Tema 17 Reacciones multisustrato Reacciones enzimáticas con dos sustratos

1. Introducción

2. Nomenclatura

3. Reacción enzimáticas con 2 sustratos y 2 productos.

4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción: Ecuaciones con dos substratos

4.1. Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar. 4.2. Mecanismo Secuencial Bi Bi ordenado. 4.3.Mecanismo Bi BiPing-Pong

Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos de transformación enzimática de un sustrato en un único producto.

Sin embargo, en los sistemas biológicos, son casos excepcionales, restringidos a reacciones de isomerización.

Las reacciones enzimáticas que implican a más de un sustrato, transformándolos en varios productos son las más frecuentes.

1.Introducción

S + E <==> ES <==> EP <==> E + P

- Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas:

- Por ejemplo:

A + B P + Q

Adenilato ciclasa Citrato sintasa Alcohol-DH Malato-DH Ribitol-DH Lactato-DH Coenzima-A transferasa Glutamato-alanina transaminasa Glucosa oxidasa etc. ....

Estudio cinético:

A) Velocidad inicial

B) Depender la velocidad de la reacción de uno solo de los reactantes (Resto saturación).

Reacción orden cero con respecto todos los substratos menos uno

SK

SVv

``max

a) En cuanto al número de sustratos y productos:

Reacción Nombre

A -----> P Uni-UniA + B -----> P Bi-Uni

A + B + C -----> P + Q Ter-Bi

A + B -----> P + Q Bi-Bi

b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los productos:

* Reacciones secuenciales: - al azar - ordenadas

* Reacciones de desplazamiento: - Ping-Pong

2. Nomenclatura

De acuerdo con la simbología de Cleland, el progreso de la reacción se simboliza por una línea horizontal.

El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser bastante complicado a la hora de representar los esquemas de

las reacciones

A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero el que más éxito ha tenido ha sido el propuesto por Cleland.

La entrada de sustratos y la salida de productos se representan por flechas verticales que indican la dirección de entrada o

salida de la reacción.

- Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos

y se forman 2 productos:

E EEA E

A P

EB

B Q

E EEA EAB

A B

EQ

P Q

EPQ

Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong

Secuencial: Bi-Bi ordenada

¿Se atreve a nombrar los siguientes mecanismos?

E E

A B P QCa)

E E

A B C QPb) R

E E

A B CQPc) R

Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi:

A + B --- P + Q

-Mecanismos secuenciales

- al azar

- ordenadas

- Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento

3. Reacciones enzimáticas de dos sustratos y dos productos

A) Mecanismos secuenciales, Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se

libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo ternario EAB o EBA debe formarse como requisito

indispensable antes de que se produzca la formación de productos.

La formación del complejo ternario es independiente del orden de unión de los sustratos.

Este tipo de reacciónes se denominan reacciones secuenciales al azar,

La formación del complejo ternario debe producirse en un orden determinado para que el complejo sea productivo

desde el punto de vista catalítico.Este tipo de reacción se denomina

reacciones secuenciales ordenadas).

Analicemos, desde el punto de vista esquemático, estos dos tipos de reacciones secuenciales.

Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico:

E + A <=> EA

E + B <=> EB

EAB <=> EPQ

EQ <=> E + Q

EP <=> E + P

B

A

P

Q

Bi-Bi al azar

E + A <==> EA + B <==> EAB <=> EPQ <==> EQ + P <==> E + Q

Bi-Bi ordenado

Utilicemos ahora la simbología o nomenclatura de Cleland:

Bi-Bi al azar

E E

A B

EA

B A

EB

EAB

Q

QP

P

EP

EQ

EBA

EPQ

EQP

Bi-Bi ordenada

E EEA EAB

A B

EQ

P Q

EPQ

E EEA

A B

EQ

P Q

- Un caso especial, es el siguiente:

- Este mecanismo se conoce como “Mecanismo de Theorell-Chance”, y en realidad es un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB ni

EPQ

La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrámeroque contiene zinc en el centro activo y que cataliza la oxidación de etanol) por el coenzimanicotinamina adenina dinuclótido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido

B) Mecanismo “ping-pong” o de doble desplazamiento

E + A <=> EA <=> E + P +B <=> EB <=>EQ <==> E + Q

- Este tipo de mecanismo es muy común en las reacciones en las que un grupo químico se transfiere desde el sustrato A al B, es

decir en reacciones de transferencias.

En este tipo de mecanismo, tras la unión del primer sustrato se libera uno de los productos, en una reacción parcial en la que se

genera una forma modificada de la enzima. (acil enzimas, fosforil enzimas)

Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formación del segundo producto con regeneración de la forma nativa de la

enzima.

* Utilizando la simbología de Cleland, en el caso de reacciones Ping-Pong, tenemos:

E EEA E

A P

EB

B Q

Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong, o tetra-Uni Ping

Pong

¿De acuerdo con la nomenclatura de Cleland, cómo nombraría la siguiente reacción?

EE

Succ

inil

-CoA

HS

CoA

Pi Succ

inat

o

GD

P

GT

P

Succinil-E E-P

4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción:Ecuaciones con dos substratos

Las condiciones de partida para derivar la ecuación de velocidad con dos o más sustratos son las mismas que hemos utilizados para la derivación de la

ecuación de velocidad en un sistema sencillo: S --> P

a) Supondremos la formación de un equilibrio rápido:entre la E y los S

b) La ec. de conservación nos dice que (Eo) = al sumatorio de todas las especies químicas en las que pueda encontrarse la

enzima:

(Eo) = (EXi)

c) Supondremos la existencia de condiciones de estado estacionario

4.1 Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar.

B A

E + P+ Q

v = kcat [EAB=EBA]

EABEBEAEE

EBA

BEBK

EAB

BEAK

EB

BEK

EA

AEK

T

MM

BA

BAAB

AB

BA

M

M

B

A

K

K

K

K

A + B P +Q

E

A B

EA

EB

EAB kcat

KA

KB

KMAB

KMBA

EBA

KM es la concentración de Substrato en el cual v=1/2 Vmax cuando el otro substrato está saturante

E

A B

EA

EB

EAB

kcatKA

KB

KMAB

KMBA

EBA

AMBAT

T

AM

M

M

KKBA

EKB

EKA

EEE

EABEBEAEEKKBA

EEAB

KBEA

EAB

EABBEA

K

AB

AB

AB

AB

][

][

E + P+ Q

AB

MAKK

BAEkcatv

BAKBKAKK

BAEkcatv

BAABABMMMA

T

Ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar

v = kcat [EAB]

BAKBKAKK

BAEkcatv

BAABABMMMA

T

BAKBKAKK

BAVv

BAABABMMMA

max

Vmax = kcat [ET] Concentraciones saturante de A y B

ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar

BAKBKAKK

BAVv

BAABABMMMA

max

Constante [A]

AK

AKKK

AK

AVV

BA

AB

BA

M

AM

M

´

max´max

Un substrato constante pero no saturante

Ver anexo 1

BK

BVv

´´max

Igual se hace para [B] constante pero no saturante

BAKBKAKK

BAVv

BAABABMMMA

max

AK

AVv

´´max

BK

BKKK

BK

BVV

AB

BA

AB

M

BM

M

´

max´max

Constante [B]

[A]

Vmax

V`max

KMBA

AK

AVV

BAM

max´max

AK

AKKK

BA

AB

M

AM´

K`

[A]

KB

KMAB

Representación gráfica: Obtención de las constantes cinéticas

[A] =0

[B]

VmaxV`max

KMAB

BK

BVV

ABM

max´max

K`

[B]

KA

KMBA

BK

BKBKK

AB

BA

M

M´

AK

AVv

´´max

BK

BVv

´´max

[A] cte [B] cte

AK

AKKK

BK

BVV

BA

AB

BA

M

AM

M

´

max´max

[B] se hace muy grande, --> , condición de saturación

Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten

Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante

BAKBKAKK

BAVv

BAABABMMMA

max

AK

AVv

ABM

max

AB

AB

MM

KA

AKK

VB

BVV

´

maxmax

´max[B] Muy grande

[A] se hace muy grande, --> , condición de saturación

Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten

Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante

BAKBKAKK

BAVv

BAABABMMMA

max

BK

BVv

BAM

max

BA

BA

MM

KB

BKK

VA

AVV

´

maxmax

´max[A] Muy grande

BK

BKKK

AK

AVV

BA

AB

BA

M

AM

M

´

max´max

4.2. Mecanismo secuencial Bi-Bi ordenado

QPEEABBEAAE KA KmAB kcat

EABEAEE

EAB

BEAKm

EA

AEK

T

AB

A

v

BAKAKK

BAEkcatv

ABABMMA

T

V=kcat[EAB]

BAKAKK

BAVv

ABABMMA

max

Constante B

BAKAKK

BAVv

ABABMMA

max

BK

KKK

BK

BVV

AB

AB

AB

M

MA

M

`

max`max

Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B

[B]

Vmax

AK

AVv

``max

V`maxRegresión No-linear

Vmax

KMAB

K`

[B]

KA

Constante A

BAKAKK

BAVv

ABABMMA

max

BK

BVv

``max

AB

AB

MMA

KA

KKK

VV

`

max`max

K`KM

AB

[A]

Pendiente es igual: KA KAB

ORDEN DE UNÓN DE SUBSTRATOS EN UN MECANISMO BIBI ORDENADO:Cálculo de la Velocidad máxima haciendo constante un substrato: Una relación de substrato concentración idependiente frente a valor de Vmax indica que es el primer substrato que se une a la enzima

4.3. Mecanismo Bi Bi Ping-Pong

No hay complejo ternario

k1 k2 k3 k4 E +A EA P + E* + B E*B E + Q k -1 k-3

O con la nomenclatura de Cleland:

E EEA E*

A P

E*B

B Q

- Consideraremos velocidades iniciales unidireccionales.

KMA KM

B

k1 k2 k3 k4 E +A EA P + E* + B E*B E + Q

k -1 k-3 KMA KM

B

La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB

v = k4 [E*B]

BEEEAEE

BE

BE

k

kkK

EA

AE

k

kkK

T

BM

AM

**

´

*

3

43

1

21

Las constantes de Michaelis y el balance de masas en el estado estacionario

4kkcat

2

4

2

41

max

kk

BAAKBKkk

BAVv

BM

AM

Despejando [E*B]de las ecuaciones anteriores

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO BI BI PING PONG

2

4

42

4

k

k

kk

kkcat

BAAKBK

BAVv

BM

AM

maxPaso limitante

Constante B

BAAKBK

BAVv

BAABMM

max

BK

BKK

BK

BVV

B

A

B

M

M

M

`

max`max

Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B

[B]

Vmax

AK

AVv

``max

V`maxRegresión No-linear

Vmax

KMB

K`

[B]

KMB

KMA

KMB

Constante A

AK

AVv

``max

AK

AKK

AK

AVV

A

B

A

M

M

M

`

max`max

BAAKBK

BAVv

BAABMM

max

[B]

Vmax

V`max

K`

[B]

KMA

KMB

KMA

Regresión No-linear

Vmax

KMA

DIFERENCIACIÓN MECANISMOS

[B]

K` Ping-Pong

Ordenada

Al azar

K` Ping-Pong

Ordenada

Al azar

[A]

Mecanismo Enzima

Bi-Bi al azar Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3)

Creatin quinasa (EC 2.7.3.2)

Citrato sintasa (EC 4.1.3.7)

Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1)

Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37)

Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56)

Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27)

Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7)

Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2)

Glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)

Inhibición por productos

Diferentes tipos de inhibición por producto en las reacciones que transcurren con dos substratos y dos productos

Mecanismo Inhibidor SubstratoA (B saturante)

SubstratoB(A saturante)

Bi-Bi ordenado P Q

AcompetitivaCompetitiva

No competiva------------------

Ping Pong P Q

Competitiva-----------------

------------------Competitiva

Bi-Bi al azar P Q

No competitivaNo Competitiva

No competitivaNo competitiva

A + B --- P + Q

RESUMEN

Los conceptos utilizados para la obtención de datos cinéticos en reacciones monosubstratos ,son útiles para el estudio de las reacciones más complejas, con más de un substrato y más de un producto de reacción, si se hace depender la reacción de un solo reactante y los demás permanecen a concentraciones saturantes, es decir, la reacción será de orden cero con respecto a todos los reactantes menos uno.

En el caso de reacciones bisustratos puede distinguirse si la reacción tiene lugar mediante un complejo ternario, o si el enzima queda modificado al reaccionar con el primer substrato (mecanismo Ping Pong). En el caso de formación de un complejo ternario puede obtnerse al azar (mecanismo BiBi al azar) o de manera ordenada (mecanismo Bi-Bi ordenado).

Se han deducido la s ecuaciones de velocidad y la forma de obtener las constantes cinéticas que describen el proceso enzimático.

La inhibición por los productos P y Q puede servir para discriminar mecanismos probables de reacción.

En general la información cinética puede ayudarnos para comprender propiedades locales de las enzimas, necesarias parea entender el control de la actividad enzimática y el papel de una enzima en el proceso de metabolismo celular.

Anexo 1

BAKBKAKK

BAVv

BAABABMMMA

max

A constante

BAK

AKKB

AK

Vv

BAK

KAKKB

AK

Vv

AK

BAKKAKKB

AK

Vv

AK

BAKBKAKKB

AK

Vv

BAKBKAKK

BAVv

BA

ABBA

BA

ABABBA

BA

BAABABBA

BA

BAABABBA

BAABAB

M

AMM

M

MMAM

M

MMMAM

M

MMMAM

MMMA

)(max

max

)(max

max

max

AK

AKKK

AK

AVV

BA

AB

BA

M

AM

M

´

max´max

Se divide

BK

BVv

´´max

PROBLEMAS.

1. Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma

AX +B Bx + AFue investigada a temperatura, pH y concentración de enzima constante

dejando constante la concentración de B, y variando la concentración de substrato AX. Los resultados obtenidos.

INICIAL [AX] [B]=2.0mM 4.0 mM 6.0 mM

2.0 250 286 300

2.5 278 323 341

3.3 313 371 395

5.0 357 435 469

10.0 417 526 577

¿Qué tipo de mecanismo cursa esta reacción bisustrato?