Resumen

Resumen 277

Trypanosoma cruzi es el parsito protozoario agente etiolgico de la enfermedad de

Chagas, que afecta a millones de personas en el mundo, siendo la vinchuca (Triatoma

infestans) el principal insecto vector de su transmisin en nuestro pas. El parsito se

caracteriza por utilizar un husped vertebrado y otro invertebrado para completar su

ciclo de vida, sufriendo transformaciones morfolgicas y bioqumicas durante las

diferentes estados.

Estudios biolgicos, genticos, bioqumicos e inmmunolgicos realizados sobre

cepas de diferentes orgenes, permitieron su clasificacin filogentica en dos linajes

principales: el linaje 1, que comprende las cepas con ciclo de vida salvaje, menos

infectivas, y el linaje 2, que agrupa a las cepas ms infectivas, asociadas al ciclo

domstico y, por lo tanto, a la enfermedad de Chagas.

Las glicoprotenas tipo mucina estn ancladas a la superficie de T. cruzi por medio

de glicosilfosfatidilinositol y sus cadenas O-glicosdicas se encuentran unidas a residuos

de Ser Thr de la protena a travs de -N-acetilglucosamina (-GlcNAc), en lugar de N-acetilgalactosamina (-GalNAc), como ocurre en mucinas de vertebrados. La funcin de estas glicoprotenas consiste en la adhesin y proteccin de la superficie celular del

parsito. Asimismo, son aceptoras de cido silico en la reaccin catalizada por la

enzima trans-sialidasa, tambin localizada en la superficie del parsito, que es decisiva

para la infeccin.

La estructura de la porcin glicosdica de las mucinas de T. cruzi depende en gran

medida del linaje y del estado en el que el parsito se encuentra. Se sabe que las

cadenas O-glicosdicas de mucinas de algunas de las cepas del linaje 1 contienen el

core -D-Galf-(1l4)-GlcNAc, que puede estar sustitudo con una varias unidades de Galf y/o Galp, mientras que las estructuras halladas en las cepas ms infectivas del

linaje 2, que provienen del core -D-Galp-(1l4)-GlcNAc, se encuentran sustitudas slo por galactosa piransica. La presencia de galactofuranosa, que no es biosintetizada

por mamferos, en la estructura del glicano sugiere que es posible una relacin entre

estas estructuras y los diferentes grados de infectividad mostrados por cepas de los

distintos linajes.

El objetivo principal de este trabajo de Tesis consisti en la sntesis de

oligosacridos de mucinas del linaje 1 de T. cruzi, que contienen -galactofuranosa en su estructura, dando continuidad a los estudios previamente iniciados en nuestro

laboratorio. Para ello se necesitaban desarrollar estrategias de sntesis que permitieran

la construccin de las estructuras ms complejas con el mejor rendimiento y

diastereoselectividad en la formacin de los enlaces glicosdicos, utilizando adems el

menor nmero de pasos. Esto implicaba contar con un mtodo suave de glicosidacin,

278 Resumen

que conservara intactas las uniones ms lbiles de galactofuranosa y la eleccin

cuidadosa de los grupos protectores, para minimizar la exposicin de los compuestos

intermedios a condiciones rigurosas.

Como primer objetivo, se encar la sntesis del tetrasacrido -D-Galp-(1l3)--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (III) que se describe en el Captulo 2, que haba sido aislado como el alditol correspondiente 40, por -eliminacin de las mucinas de las cepas G, Dm28c y Tulahuen del linaje 1. Teniendo como antecedente la sntesis del

trisacrido -D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (II), se dise una ruta convergente para obtener el tetrasacrido III, por condensacin del derivado de -D-Galf-(14)-D-GlcNAc 28 con su OH-6 libre, con el donor derivado de -D-Galp-(13)-D-Galp 37. El aceptor 2,3,5,6-tetra-O-benzol--D-galactofuranosil-(1l4)-2-acetamido-3-O-benzol-2-desoxi--D-glucopiransido (28) se construy a partir del bencil glicsido de GlcNAc 22, puesto que una vez finalizada la sntesis, conducira por reduccin cataltica

al tetrasacrido libre III que, por reduccin con NaBH4, dara el alditol 40

correspondiente. El compuesto 22 se protegi selectivamente en la posicin 6 primaria con t-butildifenilsilil ter y, posteriormente, fue selectivamente benzoilado en la posicin

3, utilizando N-benzoilimidazol. Una vez obtenido el aceptor de GlcNAc 24, se deba introducir la unidad de Galf en posicin 4, para lo cual se ensayaron dos mtodos de

glicosidacin. En primer lugar, la aplicacin del mtodo que emplea galactofuranosa

perbenzolada (11) como donor y SnCl4 como promotor, que ha sido ampliamente utilizado en nuestro laboratorio, condujo al disacrido 25 buscado, pero con rendimiento moderado. A continuacin, se aplic el mtodo de tricloroacetimidato, que utiliza

condiciones ms suaves durante el paso de glicosidacin. De esta manera, por empleo

del tricloroacetamidato de O-(2,3,5,6-tetra-O-benzol--D-galactofuranosilo) (27) y TMSOTf como catalizador, se obtuvo 25 con mejor rendimiento. La remocin del TBDPS- en 6 de 25 fue realizado con HF diludo en acetonitrilo, puesto que el medio dbilmente cido permiti la obtencin del aceptor 28 sin hidrolizar el enlace galactofuranosdico.

Para la sntesis del disacrido donor se utiliz el compuesto 2,3,4,6-tetra-O-acetil--D-galactopiranosil-(1l3)-1,4,6-tri-O-acetil-2-O-pivalol--D-galactopiranosa (29p), que ya haba sido sintetizado en nuestro laboratorio a partir de 5,6-isopropilidn-2-O-pivaloil-D-

galactono-1,4-lactona (31), como precursora de la Galp del extremo reductor. El HO-anomrico de 29p se desacetil con un mtodo selectivo y luego se activ por transformacin en el tricloroacetimidato correspondiente 37. Una vez obtenidos el

aceptor de -D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc 28 y el donor de -D-Galp-(1l3)-D-Galp 37, se realiz la reaccin de glicosidacin en condiciones suaves, que dio el tetrasacrido 38

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diastereoselectivamente, con unin (1l6), por la presencia del grupo pivalolo asistente en C-2 del donor. El tratamiento de 38 con metxido de sodio en metanol y su

posterior hidrogenacin cataltica, condujo al tetrasacrido libre -D-Galp-(1l3)--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (III). La reduccin de III con NaBH4 dio el alditol correspondiente 40, cuyas seales espectroscpicas coincidieron con las descriptas

para el producto obtenido por -eliminacin reductiva de las mucinas de T. cruzi, confirmndose as, por sntesis qumica, esta estructura.

Continuando con la sntesis de oligosacridos constituyentes de mucinas de T.

cruzi, se sintetiz el pentasacrido -D-Galp-(1l2)-[-D-Galp-(1l3)]--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (IV), tambin presente en mucinas de las cepas G, Tulahuen y el clon Dm28c. Como se describe en el Captulo 3, para esta sntesis se utiliz una ruta

convergente que condensaba el aceptor derivado de -D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc 28, previamente empleado en la sntesis del tetrasacrido III, con un donor derivado de -D-Galp-(1l2)-[-D-Galp-(1l3)]-D-Galp 42, que era necesario construir. Para ello se consideraron dos caminos de sntesis y se demostr que la ruta sinttica clsica, que

parta del precursor piransico bencil 4,6-di-O-bencilidn--D-galactopiransido (51) para la sntesis del donor 42, dio mejores rendimientos y present menor complejidad en las etapas de purificacin, comparada con la sntesis que parta de 5,6-O-isopropilidn-D-

galactono-1,4-lactona, que haba sido evaluada en primer lugar y que previamente haba

dado muy buen resultado en la construccin de 29p, como sintn para el tetrasacrido

III.

La glicosidacin del tricloroacetimidato de O-(4,6-di-O-acetil-2,3-di-O-(2,3,4,6-tetra-

O-acetil--D-galactopiranosil)--D-galactopiranosilo) (42) obtenido con el aceptor 28 consisti en el paso clave de esta sntesis, pues el donor careca de grupo asistente en

C-2 que favoreciera la formacin del -glicsido. Luego de un primer ensayo empleando CH2Cl2 como solvente, en el que se obtuvo mayoritariamente el glicsido (1l6), la glicosidacin se realiz en acetonitrilo, por sus conocidas propiedades como solvente

participante. Se obtuvo as, de manera diastereoselectiva y como nico producto, el

pentasacrido 57 con enlace (1l6). La desacilacin de 57 condujo al bencil -D-galactopiranosil-(1l2)-[-D-galactopiranosil-(1l3)]--D-galactopiranosil-(1l6)-[-D-galacto-furanosil-(1l4)]-2-acetamido-2-desoxi--D-glucopiransido (58), que ms adelante sera estudiado como aceptor en la reaccin de trans-sialidacin enzimtica.

En particular, el minucioso anlisis de los espectros de RMN mono y bidimensionales

permiti la asignacin de las seales de los H-3 de las Galp terminales de 58, que sera decisivo para determinar el sitio de sialilacin en dicha reaccin. Por hidrogenlisis de

58, se obtuvo el pentasacrido libre IV, objeto de sntesis, que a continuacin se redujo

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con NaBH4 dando el alditol correspondiente 59, cuyas seales en los espectros de RMN 1H y 13C, resultaron coincidentes con las del alditol obtenido de fuente natural.

En el Captulo 4 de esta Tesis se describe la sntesis del hexasacrido -D-Galp-(1l2)-[-D-Galp-(1l3)]--D-Galp-(1l6)-[-D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc (VIII), presente en cepas G, Dmc28 y Tulahuen del linaje 1, como as tambin la de dos

trisacridos de estructuras parecidas, -D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VI) y -D-Galf-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VII), que ms recientemente se haban encontrado en mucinas de la cepa Tulahuen. Dado que la estructura del trisacrido VI

se encuentra contenida en la del hexasacrido VIII, se pens en una ruta convergente

que involucrara algn precursor comn a ambos oligosacridos. La ruta que se dise

para la sntesis de VIII consideraba al tricloroacetimidato donor 42 y a un trisacrido

aceptor con el HO-6 libre, derivado de -D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc 60, de manera similar a la estrategia utilizada para el pentasacrido IV.

El desafo principal de esta etapa consisti en la sntesis del aceptor 60 de difcil construccin, pues la estructura contena una Galf interna unida a la posicin 4 menos

reactiva de la GlcNAc. Para ello se utilizaron el derivado de D-galactono-1,4-lactona con

el HO-2 libre 69, como precursor de la Galf interna, el donor 33 para la Galp terminal del extremo no reductor y el aceptor derivado de GlcNAc 24, con el HO-4 libre, ya utilizado

en la sntesis del tetrasacrido III. As, por empleo del mtodo de la aldonolactona se

obtuvo el tricloroacetimimidato derivado de -D-Galp-(1l2)-D-Galf 61, listo para condensarse con el aceptor 24. Este paso era interesante, pues consista en la

construccin del enlace (1l4) a partir de un donor furansico que careca de grupo asistente en C-2 y se encontraba sustitudo por una -Galp en dicha posicin. Puesto que no se encuentra descripto el uso de solventes participantes con donores furansicos

sin asistencia anquimrica, se procedi a estudiar la glicosidacin de 61 con el aceptor 24 en diferentes solventes y condiciones, para obtener diastereoselectivamente el

trisacrido con unin . Dicha reaccin se ensay primeramente en CH2Cl2, como solvente no participante de baja polaridad, y luego en acetonitrilo y ter etlico para

analizar el efecto de estos solventes participantes. Este estudio permiti sintetizar el

compuesto bencil 2,3,4,6-tetra-O-acetil--D-galactopiranosil-(1l2)-3,5,6-tri-O-benzol--D-galactofuranosil-(1l4)-2-acetamido-3-O-benzol-6-O-tert-butildifenilsilil-2-desoxi--D-glucopiransido (78) con buena diastereoselectividad, empleando acetonitrilo como solvente de reaccin. La desproteccin selectiva del TBDPS- en -6 de 78, permiti obtener el compuesto 60, clave para ambas sntesis. Una parte del producto se

desprotegi totalmente, siguiendo la metodologa descripta para los oligosacridos III y

IV, dando el trisacrido VI buscado, mientras que otra parte se glicosid con el donor 42

Resumen 281

en acetonitrilo para generar diastereoselectivamente el hexasacrido con enlace

(1l6). Las posteriores reacciones de desproteccin por los mtodos habituales condujeron al hexasacrido libre VIII, objeto de sntesis. Los azcares libres VIII y VI

se redujeron en el extremo reductor para dar los respectivos alditoles, 84 y 81, cuyas caractersticas espectroscpicas se compararon con las descriptas y coincidieron con

ellas.

Como se mencion anteriormente, junto con -D-Galp-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VI) se haba aislado otro trisacrido de estructura -D-Galf-(1l2)--D-Galf-(1l4)-D-GlcNAc (VII). La semejanza entre ambas estructuras determin que se sintetizara VII a travs de una estrategia similar a la utilizada para el trisacrido VI, en

la que se reemplaz el donor de Galp por un donor de Galf. Nuevamente se realiz un

estudio de glicosidacin en CH2Cl2, acetonitrilo y ter etlico como solventes, para

analizar sus efectos en el curso de la glicosidacin hacia el enlace Galf-(1l4). En estos ensayos se comprob que el uso de solventes participantes no mejor la

diastereoselectividad ni el rendimiento obtenido inicialmente al emplear CH2Cl2. El

trisacrido alditol 90, derivado de esta ltima sntesis mostr propiedades espectroscpicas coincidentes con las descriptas para el alditol natural.

Los oligosacridos y sus respectivos alditoles, sintetizados en nuestro laboratorio

podran resultar de utilidad para la identificacin de cepas de Trypanosoma cruzi.

Para completar los objetivos de este trabajo de Tesis, se estudi la trans-sialidacin

del bencil pentasacrido 58, como modelo del pentasacrido IV que es la estructura

mayoritaria en las mucinas de la cepa G, que presenta dos unidades de -D-Galp terminales para ser sialiladas por la enzima TcTS. En el Captulo 5 se describe en

primer lugar la sntesis de bencil 2,3-di-O--D-galactopiranosil--D-galactopiransido (91), cuya estructura se encuentra contenida en el pentasacrido IV y en el

hexasacrido VIII, para ser utilizado como modelo ms simple en la determinacin del

sitio preferido de sialilacin. La reaccin de trans-sialidacin de 91 se realiz a escala preparativa y el producto aislado se analiz por espectroscopa de masa y de RMN

mono y bidimensional. De esta manera, la determinacin del sitio de sialilacin se

simplific, concluyndose que se incorporaba una nica molcula se cido silico en la

unidad terminal de Galp-(1l3), menos impedida estricamente y ms expuesta. Por su parte, la trans-sialidacin preparativa sobre el bencil glicsido 58 tambin

produjo un nico producto de sililacin S-58, que fue aislado y su estructura determinada por metodos espectroscpicos. As, por espectroscopa de masas se determin que se

encontraba monosialilado y por medio de un minucioso anlisis de los correspondientes

espectros de RMN mono y bidimensionales (COSY, HETCOR, TOCSY y NOESY) se

282 Resumen

pudo concluir que el sitio preferido de sialilacin result ser la unidad terminal de Galp

unida en (1l3) a la Galp interna, tal como haba sido demostrado para el bencil trisacrido 91, empleado como modelo.

La sntesis de 2,3 di-O-(-D-galactopiranosil)-D-galactitol (92) y el posterior anlisis de la selectividad de la enzima en un ensayo preparativo con dicho compuesto,

demostr que la estructura abierta en zig-zag del D-galactitol dejara a ambas Galp

accesibles, siendo reconocidas casi de igual manera por la TcTS.

En conclusin en este trabajo se present:

- Un panorama de las funciones, estructuras y diversidad de las glicoprotenas tipo

mucina en Trypanosoma cruzi y su relacin con la enzima trans-sialidasa.

- La descripcin detallada de la sntesis de cinco oligosacridos de estructura

novedosa y sus correspondientes alditoles, que permiti corroborar las estructuras

descriptas para los oligosacridos aislados de fuente natural.

- La determinacin del sitio de sialilacin en un derivado del pentasacrido IV y en

dos trisacridos modelo ms pequeos, por la enzima TcTS recombinante.

Parte de este trabajo dio lugar a las siguientes publicaciones:

1. Synthesis of -D-Galp-(1l3)--D-Galp-(1l6)-[-D-Galf-(1l4)]-D-GlcNAc, a tetrasaccharide component of mucins of Trypanosoma cruzi.

Carola Gallo-Rodriguez, M. Agustina Gil Libarona, Vernica M. Mendoza, Rosa M.

de Lederkremer

Tetrahedron, 2002, 58, 9373-9380.

2. Synthesis of 2,3-di-O-(-D-Galp)-D-Galp, a synthon for the mucin oligosaccharides of Trypanosoma cruzi.

Vernica M. Mendoza, Carola Gallo-Rodriguez and Rosa M. de Lederkremer

Arkivoc 2003, X, 82-94. (Commemorative Issue in Honor of Prof. Roberto A. Rossi on his 60th Anniversary and Prof. Edmundo A. Rveda on his 70th Anniversary).

3. Selective sialylation of 2,3-di-O-(-D-galactopyranosyl)-D-galactose catalyzed by Trypanosoma cruzi trans-sialidase.

Rosala Agusti, Vernica M. Mendoza, Carola Gallo-Rodrguez and Rosa M. de

Lederkremer. Ambos autores contribuyeron de igual forma a este trabajo. Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 541-552.

Resumen 283

4. Synthesis of the pentasaccharide, O-linked in glycoproteins of Trypanosoma

cruzi, and selective sialylation by recombinant trans-sialidase.

Vernica M. Mendoza, Rosala Agusti, Carola Gallo-Rodrguez and Rosa M. de

Lederkremer.

Carbohydrate Research 2006, 341, 14881497.

5. Comparative rates of sialylation by recombinant trans-sialidase and inhibitor

properties of synthetic oligosaccharides from Trypanosoma cruzi mucins-

containing galactofuranose and galactopyranose.

Rosala Agusti, M. Eugenia Giorgi, Vernica M. Mendoza, Carola Gallo-

Rodriguez and Rosa M. de Lederkremer.

Bioorganic & Medicinal Chemistry 2007, 15, 26112616.

FG