Docente: Ing. Dr. EULER NAVARRO PINEDOTARAPOTO -2014 TECNOLOGIA DE LAS FERMENTACIONESTECNOLOGIA AGROALIMENTARIA II

INTRODUCCIN

La palabra fermentacin ha sufrido evoluciones en s misma. El trmino fue empleado para describir la condicin de burbujeo vista en la produccin del vino, antes de que las levaduras fueran descubiertas.

Sin embargo despus del descubrimiento de Pasteur, la palabra fue usada en relacin con la actividad microbiana y al final en las ltimas fechas de las enzimas. Corrientemente el trmino es usado an para describir la evolucin de bixido de carbono gaseoso durante la accin de clulas vivientes.

Hay una diferencia entre la fermentacin y la putrefaccin. La fermentacin es una accin sobre materiales de carbohidratos; la putrefaccin relaciona la accin general sobre los materiales proteicos.

La fermentacin es una de las biotecnologas aplicadas ms antiguas, se ha utilizado para conservar alimentos durante ms de seis mil aos. Es una tcnica de conservacin de alimentos barata y fcil, y muy adecuada donde otros mtodos son inaccesibles o no existen, como las conservas y la congelacin. La fermentacin es un proceso que ocupa mucha mano de obra y requiere una infraestructura mnima y poca energa, adems de que se integra bien en la vida de las aldeas de las zonas rurales de muchos pases en desarrollo. La fermentacin de alimentos bsicos es una fuente importante de nutricin para las poblaciones rurales numerosas, y contribuye significativamente a la seguridad alimentaria al aumentar la variedad de materias primas que se pueden utilizar para producir alimentos. Sin embargo, es necesario asegurar que el progreso econmico y cultural no desplace esta tcnica, y que el conocimiento bsico de su produccin no se pierda.

Es ms, hace falta conocer mejor los mtodos de fermentacin para mejorar la inocuidad, los rendimientos y la calidad de los productos alimentarios fermentados, y conviene sensibilizar a los consumidores sobre el provecho de consumir alimentos fermentados.

FERMENTACIONES INDUSTRIALESLa microbiologa industrial est dedicada a la utilizacin comercial de microorganismos e incluye procesos que tienen gran importancia econmica, ambiental y social.

Tradicionalmente se ha utilizado la palabra fermentacin en microbiologa industrial para describir los procesos de cultivo de microorganismos con propsitos industriales. Sin embargo, no hay que confundir esta utilizacin del trmino con el proceso bioqumico de fermentacin consistente en la regeneracin del poder reductor (NADH) por un procedimiento no oxidativo.

La fermentacin que tiene lugar en la produccin del vino, en este sentido, comprende ambos significados: por un lado, se trata bioqumicamente de un proceso de fermentacin (produccin de alcohol a partir de glucosa en condiciones anaerobias) y es una fermentacin industrial en el sentido de que se trata de un proceso industrial llevado a cabo por microorganismos.

El desarrollo de una fermentacin industrial incluye dos tipos de procesos denominados, por sus nombres en ingls, procesos UPSTREAM y procesos DOWNSTREAM.

Los procesos upstream comprenden la seleccin y preparacin del microorganismo, la preparacin del medio de cultivo y de las condiciones de fermentacin (cultivo). Los procesos downstream incluyen la purificacin del producto y el tratamiento de los residuos de la fermentacin.

En el proceso de fermentacin del mosto de uva para producir vino, podemos distinguir los procesos upstream de la seleccin y preparacin de cepas de levadura, tratamiento del mosto y acondicionamiento de las condiciones de fermentacin. Los procesos downstream comprenden, en este caso, el tratamiento del vino para su clarificacin y el de los residuos del proceso.

Los productos fabricados por fermentaciones industriales pueden agruparse grosso modo en dos clases: (1) los productos de gran volumen y bajo valor (en este grupo se incluyen los productos alimenticios, bebidas, aditivos alimentarios y algunos productos qumicos producidos por fermentacin) y,(2) los productos de bajo volumen y alto valor (los frmacos, por ejemplo).

Por otro lado, hay que sealar que tienen origen en fermentaciones industriales un gran nmero de productos de uso cotidiano que pertenecen a diferentes grupos:

alimentos (derivados lcteos y de vegetales fermentados), bebidas (vino, cerveza, etc.), aditivos alimentarios (vinagre, cido ctrico, carotenos, etc.).

(2) productos farmacuticos: antibiticos -lactmicos (penicilinas y cefalosporinas), antibiticos aminoglicsidos y tetraciclinas; compuestos antitumorales y otros frmacos (lovastatina, por ejemplo, utilizada para controlar la produccin de colesterol).(3) Enzimas microbianas tales como proteasas, amilasas, etc.

(4) Productos qumicos tales como alcoholes, polisacridos, disolventes (acetona), lpidos, productos base para la produccin de plsticos, etc. (5) Productos recombinantes diseados por ingeniera gentica.

Adems de estas utilidades, los microorganismos se usan industrialmente en ciertos procesos de microbiologa ambiental tales como el tratamiento de residuos slidos y lquidos y en biorremediacin.

Definicin Bioqumica.-

Es un proceso anaerbico en que se libera energa, sobre un sustrato orgnico.El cido pirvico es el producto intermedio y de all se pueden tener una serie de fermentaciones. Durante este proceso se ceden electrones que son captados por un aceptor orgnico.

Es un mtodo de conservacin para productos crnicos, lcteos, vegetales, etc., en la cual cambia las caractersticas de los productos como: color, textura y sabor.

Definicin Tecnolgica.-

Tcnica que se realiza por la accin controlada de microorganismos que transforman sustancias qumicas inestables (azcares) en otros estables (alcohol, cido) que previenen el desarrollo de microorganismos perjudiciales para los alimentos, producindose un efecto de prevencin de las mismas, y adems, hay cambios de textura, sabor y aroma. Actualmente se complementa con otros medios de conservacin (fro, pasteurizacin, envasado asptico, etc).

La primera explicacin bioqumica del proceso por el cual el azcar en solucin acuosa es descompuesto en alcohol y gas carbnico, en virtud de la accin de clulas vivas de levadura, la dio el qumico francs LOUIS PASTEUR, el cual vio que mientras descomponen el azcar en ausencia de aire, las clulas de levadura viven y se propagan en el lquido en fermentacin y llam al proceso de la fermentacin alcohlica `vida sin oxigeno'.

La explicacin de PASTEUR fue modificada por BUCHNER, quien demostr que poda realizarse la fermentacin en una solucin acuosa de azcar por el jugo obtenido prensando clulas muertas de levadura.

Observ, entonces, que el jugo filtrado de clulas de levadura que haban sido molidas con arena contena una sustancia eficaz para descomponer los azcares, y a esta sustancia activa o mezcla catalizadora le dio el nombre de fermento, enzima o zimasa.

De acuerdo con la interpretacin bioqumica hecha por PASTEUR, la fermentacin se conoce como la desasimilacin anaerbica de compuestos orgnicos por la accin de microorganismos u otras clulas o de extractos celulares; adems, es un conjunto de reacciones bioqumicas a travs de las cuales una sustancia orgnica se transforma en otras por accin de ciertos microorganismos (bacilos, bacterias, clulas de levadura), que en general van acompaadas de un desprendimiento gaseoso y de un efecto calorfico.Se conocen centenares de especies de levaduras, bacterias y mohos que producen alcohol, pero slo dos o tres especies de levadura se aplican industrialmente en la produccin de alcohol; su rapidez en la fermentacin, su tolerancia de concentraciones elevadas de azcar y alcohol y su rendimiento elevado de alcohol, hacen que se usen ms que las otras.

Algunos microorganismos ofrecen ms de una aplicacin industrial. Las levaduras, por ejemplo, producen alcohol y glicerol partiendo de azcares, hacen subir la masa en la fabricacin del pan y son una fuente de protenas, vitaminas y enzimas.

Ventajas

Se usan condiciones moderadas de pH y T, que mejoran las caractersticas de calidad, generalmente se mantienen las condiciones nutricionales del alimento (Vit).No se usan T drsticas, como el producto es cido se requiere bajar temperaturas, el valor nutricional se altera menos, las sustancias voltiles, tambin se reduce menos.Se producen aromas, que a veces no son logrados por otros procedimientos.Es un proceso de conservacin que hace producir un nivel bajo de energa.Costos de produccin bajo, la infraestructura no es cara. Antiguamente se realizaban con microorganismos nativos, ahora se trabaja con las enzimas, mediante inmovilizacin.Es un proceso simple.Las ms usadas son las lcticas y alcohlicos.

Los microorganismos se dividen en:

Homofermentativos y HeterofermentativosLos microorganismos que producen un solo producto como resultado de la fermentacin son los Homofermentativos, y los que producen ms de una sustancia se llaman Heterofermentativos.

Desde el punto de vista comercial, en la conservacin de alimentos los ms importantes son los lcticos y etanlicos a partir de H. de C.Entre las bacterias lcticas tenemos los siguientes:

Homofermentativos (cido lctico principalmente)StreptococcusPediococcusLactobacillus (algunos)

Heterofermentativos (cido lctico, CO2, etanol y cido actico) a. Leuconoctoc b. Algunos Lactobacillus (brevis y bifidus)

Fermentacin Lctica Homofermentativa

C6H12O6 + 2ADP + 2PiCH3CHOH COOH + 2ATP + Trazas de otros Glucosa Ac. Lctico productos voltiles o cidosFermentacin Lctica Heterofermentativa

Con formacin de CO2 Leuconostoc mesenteroidesC6H12O6+1ADP+1Pi CH3CHOHCOOH + CH3-CH2OH + CO2 + 1ATPGlucosa c. Lctico Etanol energa

b) Lactobacillus brevis

C6H12O6 + 2ADP+2Pi CH3-CHOH-COOH + CH3-COOH + CO2 + 2ATPGlucosa c. Lctico c. Actico

Sin formacin de CO2 2C6H12O6 + 5ADP + 5Pi 2CH3CHOHCOOH + 3CH3-COOH + 5ATP Glucosa Ac. Lctico c. Actico Produce ms energa

TIPOS DE FERMENTACIN DE AZCAR.

Los microorganismos son usados para fermentar azcar por oxidacin completa, oxidacin parcial, fermentacin alcohlica, fermentacin de cido lctico, fermentacin butrica y otras acciones fermentadoras menores.Las bacterias y los mohos son capaces de convertir el azcar (glucosa) a CO2 y agua. La fermentacin ms comn es aquella en que ocurre una oxidacin parcial del azcar. En este caso el azcar puede ser convertido en cido. Finalmente el cido puede ser oxidado para dar CO2 y agua, si se permite que ocurra. Por ejemplo, algunos mohos son usados en la produccin de cido ctrico de soluciones de azcar.

Las levaduras son convertidores de aldehdos a alcoholes ms eficientes. Muchas especies de bacterias, levaduras y mohos son capaces de producir alcohol. La levadura Saccharomyces ellipsosoideus, es de gran importancia industrial en las fermentaciones alcohlicas.

Las fermentaciones butricas son menos tiles en la conservacin de alimentos. Los microorganismos son anaerbios e imparten sabores y olores indeseables a los alimentos. La gran mayora de los microorganismos anaerbios nocivos para el ser humano son fermentadores butricos.

CINETICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una fermentacin.

Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el costo que ello supone, puesto que no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc.

Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico.

El tiempo que tarda una clula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generacin y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones ptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

Si llamamos No al nmero de clulas inicial, y g al nmero de generaciones transcurridas, el nmero de clulas final (N) ser:Llamando T al tiempo de generacin y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuacin anterior puede transformarse en la siguiente:Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello es mejor transformarlas en algo ms simple, como puede ser una recta.

Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos trminos y resulta:

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generacin T es muy grande, el crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si T es pequeo el crecimiento ser rpido.

En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento evolucionan en paralelo. Esto es: el incremento en el nmero de clulas, en la biomasa de cultivo y en la acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto, en la ecuacin anterior N puede representar cualquiera de estos factores.

Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que describe la cintica es la siguiente:

esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo as como la probabilidad de que una clula se divida en un tiempo determinado.

Integrando la ecuacin anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente funcin exponencial:la transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta ecuacin con la similar presentada ms arriba, podemos concluir que = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin.

Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero de clulas, biomasa, etc.El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relacin de proporcionalidad puede expresarse de la forma siguiente:

donde dS indica la variacin de la concentracin del substrato. Al valor Ys lo denominamos rendimiento de utilizacin del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de substrato consumido:El rendimiento de utilizacin de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan" ms que otros), vara entre diferentes microorganismos (en un smil antropomrfico: hay personas que engordan ms que otras comiendo lo mismo) y vara tambin en funcin de otras condiciones ambientales o fisiolgicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si est sano o enfermo o si est en verano o en invierno). Tambin vara el rendimiento en funcin de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo.

Podemos calcular el rendimiento de la utilizacin del substrato en funcin de la cantidad de substrato aadido al cultivo, o en funcin de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo).

Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa (total gramos de clulas, por ejemplo) o de carbono presente en las clulas (aproximadamente el 50% de la masa celular corresponde a carbono).Haciendo las transformaciones que se indican a la derecha sobre la frmula que relaciona la variacin de biomasa con la de substrato, llegamos a la definicin de un nuevo concepto qs denominado tasa especfica de consumo de substrato por el organismo.

La tasa especfica de consumo de substrato la podemos considerar como la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato.

Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor ser la velocidad de crecimiento (). Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, tambin mayor ser la tasa de crecimiento.Sin embargo, hay una cierta compensacin entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento ms bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye).

A esta correlacin inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur. Por ltimo, nos falta relacionar la tasa de crecimiento () con la concentracin de substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentracin de este no afecta al valor de ; pero cuando el substrato se hace limitante, s existe ese efecto. La expresin matemtica que relaciona ambos parmetros se conoce con el nombre de ecuacin de MONOD y es la siguiente:

En esta ecuacin la tasa de crecimiento () depende de la mxima que puede alcanzar el microorganismo, de la concentracin de substrato y de un valor Ks que representa la concentracin de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la mxima.

La ecuacin de MONOD tendr mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuacin el rendimiento debe ser independiente de la concentracin de substrato.

FASES DEL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le denomina cultivo batch y podramos traducirlo por cultivo discontinuo por contraposicin con el cultivo continuo que desarrollaremos ms adelante.

El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura:

Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo:

(1) la fase lag en la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metablica para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es variable y en general es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuya cintica explicamos en la pgina anterior.

(3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sino que la aparicin de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros.

(4) La fase de muerte en la que el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias.

En la fase de muerte decimos que el nmero de microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero qu es un microorganismo vivo en trminos microbiolgicos?. Consideramos vivo al microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto porque los microorganismos microbiolgicamente muertos no tienen porqu estar metablicamente inactivos.

FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS Qu factores ambientales influyen en el crecimiento microbiano?. Temperatura

Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuado. Si consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento (m) en funcin de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura ptima a la que m es mxima (para las condiciones de concentracin de substrato en que se trabaja. Por encima de esta temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente ( 0) y se produce la muerte celular.

pH:

Este es un factor importante en la fermentacin, debido a su importancia en el control de la contaminacin bacterial como tambin al efecto en el crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentacin y en la formacin de alcohol. Durante la fermentacin la levadura toma el nitrgeno de los aminocidos orgnicos, perdiendo su carcter anftero y pasando a cidos, lo cual origina una disminucin del pH del medio.

Cuanto ms bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infeccin, pero si se trabaja con pH muy bajos la fermentacin es muy lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente. Segn estudios se hall que el pH ms favorable para el crecimiento de la saccharomyces cerevisiae se encuentra entre 4.4 - 5.0, con un pH de 4.5 para su crecimiento ptimo.

Concentracin de nutrientes:

La presencia de sustancias nutritivas adecuadas es una condicin necesaria para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo su concentracin un factor primordial en la actividad vital de la levadura. Las principales sustancias nutritivas y las ms influyentes son el nitrgeno, fsforo, azufre, vitaminas y trazas de algunos elementos.

Aireacin:

El aire es un factor decisivo en toda fermentacin, ya que su presencia hace ms vigoroso el crecimiento de la levadura.

EL FERMENTADOR

DEFINICION OPERATIVA:Contenedor en el que se mantiene un medio ambiente favorable para la operacin de un proceso biolgico deseado.

En cuanto al biorreactor:

Para cada proceso biotecnolgico, el sistema de contencin ms apropiado debe disearse para brindar el mejor medio ambiente, optimizado para el crecimiento celular y actividad metablica.

Equipos accesorios.Vlvulas de seguridadManmetrosVlvulas de controlTuberasControl de temperaturaControl de pHControl de espumasPuntos de muestreo

El medio ambiente puede considerarse en tres aspectos:BIOLOGICOQUIMICOFISICO

Fermentacin Para el cultivo de microorganismos en condiciones ptimas, as como para la produccin por microorganismos de los metabolitos o las enzimas deseados deben ser desarrollados procedimientos de fermentacin

Tipos de fermentadores Air lift: al medio del cultivo se le inyecta aire para ser agitado, el cual tambin sirve como fuente de oxigeno para el crecimiento microbiano. Tanque agitado: el medio de cultivo es movido interior por medios mecnicos. Columna de aire

La agitacin es necesaria para:1- incrementar la velocidad de transferencia de oxgeno desde las burbujas de aire al medio lquido; los microorganismos no pueden utilizar oxgeno gaseoso, sino solamente el que se encuentra en disolucin..Sistemas de aireacin y agitacin

2- aumentar la velocidad de transferencia de oxgeno y nutrientes desde el medio a las clulas. Debido al movimiento se evita que las clulas creen reas estancadas con bajos niveles de oxgeno y nutrientes.3- impedir la formacin de agregados celulares.4- aumentar la velocidad de transferencia de productos metablicos de las clulas al medio.5- aumentar la tasa o la eficiencia de la transferencia de calor entre el medio y las superficies de refrigeracin del fermentador.

PREGUNTAS

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