TÉCNICAS DE GENÉTICA

Proyecto EditorialMANUALES DE GENÉTICA

Coordinador:

César Benito Jiménez

TÉCNICAS DE GENÉTICA

Josefa Cabrero HurtadoF. David Carmona López

Lara Bossini Castillo

Consulte nuestra página web: www.sintesis.comEn ella encontrará el catálogo completo y comentado

© Josefa Cabrero HurtadoF. David Carmona López

Lara Bossini Castillo

© EDITORIAL SÍNTESIS, S. A.Vallehermoso, 34 - 28015 Madrid

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ISBN: 978-84-1357-097-6Depósito Legal: M. 22.475-2021

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de Editorial Síntesis, S. A.

Índice

PRÓLOGO .................................................................................................................................................................... 15

1.. INTRODUCCIÓN.AL.LABORATORIO.DE.GENÉTICA .......................................................... 17

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 17Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 17 1.1.. Equipamiento ....................................................................................................................................... 17 1.2.. Organización ........................................................................................................................................ 19 1.3.. Seguridad ............................................................................................................................................... 20 1.4.. Diseño.de.los.experimentos .......................................................................................................... 21

2.. EXTRACCIÓN.DE.ÁCIDOS.NUCLEICOS ...................................................................................... 23

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 23Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 23 2.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 23 2.2.. Extracción.de.ADN.genómico ..................................................................................................... 24

2.2.1.. Lisis.celular ........................................................................................................................ 24 2.2.2.. Eliminación.de.restos.celulares ................................................................................. 25 2.2.3.. Extracción.del.ADN ........................................................................................................ 26 2.2.4.. Precipitación.del.ADN ................................................................................................... 30 2.2.5.. Purificación.del.ADN ..................................................................................................... 31 2.2.6.. Elución.del.ADN ............................................................................................................... 31

2.3.. Extracción.de.ADN.plasmídico ................................................................................................... 32 2.4.. Extracción.de.ARN.total ................................................................................................................. 33

2.4.1.. Métodos.orgánicos.-.TRIzol ........................................................................................ 33

Técnicas de Genética6

2.4.2.. Métodos.sobre.soporte.físico ...................................................................................... 34 2.5.. Extracción.de.ARN.mensajero ..................................................................................................... 34 2.6.. Concentración.y.pureza.de.los.ácidos.nucleicos ................................................................. 35Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 36Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 36

3.. ELECTROFORESIS.E.HIBRIDACIÓN .............................................................................................. 39

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 39Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 39 3.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 40 3.2.. Geles.de.electroforesis ..................................................................................................................... 41

3.2.1.. Geles.de.agarosa .............................................................................................................. 41 3.2.2.. Geles.de.poliacrilamida ................................................................................................ 43 3.2.3.. Carga.de.las.muestras,.electroforesis.y.lectura.de.resultados ................... 45

3.3.. Purificación.de.bandas ..................................................................................................................... 47 3.3.1.. A.partir.de.un.gel.de.agarosa ..................................................................................... 48 3.3.2.. A.partir.de.un.gel.de.poliacrilamida....................................................................... 49

3.4.. Southern.blot ........................................................................................................................................ 50 3.5.. Northern.blot ........................................................................................................................................ 52Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 54Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 55Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 57

4.. REACCIONES.EN.CADENA.DE.LA.POLIMERASA.(PCR) .................................................. 59

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 59Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 59 4.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 60 4.2.. Reacción.en.cadena.de.la.polimerasa.(Polymerase.Chain.Reaction,.PCR) ............ 64 4.3.. Reacción.en.cadena.de.la.polimerasa.anidada.(nested.polymerase.Chain.Reac-

tion,.PCR) .............................................................................................................................................. 66 4.4.. Reacción.en.cadena.de.la.polimerasa.con.retrotranscriptasa.(Retrotranscriptase.

Polymerase.Chain.Reaction,.RT-PCR) .................................................................................... 68 4.4.1.. Retrotranscripción.con.síntesis.de.la.primera.hebra ...................................... 68 4.4.2.. Retrotranscripción.con.síntesis.de.la.segunda.hebra ..................................... 69

4.5.. Reacción.en.cadena.de.la.polimerasa.en.tiempo.real.o.cuantitativa.(Quantitati-ve.Polymerase.Chain.Reaction,.qPCR) ................................................................................... 70 4.5.1.. Cuantificación.absoluta.usando.un.agente.colorante.de.ADN.de.doble.

cadena.y.una.curva.patrón .......................................................................................... 70 4.5.2.. Cuantificación.relativa.por.unidad.de.masa.usando.un.agente.colo-

rante.de.ADN.de.doble.cadena .................................................................................. 72 4.5.3.. Cuantificación.relativa.usando.sondas.y.un.gen.de.control.interno ........ 72

7Índice

4.6.. Limitaciones.y.aplicaciones.de.estas.técnicas ...................................................................... 73Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 76Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 76Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 78

5.. GENERACIÓN.DE.VECTORES.DE.CLONACIÓN.Y.EXPRESIÓN ................................. 81

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 81Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 81 5.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 82 5.2.. Enzimas.de.restricción ..................................................................................................................... 82 5.3.. Ligación .................................................................................................................................................. 84 5.4.. Tipos.de.vectores.de.clonación.y.de.expresión .................................................................... 85

5.4.1.. Plásmidos ............................................................................................................................. 87 5.4.2.. Bacteriófagos ..................................................................................................................... 87 5.4.3.. Cósmidos .............................................................................................................................. 87 5.4.4.. Cromosomas.artificiales ............................................................................................... 87

5.5.. Transferencia.del.vector .................................................................................................................. 88 5.5.1.. Transformación.de.bacterias.con.plásmidos ...................................................... 88 5.5.2.. Transducción.de.bacterias.mediante.bacteriófagos ........................................ 90 5.5.3.. Transfección.de.células.de.mamífero.con.lipofectamina .............................. 92 5.5.4.. Transducción.de.células.humanas.mediante.virus ........................................... 93

5.6.. Aplicaciones ......................................................................................................................................... 96Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 98Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 99Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 101

6.. INGENIERÍA.GENÉTICA .......................................................................................................................... 103

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 103Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 103 6.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 104 6.2.. Knock-out./.knock-in......................................................................................................................... 105

6.2.1.. Protocolo.de.generación.de.knock-out.mediante.agentes.químicos.o.físicos ..................................................................................................................................... 105

6.2.2.. Protocolo.de.generación.de.knock-out./.knock-in.mediante.inserción.de.transposones ................................................................................................................. 105

6.2.3.. Protocolo.de.generación.de.knock-out./.knock-in.basado.en.la.recom-binación.homóloga .......................................................................................................... 109

6.2.4.. Protocolo.de.generación.de.knock-out./.knock-in.mediante.recombi-neering ................................................................................................................................... 110

6.2.5.. Protocolo.de.generación.de.knock-out.mediante.ZFN.y.TALEN .............. 112 6.3.. Knock-down .......................................................................................................................................... 112


6.3.1.. Sistemas.de.reducción.permanente .......................................................................... 113 6.3.2.. Sistemas.de.reducción.temporal................................................................................ 113

6.4.. Recombinación.Cre-LoxP .............................................................................................................. 114 6.5.. Sistemas.CRISPR-Cas9 .................................................................................................................. 116

6.5.1.. Knock-out/.knock-in.generado.mediante.técnicas.CRISPR-Cas9 ........... 116 6.5.2.. CRISPRa.y.CRISPRi....................................................................................................... 117 6.5.3.. Edición.de.nucleótidos.mediante.CRISPR ........................................................... 119

6.6.. Aplicaciones.de.estas.técnicas ..................................................................................................... 120Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 121Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 122Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 123

7.. MATERIAL.UTILIZADO.PARA.ESTUDIOS.CITOGENÉTICOS ........................................ 125

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 125Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 125 7.1.. Material.utilizado.para.el.estudio.de.la.mitosis ................................................................... 126

7.1.1.. Obtención.del.material.de.forma.directa .............................................................. 126 7.1.2.. Obtención.del.material.mediante.cultivos.celulares ....................................... 129

7.2.. Material.utilizado.para.el.estudio.de.la.meiosis .................................................................. 131 7.2.1.. Material.para.el.estudio.de.la.meiosis.masculina ............................................ 131 7.2.2.. Material.para.el.estudio.de.la.meiosis.femenina .............................................. 132

7.3.. Técnicas.de.aislamiento.cromosómico .................................................................................... 133 7.3.1.. Microdisección.cromosómica ..................................................................................... 133 7.3.2.. Citometría.de.flujo ........................................................................................................... 134

7.4.. Preparaciones.cromosómicas ....................................................................................................... 135 7.4.1.. Preparaciones.por.aplastamiento.(squash) ......................................................... 135 7.4.2.. Preparaciones.por.extensión.(spreading) ............................................................. 136

7.5.. Diferencias.entre.las.preparaciones.de.plantas.y.animales ............................................. 138 7.6.. Los.cromosomas.de.hongos.y.levaduras ................................................................................. 139 7.7.. El.caso.concreto.de.los.cromosomas.humanos .................................................................... 140

7.7.1.. Diagnóstico.preimplantacional ................................................................................. 141 7.7.2.. Diagnóstico.prenatal.utilizando.biopsia.de.corion .......................................... 141 7.7.3.. Diagnóstico.prenatal.mediante.amniocentesis .................................................. 141 7.7.4.. Diagnóstico.prenatal.no.invasivo.utilizando.sangre.materna .................... 141

7.8.. Tinción.de.los.cromosomas..Métodos.convencionales .................................................... 141 7.9.. Tinción.de.Feulgen ............................................................................................................................ 1437.10.. Observación.al.microscopio.y.obtención.de.imágenes .................................................... 1447.11.. Cariotipo.e.idiograma..Ejemplo.del.cariotipo.humano .................................................... 145Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 147Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 148Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 149

9Índice

8.. TÉCNICAS.DE.BANDEO.CROMOSÓMICO ................................................................................. 151

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 151Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 151 8.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 152 8.2.. Técnicas.para.la.observación.de.bandas.cromosómicas .................................................. 152

8.2.1.. Bandas.C .............................................................................................................................. 152 8.2.2.. Bandas.G .............................................................................................................................. 153 8.2.3.. Bandas.R .............................................................................................................................. 154 8.2.4.. Bandas.NOR.o.de.impregnación.argéntica ......................................................... 154 8.2.5.. Bandeo.de.restricción .................................................................................................... 155 8.2.6.. Técnicas.de.bandeo.mediante.fluorescencia ....................................................... 156

8.3.. Bandeo.por.incorporación.de.BrdU .......................................................................................... 160 8.4.. Bandeos.de.alta.resolución ............................................................................................................ 160 8.5.. Significado.de.las.bandas.cromosómicas ................................................................................ 161 8.6.. Aplicaciones.y.limitaciones.de.estas.técnicas ...................................................................... 162

8.6.1.. Aplicaciones ....................................................................................................................... 162 8.6.2.. Limitaciones ....................................................................................................................... 162

Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 163Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 163Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 164

9.. TÉCNICAS.DE.CITOGENÉTICA.MOLECULAR:.HIBRIDACIÓN.IN SITU .............. 167

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 167Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 167 9.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 168 9.2.. Fijación.del.material.y.preparaciones ....................................................................................... 168

9.2.1.. Preparación.de.las.sondas.y.marcaje ..................................................................... 168 9.2.2.. Preparación.y.pretratamiento.de.los.cromosomas..Diferencias.entre.el.

material.animal.y.vegetal ............................................................................................. 171 9.3.. Protocolo.de.hibridación.in.situ.fluorescente.(FISH) ....................................................... 172 9.4.. Protocolo.de. la.hibridación. in.situ.fluorescente.mediante.detección.con.anti-

cuerpos .................................................................................................................................................... 175 9.5.. Tipos.de.hibridación.in.situ.fluorescente.y.sus.aplicaciones ......................................... 177

9.5.1.. Pintado.de.todo.el.cromosoma.o.Pintado.Cromosómico.(WCP,.por.sus.siglas.en.inglés) ................................................................................................................ 177

9.5.2.. FISH.Multicolor.(M-FISH) ......................................................................................... 178 9.5.3.. Hibridación..Genómica.in.situ.(GISH) .................................................................. 178 9.5.4.. Marcado.de.cebadores.(primers).in.situ.(PRINS) ............................................ 179 9.5.5.. Hibridación.in.situ.de.fibra.extendida.(Fiber.FISH) ....................................... 179 9.5.6.. Hibridación.Genómica.Comparada.(CGH) ........................................................ 179


9.5.7.. FISH.para.detectar.roturas.en.el.ADN.(DBD-FISH:.DNA-breakage.detection-FISH) ................................................................................................................ 179

9.5.8.. FISH.mediante.Cas9.(CASFISH) ............................................................................. 180 9.5.9.. FISH.con.ARN.(RNA-.FISH) ...................................................................................... 180

9.6.. Limitaciones.de.la.hibridación.in.situ ...................................................................................... 180Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 181Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 182Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 182

10.. TÉCNICAS.DE.INMUNODETECCIÓN.DE.PROTEÍNAS ...................................................... 185

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 185Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 18510.1.. Fundamento.teórico .......................................................................................................................... 18610.2.. Fijación.del.material.y.preparaciones ....................................................................................... 186

10.2.1.. Para.la.visualización.sobre.cromosomas ............................................................. 18710.2.2.. Visualización.sobre.tejidos .......................................................................................... 188

10.3.. Inmunofluorescencia.directa.(IFD).e.indirecta.(IFI) ......................................................... 19210.3.1.. Inmunofluorescencia.directa.(IFD) ......................................................................... 19310.3.2.. Inmunofluorescencia.indirecta.(IFI) ....................................................................... 194

10.4.. Detección.enzimática:.Inmunocitoquímica.(ICC).e.inmunohistoquímica.(IHC) 19710.4.1.. Detección.enzimática.directa ..................................................................................... 19810.4.2.. Detección.enzimática.indirecta ................................................................................. 199

10.5.. Otros.métodos.de.inmunodetección .......................................................................................... 20210.5.1.. Detección.con.avidina.o.espreptoavidina.marcada.con.peroxidasa ....... 20210.5.2.. Detección.indirecta.con.polímeros.conjugados ................................................. 20210.5.3.. Inmunodetección.mediante.marcaje.con.oro.coloidal .................................... 20310.5.4.. Técnica.doble.de.inmunofluorescencia.y.FISH.................................................. 203

10.6.. Aplicaciones.y.limitaciones.de.las.técnicas.de.inmunodetección ............................... 203Resumen.conceptual ........................................................................................................................................ 204Problemas.propuestos ..................................................................................................................................... 205Preguntas.de.evaluación................................................................................................................................. 206

11.. LA.REVOLUCIÓN.GENÓMICA ............................................................................................................. 209

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 209Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 20911.1.. Proyectos.genómicos ........................................................................................................................ 209

11.1.1.. Proyecto.Genoma.Humano ......................................................................................... 21011.1.2.. Proyecto.HapMap ............................................................................................................ 21211.1.3.. Proyecto.1.000.genomas ............................................................................................... 21311.1.4.. Proyecto.GTEx .................................................................................................................. 21511.1.5.. Proyecto.Roadmap.Epigenomics .............................................................................. 216

11Índice

11.1.6.. Proyecto.ENCODE ......................................................................................................... 21711.2.. Organización.y.estructura.de.los.genomas ............................................................................. 217

11.2.1.. Arquitectura.funcional.del.genoma ......................................................................... 21811.2.2.. Variabilidad.genética ..................................................................................................... 21911.2.3.. Desequilibrio.de.ligamiento.y.bloques.haplotípicos ....................................... 220


12.. SECUENCIACIÓN.DE.ADN...................................................................................................................... 227

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 227Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 22712.1.. Contexto.histórico.de.los.métodos.de.secuenciación.del.ADN .................................... 22712.2.. Método.Sanger.con.marcado.fluorescente ............................................................................. 229

12.2.1.. Preparación.de.la.muestra .......................................................................................... 22912.2.2.. Reacción.de.secuenciación .......................................................................................... 23012.2.3. Purificación.del.producto.de.la.reacción.de.secuenciación ........................ 23312.2.4.. Electroforesis.capilar.y.obtención.de.la.secuencia .......................................... 233

12.3.. Chips.de.ADN ...................................................................................................................................... 23412.4.. Librerías.de.secuenciación ............................................................................................................. 236

12.4.1.. Secuenciación.dirigida .................................................................................................. 23712.4.2.. Secuenciación. del. exoma. completo. (WES). y. del. genoma. completo.

(WGS) .................................................................................................................................... 23812.4.3.. Secuenciación.del.transcriptoma.completo.(RNA-seq) ................................. 23912.4.4.. Secuenciación.con.bisulfito ......................................................................................... 242

12.5.. Plataformas.de.secuenciación ...................................................................................................... 24412.5.1.. Tecnología.454 .................................................................................................................. 24412.5.2.. Secuenciación.SOLID .................................................................................................... 24512.5.3.. Secuenciación.Ion.Torrent ........................................................................................... 24512.5.4.. Secuenciación.por.síntesis.de.Illumina ................................................................. 24612.5.5.. Secuenciación.de.nanoporos ..................................................................................... 246


13.. TÉCNICAS.DE.GENOTIPADO.MASIVO ......................................................................................... 253

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 253Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 25313.1.. Estudios.de.asociación.a.gran.escala ........................................................................................ 25313.2.. Plataformas.de.genotipado.de.alto.rendimiento .................................................................. 255

13.2.1.. Plataformas.GWAS .......................................................................................................... 256


13.2.2.. Plataformas.personalizadas ....................................................................................... 25813.3.. Tratamiento.y.análisis.de.datos ................................................................................................... 260

13.3.1.. Controles.de.calidad ....................................................................................................... 26013.3.2.. Imputación.de.genotipos ............................................................................................... 26213.3.3.. Tests.de.asociación.genética ....................................................................................... 26313.3.4.. Representación.e.interpretación.de.los.resultados ........................................... 265

13.4.. Anotación.de.variantes.asociadas ............................................................................................... 26713.4.1.. Identificación.de.variantes.genéticas.altamente.ligadas.a.la.variante.

asociada.(proxies) ........................................................................................................... 26713.4.2.. Contexto.genómico.de.las.variantes.analizadas ............................................... 26713.4.3.. Evaluación.de.efectos.sobre.la.secuencia.de.proteínas ................................. 26813.4.4.. Evaluación.de.efectos.sobre.el.splicing ................................................................. 26813.4.5.. Evaluación.de.anotaciones.del.genoma.no.codificante ................................. 268


14.. GENÓMICA.FUNCIONAL ........................................................................................................................ 275

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 275Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 27514.1.. Métodos.de.estudio.de.la.accesibilidad.a.la.cromatina .................................................... 275

14.1.1.. DNase-seq............................................................................................................................ 27614.1.2.. FAIRE-seq ............................................................................................................................ 27814.1.3.. ATAC-seq .............................................................................................................................. 280

14.2.. Métodos.de.estudio.de.interacción.de.proteínas.con.la.cromatina ............................. 28114.2.1.. ChIP-chip ............................................................................................................................. 28114.2.2.. ChIP-seq ............................................................................................................................... 282

14.3.. Métodos.de.estudio.de.la.conformación.de.la.cromatina ................................................ 28414.3.1.. Métodos.tradicionales ................................................................................................... 28414.3.2.. Métodos.basados.en.inmunoprecipitación.de.la.cromatina ........................ 28914.3.3.. Métodos.de.enriquecimiento.de.secuencias ........................................................ 291


15.. GENÓMICA.COMPARATIVA ................................................................................................................. 297

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 297Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 29715.1.. Historia.de.la.genómica.comparativa ....................................................................................... 29815.2.. Secuenciación.de.novo.y.ensamblaje.de.genomas ............................................................. 29915.3.. Anotación.de.ensamblajes.de.novo ............................................................................................ 302

13Índice

15.3.1.. Anotación.estructural ..................................................................................................... 30315.3.2.. Anotación.funcional ........................................................................................................ 303

15.4.. Comparación.de.secuencias.entre.distintos.organismos .................................................. 30415.4.1.. Bases.de.datos ................................................................................................................... 30415.4.2.. Aproximaciones.en.los.estudios.de.genómica.comparativa ......................... 305

15.5.. Filogenias.moleculares .................................................................................................................... 30615.5.1.. Árboles.filogenéticos ...................................................................................................... 30715.5.2.. Métodos.de.análisis.filogenético ............................................................................... 309


16.. MEDICINA.GENÓMICA ............................................................................................................................ 319

Conceptos.por.estudiar ................................................................................................................................... 319Objetivos.para.el.aprendizaje ...................................................................................................................... 31916.1.. Potencial.de.la.medicina.genómica.en.la.práctica.clínica ............................................... 31916.2.. Herramientas.genéticas.para.el.diagnóstico.y.el.pronóstico .......................................... 320

16.2.1.. Pruebas.genéticas.para.rasgos.monogénicos .................................................... 32116.2.2.. Estrategias.para.el.diagnóstico.y.pronóstico.de.enfermedades.comple-

jas ............................................................................................................................................ 32316.3.. Farmacogenómica .............................................................................................................................. 32616.4.. Terapia.génica ...................................................................................................................................... 328

16.4.1.. Vectores.virales ................................................................................................................. 32816.4.2.. Vectores.no.virales ........................................................................................................... 32916.4.3.. Herramientas.de.edición.del.genoma ..................................................................... 330


SOLUCIONARIO ..................................................................................................................................................... 335

ABREVIATURAS ..................................................................................................................................................... 353

REACTIVOS.Y.TAMPONES ............................................................................................................................. 359

BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................................................................ 363

2Extracción de ácidos nucleicos

ConCeptos por estudiar

✓ ADN.genómico..Métodos.orgánicos,. inorgánicos.y.sobre.soporte.sólido.de.extracción.y.purificación.del.ADN.

✓ ADN.plasmídico..Preparaciones.de.ADN.plasmídico.✓ ARN.total..Métodos.orgánicos.y.sobre.soporte.sólido.de.extracción.y.purificación.del.ARN.✓ ARN.mensajero..Selección.mediante.cebadores.de.oligo-dT.

Objetivos para el aprendizaje

•. Identificar.el.ácido.nucleico.de.interés.y.las.particularidades.de.su.extracción.y.purificación.•. Asimilar.los.fundamentos.de.los.métodos.orgánicos,.inorgánicos.y.sobre.soporte.sólido.de.

extracción.y.purificación.del.ADN.genómico.•. Conocer. las. características. físico-químicas. aprovechadas. en. las. preparaciones. de.ADN.

plasmídico.para.su.extracción..•. Reconocer.los.riesgos.y.medidas.de.prevención.asociados.a.las.extracciones.orgánicas.de.

ácidos.nucleicos.•. Evaluar.los.riesgos.de.degradación.por.nucleasas.en.la.extracción.de.los.ácidos.nucleicos..•. Disponer.de.herramientas.para.obtener.los.ácidos.nucleicos.necesarios.para.la.realización.

de.las.diferentes.técnicas.de.genética.y.biología.molecular..

2.1. Fundamento teórico

El.punto.de.partida.de.la.mayoría.de.las.técnicas.de.genética.y.biología.molecular.es.la.obtención.de. los.ácidos.nucleicos.a.analizar..Para.conseguir.aislar.ácidos.nucleicos.en.cantidad.y.pureza.suficientes,.será.determinante.el.origen.y.naturaleza.de.la.muestra,.así.como.su.estado.y.méto-do.de.conservación..A.grandes.rasgos,.una.extracción.y.purificación.de.ácidos.nucleicos.exitosa.


depende.de.la.eficiencia.de.la. lisis.celular,.de.la.correcta.eliminación.de.otras.macromoléculas.como.proteínas.y. lípidos.y.de.desechos.de.orgánulos.celulares,.así.como.de. la.eliminación.de.trazas.de.reactivos.que.inhiban.las.técnicas.posteriores..Además,.es.necesario.conseguir.inactivar.las.nucleasas,.enzimas.capaces.de.romper.los.enlaces.fosfodiéster.entre.los.nucleótidos.del.ADN.(desoxirribonucleasas.o.DNasas).y.del.ARN.(ribonucleasas.o.RNasas)..

Si.el.objeto.de.estudio.es.la.información.genética.asociada.al.desarrollo.y.funcionamiento.de.los.seres.vivos.contenida.en.el.genoma,.el.objetivo.será.la.extracción.y.purificación.del.ADN..En.los.organismos.eucariotas,.la.mayor.parte.del.ADN.se.organiza.en.cromosomas.dentro.del.núcleo.(ADN.genómico),.pero.también.existe.ADN.en.las.mitocondrias.o.en.los.cloroplastos..En.el.caso.de. los.organismos.procariotas,. el.ADN.se.estructura.en.cromosomas.circulares.y.en.pequeños.plásmidos.circulares.(ADN.no.esencial).en.el.citoplasma..

Por.otro. lado,. si.nuestro.experimento.se.centra.en. la.caracterización. transcriptómica.de. la.muestra,.nuestro.objetivo.será.la.caracterización.del.ARN.contenido.en.el.citoplasma..Una.ex-tracción.del.ARN.total.contendrá.tanto.el.ARN.mensajero.(ARNm),.como.el.ARN.ribosómico.(ARNr),. el.ARN.de. transferencia. (ARNt),. los.ARN.pequeños. (microARN,.ARN.pequeños.de.interferencia,.ARN.largos.no.codificantes),.etc.,.por.lo.que.para.el.estudio.de.la.expresión.del.ge-noma.codificante.deberemos.añadir.un.protocolo.específico.de.selección.del.ARNm..

2.2. Extracción de ADN genómico

La.mayoría.de.los.estudios.centrados.en.la.información.genética.transmitida.de.una.generación.a.otra.requieren.de.la.obtención.del.ADN.genómico.(cromosómico).de.un.organismo..Estas.son.las.etapas.y.métodos.más.comúnmente.usados:

2.2.1. Lisis celular

El.primer.paso.de.todo.protocolo.de.extracción.del.ADN.incluye.la.lisis.de.las.membranas.celula-res,.pero.se.combina.con.diferentes.estrategias.según.las.características.de.la.muestra..Por.ejem-plo,.si.se.parte.de.tejidos.celulares.o.muestras.complejas,.se.deben.emplear.protocolos.específicos.de.disgregación.tisular.y.eliminación.de.la.matriz.extracelular.(homogeneización.de.la.muestra)..Además,.en.aquellos.casos.en.los.que.las.células.posean.una.pared.celular,.tendremos.que.elimi-narla.mediante.diferentes.procedimientos.dependiendo.de.la.naturaleza.de.esta..Cabe.destacar.que.debemos.considerar.si.la.muestra.de.partida.es.material.fresco,.congelado.o.conservado.en.alguna.solución.o.método.de.inclusión.para.aplicar.protocolos.o.kits.específicos..Obviando.los.detalles.de.cada.posible.fuente.de.material,.la.lisis.celular.se.puede.llevar.a.cabo.por.métodos.físicos,.quími-cos,.enzimáticos.o.una.mezcla.de.ellos,.tal.como.se.detalla.en.los.siguientes.apartados.

A). Métodos.físicos

Son.adecuados.para.tejidos.compactos.o.muestras.vegetales..Los.más.comunes.consisten.en.el.uso.de.morteros.o.dispositivos.para.disgregar.y.machacar.las.muestras..En.ocasiones,.la.muestra.se.


congela.con.nitrógeno.líquido.mientras.se.machaca.para.facilitar.este.paso..Estos.métodos.también.incluyen.la.agitación.en.presencia.de.partículas.o.microesferas.de.cristal,.metal,.cerámica,.etc.,.o.la.aplicación.de.ultrasonidos.(sonicación).

B). Métodos.químicos

Por.sí.solos.pueden.aplicarse.a.suspensiones.celulares.o.muestras.de.fácil.lisis,.pero.normal-mente.se.usan.en.combinación.con.otros.métodos..Incluyen.diferentes.detergentes.y.compuestos.capaces.de.romper.las.membranas.celulares.o.desnaturalizar.proteínas..Los.más.comunes.son.el.dodecilsulfato.sódico.(SDS),.las.soluciones.alcalinas.o.las.sales.caotrópicas.(capaces.de.debilitar.el.ambiente.hidrofóbico.de.una.solución.acuosa.y.producir.la.precipitación.de.macromoléculas.como.los.ácidos.nucleicos)..En.el.caso.de.soluciones.o.tampones.de.lisis.que.contengan.ácido.etilendia-minotetraacético.(EDTA),.debemos.considerar.que.es.un.agente.quelante,.es.decir,.que.tiene.la.pro-piedad.de.combinarse.con.los.iones.positivos.bivalentes.y.trivalentes.formando.complejos.estables,.por.lo.que.secuestra.cationes.como.los.de.Mg2+..Estos.cationes.son.necesarios,.por.ejemplo,.para.la.reacción.en.cadena.de.la.polimerasa.(PCR),.por.lo.que.si.esa.es.nuestra.intención,.se.recomienda.usar.otros.tampones.basados.en.la.solución.Tris.–tris(hidroximetil)aminometano–.y.enzimas.

C). Métodos.enzimáticos

A.pesar.de.que.su.coste.es.más.elevado,.son.los.más.eficaces.para.romper.tejidos.compactos.y.células.con.paredes.celulares.resistentes..Las.enzimas.elegidas.dependen.de.la.composición.de.la.matriz.o.pared.celular.que.queremos.eliminar,.siendo.las.más.frecuentes:.proteinasa.K.(serina.proteasa.de.amplio.espectro),.tripsina.(peptidasa.que.suele.usarse.en.conjunción.con.la.proteinasa.K),.colagenasa.(rompe.los.enlaces.peptídicos.del.colágeno),.lipasa.(hidroliza.el.triacilglicerol.de.los.lípidos),.lisozima.(rompe.la.pared.bacteriana),.liticasa.(rompe.la.pared.celular.de.levaduras.y.hongos),.zimolasa.(rompe.la.pared.celular.de.levaduras.y.hongos).

2.2.2. Eliminación de restos celulares

Tras.producirse.la.lisis.celular,.el.ADN.se.encuentra.mezclado.con.restos.de.los.orgánulos.celu-lares,.lípidos.que.han.sido.arrastrados.por.los.detergentes.usados,.algunas.proteínas.desnaturali-zadas,.etc.,.que.deben.ser.eliminados.para.evitar.interferencias.con.técnicas.o.dispositivos.usados.posteriormente..La.eliminación.de.estos.restos.celulares.suele.realizarse.mediante.centrifugación,.que.arrastra.los.restos.celulares.al.fondo.del.tubo:.

1.. Se.introduce.1.mL.de.la.muestra.obtenida.tras.la.lisis.celular.en.un.tubo.2..Centrifugar.brevemente.a.1..000.g.durante.5.minutos.para.eliminar.restos.grandes.3.. Se.recupera.el.sobrenadante.y.se.centrifuga.a.15..000.g..durante.15.minutos.para.precipitar.

las.mitocondrias.y.otros.restos.más.pequeños..4.. Se.pasa.el.sobrenadante.a.un.tubo.limpio.y.se.descarta.el.sedimento.de.restos.


Este.paso.también.puede.realizarse.usando.filtros..En.caso.de.estar.interesados.en.la.obtención.del.ADN.de.las.mitocondrias.podemos.usar.el.precipitado.de.la.segunda.centrifugación.o.kits.es-pecíficos..Si.queremos.obtener.ADN.de.los.cloroplastos,.podemos.usar.un.gradiente.en.sacarosa.o.en.Percoll,.así.como.kits.comerciales.para.su.separación..

FIGURA 2.1. Representación esquemática de los pasos de lisis celular y de eliminación de restos celulares durante la extracción de ADN.

2.2.3. Extracción del ADN

Una.vez.llegados.a.este.punto,.existen.diferentes.métodos.para.extraer.el.ADN.del.lisado.celular:

A). Métodos.orgánicos

Presentan.un.bajo.coste.económico.y.se.obtiene.un.ADN.de.buena.calidad.y.alta.concentra-ción..Sin.embargo,.son.protocolos.largos.y.que.requieren.del.uso.de.solventes.orgánicos.(fenol,.cloroformo).que.son.irritantes,.corrosivos.y.volátiles,.por.lo.que.debemos.trabajar.en.la.campana.de.extracción.y.con.protección.para.la.piel.(guantes.y.bata).

1.. Extracción.orgánica.con.fenol.y.cloroformo

La.mezcla.de.fenol,.cloroformo.y.alcohol.isoamílico.es.inmiscible.en.agua.y,.tras.la.centrifu-gación,.formará.un.gradiente.con.una.fase.acuosa,.que.contendrá.el.ADN.en.disolución.en.la.parte.de.arriba,.además.de.una.interfase.y.una.fase.orgánica.inferior.que.contendrán.las.proteínas..El.protocolo.a.seguir.es.el.siguiente:.

1.. Se.añade.1.volumen.de.una.mezcla.de. fenol:cloroformo:alcohol. isoamílico. (proporción.25:24:1)..La.solución.debe.estar.ajustada.a.un.pH.≥.7,5.para.que.el.ADN.pase.a.la.fase.acuosa..En.algunos.protocolos.el.fenol.y.el.cloroformo.se.añaden.en.diferentes.pasos,.pero.


el.objetivo.es.el.mismo:.obtener.un.gradiente.en.el.que.el.ADN.se.mantenga.en.la.fase.acuosa.y.el.resto.de.macromoléculas.sean.arrastradas.a.la.fase.orgánica..

2..Agitar.vigorosamente.durante.un.minuto.3..Centrifugar.a.16..000.g..durante.5.minutos.(o.~.10.minutos.a.13..000.g,.es.decir,.a.menor.

velocidad.de.centrifugado.más.tiempo).4.. Se.saca.con.cuidado.solamente.la.fase.acuosa.superior.con.una.micropipeta.y.se.pasa.a.un.

tubo.limpio.5..Añadir.un.volumen.de.cloroformo:alcohol.isoamílico.(proporción.24:1)..Manejar.con.cui-

dado,.pipeteando.rápido.y.evitando.que.nos.salpique,.ya.que.la.solución.gotea.por.la.punta.de.la.pipeta.debido.a.la.baja.tensión.superficial.del.cloroformo..Este.paso.es.necesario.para.eliminar.restos.de.fenol.de.la.fase.acuosa.y,.en.su.caso,.restos.de.proteínas.

6..Centrifugar.a.16..000.g..durante.5.minutos.(o.~.10.minutos.a.13..000.g.).7.. Se.saca.con.cuidado.solamente.la.fase.acuosa.superior.con.una.micropipeta.y.se.pasa.a.un.

tubo.limpio.

VÍDEO

• Protocolo de la extracción de ADN con fenol:cloro-formo:alcohol isoamílico a partir de un cultivo celu-lar (Abnova).https://www.youtube.com/watch?v=JNl1kjw9ZDQ

2.. Método.CTAB

Si.partimos.de.muestras.de.origen.vegetal,.con.grandes.cantidades.de.polisacáridos.y.poli-fenoles,.es.muy.común.aplicar.el.método.CTAB.(bromuro.de.cetil.trimetil.amonio)..El.tampón.CTAB.contiene.Tris-HCl.y.2-β-mercaptoetanol.(altamente.tóxico.y.volátil),.por.lo.que.debemos.trabajar.en.la.campana.de.extracción:

. 1..Disgregación.del.tejido.con.nitrógeno.líquido.en.mortero.hasta.conseguir.un.polvo.fino.

. 2..Se.añade.1.mL.de.tampón.CTAB.2×.(precalentado.a.55.°C).por.cada.100.mg.de.tejido.vegetal.en.polvo.

. 3..Se.mezcla.por.inversión.y.se.incuba.5.minutos.

. 4..Incubación.en.hielo.durante.5.minutos.

. 5..Se.añade.RNasa.A.y.se.incuba.a.37.°C.durante.20.minutos..Debemos.invertir.el.tubo.du-rante.este.tiempo.para.asegurarnos.de.que.la.enzima.llegue.a.todo.el.tejido.

. 6..Agregar.proteinasa.K.e.incubar.a.60.°C.durante.20.minutos.(de.nuevo.invertiremos.el.tubo.varias.veces.en.este.tiempo).

. 7..Incubar.en.hielo.5.minutos.

. 8..Se.añade.la.mezcla.de.fenol:cloroformo:alcohol.isoamílico.(proporción.25:24:1).o.mezcla.de.cloroformo:alcohol.isoamílico.(proporción.24:1).y.se.agita.por.inversión.

. 9..Centrifugación.a.13..000.rpm.durante.5.-.10.minutos.(o.a.menor.velocidad.pero.en.frío).


10..Se.extrae.con.cuidado.solamente.la.fase.acuosa.superior.con.una.micropipeta.y.se.pasa.a.un.tubo.limpio.

VÍDEO

• Protocolo de la extracción de ADN mediante método CTAB a partir de hoja de tomate (Universidad Politécnica de Va-lencia).https://www.youtube.com/watch?v=nXeB1Ib13P8&t=312s

B). Métodos.inorgánicos..Precipitación.de.las.proteínas.con.sales

Esta.estrategia.se.basa.en.el.uso.de.una.solución.saturada.de.acetato.de.sodio.(CH3COONa).u.otras.sales.(NaCl,.AmOAc,.LiCl,.etc.).para.eliminar.las.proteínas.del.lisado.por.deshidratación.y.precipitación,.dejando.el.ADN.en.disolución..Evitamos.de.este.modo.el.uso.de.solventes.orgánicos.peligrosos..Estos.son.los.pasos.de.un.protocolo.básico:

1.. Se.añaden.1/10.volúmenes.de.solución.de.acetato.de.sodio.(3.M,.ajustado.a.pH.=.5,2.con.ácido.acético.glacial) para.conseguir.una.concentración.final.de.la.sal.de.0,3.M.

2..Agitar.vigorosamente,.usando.el.vórtex,.durante.15.-.30.segundos.3.. Incubar.a.–.20.ºC.durante.20.minutos,.al.menos.4..Centrifugación.a.14..000.-.16..000.g..durante.20.minutos.(a.4.ºC,.si.es.posible).5.. Se.pasa.el.sobrenadante.a.un.tubo.limpio.y.se.descarta.el.sedimento.de.restos.

C). Métodos.sobre.soporte.físico

Otra.de.las.estrategias.posibles.para.recuperar.el.ADN.de.la.muestra.es.el.uso.de.matrices.que,.en.ciertas.condiciones.de.pH.y.concentración.de.sales,.tienen.afinidad.por.los.ácidos.nucleicos.o.están.recubiertas.de.partículas.que.se.unen.a.ellos.de.manera.específica..Algunos.de.los.más.usados.incluyen:

1.. Adsorción.en.columnas.de.sílice

Los.agentes.caotrópicos.como.el.tiocinato.de.guanidio.o.el.cloruro.de.guanidinio.favorecen.la.unión.del.ADN.a.una.matriz.de.sílice. Esta.propiedad.se.explota.en.múltiples.kits.comerciales,.que.disponen.la.sílice.en.pequeñas.columnas.de.centrifugación.o.microesferas.que.permiten.obtener.buenas.concentraciones.de.ADN..Estos.métodos.comerciales.son.rápidos.pero.caros.y.es.necesario.ajustar.la.cantidad.de.muestra.y.seguir.los.pasos.detallados.por.el.fabricante.para.evitar.la.satura-ción.de.las.columnas.o.microesferas..


En.general,.los.protocolos.comienzan.con.la.adición.de.etanol.absoluto.o.de.una.solución.es-pecífica.para.favorecer.la.unión.de.los.ácidos.nucleicos.a.la.columna.de.sílice.y.una.centrifugación.inicial..Una.vez.el.ADN.está.retenido.en.la.columna,.se.lava.añadiendo.diferentes.soluciones.que.se.eliminan.por.centrifugación..Y,.finalmente,.el.ADN.se.separa.de.la.matriz.al.añadir.eluyentes.con.baja.concentración.de.sales.(agua.libre.de.nucleasas.o.tampón.TE).

VÍDEO

• Protocolo de la extracción de ADN mediante columnas de sílice a partir de muestras de sangre (Centre for Proteomic & Genomic Research). https://www.youtube.com/watch?v=gmNw6CWtN5k

FIGURA 2.2. Columna de sílice para extracción de ADN de muestras de sangre.

2.. Separación.magnética

Este.método.se.basa.en.el.uso.de.superficies,.microesferas.o.partículas.magnéticas.que.se.re-cubren.con.anticuerpos.o.reactivos.que.se.unen.al.ADN..En.primer.lugar,.se.incuba.el.ADN.junto.a.las.microesferas.para.permitir.su.unión..Después,.las.microesferas.se.atraen.a.un.lateral.del.tubo.mediante.el.imán.y.el.líquido.se.pipetea.o.decanta..Este.paso.se.repite.con.diferentes.lavados..Por.último,.procederemos.a.la.elución.del.ADN,.es.decir,.añadiremos.una.solución.específica.que.lo.ex-traerá.del.medio.sólido.que.lo.ha.absorbido,.en.este.caso.las.microesferas..En.este.paso,.se.incuban.las.microesferas.con.la.solución.de.elución.varios.minutos,.para.permitir.la.separación.del.ADN.y,.de.nuevo,.se.unen.las.microesferas.a.un.lateral.del.tubo.con.el.imán.como.en.los.pasos.anteriores..Sin.embargo,.en.último.paso.nos.quedamos.con.el.líquido,.puesto.que.contiene.el.ADN.resuspendido.


VÍDEO

• Protocolo de la extracción de ADN mediante microesferas magnéticas a partir de una librería de ADN genómico (Dr Eric Chow, University of California San Francisco UCSF).https://www.youtube.com/watch?v=hrKM7d6_8hQ

3.. Cromatografía.de.intercambio.iónico

En.este.tipo.de.cromatografía,.la.fase.estacionaria.es.una.matriz,.que.suele.ser.de.celulosa.o.agarosa,.unida.a.una.resina.con.iones.de.carga.positiva,.a.la.que.se.aplica.la.muestra.que.actúa.como.fase.móvil..En.este.caso,.los.fosfatos.del.ADN.(de.carga.negativa).interactúan.con.los.catio-nes.de.la.fase.estacionaria,.en.condiciones.de.concentración.baja.o.media.de.sales..Posteriormente,.el.ADN.se.eluye.en.medios.con.concentración.media-alta.de.sales.

4.. Métodos.rápidos.para.PCR

Existen.materiales.de.celulosa.(papel.FTA.Whatman).o.resina.(resina.Chelex).que.están.re-cubiertos.de.reactivos.para.la.lisis.celular.y.la.unión.al.ADN.y.permiten.una.rápida.extracción.de.ADN.para.proceder.directamente.a.una.PCR,.y.que.se.usan.en.estudios.forenses.o.métodos.rápidos.de.diagnóstico.genético.

2.2.4. Precipitación del ADN

Si.se.añade.suficiente.cantidad.de.un.alcohol.en.presencia.de.altas.concentraciones.de.sales,.se.consigue.que.la.atracción.entre.los.grupos.fosfato.del.esqueleto.del.ADN.y.los.iones.positivos.presentes.en.la.disolución.sea.suficiente.como.para.formar.enlaces.iónicos.y.que.el.ADN.precipite.

Esta.precipitación.se.puede.conseguir.con.diferentes.alcoholes,.pero.los.más.comunes.son.el.eta-nol.y.el.isopropanol..Si.el.volumen.de.muestra.es.pequeño,.el.alcohol.de.elección.suele.ser.el.etanol,.ya.que.la.cantidad.de.sales.que.tiende.a.co-precipitar.con.el.ADN.en.este.caso.es.menor..Por.otro.lado,.el.isopropanol.permite.una.precipitación.a.temperatura.ambiente,.usar.menores.volúmenes.de.alcohol.y.mantener.al.ARN.(de.menor.tamaño).en.la.disolución..El.procedimiento.a.seguir.es.el.siguiente:

1..Ajustar.la.concentración.final.de.las.sales.como,.por.ejemplo,.acetato.de.sodio.(NaCH3CO2 0,3.M,.ajustado.a.pH.=.5,2.con.ácido.acético.glacial).o.acetato.de.amonio.(NH4CH3CO2.2,5.M)..Este.paso.no.es.necesario.si.la.extracción.se.realizó.mediante.precipitación.proteica.con.sales..

2.. Se.añaden.2-3.volúmenes.de.etanol.enfriado.previamente.o.0,6-0,7.volúmenes.de.isopropanol.3..Mezclar.bien.por.inversión,.pero.suavemente,.para.evitar.la.fragmentación.del.ADN.genómico.4.. En.el.caso.de.muestras.con.etanol,.incubar.a.–.20.°C.al.menos.una.hora..Para.muestras.con.

isopropanol.este.paso.no.es.necesario,.aunque.se.puede.dejar.reposar.la.mezcla.5.minutos.(o.más).en.hielo.(o.a.–.20.°C).para.aumentar.la.cantidad.de.ADN.precipitado.(aunque.tam-bién.se.aumentará.el.riesgo.de.co-precipitar.sales).


5..Centrifugar.a.10..000.-.15..000.g..durante.15.-.30.minutos.a.4.°C.6..Decantar.el.sobrenadante.y.quedarnos.con.el.sedimento.

2.2.5. Purificación del ADN

Es.necesario.eliminar.de.la.muestra.restos.de.proteínas,.sales,.lipopolisacáridos.y.ARN.pequeños.que.hayan.precipitado.o.se.hayan.unido.a.la.matriz.junto.al.ADN..Con.este.fin,.se.usan.tampones.que.contienen.alcoholes.en.pasos.de.lavado.como.el.siguiente:.

1..Añadir.1.-.10.mL.de.etanol.70.%.(si.es.posible.en.frío).2..Centrifugación.a.10..000.-.15..000.g..durante.5.-.15.minutos.a.4.°C.3.. Se.decanta.el.sobrenadante..Estos.pasos.se.pueden.repetir.si.es.necesario.4.. Se.eliminan.los.restos.de.etanol.cuidadosamente.con.una.micropipeta.5.. Secar.al.aire.el.sedimento.5.-.20.minutos.

El.etanol.inhibe.técnicas.como.la.PCR,.por.lo.que.es.muy.importante.dejar.secar.bien.el.se-dimento.de.ADN.

2.2.6. Elución del ADN

El.último.paso.de.este.proceso.es.volver.a.resuspender.o.eluir.el.sedimento.de.ADN.en.una.di-lución.que.nos.permita. almacenarlo.o. seguir. realizando.diferentes. técnicas..Para. ello,. se. usan.soluciones.con.baja.concentración.de.iones.como.el.tampón.TE.o.el.H2O..En.caso.de.que.usemos.tampón.TE,.no.debemos.olvidar.que.uno.de.sus.componentes.es.el.EDTA.(inhibidor.de.la.PCR)..Mientras.que,.si.elegimos.agua.ultrapura,.debemos.mantenerla.siempre.libre.de.desoxirribonu-cleasas.y.recordar.que,.en.medios.sin.tamponar,.el.ADN.tiende.a.degradarse..

FIGURA 2.3. Representación esquemática de los pasos de extracción, precipitación, purificación y elución durante el proceso de extracción del ADN, si elegimos A) una extracción con solventes

orgánicos, o B) columnas de adsorción con matriz de sílice.


Si.necesitamos.ADN.de.alta. calidad,.por. ejemplo,.para. técnicas.de. secuenciación.masiva,.podemos.añadir.ribonucleasas.(RNasa.A),.para.eliminar.el.ARN.residual.de.nuestra.muestra..Tras.el.tratamiento.con.la.ribonucleasa,.realizaremos.nuevos.pasos.de.lavado.para.eliminar.restos.y.la.enzima,.por.lo.que.perderemos.algo.ADN.en.el.proceso..Para.evitarlo,.en.algunos.protocolos.se.incluye.la.adición.de.ribonucleasa.bien.tras.la.lisis.celular.o.en.el.paso.de.purificación.de.ADN.

2.3. Extracción de ADN plasmídico

Los.plásmidos.contenidos.en.las.bacterias.son.una.fuente.de.ADN.fácilmente.modificable.y.multipli-cable.en.cultivo,.así.como.esenciales.en.múltiples.diseños.experimentales..Al.tratarse.de.moléculas.de.ADN.circulares.y.de.menor. tamaño.que.el.cromosoma.bacteriano,.se.han.diseñado.estrategias.experimentales.para.obtener.los.plásmidos.de.manera.específica..Aunque.existen.diferentes.proce-dimientos,.el.más.común.se.basa.en.un.choque.alcalino.inicial.mediante.una.solución.de.NaOH.y.SDS.(C12H25NaO4S).para.lisar.la.pared.de.las.bacterias.y.desnaturalizar.las.proteínas.y.el.ADN..La.desnaturalización.del.ADN.consiste.en.la.ruptura.de.los.enlaces.de.puente.de.hidrógeno.entre.las.bases.del.ADN.de.doble.cadena,.transformándolo.en.ADN.de.cadena.simple..Después,.se.procede.a.una.neutralización.del.medio.con.acetato.de.potasio.(CH3CO2K).y.ácido.acético.glacial,.que.baja.el.pH.de.la.solución permitiendo.el.realineamiento.del.ADN..Este.realineamiento.es.rápido.y.sencillo.para.el.ADN.plasmídico,.que.se.queda.en.la.disolución,.pero.imposible.para.el.ADN.cromosómico.(más.grande),.que.precipita.como.también.precipitan.el.SDS.y.las.proteínas..A.este.tipo.de.protocolos.se.les.denomina.preparaciones.o.“preps”.(miniprep,.midiprep,.maxiprep,.megaprep.o.gigaprep.en.orden.cre-ciente.de.cantidad.de.bacterias.de.partida.y.de.plásmidos.obtenidos),.y.constan.de.los.siguientes.pasos:

1.. Se.centrifuga.el.cultivo.bacteriano.(11..000.rpm.durante.2.minutos).y.se.retira.el.sobrenadante.2.. Se.resuspenden.las.bacterias.en.una.solución.que.contiene.Tris.((HOCH2)3CNH2),.EDTA,.

glucosa.y.RNasa.A.3..Añadir. la. solución.de. lisis.alcalina,.mezclando.bien.pero.no.demasiado.vigorosamente..

Esta.solución.tiene.un.pH.≥.11,.muy.alcalino,.por.lo.que.es.necesario.proteger.los.ojos.y.las.manos.de.salpicaduras..

4.. Se.añade.la.solución.neutralizadora.5.. Se.eliminan.de.los.restos.mediante.centrifugación.(14..000.-.16..000 g.durante.10.minutos).

Una.vez.en.este.punto.se.procede.a.la.extracción,.precipitación.y.purificación.del.ADN.como.se.describió.anteriormente.(normalmente.mediante.adsorción.en.columnas.de.sílice).

VÍDEO

• Miniprep para la recuperación de ADN plasmídico usando el Kit QIAprep Spin de Qiagen (iGEM Academy).https://www.youtube.com/watch?v=We9_Ul8XQ6E


2.4. Extracción de ARN total

Las.moléculas.de.ARN.son.de.menor.tamaño.y.menos.estables.que.las.de.ADN.y.las.ribonucleasas.son.difíciles.de.inactivar.y.están.presentes.de.manera.ubicua.en.todos.los.organismos..Por.lo.tanto,.antes.de.comenzar.con.nuestros.experimentos.con.ARN,.es.necesario.disponer.de.una.zona.libre.de.ribonucleasas.(RNase-free)..Estas.zonas.se.limpian.con.productos.especiales.y.se.mantienen.libres.de.polvo.o.interacción.con.material.de.laboratorio.no.destinado.a.experimentos.con.ARN..Además,.nuestras.soluciones.deben.estar.libres.de.ribonucleasas.por.lo.que.se.usa.agua.tratada.con.pirocarbonato.de.dietilo.(DEPC).o.se.añaden.otros.inhibidores.comerciales.de.estas.enzimas.

Existen.diferentes.protocolos.para.la.extracción.del.ARN.total.de.una.muestra..Pero,.en.gene-ral,.encontramos.métodos.con.solventes.orgánicos.y.métodos.sobre.soporte.físico:

2.4.1. Métodos orgánicos - TRIzol

Uno.de.los.métodos.de.extracción.de.ARN.total.de.uso.más.extendido.es.el.basado.en.el.reactivo.TRIzol.(o.reactivo.TRI)..Este.método.es.una.variación.de.la.extracción.de.ácidos.nucleicos.con.fenol.y.cloroformo,.pero.en.un.medio.ácido.en.lugar.de.básico.como.ocurría.en.la.extracción.de.ADN..El.TRIzol.es.un.reactivo.comercial.que.contiene.un.40.%.en.peso.de.fenol.saturado.(pH.4,3),.tiocianato.de.guanidio.1.M,.tiocianato.de.amonio.1.M,.tampón.de.acetato.de.sodio.0,1.M.(pH.5,0).y.un.5.%.en.peso.de.glicerol,.al.que.se.le.añade.cloroformo.para.conseguir.la.formación.de.un.gradiente.con.tres.fases:.una.acuosa.que.contiene.el.ARN,.una.interfase.(donde.se.encuentra.el.ADN.gracias.a.las.propiedades.caotrópicas.del.tiocianato.de.guanidio).y.una.fase.orgánica.(en.la.que.encontramos.proteínas.y.otros.restos.de.ADN)..Antes.de.realizar.este.protocolo.debemos.recordar.que.es.necesario.conservar.el.reactivo.TRIzol.en.oscuridad.y.refrigerado,.y.que.debemos.trabajar.en.campana.de.flujo.laminar.y.con.protección.frente.a.salpicaduras,.ya.que.los.reactivos.(fenol,.cloroformo).son.corrosivos,.irritantes,.volátiles.y.muy.peligrosos..

Partiendo.de.una.suspensión.celular.o.de.un.tejido.disgregado.mecánicamente,. los.pasos.a.seguir.son.los.siguientes:

. 1..Se.añade.1.mL.de.TRIzol.por.cada:.50. -.100.g.de. tejido,.10.cm2.de.placa.de.cultivo,.5.-.10.·.106.células.eucariotas.o.107.células.procariotas.

. 2..Mezclar.bien.usando.vórtex.e.incubar.5.minutos.en.hielo.

. 3..Se.añade.0,2.mL.de.cloroformo.por.cada.1.mL.de.TRIzol.

. 4..Mezclar.bien.usando.el.vórtex.e.incubar.3.minutos.

. 5..Centrifugación.a.máxima.velocidad.en.una.microcentrífuga.de.mesa.(12..000.g).durante.5.-.15.minutos.a.4.°C.

. 6..Se.transfiere.con.una.micropipeta.la.fase.superior.acuosa.(transparente).a.un.tubo.limpio,.descartando.la.interfase.(blanca).y.la.fase.inferior.(rosa).

. 7..Se.añade.1.mL.de.isopropanol.por.cada.1.mL.de.TRIzol.usado.y.se.mezcla.bien.por.inver-sión.y.se.incuba.durante.5.minutos.

. 8..Centrifugación.a.máxima.velocidad.(12..000.g).durante.10.-.30.minutos.a.4.°C.

. 9..Se.descarta.el.sobrenadante.10..Se.añade.1.mL.de.etanol.70.%.por.cada.1.mL.de.TRIzol.usado.y.se.resuspende.el.sedimento.


11..Centrifugación.a.7.500.g.durante.5.-.10.minutos.a.4.°C.12..Se.elimina.el.sobrenadante.volcando.el.tubo.(el.ARN.se.encuentra.en.el.sedimento).13..Secar.el.sedimento.durante.5.minutos.en.un.baño.seco.a.55.°C.o.al.aire.hasta.que.desapa-

rezca.cualquier.resto.de.etanol.14..Se.resuspende.en.agua.tratada.con.DEPC..

Si.queremos.eliminar.cualquier. resto.de.ADN.de.nuestra.muestra,.podemos.proceder.a.un.tratamiento.con.desoxirribonucleasas.(DNasa.I),.que.aumentará.la.pureza.del.ARN.pero.nos.hará.perder.algo.de.concentración.

VÍDEO

• Protocolo de la extracción de ARN total con TRIzol a partir de un cultivo celular (Abnova).https://www.youtube.com/watch?v=RmPsLoIPRwc

2.4.2. Métodos sobre soporte físico

En. este. caso,. de. nuevo. nos. encontramos. con. diferentes.matrices,. normalmente. de. sílice,. dis-puestas.en.columnas.para.centrifugación,.microesferas.magnéticas.o.membranas.de.filtrado.que.permiten.una.rápida.obtención.del.ARN.de.la.muestra..El.fundamento.vuelve.a.ser.la.creación.de.las.condiciones.necesarias.para.la.unión.del.ARN.a.la.matriz.(adición.de.etanol.u.otras.soluciones.específicas).y.el.lavado.del.resto.de.macromoléculas.pero,.al.tratarse.de.kits.comerciales,.los.pro-tocolos.a.seguir.son.los.detallados.por.el.fabricante.en.cada.caso..

2.5. Extracción de ARN mensajero

La.mayoría.de.las.técnicas.enfocadas.al.estudio.de.la.expresión.génica.requieren.de.la.obtención.de.ARNm.de.alta.calidad.sin.la.interferencia.de.otros.tipos.de.ARN.o.de.restos.de.ADN..Para.ello,.lo.más.común.es.aprovechar. la.poliadenilación.que.ocurre.de.manera.natural.en.el.ARNm,.es.decir,.se.aprovecha.la.adición.de.una.cola.de.nucleótidos.de.adenina.(cola.poli-A).que.se.produce.durante.la.maduración.del.ARNm,.para.purificar.estas.moléculas.de.manera.selectiva..Esto.se.con-sigue.mediante.el.uso.de.microesferas.o.columnas.recubiertas.de.oligonucleótidos.de.desoxitimi-dina.(oligo-dT).que.se.unen.a.esta.cola.poli-A..Un.protocolo.clásico.consta.de.los.siguientes.pasos:

. 1..Se.pipetean.250-500.μg.de.la.solución.de.ARN.total.obtenidos.por.cualquiera.de.los.mé-todos.anteriores.y.se.completa.el.volumen.hasta.250.μL.con.agua.libre.de.RNasas.

. 2..Se.añaden.250.μL.de.solución.de.unión.2×.y.se.mezcla.usando.el.vórtex..

. 3..Se.mezcla.bien.con.15.μL.de.microesferas.recubiertas.de.oligo-dT.usando.el.vórtex..

. 4..Incubación.a.70.°C.durante.3.minutos.para.desnaturalizar.el.ARN.


. 5..Se.saca.la.mezcla.del. incubador.y.se.deja.enfriar.a. temperatura.ambiente.alrededor.10.minutos,.para.permitir.la.unión.del.ARNm.al.los.oligo-dT.de.las.microesferas.

. 6..Centrifugación.a.14..000.-.18..000.g.durante.1.-.2.minutos..

. 7..Se.quita.el.sobrenadante.con.cuidado,.dejando.algo.de.líquido.para.evitar.arrastrar.el.pellet.de.microesferas.y.ARNm.

. 8..Se.añaden.500.μL.de.solución.de.lavado.y.se.resuspende.bien.el.pellet.usando.el.vórtex.

. 9..Se.pasa.el.líquido.a.una.columna.de.filtrado.depositada.dentro.de.un.tubo.para.centrifugación.10..Centrifugación.a.14..000.-.16..000.g.durante.2.minutos..11..Se.descarta.el.líquido.y.se.cambia.la.columna.de.tubo.12..Se.añaden.500.μL.de.solución.de.lavado.y.se.centrifuga.a.14..000.-.16..000.g.durante.2.minutos.13..Se.descarta.el.líquido.y.se.pasa.la.columna.a.un.nuevo.tubo.14..Se.calienta.la.solución.de.elución.a.70.°C.y.se.añaden.50.μL.a.la.columna.*15..Incubación.durante.2.-.5.minutos.a.70.°C.16..Centrifugación.a.14..000.-.16..000.g.durante.1.minuto.17..Repetir.los.pasos.de.elución.(desde.el.marcado.mediante.*).una.vez.más..

VÍDEO

• Protocolo de la purificación de ARNm a partir de ARN total (Abnova).https://www.youtube.com/watch?v=4FLThf7r3ZE

2.6. Concentración y pureza de los ácidos nucleicos

Los.ácidos.nucleicos.absorben.la.luz.ultravioleta.a.diferentes.longitudes..Se.calcula.que.una.den-sidad.óptica.(DO).a.260.nm.equivale.a.50.μg/mL.de.concentración.ADN.o.40.μg/mL.de.concen-tración.de.ARN..

Del.mismo.modo,.para.calcular.la.pureza.de.los.ácidos.nucleicos,.se.mide.la.absorbancia.a.260.nm,.a.280.nm.y.a.230.nm.y.se.comparan.medidas.del.espectrofotómetro,.de.este.modo:

ODOD

1,8.ADN.puro.(rango.aceptable.1,7.-.2,0)260

280

ODOD

2,0.ARN.puro.(rango.aceptable.1,9.-.2,2),.ácidos.nucleicos.puros.(una.ratio.menor.indica.contaminación)260

280

ODOD

(rango.aceptable.1,8.-.2,2)260

230

ODOD

2,0.ARN.puro.(rango.aceptable.1,9.-.2,2),.ácidos.nucleicos.puros.(una.ratio.menor.indica.contaminación)260

280

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