TEMA 41TEMA 41

CONTEXTUALIZACIÓNCONTEXTUALIZACIÓNCONTEXTUALIZACIÓNCONTEXTUALIZACIÓN Técnica que engloba un gran número de disciplinas y áreas de investigación:

biología molecular bioquímica biología celular virología medicina…

Hace disminuir el número necesario de animales de experimentación

Tecnología de máxima actualidad y controversia

Proporciona modelos extrapolables válidos de patologías humanas

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN Un organismo transgénico es aquel que porta en su genoma

genes “nuevos”

En animales se consigue normalmente por microinyección de DNA purificado en el pronúcleo de huevos fertilizados

En plantas, el DNA exógeno se transfiere desde la bacteria A.tumefaciens

Se requiere la integración en el genoma del organismo manipulado

DATOS HISTÓRICOSDATOS HISTÓRICOSDATOS HISTÓRICOSDATOS HISTÓRICOS 1891. El grupo de Heape describe los primeros éxitos de

transferencia de embriones

1977. Gurdon transfiere mRNA y DNA en huevos de Xenopus y estudian la síntesis proteica

1981. Gordon y Ruddle acuñan la palabra transgénico: variante animal originada tras la introducción de genes nuevo en su genoma

1986. Brinster y Palmiter describen la introducción de genes dentro de la línea germinal de animales

LEGISLACIÓN EN ESPAÑALEGISLACIÓN EN ESPAÑALEGISLACIÓN EN ESPAÑALEGISLACIÓN EN ESPAÑA

Legislación sobre Organismos Modificados

Genéticamente. Real Decreto 951/1997 que

establece el régimen jurídico de la utilización

confinada, liberación voluntaria y comercialización

de organismos modificados genéticamente, con el

fin de prevenir el riesgo para la salud humana y el

medio ambiente (B.O.E. 150, 24 de junio de 1997).

APLICACIONES DE LA APLICACIONES DE LA TRANSGENIZACIÓNTRANSGENIZACIÓN

APLICACIONES DE LA APLICACIONES DE LA TRANSGENIZACIÓNTRANSGENIZACIÓN

Bases genéticas de enfermedades y diseños de terapia

Modelos para investigación de infecciones y terapia génica

Modelos como banco de pruebas de diferentes drogas y medicamentos

Diseños biotecnológicos en industrias agropecuarias

Modelos de animales para analizar los efectos de la modulación, activación o supresión de la expresión génica

ASPECTOS A CONSIDERAR EN ASPECTOS A CONSIDERAR EN LA TRANSGENIZACIÓNLA TRANSGENIZACIÓN

ASPECTOS A CONSIDERAR EN ASPECTOS A CONSIDERAR EN LA TRANSGENIZACIÓNLA TRANSGENIZACIÓN

Impacto medioambiental

Aceptación pública

Consideraciones éticas

Legislación

Seguridad en el caso de alimentos transgénicos

Aspectos de patente, economía y uniformidad del producto

REFLEXIONES...REFLEXIONES...REFLEXIONES...REFLEXIONES...¿Podrían aparecer nuevas enfermedades o producirse un

salto interespecífico de alguna enfermedad concreta?

¿Podrían crearse organismos altamente patógenos artificialmente?

¿Cuál sería el verdadero impacto medioambiental de algunos productos transgénicos si se liberaran en la naturaleza?.

PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOSANIMALES TRANSGÉNICOS

PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOSANIMALES TRANSGÉNICOS

1º Determinar, caracterizar y purificar el material genético a transferir

2º Superovulación

3º Transferencia génica

4º Transferencia de embriones

5º Caracterización de la progenie

PREPARACION Y PREPARACION Y PURIFICACION DEL DNAPURIFICACION DEL DNA

PREPARACION Y PREPARACION Y PURIFICACION DEL DNAPURIFICACION DEL DNA

DNA sin nicks o roturas de secuencia

Tampones de microinyección de baja fuerza iónica

Concentraciones de DNA entre 1 y 2 ng/l.

DNA con extremos no romos se integran mejor

Microinyección en el pronúcleo masculino

PROCESOS DE BIOLOGÍA PROCESOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR FRECUENTESMOLECULAR FRECUENTES

PROCESOS DE BIOLOGÍA PROCESOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR FRECUENTESMOLECULAR FRECUENTES

Construcción de librerías génicas

PCR

Secuenciación nucleotídica

Inserción en vectores

Extracción, purificación y concentración

SUPEROVULACIÓNSUPEROVULACIÓNSUPEROVULACIÓNSUPEROVULACIÓN

Mediante las siguientes hormonas:1ª: - PMSG (Pregnant Mare´s Serum

Gonadotropin) - FSH (Follicle-Stimulating Hormone)

2ª: - HCG (Human Chorionic Gonadotropin) - LH (Luteinizing Hormone)

Hasta 35 óvulos por hembra

MODELOS DE MODELOS DE TRANSFERENCIA GÉNICATRANSFERENCIA GÉNICA

MODELOS DE MODELOS DE TRANSFERENCIA GÉNICATRANSFERENCIA GÉNICA

Microinyección

Infección viral (retrovirus normalmente)

Transfección de células Embrionarias (ES)

Segmento T-DNA del plásmido Ti (plantas)

MICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓN

Transgén introducido directamente en el pronúcleo masculino (mayor tamaño)

El tamaño del fragmento a microinyectar no es muy relevante, incluso

Cromosomas artificiales de levadura (Yeast Artificial Chromosomes, YAC)

Inserción en el genoma al azar

ELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓNELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓN ELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓNELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓN

Embriones en estadio 1 (2 pronúcleos)

DNA a transferir purificado

Microscopio de microinyección

Micropipeta de sujección

Pipeta de microinyección

REIMPLANTACION DE LOS REIMPLANTACION DE LOS EMBRIONES MICROINYECTADOSEMBRIONES MICROINYECTADOS

REIMPLANTACION DE LOS REIMPLANTACION DE LOS EMBRIONES MICROINYECTADOSEMBRIONES MICROINYECTADOS

Transferencia al oviducto de una hembra pseudopreñada. Para ello,

Cruce con ratones vasectomizados

Los embriones se pueden congelar con un agente crioprotector (DMSO)

ANÁLISIS DE LA PROGENIEANÁLISIS DE LA PROGENIEANÁLISIS DE LA PROGENIEANÁLISIS DE LA PROGENIE Técnicas de Biología Molecular:

Southern blot Slot o Dot blot Northern blot PCR...

Técnicas Inmunobioquímicas Inmunoprecipitación Inmunohistoquímica Inmofluorescencia Western blot...

Otras: Desarrollo del animal Conducta...

CÉLULAS EMBRIÓNICAS CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) IPLURIPOTENCIALES (ES) I

Suelen derivar de la masa interna del blastocisto

Pueden originar “en cultivos” células de diferentes tejidos (epiteliales, musculares…)

ES reinyectadas en el blastocisto constituirán parte del tejido adulto

CÉLULAS EMBRIÓNICAS CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) IIPLURIPOTENCIALES (ES) II

CÉLULAS EMBRIÓNICAS CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) IIPLURIPOTENCIALES (ES) II

Permite recombinación homóloga del transgén con el genoma celular:

Introducir un gen nuevo Sustituir uno ya existente por otro mutado, consiguiendo la

pérdida funcional de dicho gen: “Knock-out”

Las ES manipuladas se introducen en el útero de la hembra pseudopreñada

Suelen producir Quimeras

TRANSFERENCIA GÉNICA EN TRANSFERENCIA GÉNICA EN “ES”“ES” Transfección:

Precipitación con fosfato cálcico

Lipofección

Electroporación

Infecciones virales: Retrovirus

Adenovirus

Herpesvirus

TRANSFERENCIA GÉNICA TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR RETROVIRUSMEDIADA POR RETROVIRUS

TRANSFERENCIA GÉNICA TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR RETROVIRUSMEDIADA POR RETROVIRUS

Retrovirus alcanza una eficiencia de transferencia próxima al 100%

Uno de los retrovirus más utilizados es el de la leucemia murina (MuLV).

Embriones de 4-16 células pueden ser infectados con retrovirus recombinante

Tras la infección, el embrión se reimplanta en el útero de la hembra pseudopreñada

El virus solo puede integrar, al azar, una copia de DNA por célula.

DNA vector

Introducción delDNA

Estadio embrionario

Transferencia delembrión

Nº de copias de DNAintegradas

Porcentaje de éxito

Integración

Desventajas

Microinyección

Cualquier tipo deDNA clonado

Microinyección

Monocelular

Oviducto

1-200

10-30

Al azar

a) Daño físicodurantemicroinyección

b) Integraciónmuticopia

c) No se producerecombinaciónhomóloga

Infección retroviral

Retrovirusrecombinante o no

Infección tras removerla zona pelúcida

4-16 células

Útero

1

5-40

Normalmente al azar através de las LTRs

a) Bajo nivel deexpresión

Células ES

DNA clonado oretrovirus

Electroporación oinfección retroviral

ES Totipotentes

En el blastocisto y deaquí al útero

Varía según métodode introducir DNA

Hasta el 100

Depende del métodode introducir el DNA

a) Dificultad deconseguirbuenos cultivoscelulares

RESUMEN DE LARESUMEN DE LATRANSFERENCIATRANSFERENCIAGÉNICAGÉNICA

RESUMEN DE LARESUMEN DE LATRANSFERENCIATRANSFERENCIAGÉNICAGÉNICA

Colonias ESColonias ES Cultivos ESCultivos ES

QuimerasQuimeras

TRANSGENIZACIÓN POR CÉLULAS TRANSGENIZACIÓN POR CÉLULAS ESES