Técnicas de manipulación del genoma.

Técnicas de manipulación del genoma.

Pero ,¿qué Pero ,¿qué necesitaremos necesitaremos

recordar?recordar?

Estructura de un gen

PROMOTOR

RNA(cDNA)

IntronesExones

PROTEÍNA

Al azarAl azar

Introducción de DNA exógeno en el genomaIntroducción de DNA

exógeno en el genoma

GENOMAGENOMA

GENGEN

TRANSGÉNTRANSGÉN

GENGEN

Al azarAl azar

TRANSGÉNTRANSGÉN

ConcatémerosConcatémeros

Gen crucialGen crucial

Zonas metiladasZonas metiladas

MuerteMuertecelularcelular

Recombinación Recombinación homólogahomóloga

Al azarAl azar

Introducción de DNA exógeno en el genomaIntroducción de DNA

exógeno en el genoma

GENGEN

TRANSGÉNTRANSGÉN

Recombinaciónhomóloga

Recombinaciónhomóloga

TRANSGÉNTRANSGÉN

Para poder Para poder realizar la realizar la

recombinación recombinación homóloga son homóloga son

necesarias necesarias células en cultivocélulas en cultivo

¿QUÉ es la Terapia génica?¿QUÉ es la Terapia génica?

“Proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo

para producir un efecto terapéutico.”

DNA como medicamento o Curar con genes

¿QUÉ es Gene Marking?¿QUÉ es Gene Marking?

“Proceso que utiliza técnicas comunes a la

Terapia Génica pero sin buscar un efecto

terapéutico.”Ej. Seguir la pista a determinadascélulas en el organismo.

““Suprimir función”Suprimir función”

““Añadir función”Añadir función”

Terapia GénicaTerapia Génica

““Añadir función”Añadir función”

Terapia GénicaTerapia Génica

•Sustitución del gen deseado.Sustitución del gen deseado.

•Reparación de una mutación. Reparación de una mutación. •Añadir un genAñadir un gen

Añadir funciónAñadir funciónAñadir funciónAñadir función

•Recombinación homológa Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual)(sustitución o reparación puntual)

• Introducción del transgen Introducción del transgen al azar al azar

(añadir un gen)(añadir un gen)

Añadir funciónAñadir funciónAñadir funciónAñadir función

““Suprimir función”Suprimir función”

Terapia GénicaTerapia Génica

•Muerte celular (suicidio Muerte celular (suicidio de las células) de las células)

•Oligonucleótidos Oligonucleótidos antisentido (expresión).antisentido (expresión).

•Ribozimas (Ruptura). Ribozimas (Ruptura).

Suprimir funciónSuprimir funciónSuprimir funciónSuprimir función

OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDOiRNA: RNA de interferencia

MODOS DE INTRODUCCIÓN

MODOS DE INTRODUCCIÓN

““Ex vivo”Ex vivo”

““In vivo”In vivo”

Terapia GénicaTerapia Génica

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

•DIRECTOS•DIRECTOS

•QUIMICOS•QUIMICOS

•FISICOS•FISICOS

Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio

ElectroporaciónElectroporación

DNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

David "niño burbuja",

(Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)

Tratamientos

- Aportación de la enzima recombinante:

ADAPEG-ADA

- Transplante de médula osea.

1ª Experiencia de Terapia génica: Deficiencia Inmune Severa

Combinada

- 1990. Dr Blaese (EEUU)Dr. Bordignon (Italia)

-1995 Demuestran la eficacia del tratamiento

Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad.(Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada

-Mutación en el Cromosoma X

- Deficiencia en la cadena del

receptor para la interleukina

IL2RG

- Hospital Necker de Paris (11

niños)

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada

-3 de los niños sufrieron una leucemia.- ¿Por qué?

-Efecto posición (LMO2)-2003-Efecto sobreexpresión- 2006

Para saber que Para saber que se está se está

haciendo…haciendo…

Sociedad Europea de TGSociedad Europea de TG

Sociedad Americana de TGSociedad Americana de TG

1. Estudios en investigación básica- Funcionamiento de genes- Funcionamiento promotores

2. Producción Animal - Incremento de productividad

CuantitativoCualitativo

- “Biotecnología de corral”

3. Sanidad - Animales modelos de

enfermedades- Xenotrasplantes- Terapia Génica Germinal.

TRACYTRACY

s1-antitripsinahumana

s1-antitripsinahumana

Promotor-lactoglobulina

ovina

Promotor-lactoglobulina

ovina

Primeros ensayos en ratón:

4.3 Kb Promotor

WAP de ratón

6.6 Kb de AAT-humanocDNA

12.5 gr./litroObtienen microlitros

de leche

Volumen/año gr./año Producción vital

8 litros400 litros10.000 l.

0.04 Kg.2 kg. 50 kg

1 Kg.100 kg.

toneladas

ConejaOvejaVaca

Roslin Institute-PPL Therapeutics(lo que sabemos......)

s1-antitripsinas1-antitripsina

FibrinógenoFibrinógeno

Factor VII y Proteína CFactor VII y Proteína C

Factor XIFactor XI

BSSL (lipasa)BSSL (lipasa)

Anticuerpos humanizadosAnticuerpos humanizados

Organismos modelosOrganismos modelos

RatónRatón

Especie de elección Metodología de creación puesta a

punto.Corto intervalo generacionalNumerosos descendientes.

Especie de elección Metodología de creación puesta a

punto.Corto intervalo generacionalNumerosos descendientes.

¿Pero, hay ¿Pero, hay muchos modelos muchos modelos

animales?animales?

Mouse Models for Human Disease

Mouse Models for Human Disease