabo este mtodo son las siguientes:

Se realiza el corte del tejido que se quiera estudiar

Se coloca en un recipiente estril, se le agrega una solucin que tenga una composicin similar a los lquidos tisulares.

Se le aaden ciertas enzimas proteolticas como la tripsina y colagenasa, cuya funcin es romper los enlaces intercelulares, permitiendo as obtener clulas individuales.

Luego se aaden estas clulas a un medio de cultivo nutritivo, como plasma o sangre, el cual va a permitir el crecimiento de estas clulas.

Debe aadirse soluciones de antibiticos con la finalidad de inhibir el crecimiento bacteriano.

El cultivo debe mantenerse a una temperatura de 37C para simular la temperatura corporal.

De esta manera se lleva a cabo el cultivo de clulas vivas, donde se obtendrn clones de clulas para cualquier estudio histolgico; estas clulas para conservarlas mas tiempo se pueden congelar, sin embargo existen ocasiones donde se le debe aadir nitrgeno liquido a -196C para preservarlas por meses o aos y al descongelarlas estarn en condiciones para seguir su crecimiento.b) Coloracin vital: Consiste en el empleo de soluciones muy diluidas de sustancias colorantes no txicas, para estudiar a una muestra de clulas o tejidos. Los colorantes utilizados son el Verde Jano, Azul tripn, Rojo congo, Rojo neutro, Azul pirrol, etc. Se clasifica en :

Coloracin intravital: Se basa en la introduccin de colorantes no txicos en el organismo vivo por vas digestiva, subcutnea, al torrente sanguneo o linftico; por ejemplo: la alizarina se utiliza para estudiar el crecimiento seo, ya que este se fija a la matriz sea. En algunas ocasiones lo utilizan para estudios con animales luego de aplicar la tcnica matan al animal y se sigue los pasos de la Tcnica Histolgica corriente. En la observacin microscpica se vern determinadas estructuras que contienen el colorante.

Coloracin supravital: Se realiza sobre clulas libres, extradas del organismo, como el caso de clulas sanguneas, clulas de raspado de la mucosa bucal o vaginal, cortes finos de tejido cartilaginoso que conserva su vitalidad. Hay que proceder a la observacin rpida antes de que comiencen los procesos de post morten.

2. METODOS MEDIATO O POST MORTENLos tejidos muertos se preparan de acuerdo al microscopio que se vaya a utilizar.PARA EL MICROSCOPIO OPTICO SE INCLUYEN LOS SIGUIENTES PASOS: Fijacin: se refiere al tratamiento con fijadores. Deshidratacin y aclaramiento: debido a que gran parte del tejido esta constituido por agua, se somete el tejido a una serie gradual de baos de alcohol, iniciando con alcohol al 50% y alcanzando de manera progresiva al 100% para eliminar el agua (deshidratacin), luego este tejido deshidratado se trata con xileno, una sustancia qumica que es miscible con parafina fundida, el xileno torna al tejido transparente. Inclusin: con el objetivo de distinguir entre si las clulas que conforman un tejido, se debe incluir el tejido en un medio apropiado que le de firmeza al tejido para luego realizar los cortes, el medio habitual es la parafina. Se coloca el tejido en un recipiente adecuado con parafina fundida hasta que se infiltra por completo y se deja endurecer para formar bloques de parafina. Corte: una vez que este listo el bloque de tejido debe cortarse, parta ello vamos a utilizar un equipo llamado Micrtomo; se realizan cortes delgados que permitan el paso de la luz, generalmente el espesor de los cortes es de 5 a 10 m Montaje: los cortes de parafina se montan en portaobjetos de vidrio y se colorean con colorantes hidrosolubles que permiten diferenciar los diversos componentes celulares. Tincin: el mas utilizado es la combinacin de Hematoxilina-Eosina, que tien los componentes nucleares de azul violceo, mientras que casi todas las estructuras citoplasmticas adquieren una tonalidad rosada.PARA EL MICROSCOPIO ELECTRONICO SE INCLUYEN LOS SIGUIENTES PASOS: Fijacin: se utiliza Glutaraldehido o terxido de osmio

Deshidratacin: de igual manera que para el ptico

Inclusin: para la inclusin se suelen utilizar resinas epoxi y distintos materiales plsticos, que adquieran una gran dureza despus del secado y permiten la seccin de cortes mas finos entre 0,02 a 0,1 m, para ello se utiliza el ultra micrtomo. Montaje: los cortes ultrafinos se montan en una rejilla pequea de cobre, denominado grilla. El haz de electrones atraviesa el corte por los orificios de la grilla.

Tincin o Coloracin: generalmente se utiliza toluidina que es un colorante bsico, por su capacidad de penetrar los medios de inclusin de resinas epoxi.

TCNICA DE CONGELACIN PARA M/E:Mediante esta tcnica es posible estudiar al M/E estructuras celulares superficiales o puestas al descubierto por medio de la fractura de una muestra congelada a muy bajas temperaturas, sin ningn tipo de procesamiento qumico que altere la ultraestructura de la misma. La muestra se congela en nitrgeno lquidos (-196 C). Mediante una cuchilla se produce un corte que provoca una lnea de fractura en la muestra, quedando expuesta la superficie donde se produjo el corte. Esta superficie pierde agua por sublimacin y posteriormente se le evaporan carbn y metales pesados desde diferentes ngulos, hasta cubrirla en su totalidad, logrando de esta

manera, una rplica o mascarilla de la misma. Por un procedimiento donde se elimina el material biolgico, la replica se separa de la muestra y se examina al M/E, en ella se pueden apreciar las caractersticas de las estructuras que quedaron impresas en la rplica TCNICA DE FRACCIONAMIENTO CELULAR:

Cuando se requieren separar los componentes intracelulares (organitos), la tcnica de eleccin es la centrifugacin o la ultracentrifugacin en un medio isotnico. Para esto es necesario romper previamente las clulas mediante procedimientos mecnicos (en un homogeneizador con mbolo de vidrio o tefln), con la consiguiente liberacin al medio de sus componentes.

En la centrfuga las partculas de distinta densidad, forma y tamao, sedimentan a diferentes velocidades y tiempo. De este modo se obtienen distintas porciones o fracciones celulares. Aunque con esta tcnica se obtienen fracciones celulares bastante puras, no es posible evitar la contaminacin de una determinada fraccin con partes de otra. Como se plante anteriormente, el comportamiento de las diferentes partes de la clula en el campo centrifugacional, est determinado por varios parmetros que pueden coincidir en organitos diferentes; por ejemplo, una mitocondria pequea puede tener similar forma, talla y densidad que un lisosoma y, por tanto, se obtiene una fraccin mitocondrial contaminada por lisosomas. Este hecho es necesario tenerlo en cuenta cuando se est estudiando el contenido enzimtico de determinada fraccin, ya que se pueden falsear los resultados.