TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE MACROMOLÉCULAS

CENTRIFUGACIÓN

La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad mediante una centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la sedimentación del sólido o de las partículas de mayor densidad.

DIÁLISIS Las moléculas se separan según su tamaño.

Es un procedimiento que separa las proteínas de los disolventes aprovechando el mayor tamaño de las proteínas. El extracto parcialmente purificado se coloca en un saco o tubo de membrana semipermeable. Cuando éste se suspende en un volumen mayor de solución tamponada de fuerza iónica apropiada, la membrana permite el intercambio de sal y tampón, pero no de proteínas. De esta forma, la diálisis retiene las proteínas grandes dentro del saco o tubo de membrana, mientras que permite que la concentración de los demás solutos en la preparación de la proteína cambie hasta llegar al equilibrio con la solución del

exterior. La diálisis puede utilizarse, por ejemplo, para eliminar el sulfato amónico de una preparación de proteína.

Centrifugación diferencial: Primero lisamos las membranas plasmáticas. Después se centrifuga a pocas revoluciones (es decir, implicamos poca gravedad) entonces precipitarán los núcleos de la cél (pellet). Después aumentaremos gradualmente las RPM e irán precipitando las ostras sustancias. Precipitará de lo más pesado a lo más ligero. Conclusión: mediante la centrifugación podemos hacer precipitar selectivamente y así aislar.

CROMATOGRAFÍA: CONCEPTOS BÁSICOS Permite separar sustancias con propiedades químicas y físicas diferentes. Las diferentes moléculas se separan mediante múltiples repartos entre una fase móvil y una fase estacionaria. Una determinada molécula podrá separarse (aislarse) de otra según su coeficiente de reparto. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Las proteína se separan en función de la especificidad de unión a un ligando. Las proteínas retenidas en la columna son la que se unen específicamente a un ligando unido covalentemente a las partículas. Una vez se han lavado las proteínas que no se unen a través de la columna, la proteína unida de interés se extrae por medio de la inserción de una solución que contiene en un gran porcentaje ligando libre (provocando un exceso, así la proteína unida a los ligandos de la columna, se unirán a los ligandos libres ya que habrá muchísimos más).

1. Se añade la mezcla de proteínas a una columna que contiene un ligando específico para la proteína de interés unido al polímero.

2. Las proteínas no deseadas se lavan a través de la columna.

3. La proteína de interés se eluye por medio de una solución de ligando.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Las proteínas se separan según su carga a un pH determinado. La matriz de la columna es un polímero sintético que tiene unidos grupos cargados; los que tiene unidos grupos aniónicos son intercambiadores catiónicos y los que tienen unidos grupos catiónicos, intercambiadores aniónicos. La afinidad de cada proteína por los grupos cargados de la columna está afectada por el pH y la concentración de iones salinos libres en competencia en la solución que les rodea. La separación puede optimizarse cambiando gradualmente el pH y/o la concentración de la sal de la fase móvil de forma que se cree un gradiente de pH o sal.

1. Partículas poliméricas con grupos funcionales cargados negativamente.

2. Se añade una mezcla de proteínas a la columna que contiene intercambiadores.

3. Las proteínas se desplazan por la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH usado. Con los intercambiadores catiónicos, las proteínas con más carga neta negativa se desplazan más rápido y eluyen antes.

Al haber intercambiadores catiónicos, es decir, grupos funcionales cargados negativamente, al añadir proteínas con una carga neta negativa, se repelen mucho ya avanzarán antes.

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN O EXCLUSIÓN MOLECULAR

Se separan según su tamaño. La matriz de la columna es un polímero entrecruzado con poros de un tamaño seleccionado. Las proteínas mayores se desplazan más rápidamente que las menores, ya que son muy grandes para penetrar en los poros de las partículas y siguen una ruta más directa. Las más pequeñas penetran en los poros y son retardadas por la ruta más laberíntica que describen a través de la columna.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Se separan según su afinidad con la fase estacionaria. Fase estacionaria: sólido poroso (gel de sílice) sobre vidrio (capa fina) papel (celulosa) Fase móvil: mezcla de disolventes. La separación de los componentes de una mezcla depende de:

• Diferente grado de adsorción de cada componente a la fase estacionaria. (más afinidad menos subirá)

• Diferente solubilidad de los componentes en la fase móvil. (ha de ser soluble) Ejemplo: Cromatografía de adsorción de aa:

Fase estacionaria: papel (celulosa) Fase móvil: propanol y agua. Después para visualizar el recorrido de lo que han subido por la fase estacionaria, teñiremos con anhidrina.

1. Se añade la mezcla de proteínas a la columna que contiene un polímero entrecruzado.

2. Las moléculas de proteína se separan por tamaños; las moléculas mayores pasa más libremente, apareciendo en las primeras fracciones.

Celda/pila electrolítica

ELECTROFORESIS: CONCEPTOS BÁSICOS Desplazamiento de sustancias en un campo eléctrico en función de su carga. La movilidad dependerá de:

• La carga de la sustancia. • El tamaño. • El potencial eléctrico.

ELECTROFORESIS EN TIRAS DE ACETATO

Método rápido: aplicación de campo eléctrico a solución de proteínas depositadas sobre una tira de acetato de celulosa. A pH básico (8,6) las proteínas se desplazarán hacia el ánodo en función de: carga y peso (interacción con el soporte sólido).

Carga de los aminoácidos y de las proteínas con los cambios de pH:

Puesto que se utiliza normalmente en condiciones de pH alcalinas, la mayoría de las proteínas van a estar cargadas negativamente, es decir, migrarán hacia el Ánodo (+)

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS

Gel “Stacking” (empaquetador) • Menor concentración de archilamida. • Tamaño de poro mayor • pH ácido-neutro

Función: acumular las proteínas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo. Gel “Resolving” (separador)

• Mayor concentración de archilamida • Tamaño de poro menor. • pH alcalino

Función: separar las proteínas.

EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES

1. Se emplea un agente reductor de puente -S-S- β-mercaptoetanol 2. Se emplea el detergente aniónico SDS (Dodecil Sulfato Sódico) 3. Generalmente también se calienta la muestra

Se cargan diferentes muestras en los pocillos o depresiones en la parte superior del un gel de poliacrilamida. Las proteínas se trasladan a través del gel cuando se aplica un campo eléctrico. El gel mantiene al mínimo las corrientes de convención producidas por pequeños gradientes de temperatura y también minimiza los movimientos de proteínas que no sean los producidos por el campo eléctrico. Después de la electroforesis se pueden visualizar las proteínas tratando el gel con un colorante tal como el azul de Coomassie, que se fija a las proteínas pero no al gel. Cada banda del gel representa una proteína diferente (o subunidad proteica); las proteínas más pequeñas se desplazan más rápidamente y, por tanto, se encuentran cerca del extremo inferior del gel.

VENTAJAS: • Separación rápida de las

proteínas. • La separación no depende de la

forma de la proteína nativa. • Se puede estimar el peso

molecular de las proteínas.

DESVENTAJAS: • Las proteína separadas están

desnaturalizadas, ya no son funcionales.

Visualización del recorrido de las proteína mediante el uso del azul de Coomassie.

Agente reductor: Mercaptoetanol El β-mercaptoetanol rompe los enlaces -S-S- tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox (reduce los puentes disulfuro)

Detergente aniónico SDS:

Por cada dos aminoácidos se una molécula de SDS, incorporando una gran carga neta negativa sobre la proteína, lo que provoca el desplegamiento (desnaturalización) de la proteína y con ello la perdida de funcionalidad.

La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser aprox. la misma, de modo que las proteínas se separan exclusivamente en función de su masa molecular.

Al desnaturalizar podemos llegar a saber si esa proteína es multimérica o no. Si lo es la parte más pequeña migrará más.

Cálculo de la masa molecular de una proteína

ISOELECTROENFOQUE (ENFOQUE ISOELÉCTRICO) Es un procedimiento utilizado para determinar el pI de una proteína. Se establece un gradiente de pH dejando que una mezcla de ácidos y bases orgánicos de baja masa molecular (anfolitos1, los cuales crean un gradiente de pH) se distribuya espontáneamente en un campo eléctrico generado a través del gel. Cuando se aplica una mezcla de proteínas, cada una de ellas se desplaza hasta que alcanza el pH que iguala su pI. De este modo las proteínas con puntos isoeléctricos distintos se distribuyen de manera diferente a lo largo del gel.

1 Anfolito: se denomina como anfolito ese aminoácido en forma de ión dipolar que puede actuar como ácido o como base, es decir, que tiene una naturaleza dual = anfótera.

La movilidad electroforética de una proteína en un gel de poliacrilamida con SDS es proporcional a su masa molecular Mr. A) Proteínas patrón de masa molecular conocida se someten a electroforesis (carril 1). Estas proteínas marcadoras sirven para estimar la masa molecular de una proteína desconocida (carril 2). B) Recta patrón: Una gráfica del log Mr de las proteína marcadoras frente al desplazamiento relativo durante la electroforesis es lineal, lo que permite leer la masa molecular de la proteína desconocida a partir de ella.

Esta técnica separa las proteínas según sus puntos isoeléctricos. Se establece un gradiente estable de pH en el gel por adición de anfolitos adecuados. Se coloca una mezcla de proteínas en un pocillo del gel. Con la aplicación de un campo eléctrico, las proteínas entran en el gel y se desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su pI (donde habrá una carga neta=0 no se moverán)

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Consiste en una combinación secuencial del enfoque isoeléctrico y la electroforesis en gel con SDS, el cual permite la resolución de mezclas complejas de proteínas.

Éste es un método analítico más sensible que cualquier método electroforético individual. La electroforesis bidimensional separa proteínas de masa molecular idéntica que difieren en el pI o proteínas con valores de pI similares pero con diferentes masas moleculares.

Las proteínas se separan primero mediante enfoque isoeléctrico en un gel cilíndrico. A continuación se extiende el gel horizontalmente sobre un segundo gel, en forma de plancha, y las proteínas se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. La separación horizontal refleja las diferencias de pI; la vertical refleja las diferencias en masa molecular.