Soluciones para Microbiología Industrial...(paso 1) Calentamient o del tubo (paso 2) Enfriamiento...
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BioControl Systems, Inc.
Bellevue - Seattle- USA
Soluciones para
Microbiología Industrial
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Método de PCR en
Tiempo Real validado
por SAG para
muestras oficiales de
productos cárnicos (matrices del programa de reducción de
patógenos)
Marzo 2011
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Amplificación de PCR: Una reacción = Un ciclo
Cómo funciona el PCR ?
Los primers se unen
a la secuencia
complementaria del
target cuando se
enfría
(55 C)
La Taq polimerasa
elabora nuevas
cadenas de ADN
(72 C)
Separación de las 2
cadenas cuando se
calienta (95 C)
A
AGTC
C
T
T
AG
A
AGTC
C
T
T
AG
A
AGTC
TCA
C
T
T
AG
A
TC
Todo el proceso se repite con los
cambios de temperatura
Paso 1 – Desnaturalización del ADN
Paso 2 - Primers
Paso 3 - Extensión
Paso 4 – Se repite el ciclo
Paso 5 - Detección
El producto terminado de este proceso
debe ser detectado para determinar si
el target estaba presente
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La evolución del método de PCR…Electroforesis – 1a.
Generación de PCR
Lectura multicanales
Bloque sólido Curva de fusion
( 2a. Generación)
Rotor Gene 3a.
Generación
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No son necesarias 3 salas separadas...
Las tres partes del método PCR
Preparación
de Muestra
Equipo
Preparación
de Reactivos
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6
Preparación de la muestra
Usar PickPen
para capturar
la bacteria Vortex
Adición del
reactivo de
Concentración
(immunobeads) y
la solución de
lavado
Enriq. de
la Muestra
Assurance
Adición de
1ml de la
muestra
10 min
Preparación de
la Muestra
Transferir immunobeads al
buffer con MgCl
Separación ImmunoMagnética
PickPen => Innovación
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¿Cómo funciona la PickPen ?
Immunobeads
con
anticuerpos
Bacteria se une
a los
anticuerpos
8 imanes protegidos
por puntas de silicón
atrapan los
immunobeads.
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Comparación de los
procedimientos
Enriq. de
muestra
Assurance GDS
2a. GeneraciónEnriq.
muestra
Adición
0.005ml
Muestra
95°C37°C
20 min 10 min 5 min
Adición de
(immunobeads)Adición 1ml
muestra
Adición
proteasaAdición
reactivo
para lisis
Calentamiento
del tubo
(paso 1) Calentamient
o del tubo
(paso 2)Enfriamiento
tubo de lisis
Diluie
Concentra
Vortex por
10 minutos
Usar PickPen para
capturar las perlas
metalicas con las
bacterias.
Transferir
para buffer
MgCl
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Sistema de Reactivos Primers específicos + Sonda DNA => PCR en Tiempo Real
Dos niveles adicionales de especificidad
Primers específicos al target
Sistema de sonda específica – MGB Eclipse Probe
Sistema de
Reactivos
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¿Cómo funciona la sonda?
hv
MGBProbe bound to target, ( fluorescence emitted )
Correlación directa entre la cantidad de fluorescencia y la cantidad del DNA target
Si la sonda está en solución, ¿qué pasa?• Su formato no es lineal• Marcador fluorescente está inhibido
F = Fluoroforo
Q= Quencher
MGB = Minor Groove
Binder
Cuando la sonda se une al target…La sonda se vuelve lineal• El marcador genera fluorescencia.
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Termociclador Centrífugo con
intercambio de aire
Formato rotativo
Multi Canal – 3 canales con
diferentes longitudes de onda
Plataforma del Instrumento
Assurance GDS Rotor-GeneTM
Instrumento
Objetivo: Tener una plataforma de Detección y
Amplificación Rápida y Fácil de usar
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PCR de 2a Generación (Curvas de Fusión)
vs PCR – Tiempo Real ( sondas)
Instrumento
PCR-TR
PCR con curvas de fusión
La fluorescencia es inmediatamente
detectada y la linea aparece en la
pantalla.La fluorescencia se acumula y después se
sube la temperatura para desnaturalizar el
DNA y la fluorecencia disminuye.
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¿Cómo leemos los resultados usando el GDS?
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Transferindo Inmunobeads para
bandeja con buffer MgCl.
Inmunobeads +
buffer MgCl
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Colocando TAQ – Polymerase en
los tubos GDS de amplificación
Dentro de los tupos de amplificación están: Primers + Nucleótidos + Sonda
MGB(Tiempo Real) + Controle Interno. Todo en formato de pastilla blanca liofilizada.
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Transferindo los inmunobeads para los
tubos de amplificación usando pipeta
multicanal...
Beads
con las
bacterias
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Colocando los tubos en el termociclador
(Rotor Gene)
Entrar con nombre de
muestras
Colocar tubos amplificación
en el RotorGene
Ler los resultados en 75min.
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Resultados
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E. coli 0157:H7
E. coli 0157:H7 Shiga toxins
Listeria monocytogenes
Listeria spp.
Salmonella spp.
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