Tecnicas instrumentos y_modelos_par_el_estudio_de_la_biologia_celular

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UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL LISANDRO ALVARADO SISTEMA DE EDUCACION A DISTANCIA DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD CURSO PREUNIVERSITARIO NIVELES DE ORGANIZACION BIOTICOS CURSO PREUNIVERSITARIO DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD.

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Barquisimeto, Febrero 2011

UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTALLISANDRO ALVARADO

SISTEMA DE EDUCACION A DISTANCIADECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD

CURSO PREUNIVERSITARIO

NIVELES DE ORGANIZACION BIOTICOS

CURSO PREUNIVERSITARIO

DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD.

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Dra. Aura ChavezDra. María Elena olivares

UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTALLISANDRO ALVARADO

SISTEMA DE EDUCACION A DISTANCIADECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD

CURSO PREUNIVERSITARIO

UNIDAD I2da. PARTE

TÉCNICAS, INSTRUMENTOS Y MODELOS PARA EL ESTUDIO DE LA

BIOLOGÍA CELULAR

CURSO PREUNIVERSITARIO

DECANATO DE CIENCIAS DE LA SALUD.

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Niveles de organización bióticos

TABLA DE CONTENIDOS

Página

Introducción……………………………………………………………….. 4

Objetivo terminal…………………………………………………………... 4

Objetivos específicos………………………………………………………. 4

Técnicas, instrumentos y modelos para el estudio de la biología celular…... 6

Cultivos celular………………………………………………………… 6Impacto de la Utilización de las Células como Modelos Experimentales en los Avances Científicos Aplicables a la Morfofisiología de Células Normales…………………………………………………………………….

13

Actividad Control 5………………………………………………………… 19

Técnicas e Instrumentos de estudio………………………………………… 20

Microscopio óptico…………………………………………………….. 20

Sistema óptico………………………………………………………. 21

Sistema mecánico…………………………………………………… 21

Formación de la imagen…………………………………………….. 24

Actividad Control 6……………………………………………………….. 27

Curso preuniversitario. Biología Celular. Niveles de Organización, 2010. Chávez, A. y Olivares M.

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Niveles de organización bióticos

INTRODUCCION

Como en toda ciencia, la Biología Celular y Molecular cuenta con modelos,

técnicas e instrumentos de investigación, que a lo largo de muchas décadas de trabajo,

han permitido construir el conocimiento y por tanto el avance de la Biología en

general, y de la Medicina en particular. A través del tiempo, los avances tecnológicos

de los recursos utilizados, han permitido el perfeccionamiento de las diferentes

técnicas e instrumentos de trabajo, así como la utilización de modelos biológicos más

apropiados para el estudio de los fenómenos biológicos.

Hoy por hoy, el impacto de los aportes de la Biología Celular al mundo

científico, justifican las grandes cantidades de tiempo, dinero y trabajo que se

invierten en ésta ciencia.

En la sección que se desarrolla a continuación se esbozan puntos fundamentales

sobre las técnicas, instrumentos y modelos biológicos utilizados con mayor

frecuencia en el estudio de los fenómenos biológicos, enfatizando en su aplicabilidad

y la calidad de los resultados obtenidos a partir de ellos.

OBJETIVOSOBJETIVO GENERAL

Analizar la importancia de las técnicas, Instrumentos y Modelos utilizados en el

estudio de la Biología Celular.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS1. Comprender las ventajas de la aplicación de la técnica de cultivo celular.

2. Describir los pasos a seguir durante la técnica de cultivo celular.

3. Analizar la importancia de la utilización de modelos experimentales en el

estudio de la Biología Celular.

4. Analizar los principios físicos que rigen el funcionamiento del Microscopio

óptico.

5. Analizar la importancia de la utilización de la Microscopía óptica en el

estudio de la Biología Celular.

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CONTENIDOS

Página

Técnicas, instrumentos y modelos para el estudio de la biología celular…... 6

Cultivos celular………………………………………………………… 6Impacto de la Utilización de las Células como Modelos Experimentales en los Avances Científicos Aplicables a la Morfofisiología de Células Normales…………………………………………………………………….

13

Modelos Biológicos………………………………………………………… 13

Modelos Experimentales…………………………………………………… 14

Bacteria; Echerichia coli……………………………………………..... 14

Levadura: Saccharomyces cerevisiae…………………………………. 14

Nematodo; Caenorhabditis elegans…………………………………… 14

La mosca de la fruta; Drosophila melanogaster………………………. 15

La planta: Arabidopsis thaliana……………………………………….. 15

Los vertebrados……………………………………………………….. 16

La rana Xenopus laevis………………………………………….. 16

El pez Cebra……………………………………………………… 17

Los roedores……………………………………………………… 18

Actividad Control 5………………………………………………………… 19

Técnicas e Instrumentos de Estudio……………………………………….. 20

Microscopio óptico…………………………………….………………. 20

Sistema óptico…………………………………………………………. 21

Sistema mecánico……….……………………………………………… 21

Formación de la imagen…………………………………………….….. 24

Actividad Control 6……………………………………………………….. 27

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Cultivo Celular

La técnica de cultivo celular, que

hace referencia a cómo cultivar células

fuera de un organismo es una de las

aproximaciones más útiles en el

estudio de la Biología Celular y

Molecular. En su mayoría, las

investigaciones realizadas actualmente

se llevan a cabo en células cultivadas

con la finalidad de determinar la

localización intracelular de una

molécula, el efecto de ciertas drogas o

fármacos, y las vías de señalización

celular, entre otros tópicos de interés.

El cultivo de células de

mamíferos es mucho más exigente que

el cultivo de bacterias o de levaduras

por las condiciones de trabajo que se

requieren; no obstante, existe una

gama tanto de células animales como

vegetales que son cultivadas y

manipuladas en los diversos

laboratorios de investigación a nivel

mundial. A diferencia de las bacterias,

la mayoría de las células obtenidas de

tejidos no están adaptadas para vivir en

suspensión, y requieren una superficie

sólida en la cual crecer y dividirse.

Para los cultivos celulares, este soporte

está generalmente provisto por la

superficie de una placa de cultivo

plástica (Figura 1).

Figura 1. Técnica de Cultivo celular.http://blog.kossodo.com/category/novedades/\

Los sistema de cultivo celular in

vitro han permitido estudiar el

crecimiento y diferenciación celular y

el efecto de manipulaciones genéticas

necesarias para la comprensión de la

estructura y función de los genes.

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El cultivo celular tiene su razón

de ser en el hecho de que muchas

células cultivadas se pueden obtener en

grandes cantidades, casi todos los

cultivos contienen generalmente un

tipo celular. Diversas actividades

celulares como la endocitosis, el

movimiento celular, la división

celular, el tráfico de membranas y la

síntesis de macromoléculas, pueden

ser estudiadas en un cultivo celular. Se

puede inducir la diferenciación de las

células en cultivo así como también se

les puede aplicar tratamientos con

fármacos, hormonas, factores de

crecimiento o cualquier otro agente

que se desee estudiar.

En las primeras células

cultivadas los medios de cultivo

utilizados no eran conocidos

detalladamente en cuanto a su

composición química. Se descubrió

que las células necesitaban nutrientes

variables, hormonas, factores de

crecimiento y cofactores para poder

mantenerse sanas y crecer.

En la actualidad, en una

infinidad de laboratorios se sigue

añadiendo suero a los medios de

cultivo puesto que allí se encuentran

los factores de crecimiento, que actúan

como reguladores del crecimiento y

diferenciación celular. El medio de

cultivo que se utiliza para las células

animales es mucho más complejo en

cuanto a nutrientes, que el medio

mínimo utilizado para el crecimiento

de bacterias (Figura 2) y levaduras.

Figura 2. Medios de cultivo para levaduras y bacterias.http://www3.unileon.es/personal/wwdbvcac/images/Micorrizas_Lab/InoculoSustratoLiquido.jpg

En la figura 3, se observan

frascos de cultivo en una incubadora,

que mantiene parámetros constantes de

temperatura (37oC), CO2 (5%), y

humedad (70%) (Figura 3).

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Figura 3. Cultivos celulares mantenidos en incubadora.http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/2/images/cultivo.jpg

En 1955, se obtuvo un gran

avance en el cultivo de células

animales cuando Harry Eagle describió

el primer medio de cultivo con una

composición química bien definida.

Este medio se compone de sales,

glucosa, aminoácidos y vitaminas

(Figuras 4, 5 y 6).

Figura 4. Medio de cultivo en frasco de cultivo.http://www.trensa.com/cedivet/

Figura 5. Medio de cultivo en cápsula de petri.

Figura 6. Medio de cultivo en placa de 96 pozos.http://www.innoprot.com/documentos/fotos/productos/200872917130_es__Placa.jpg

En la actualidad, se ha tratado de

desarrollar medios de cultivo celular

libres de suero, es decir, medios

“artificiales” que carezcan de líquidos

naturales. Obviamente, la composición

de esos medios químicos es

relativamente compleja puesto que

requiere la adición de nutrientes,

vitaminas y proteínas purificadas que

incluyan factor de crecimiento

epidérmico entre otros componentes.

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Dada la riqueza en nutrientes, los

medios de cultivo celular constituyen

un excelente hábitat para el

crecimiento de microorganismos; por

ésta razón, cuando se lleva a cabo el

cultivo de células deben mantenerse

estrictas condiciones de esterilidad en

el espacio de trabajo.

Estas condiciones requieren el

uso de guantes estériles y la

esterilización de todos los equipos y

suministros, la utilización de

antibióticos a baja concentración y la

realización de toda la rutina de cultivo

celular bajo una campana de flujo

laminar estéril (Figura 7).

El primer paso del cultivo celular

consiste en obtener las células

adecuadas para el estudio a realizar, las

cuales, se denominan cultivos

primarios o cultivos secundarios según

sea el origen de las células trabajadas.

La Figura 8, muestra un esquema de

los pasos efectuados en la obtención de

cultivos primarios y secundarios.

Figura 7. Sala de cultivo celular.http://www.diariomedico.com/especiales/mejoresideas2009/img/investigacion/investigacion08.jpg

.

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Figura 8. Esquematización de las fases necesarias para la obtención de cultivos primarios y secundarios.http://biologiacelularb.com.ar/joomlaespanol/images/diagramas/u3moinvert.jpg

Los cultivos iniciales de células

establecidos a partir de un tejido se

conocen como cultivos primarios . En

los cultivos primarios las células

crecen hasta cubrir la superficie de la

placa de cultivo (formación de

monocapa). Posteriormente, las células

pueden ser retiradas de la placa y

sembrar nuevas placas a baja

densidad celular (cantidad mínima de

células) para formar cultivos

secundarios. Este proceso puede ser

repetido muchas veces, aunque la

mayor parte de las células normales,

no crecen en cultivo en forma

indefinida. Por ejemplo, los

fibroblastos humanos normales solo se

duplican entre 50 y 100 veces antes de

su envejecimiento y muerte; contrario

a esto, las células tumorales en cultivo

proliferan en forma indefinida y se

conocen como líneas celulares

inmortales. Actualmente, existe un

número importante de líneas celulares

inmortalizadas de roedores

procedentes de cultivos de fibroblastos

normales, esas líneas celulares han

sido de gran utilidad experimental

(Figura 9).

La frecuencia con que una célula

normal cultivada se transforma

espontáneamente en una línea celular

depende del organismo de donde

proviene. En el caso de las células de

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ratón, éstas se transforman con una

frecuencia relativamente alta, mientras

que las células humanas raramente se

transforman.

Las líneas celulares humanas

generalmente provienen de tumores, de

células infectadas con virus o de

células tratadas con sustancias

cancerígenas. La primera línea humana

de células inmortalizadas fue obtenida

por el investigador George Gey a partir

del cultivo de una muestra de tejido,

obtenida del tumor cancerígeno del

cuello del útero de Henrietta Lacks

quien murió el 4 de octubre de 1951.

El Dr. Gey llamó a éstas células recién

establecidas “células HeLa”, que desde

entonces son cultivadas en la mayoría

de los laboratorios de investigación del

mundo (Figura 10).

A partir de trabajos realizados

con células HeLa se encontró la

vacuna contra la poliomielitis y se

continúa estudiando en ellas la

leucemia, efectos de drogas y estudios

genéticos entre muchos otros. Por

supuesto, en el mundo existen otras

líneas celulares inmortalizadas no sólo

humanas sino de otras especies que

han permitido la realización de grandes

avances tanto en la Biología Celular

como en la Medicina.

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Figura 9. Observación de cultivos celulares con el microscopio óptico invertido.http://biologiacelularb.com.ar/joomlaespanol/images/diagramas/u3moinvert.jpg

Figura 10. Células HeLa en cultivo. Se observa el núcleo en azul.http://www.tipete.com/userpost/topics/hela-c%C3%A9lulas-humanas-inmortales

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Impacto de la Utilización de las Células como Modelos Experimentales en los Avances Científicos Aplicables a la Morfofisiología de Células Normales

El hecho que todas las células

contienen propiedades fundamentales

conservadas, permite que los

principios básicos deducidos

experimentalmente a partir de un tipo

celular, puedan ser generalizados a

otras células. En éste aspecto también

es necesario considerar que muchos

experimentos son más fáciles de

realizar en un tipo celular que en otro.

Por otra parte, la disponibilidad

de la secuencia del genoma completo

hace de algunos organismos

herramientas de gran utilidad como

modelos biológicos para el análisis y

comprensión de los mecanismos

moleculares que se desarrollan en las

células.

El modelo experimental se

define como cualquier sistema, lógico,

físico o biológico capaz de simular

total o parcialmente el proceso que se

pretende estudiar. Los modelos

experimentales, pueden ser de

diferente naturaleza: modelos

matemáticos (simulación por

ordenador), modelos físicos o

mecánicos, los modelos biológicos

(células, tejidos órganos aislados y

animales completos) y, el ser humano

como sujeto experimental.

La calidad de la información que

se puede obtener de un modelo guarda

relación directa con su complejidad.

La resolución de un determinado

problema, puede requerir la utilización

de varios modelos, comenzando por

los más sencillos, hasta los más

complicados, como son el animal de

experimentación o incluso el hombre.

La utilización de material

biológico implica la incorporación de

fenómenos homeostáticos propios,

cuyos efectos pueden ser difíciles de

controlar y predecir. Además, la

variabilidad intrínseca del material

biológico es otro factor a tener en

cuenta.

La utilización de material

biológico bien sea de animales o del

ser humano tiene además

implicaciones de orden ético, moral y

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legal que habrá que tener en cuenta a

la hora de planificar experimentos con

estos modelos.

Desde hace varias décadas han

sido utilizados diferentes organismos

como modelos experimentales que

han permitido una mejor comprensión

de la Biología molecular de las células,

entre los cuales se puede mencionar

Echerichia coli, levaduras,

Caenorhabditis elegans, Drosophila

melanogaster, Arabidopsis thaliana y

vertebrados.

La bacteria Echerichia coli ha

sido un modelo biológico de gran

utilidad por ser un organismo sencillo:

ha permitido estudiar y dilucidar

mecanismos básicos de la genética

molecular. Los conceptos actuales de

biología molecular, sobre la

replicación del ADN, el código

genético, la expresión génica y la

síntesis de proteínas fueron

esclarecidos en estudios sobre E. coli.

Su pequeño genoma, de

aproximadamente 4.300 genes, ha

proporcionado múltiples ventajas para

el análisis genético.

Las levaduras que son los

eucariotas más simples han sido un

modelo excepcionalmente útil para el

estudio de los mecanismos

subyacentes al funcionamiento de las

células eucariotas. La levadura más

utilizada en investigación,

Saccharomyces cerevisiae, contiene

aproximadamente 6.000 genes.

Aunque posee un genoma

relativamente simple exhibe las

características típicas de las células

eucariotas. Las levaduras se cultivan

con facilidad bajo las condiciones de

laboratorio, se dividen cada 2 horas y

dan origen a colonias a partir de una

sola célula: además, se pueden

manipular genéticamente con

facilidad. Los estudios realizados en

levaduras han permitido comprender

procesos esenciales de las células

eucariotas tales como la replicación

del ADN, transcripción, procesamiento

del ARN, ensamblaje de proteínas y

regulación de la división celular.

El estudio de las características

del nematodo Caenorhabditis elegans

ha permitido la comprensión del

desarrollo animal y diferenciación

celular. Desde un punto de vista

biológico, Caenorhabditis elegans

ofrece ventajas para los trabajos de

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investigación. En primer lugar su

genoma está compuesto por 19.000

genes, lo que resulta un organismo

multicelular sencillo; además, se

reproduce con facilidad y es

genéticamente manipulable en el

laboratorio (Figura 11).

Figura 11. Caenorhabditis elegans.http://www.andaluciainvestiga.com/sgcArchivos/CTS/grandes/c.jpg?p=0,913475

En los estudios genéticos que se

han realizado en C. elegans se han

identificado genes responsables de

anormalidades del desarrollo y

diferenciación del nematodo. En tal

sentido, es importante señalar que se

han encontrado genes que controlan de

manera similar el desarrollo en seres

humanos y otros animales complejos.|

La mosca de la fruta Drosophila

melanogaster ha sido un modelo

biológico de gran trascendencia para la

Biología del Desarrollo. Su genoma

está constituido de 14.000 genes y su

corto ciclo de reproducción de

solamente 2 semanas, la convierte en

un organismo de gran utilidad para los

estudios genéticos.

Muchas de los conceptos

fundamentales de la genética, como la

relación entre genes y cromosomas, se

han obtenidos de los estudios

realizados en Drosophila a comienzos

del siglo veinte. En tal sentido, los

hallazgos encontrados, han permitido

entender los mecanismos moleculares

implicados en el desarrollo animal:

específicamente, en lo relacionado con

el cuerpo de los organismos

multicelulares.

La Arabidopsis thaliana ha sido

la planta modelo para el estudio de la

Biología Molecular. Esta planta posee

aproximadamente 15.000 genes y el

análisis de estos genes ha permitido

identificar aquellos implicados en el

desarrollo vegetal, así como las

similitudes y diferencias entre los

mecanismos que controlan el

desarrollo de vegetales y animales

(Figura 12).

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Figura 12. Arabidopsis thaliana.http://francisthemulenews.files.wordpress.com/2010/01/dibujo20100101_arabidopsis_thaliana_genome_and_photos_from_max_planck_institute_for_developmental_biology.jpg

Los vertebrados constituyen los

animales más complejos; en éste

grupo, se incluyen los seres humanos y

los demás mamíferos. El genoma

humano contiene entre 20.000 y

25.0000 genes; por esto, los seres

humanos representan organismos muy

complejos para el estudio de la

Biología Celular y Molecular. El

estudio de los seres humanos ha

despertado el interés de los Biólogos

dada la necesidad de entender los

mecanismos que le permiten funcionar

como entes individuales, además estos

descubrimientos son fundamentales

para la práctica médica.

Los estudios realizados in vitro

en células de mamíferos en cultivo han

permitido dilucidar los mecanismos

moleculares subyacentes en la

replicación del ADN, la expresión

génica, la síntesis y procesamiento de

proteínas, la señalización, el

crecimiento y la división celular. Los

experimentos realizados en células

especializadas tales como las

musculares, han sido de particular

valor para el estudio de la contracción,

producción de fuerza y movimiento a

nivel molecular. Los experimentos

realizados en neuronas, células

especializadas en la conducción de

señales electroquímicas, han permitido

caracterizar aspectos importantes del

transporte de iones a través de la

membrana y el rol del citoesqueleto en

el transporte de organelas.

La rana Xenopus laevis, ha sido

ampliamente utilizada en estudios del

desarrollo temprano de vertebrados,

porque las características de sus

huevos facilita los análisis bioquímicos

(Figura 13).

Figura 13. Rana Xenopus laevishttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=glyco2&part=ch25

Los huevos de xenopus son

células grandes con un diámetro

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aproximado de 1 mm.: además, se

desarrollan fuera de la madre, lo que

permite que todas las etapas del

desarrollo desde el huevo hasta el

renacuajo puedan ser estudiadas en el

laboratorio. Otro factor importante es

que los huevos de Xenopus se pueden

obtener en grandes cantidades lo que

facilita la realización de análisis

bioquímicos.

Todas estas ventajas que

proporciona Xenopus laevis como

modelo biológico, basadas en el ciclo

de desarrollo de los huevos, ha

permitido realizar grandes avances en

los mecanismos que controlan los

procesos de división celular,

desarrollo y diferenciación del

embrión.

Otro modelo biológico de

relevancia es el pez cebra que promete

ser un puente entre los humanos y los

sistemas invertebrados más simples.

Este ejemplar, se ha convertido en un

modelo inigualable para investigar

diferentes procesos biológicos. Sus

cualidades genéticas y embrionarias se

aprovechan para buscar nuevos

medicamentos que permitan controlar

enfermedades devastadoras, como el

cáncer y Parkinson. La importancia

del pez cebra como modelo biológico

radica en que es un pez pequeño y es

fácil de manipular en el laboratorio,

Además, se reproduce rapidamente, los

embriones se desarrollan fuera de la

madre y son transparentes, hecho éste

que permite que las primeras etapas

del desarrollo puedan ser claramente

observadas (figura 14).

Figura 14. Pez cebra.

http://www.cmrb.eu/media/upload/gif/ori_Foto_noticies_home_45.jpg

Los roedores, son entes

biológicos en los que mediante

ingeniería genética se han introducido

mutaciones germinales específicas que

han permitido estudiar sus efectos en

el desarrollo o función celular dentro

del contexto del animal completo.

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En síntesis, se puede decir que

los modelos biológicos hasta ahora

utilizados han permitido adquirir un

gran avance en el análisis y

comprensión de los mecanismos

moleculares que rigen la biología

celular y molecular. En tal sentido, los

avances hasta ahora alcanzados, se

basan principalmente en la

comprensión de los niveles de

complejidad que subyacen entre las

células procariotas y eucariotas.

ACTIVIDAD CONTROL 5:

1.- Tomando en consideración el contenido del texto hasta aquí expuesto, responda las siguientes preguntas:

a. Defina brevemente cultivos celulares, su finalidad y las actividades celulares que pueden estudiarse a través de los mismos.

b. Explique brevemente por qué en los sitios donde se realizan cultivos celulares, deben mantenerse condiciones de esterilidad y nombre algunos de los requerimientos necesarios para lograr estas condiciones.

c. Explique la diferencia entre cultivos celulares primarios y secundarios.d. Qué son las líneas celulares inmortales e indique si sólo con este tipo de

células pueden realizarse cultivos celulares.e. Cuál es la característica fundamental que debe tener un organismo para

ser considerado un modelo biológico.f. Defina modelo experimental y nombre algunos de ellos.

2.- Rellene los espacios vacíos de la tabla que se le muestra a continuación:MODELOS EXPERIMENTALES

OrganismoModelos

experimentalesTamaño ADN Hallazgos

Bacterias

Levaduras

Nemátodo

Mosca

Planta

Vertebrados NO APLICA

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Técnicas e Instrumentos de Estudio.

Microscopio Óptico

En vista de las dimensiones tan

pequeñas de los objetos que estudia la

Biología Celular se han desarrollado

instrumentos especializados que

permiten obtener información relativa a

la estructura y dinámica celular. Entre

estos instrumentos, el microscopio

óptico se ha constituido en la

herramienta más utilizada en los

estudios realizados en forma rutinaria.

Existen variantes del microscopio

óptico que ofrecen ventajas adicionales

en el estudio de las células puesto que

permiten el análisis de células vivas,

tales como el microscopio de contraste

de fases y el de fluorescencia. El

primero permite observar los detalles

subcelulares de células vivas; y el

microscopio de fluorescencia permite

determinar la localización intracelular

de moléculas, y obtener información de

la dinámica celular.

En las siguientes fotografías se

observan células en división, las

adquisiciones fueron realizadas

utilizando microscopio confocal (Figura

15), y microscopio de fluorescencia

(Figura 16). En ambas imágenes destaca

el huso mitótico en verde y los

cromosomas en azul.

Figura 15. Célula en división. Adquisición realizada con Microscopio Confocal.http://www.wired.com/images_blogs/wiredscience/2009/10/nikon1999.jpg

Figura 16. Células en división. Adquisición realizada con Microscopio de Fluorescencia.http://www.ht.org.ar/images/inmit.jpg

En la figura 17, se observa una

célula en división adquirida con un

microscopio óptico de luz.

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Figura 17. Célula en división. Adquisición realizada con Microscopio óptico de luz.http://www.galeon.com/ciclocelular/productos1503131.html

El microscopio óptico de luz, de

uso frecuente en los laboratorios de

histotecnología sigue siendo un

instrumento básico en investigación y

en el diagnóstico de algunas patologías.

Este instrumento, está compuesto por

los sistemas óptico y el mecánico. El

primero, está integrado por aquellas

partes que intervienen en la formación

de la imagen: lentes objetivos, lente

ocular, lente condensador y la fuente de

luz.

El sistema mecánico sostiene al

sistema óptico y aloja los elementos

necesarios para la iluminación y

enfoque del preparado. Las partes

mecánicas son: pie, brazo, tubo que

contiene el lente ocular, el revólver que

soporta los objetivos, la platina donde

se coloca el portaobjeto y los vernier

(Figura 18).

Figura 18. Microscopio óptico de luz.http://biologia.laguia2000.com/wp-content/uploads/2010/06/microoptico_thumb1.jpg

Pie: brinda apoyo y estabilidad al

aparato.

Vástago o brazo: soporta la

platina, tubo y tornillos de ajuste macro

y micrométrico.

Tornillo de Ajuste macro y

micrométrico: Son tornillos de

enfoque, provocan el desplazamiento

del tubo o la platina (según el modelo

de microscopio). El macrométrico lo

hace de forma rápida y el micrométrico

de forma lenta en sentido vertical, lo

que permite afinar el enfoque (Figuras

19 y 20).

Page 21: Tecnicas instrumentos y_modelos_par_el_estudio_de_la_biologia_celular

Figura 19. Tornillos Macrométrico y Micrométrico. http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Elesseg.jpg

Figura 20. Tornillos Macrométrico y Micrométrico.

http://www.salonhogar.com/ciencias/microscopio/images/macrom3.jpg

Tubo: en su extremo superior se

halla el ocular, y en el inferior el

objetivo. Se trata de un cilindro

metálico cuyo interior se encuentra

pintado de negro, lo que evita la

reflexión de la luz. Normalmente tiene

una longitud de 170 mm.

Platina: es una plataforma

horizontal sobre la cual se coloca y

sujeta el preparado a observar, tiene un

orificio central que permite el paso de la

luz y el vernier que posibilita la

ubicación de las estructuras observadas

(Figura 21).

Figura 21. Microscopio óptico donde se observa el vernier longitudinal.http://www.pce-iberica.es/medidor-detalles-tecnicos/images/microscopio-pce-mm200-objetivo.jpg

Objetivo: Lente situada cerca de

la preparación. Está formado por un

sistema de pequeñas lentes alineadas en

serie, la que se halla en el extremo distal

del objetivo se denomina lente frontal

(Figuras 22, 23 y 24).

Figura 22. Lentes objetivos ubicados en el revolver del Microscopio óptico.

http://4.bp.blogspot.com/_bXiAT6MOo8E/S2ZFqWye9VI/AAAAAAAACMc/zNChI_nQEGQ/s400/girandorevolver.JPG

Figura 23. Objetivos de diferentes aumentos.http://2.bp.blogspot.com/_BGIlM6f4bIs/S6KCK8Eq1WI/AAAAAAAAAr0/UfXaj9A6bGU/s400/objetivos.jpg

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Figura 24. Disposición de las lentes dentro de los objetivos.http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/imagenes/capitulo4/fig4_5.gif

Los objetivos pueden ser

objetivos secos (no hay ninguna

sustancia interpuesta entre la lente

frontal y el preparado, sólo aire cuyo

índice de refracción es 1), u objetivos de

inmersión (entre la lente frontal y el

preparado se coloca una sustancia cuyo

índice de refracción es muy similar al

del vidrio, aceite de cedro y es 1,52)

(Figura 25).

Figura 25. Aceite y lente de inmersión.

http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/LabExercises/Article%20Images/Microscopio11.jpg

Ocular. Lente situada cerca del

ojo del observador. Capta y amplia la

imagen formada en los objetivos.

Figura 26. Lentes oculares.http://www.amaina.com/fotos/Lupas/Accesorios/OM20/20X_400.jpg

Condensador. Concentra el haz

de luz sobre el plano del espécimen que

se encuentra en la platina. Debajo de él

se encuentra el diafragma que regula la

cantidad de luz que llega al

condensador.

Figura 27. Diafragma y condensador. http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Kondenzor.jpg

Fuente de Luz. La fuente

luminosa es la luz natural, normalmente

se usa un bombillo, antiguamente se

usaban espejos.

Para la formación de la imagen,

el condensador proyecta un cono de luz

sobre el espécimen que está siendo

Page 23: Tecnicas instrumentos y_modelos_par_el_estudio_de_la_biologia_celular

examinado en el microscopio. Después

de atravesar la muestra, ese haz

luminoso, en forma de cono, penetra en

el objetivo quien proyecta una imagen

real, aumentada e invertida en el plano

focal del ocular; este lente, nuevamente

la amplia, produciendo un imagen

virtual y derecha (Figura 28).

Figura 28. Formación de la imagen en el sistema óptico del microscopio de luz.http://www.cecyt15.ipn.mx/polilibros/instrumenta/contenido/unidades/unidad_3.htm

Un tercer sistema de lentes

localizado en la parte frontal del ojo

utiliza la imagen virtual producida por

el lente ocular como objetivo para

producir una imagen real en la retina

(Figura 29).

Figura 29. Trayecto del haz de luz durante la formación de la imagen.http://www.bolivar.udo.edu.ve/biologia/Imagenes/microscopio.jpg

El aumento total de la imagen que

se observa es el producto entre el

aumento del objetivo y el del ocular.

Ejemplo: si se tiene colocado el objetivo

de 40 y el ocular tiene un aumento de

10X, el aumento total será 40 x 10X =

400X.

El microscopio óptico es capaz de

aumentar el tamaño de las imágenes

hasta unas mil veces. En vista de que la

mayoría de las células presentan

diámetros entre 1 y 100 µm, pueden ser

observadas con el microscopio óptico.

Sin embargo, los detalles que pudieran

ser detectados estarán restringidos por

el Poder de Resolución del microscopio

óptico.

El Poder de Resolución (PR) es la

capacidad de un instrumento para

permitir que los puntos de un objeto que

están muy cercanos, aparezcan en la

imagen como puntos separados. El PR

depende de la longitud de onda (λ) de la

luz utilizada y de la Apertura Numérica

(AN) del lente objetivo. La Apertura

Numérica de los objetivos secos es 0,64

y el de los objetivos de inmersión es

1,25.

El Límite de Resolución (LR) es

la distancia mínima que debe existir

entre dos puntos para que puedan ser

distinguidos como objetos individuales.

El LR se calcula mediante la siguiente

relación:

Page 24: Tecnicas instrumentos y_modelos_par_el_estudio_de_la_biologia_celular

0.61 x λLR =

AN

El Poder de Resolución de un

instrumento es la inversa del Límite de

Resolución.

1PR =

LR

La relación inversa entre el Poder

de Resolución y el Límite de

Resolución se puede ejemplificar de la

manera siguiente: si se está observando

una muestra al microscopio óptico con

un objetivo de aumento 10, utilizando

luz visible, cuya longitud de onda es

igual a 0.5 µm, el límite de resolución

será:

0.61 x 0.5 µmLR = = 1.22 µm

0.25

El valor obtenido del Límite de

Resolución indica que bajo las

condiciones de AN y λ considerados, no

se podrá discriminar como puntos

separados objetos que estén a una

distancia menor de 1.22 µm. Para

obtener un mayor Poder de Resolución

es necesario utilizar objetivos con

mayor Apertura Numérica, como es el

caso de los objetivos de mayor

aumento. El objetivo de inmersión con

una Apertura Numérica de 1.25, ofrece

el mayor Poder de Resolución del

microscopio óptico de luz.

Cuando se observa un objeto

transparente al microscopio, cada

detalle iluminado del mismo crea un

patrón de difracción que se denomina

disco de Airy. Este patrón está formado

por un punto central brillante y varios

anillos brillantes separados por anillos

oscuros. Cuando dos detalles están muy

próximos entre sí, se podrá verlos

separados sólo si los puntos centrales no

están muy próximos o superpuestos.

Mientras más pequeños sean los discos

de Airy, mayor será la resolución en una

imagen. Los objetivos con mayor

apertura numérica producen discos de

Airy más pequeños (Figura 30).

Figura 30. Discos de Airyhttp://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo3_5.htm

La longitud de onda de la luz es el

otro parámetro que influye en el Poder

Page 25: Tecnicas instrumentos y_modelos_par_el_estudio_de_la_biologia_celular

de Resolución del Microscopio, en ese

sentido, al disminuir la longitud de onda

aumenta el Poder de Resolución del

instrumento.

Por lo tanto, el poder de resolución de

un microscopio óptico aumenta

utilizando objetivos de mayor apertura

numérica y una longitud de onda. (λ)

menor. A continuación se enumeran las

algunas longitudes de ondas de

diferentes zonas del espectro de luz.

λ = 0,5 μm luz visible.

λ = 0,4 μm luz violeta.

λ = 0,3 μm luz ultravioleta.

BIBLIOGRAFIA

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Herrera, Emilio (Comp.). (1991). Bioquímica. Aspectos estructurales y vías metabólicas. (2ª ed.). Madrid: Interamericana McGraw-Hill.

ACTIVIDAD CONTROL 6:

1.- Utilizando un esquema de llave, muestre las diferentes partes de un microscopio óptico y describa cada una de ellas.

2.- Defina Poder de Resolución y Límite de Resolución y escriba las fórmulas para calcular cada uno de ellos.

3.- Dos objetos están separados por una distancia de 1,30 µm. Podrán esos discriminarse como objetos separados si se observa con un microscopio de luz cuya longitud de onda (λ) es 0,5 µm y una apertura numérica de 0,65. Argumente su respuesta.

4.- Si estás observando un objeto con el objetivo de 100 y con un ocular con un aumento de 40X. Cuál sería el aumento total del objeto.

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Nelson, David; Cox, Michael M.; Lehninger, Albert L. (2005). Lehninger. Principios de Bioquímica. (4ª ed.). Madrid: Omega.

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Teixeira, José M. (2004). Ciencias Biológicas Ciclo Diversificado 2. Caracas: Librería Editorial Salesiana S. A.