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Seminarios en Biotecnología y Bioseguridad de OGMs
1
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
BIOPROCESOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
24 de agosto de 2017
2
Todos los seres vivos contienen miles de proteínas
con estructura y funciones muy diferentes.
Son macromoléculas conformadas largas cadenas de aminoácidos
¿QUÉ SON LAS PROTEÍNAS?
Hormona del crecimiento humano
https://es.123rf.com/photo_14568680_estructura-quimica-de-la-hormona-de-crecimiento-humana-hgh--una-hormona-natural-que-se-utiliza-como-.html
3
Las proteínas determinan la forma y la estructura de las
células y dirigen casi todos los procesos vitales.
• ESTRUCTURAL: tejidos de sostén, confieren elasticidad y
resistencia a órganos y tejidos.
• DEFENSA: Anticuerpos, toxinas, venenos
• REGULADORA: Hormonas, enzimas
• MOTILIDAD: miosina y actina, facilitan la contracción muscular
• TRANSPORTE : hemoglobina y la mioglobina, transportadoras del O2
• RESERVA ENERGÉTICA: lactoalbúmina de la leche o a ovoalbúmina
de la clara de huevo, la hordeina de la cebada y la gliadina del
grano de trigo
• ENZIMÁTICA: catalizadores
• RECONOCIMIENTO DE SEÑALES: receptores
FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS
¿CUÁLES SON LAS FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS?
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
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¿CÓMO SE APLICAN LAS PROTEÍNAS?
APLICACIÓN
•Biomedicina
•Alimentos
•Química de la
Transformación
•Reactivo químico
•Medio ambiente
•Agente terapéutico
•Vacunas
•Diagnóstico
•Procesos industriales•Aditivos•Nutracéuticos
•Suplemento alimenticio
•Industria del papel
•Industria textil y del cuero
•Industria farmacéutica
•Industria química
•Reactivo analítico
•Energía y combustibles
•Tratamiento de residuos
•Humanos
•Animales
•Plantas
•Catálisis enzimática
•Síntesis
estereoselectiva
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
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¿CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS?
DNA RNAm PROTEÍNA
Tanscripción(RNA polimerasa)
Traducción(Ribosomas)
Modificaciones Postraduccionales
(RE-AG)
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
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¿QUÉ SON LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
Proteína producida en un
organismo foráneo o no
nativo o cuya secuencia
génica codificante ha sido
manipulada
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
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EJEMPLOS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Protein Expression Systems Market, Roots Analysis Private Ltd. 2015 Martha Guerrero Olazarán [email protected]
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EJEMPLOS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Protein Expression Systems Market, Roots Analysis Private Ltd. 2015
http://www.pichia.com/science-center/commercialized-products/
Todas ellas consideradas como biológicos o biofármacos
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
Combina in vitro material
genético distintas fuentes y
transfiere a un organismo
receptor para crear
organismos genéticamente
modificados (OGM u OVM)
que adquieren un genotipo y
fenotipo alterado.
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¿ CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
POR INGENIERÍA GENÉTICA (TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE)
Vector oplásmido
Gen de interés
Plásmidorecombinante
Célula Modificada(OGM)
Genoma nativo
Célula procariota
Célula eucariota
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¿ CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
SE EMPLEAN SISTEMAS DE EXPRESIÓN
Hospedero: Organismo receptor que es
modificado para producir la proteínarecombinante
Vector de expresiónMolécula de DNA que transporta lasecuencia codificante de la proteína ysecuencias que regulan su expresión.
Técnicas • Transformación (Transferencia de DNA)• Selección de transformantes• Regulación de la expresión génica
OGM
Proteína recombinante
SISTEMAS DE EXPRESIÓN
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¿ POR QUÉ PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
11 toneladas de páncreas
100,000 cerdos
Extracción y
purificación
Hoechts
Insulina de cerdo
o de vaca
50 páncreas de
cerdo para
tratamiento anual
Alergias
Costo elevado
Contaminación
Producción de
Insulina en gran
cantidadExtracción y
purificación
Insulina
humana
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¿ POR QUÉ PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
• Producción de proteínas específicas y auténticas
• Incrementar los niveles de producción
• Facilitar su purificación
• Mejorar o modificar las propiedades biológicas de las proteínas
por Ingeniería de proteínas
• Concentraciones muy bajas
• Contaminación con toxinas
u otras moléculas traza
• Altos costos
• No idénticas
Aislamiento
purificación
FUENTES NATURALES
VENTAJAS
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¿ CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
Sistemas
microbianosSistemas de Expresión
Eucariota
Células de mamífero
Células de plantas
Células de insectos
Animales y plantas transgénicas
Algas
Protozoarios
Hongos
Levaduras
Procariota Bacterias
LOS HOSPEDEROS DE LOS
SISTEMAS DE EXPRESIÓN Características de la
proteína
Aplicación de la
Proteína
Tipo de Bioproceso• Cultivo• Propagación
Martha Guerrero Olazarán
ORIGEN DE LA PROTEINA• Procariota
• Eucariota
•Secuencia nucleotídica •Uso de codones
preferenciales
•Tamaño
•pI
•Modificaciones
postraduccionales
•Proteólisis
•pH
•Temperatura
•Extracelular
•Intracelular
PROPIEDADES DE
LA PROTEINA
•Propiedades químicas
•Estabilidad
•Toxicidad
•Destino celular
•Grado de pureza
FACTORES DETERMINANTES EN LA SELECCIÓN DE UN SISTEMA
DE EXPRESIÓN
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
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FACTORES DETERMINANTES EN LA SELECCIÓN DE UN SISTEMA
DE EXPRESIÓN
APLICACIÓN
•Biomedicina
•Alimentos
•Química de la
Transformación
•Reactivo químico
•Medio ambiente
•Agente terapéutico
•Vacunas
•Diagnóstico
•Procesos industriales•Aditivos•Nutracéuticos
•Suplemento alimenticio
•Industria del papel
•Industria textil y del cuero
•Industria farmacéutica
•Industria química
•Reactivo analítico
•Energía y combustibles
•Tratamiento de residuos
•Humanos
•Animales
•Plantas
•Catálisis enzimática
•Síntesis
estereoselectiva
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DISTRIBUCIÓN DE USO DE HOSPEDEROS PARA LA PRODUCCIÓN
DE PROTEÍNAS RECOMBINANTE
Martha Guerrero Olazarán [email protected] Expression Systems Market, Roots Analysis Private Ltd. 2015
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¿ CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
VECTORES DE EXPRESIÓN: ELEMENTOS GÉNICOS QUE LO CONFORMAN
Gen de interés
INTEGRATIVOS EXTRACROMOSOMALES
ESPECÍFICOS PARA
CADA HOSPEDERO
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¿ CÓMO SE PRODUCEN LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
ELEMENTOS GÉNICOS IMPORTANTES EN UN
VECTOR DE EXPRESIÓN
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¿ CUÁLES SON LOS RETOS EN LA PRODUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
CALIDAD DEL PRODUCTO
RENDIMIENTOS
PRODUCTIVIDAD DEL PROCESO
COSTOS
Yp/s Yp/x
Yx/s
Máxi
ma
Pro
ducc
ión
Proteína Recombinante
Hospedero Cepas recombinante Selección Bioproceso
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¿ CUÁLES SON LOS RETOS EN PRODUCCIÓN DE
PROTEÍNAS RECOMBINANTES?
REDISEÑO
GÉNICO
CONDICIONES DE
CULTIVO
• Secuencia génica
• Regiones ricas en AT/TTT
• Estructuras secundarias en 5’
• Dósis génica
Transcripción
• Codones preferenciales
• Modificaciones postraduccionales
Traducción
• Características de la proteína • Carga metabólica • Procesamiento y Secreción
Procesamiento
FACTORES QUE AFECTAN LA PRODUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Productividad volumétrica
Rendimiento específico Martha Guerrero Olazarán [email protected]
FACTORES QUE AFECTAN LA EXPRESION DE GENES,PRODUCCION Y
CARACTERISTICAS DE LAS PROTEINAS RECOMBINANTES
REGULACION DE LA TRANSCRIPCION
EFICIENCIA DE LA TRADUCCION
•SEÑALES DE RECONOCIMIENTO DE INICIO DE LA TRADUCCION (RBS)
•USO DE CODONES PREFERNCIALES
•MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
•PROMOTOR reconocible por la RNA polimerasa
•REPRESORES INDUCTORES
•SEÑALES DE TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCION
CARACTERISTICAS DEL HOSPEDERO
DESTINO CELULAR DE LA PROTEINA
ESTABILIDAD Y TOXICIDAD DE LA PROTEINA
CONDICIONES DE CULTIVO
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ETAPAS INVOLUCRADAS EN EL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS
PROTEINAS RECOMBINANTES
Martha Guerrero Olazarán
Aplicación
CaracterísticasDemanda
¿Cuánto?
Proteína
de interésSelección
+
Ho
sped
ero
Vec
tor
Sistema de
Expresión
Diseño del genSíntesis
del gen
Organismo
Recombinante
1
2
3
4
Tamizaje de
cepas
5
ETAPAS INVOLUCRADAS EN EL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS
PROTEINAS RECOMBINANTES
Martha Guerrero Olazarán
Diseño del
bioproceso
Caracterización
de la cepa
6
Caracterización
Proteína
7Purificación
8
Bioproceso
controlado
Downstream
CLARIFICACIÓN
PURIFICACIÓN
FORMULACIÓN
PRODUCTO
9
Biomasa
celular
(g/L)
Producto
(mg/L)
Fase I Fase II
SUSTRATO
100
0
0 12 24
50
100
0
Tiempo (horas)
50
Bioproceso en lote + lote alimentado
(batch + fed-batch)
Fase II
MeOH
50
0 48 64240
50
100
100
0
Tiempo (horas)
Bioproceso en lote alimentado
(fed-batch)
CONTROL DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS PROTEINAS RECOMBINANTES
Fase
de g
enera
ció
n d
e b
iom
asa
Fase
de i
nducció
n d
e g
en
Pro
ducció
n d
e la p
rote
ína
CONTROL DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS PROTEINAS RECOMBINANTES
SEMILLA XX L
XX LDownstream
FASE IVol: XX L batchGlicerol XX g/L
Tiempo: XX h pH XXAeración: XX L/minTemp: XX °CDCF: XX g/LAgitación XXX
FASE IIIVolumen total: 30 L Fuente de carbono X g/L Flujos de XX mL/minTiempo: XX h pH XMezcla aire/O2, XX L/minTemp: XX °CDCF: XX g/LAgitación XX
GENERACIÓN DE BIOMASAPRODUCCIÓN
FASE IIVolumen total: XX L FUENTE DE Carbono X g/L Flujos de XX mL/minTiempo: XX h pH XXMezcla aire/O2, XX L/minTemp: XX°CDCF: XX g/LAgitación XX
REACTOR DE 40 L /30 L VOLUMEN DE TRABAJO
SUPERVISIÓN DE INFRAESTRUCTURA
VERIFICACIÓN, ADECUACIÓNY PREPARACIÓN DE INFRAESTRUCTURA
Selección de proteína
• Ingredientes vegetales• Decrecer PO4• Peletizado• Contaminación
Optimación
• Niveles de producción • Termoestabilidad• Actividad específica
Optimación
Efectividad
• Optimación del proceso.
• Bio-ensayos in vitro • Bio-ensayos in vivo• Fisiología del proceso
Termoestable
Activa pH 6-8
MejoraGenética
Rediseño de proteína
Niveles de producción
Efectividad
Fisiología comprometida
• Bases de datos • Adq. Cepa• Clonación
Expresión • Caracterización
• Codones preferenciales
• Ing. de Proteínas
• Gen sintético
Cepa
FTEII
• Diseño multifactorial
• Análisis Transcripcional
Proceso
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Desarrollo de un Sistema de Expresión
• Universidades
• Centros de Investigación
• Pequeñas empresas que surgen como “spin-off” de los primeros
PROTECCIÓN
POR PATENTES
PRODUCCIÓN DE MÚLTIPLES
PROTEÍNAS DE INTERÉS
• COMERCIAL
• INVESTIGACIÓN
GENERAN ACTIVOS
TECNOLÓGICOS
SUSCEPTIBLE A LICENCIARSE
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
DE ALTO VALOR COMERCIAL
Proceso de investigación
32EL
SEG
MEN
TO
IN
DU
STRIA
L EN
TO
RN
O A
LA T
ECN
OLO
GÍA
DE L
AS P
RO
TEÍN
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ECO
MBIN
AN
TES
Martha Guerrero Olazarán [email protected]
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
LA INDUSTRIA DE SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y
PRODUCCION DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
EMPRESAS GRANDES:
Agilent Technologies, Inc. (EE.UU.)
Life Technologies Corporation (EE.UU.)
Lonza
Clontech
Meck-Millipore
Research Corporation Technologies
Promega Coporation (EE.UU.)
QIAGEN (Países Bajos)
Sigma-Aldrich Corporation (EE.UU.)
Takara Bio, Inc. (Japón)
Thermo Fisher Scientific, Inc. (EE.UU.)
BIOLÓGICOS TERAPÉUTICOS
EMPRESAS PEQUEÑAS:
Dyadic International
Greenovation
Geneva Biotech
iBio
Jena Bioscience
New England Biolabs, Inc.
Oxford Expression
Technologies
Pfenex
Scarab Genomics
(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
EL MERCADO DE LA INDUSTRIA DE SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y
PRODUCCION DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015
USUARIOS FINALES
Investigación académica
Organizaciones de investigación por contrato
Compañías farmacéuticas y biotecnológicas
Crecimiento del mercado global entre 2013 y 2018 se estima con un
CAGR (tasa de crecimiento anual compuesto) de 8.83%.
Valor del mercado global se estima en 1,396.68 millones de USD para el 2018
Las organizaciones de
investigación por contrato (proporcionan recursos y
conocimientos relativamente
menos costosos (CAGR )
Las empresas farmacéuticas y biotecnológicas
dominan la mayor parte del mercado mundial
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
OPORTUNIDAD, DEMANDA E IMPORTANCIA DE LOS SISTEMAS DE
EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015World Enzymes Industry Study with Forecasts for 2015 & 2020”,
BIOLÓGICOS TERAPÉUTICOS ≈900 productos biológicos terapéuticos en varios estados de desarrollo. ≈ 150 productos biológicos terapéuticos en el mercado. El valor del mercado de productos biológicos terapéuticos se estima en 200,000
millones de USD. Segmento de biosimilares con más de 550 productos en desarrollo.
SEGMENTOS LUCRATIVOS Y ASOCIADOS
BIOLÓGICOS NO TERAPÉUTICOS
El mercado global de las enzimas industriales se estima en un valor de $6.3 mil
millones de USD para el 2022.
Las enzimas industriales son usadas para la producción de biocombustibles, como
aditivos en alimentos para la nutrición animal, en la industria del cuero, textil,
de detergentes y procesado de alimentos y bebidas
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
BIOFARMA-CMO: EMPRESAS DE MANOFACTURA POR CONTRATO
(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
BIOFARMA-CMO: EMPRESAS DE MANOFACTURA POR CONTRATO
(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015
DISTRIBUCIÓN POR ESCALA DE OPERACIÓN
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
BIOFARMA-CMO: EMPRESAS DE MANOFACTURA POR CONTRATO
(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015
DISTRIBUCIÓN POR TIPO DE BIOLÓGICO
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EL SEGMENTO INDUSTRIAL ENTORNO A LA TECNOLOGÍA LAS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
BIOFARMA-CMO: EMPRESAS DE MANOFACTURA POR CONTRATO
(Protein Expression Systems Market, Current Landscape and Future Opportunities, 2015
DISTRIBUCIÓN POR TIPO SISTEMA DE EXPRESIÓN
•Biotecnología moderna:
•Se entiende la aplicación de técnicas in vitro de ácido nucleico,
incluidos el ácido desoxirribonucleico (ADN y ARN) recombinante
•la inyección directa de ácido nucleico en células u organelos, o
•la fusión de células más allá de la familia taxonómica, que supera
las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de la
recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y
selección tradicional,
•que se aplican para dar origen a organismos genéticamente
modificadosMartha Guerrero Olazarán [email protected]
Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGM)
BIOTECNOLOGÍA MODERNA
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BIOSEGURIDAD Y TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Las primeras directrices en cuestiones de seguridad en materia de la
Tecnología del ADN Recombinante se proponen en una conferencia
científica celebrada en Asilomar (California, EE.UU.) en 1975 .
Lineamientos para la Investigación que Involucra Moléculas de ADN
Recombinante y ADN sintético (NIH Guidelines for Research Involving
Recombinant or Synthetic Nucleic Acid Molecules ) del Instituto Nacional
de Salud de los Estados Unidos (NIH).
El documento especifica los procedimientos de confinamiento físico y contención
a través de barreras biológicas, necesarios para trabajar con OGMs.
Dichos procedimientos pueden de considerar como los estándares mínimos.
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Define la práctica segura y los procedimientos de contención para la
investigación básica y clínica que involucran el uso de moléculas de
ácidos nucleicos recombinantes o sintéticos, incluyendo la creación y
utilización de los organismos y los virus que contienen ácido nucleico
recombinante o sintético.
Directrices del NIH para la investigación con moléculas
de ácidos nucleicos recombinantes o sintéticas
ADN recombinante y ADN sintético según las directrices de NIH
(i) moléculas que a) se construyen por la unión de moléculas de ácido
nucleico y b) que puede replicarse en una célula viva (ADN recombinante)
(ii) moléculas de ácido nucleicos sintetizados químicamente o por otros
medios o amplificados, incluyendo aquellos que son químicamente o de
otro modo modificadas, pero puede tener pares de bases de origen
natural con moléculas de ácido nucleico (ADN sintéticos),
(iii) moléculas que resultan de la replicación de los descritos en (i) o (ii)
anterior
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La Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados
(LBOGMS)
Regula la utilización confinada de estos organismos
Utilización Confinada:
Cualquier actividad por la que se modifique el material genético de
un organismo o por la que éste, así modificado, se cultive, almacene,
emplee, procese, transporte, comercialice, destruya o elimine,
siempre que en la realización de tales actividades se utilicen barreras
físicas o una combinación de éstas con barreras químicas o biológicas,
con el fin de limitar de manera efectiva su contacto con la
población y con el medio ambiente.
BIOSEGURIDAD DE OGMs EN MÉXICO
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Evaluación del riesgo
Determinar el tipo de OGM y
actividad
Determinar el tipo de
contención y control
Garantizar que la exposición de losseres humanos y el medio ambiente alos OGMs resulte al nivel más bajo quesea razonablemente posible
Determinar la contención mínima para la actividad específica con el OGM
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EVALUACIÓN DEL RIESGO
DETERMINAR EL TIPO DE OGM Y ACTIVIDAD
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CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD
EVALUACIÓN DE RIESGO: es un proceso subjetivo
GRUPO DE RIESGO: Basado en el grupo de riesgo (GR) de un agente
CLASIFICACIÓN DE GRUPOS DE RIESGO: Los agentes se clasifican en
4 grupos de riesgo (RGS) en función de su patogenicidad a seres humanos
adultos sanos .
GRUPOS DE RIESGO (RG)
PATOGENICIDAD
Grupo 1 Agentes no asociados a enfermedades en adultos sanos.Grupo 2 Agentes asociados con enfermedades en humanos, que rara vez
es grave y para los que las intervenciones preventivas o terapéuticas a menudo están disponibles.
Grupo 3 Agentes asociados con enfermedades en humanos grave o letal para el que las intervenciones preventivas o terapéuticas pueden estar disponibles.
Grupo 4 Agentes pueden causar enfermedades humanas graves o letales para los que las intervenciones preventivas o terapéuticas generalmente no están disponibles.
DIRECTRICES DEL NIH: DEFINICIÓN DE GRUPOS DE RIESGO
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EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS
•Características de los organismos donantes y de los genes donados.
Estimación del nivel de expresión necesario para conseguir actividad biológica o
farmacológica
Toxinas, Citoquinas, Hormonas, Alergenos
Resistencia a antibióticos
Reguladores de la expresión génica
Secuencias oncogénicas
Riesgos derivados directamente del
gen insertado (organismo
donante)
Producto del gen insertado tenga una actividad biológica o farmacológica que
pueda resultar dañina
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EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS
•Características organismos receptores/hospederos
Susceptibilidad del hospedero
Patogenicidad de la cepa huésped, incluida
la virulencia, la inefectividad y la
producción de toxinas
Estado inmunitario del receptor
Modificación de la gama de huéspedes
Riesgos asociados al receptor/hospedero
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EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS
Riesgos derivados de la alteración de rasgos patogénicos existentes
• ¿Hay un aumento de la infectividad o la patogenicidad?
• ¿Podría superarse cualquier mutación incapacitante en el receptor de resultado de la inserción del gen foráneo?
Muchas modificaciones no utilizan genes cuyos
productos sean intrínsecamente
nocivos
• ¿Codifica el gen foráneo un determinante de patogenicidad de otro organismo?
• Si el ADN foráneo incluye un determinante de patogenicidad, ¿cabe prever que ese gen pudiera contribuir a la patogenicidad del OGM?
pero pueden producirse efectos adversos de resultas
de la alteración de
características patogénicas o no patogénicas existente
• ¿Se dispone de tratamiento?
• ¿Se verá afectada la susceptibilidad del OGM a los antibióticos u otra forma de tratamiento a consecuencia de la modificación genética?
• ¿Podría conseguirse la erradicación del OGM?
La modificación de genes normales puede alterar la
patogenicidad
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Evaluación Integral de Riesgos
Como decidir sobre la contención apropiado para un experimento
•Determinar el riesgo del agente de acuerdo al grupo de riesgo
•Considerar la manipulación del agente
Virulencia,
Patogenicidad
Dosis infecciosa
Estabilidad del medio ambiente
Vía de propagación
Comunicabilidad, operaciones, y cantidad,
Disponibilidad de la vacuna o el tratamiento
Efectos del producto del gen tales como toxicidad,
actividad fisiológica, y la alergenicidad
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EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMs
•Combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio.
•Equipos de seguridad e instalaciones adecuadas para las operaciones realizadas.
•Se basan en los riesgos potenciales impuestos por los agentes utilizados para la
función y la actividades de laboratorio.
•Nivel de Bioseguridad 1 es el menos estricto.
•Nivel de Bioseguridad 4 proporciona las condiciones más estrictas de contención.
•Limitación de la infectividad de un vector o vehículo (plásmido o virus) para
hospedero específicos.
•Limitación para su diseminación y la supervivencia en el medio ambiente.
•Vectores, pueden ser genéticamente diseñado para disminuir, en muchos
órdenes de magnitud, la probabilidad de diseminación de la molécula de ácido
nucleico recombinante o sintético fuera del laboratorio.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
BARRERAS BIOLÓGICAS
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Consideraciones de bioseguridad en relación con los sistemas
de expresión biológica
EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS
E. coli K12/pUC18
pUC18 carece de los genes necesarios para la expresión en otras bacterias
E. coli K12 es una
cepa no patógena
que no puede
colonizar
permanentemente el
intestino del
ser humano ni de los
animales sanos.
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Cuando la expresión de secuencias de ADN derivadas de organismos patógenos pueda aumentar la virulencia del OGM.
Cuando las secuencias de ADN insertadas no estén bien caracterizadas, por ejemplo durante la preparación de genotecas de ADN genómico de microorganismos patogénicos.
Cuando los productos génicos puedan tener actividad farmacológica.
Cuando los productos génicos sean toxinas.
Consideraciones de bioseguridad en relación con los vectores de expresión
Puede ser necesario trabajar en niveles de bioseguridad más altos en los siguientes casos:
EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS
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Los vectores víricos, por ejemplo los de adenovirus, se utilizan para transferir genes a otras células.
Esos vectores carecen de ciertos genes necesarios para la replicación vírica y son propagados en líneas celulares que complementan el defecto.
Las poblaciones de esos vectores pueden contaminarse con virus que tienen intacta la capacidad de replicación, generados por sucesos poco frecuentes de recombinación espontánea en las líneas celulares de propagación, o procedentes de una purificación insuficiente.
Esos vectores deben manipularse al mismo nivel de bioseguridad que el adenovirus del que proceden.
EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS
Consideraciones de bioseguridad en relación con vectoresvíricos para la transferencia de genes
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Los animales que llevan información genética incorporada (animales transgénicos) deben manipularse en niveles de contención apropiados para las características de los productos de los genes foráneos incorporados.Los animales en los que se han suprimido de forma selectiva ciertos genes (knock-out) no suelen entrañar riesgos biológicos particulares.
EVALUACIÓN DE RIESGOS EN RELACIÓN CON OGMS
Consideraciones de bioseguridad en relación con Animalestransgénicos y con genes inactivados (knock-out)
Los animales transgéncos que expresan receptores de virus normalmente sonincapaces de infectar a esa especie.Si esos animales salieran del laboratorio y transmitieran el transgén a lapoblación animal salvaje, en teoría podría generarse un reservorio animal de esosvirus en particular.Es preciso efectuar estudios para determinar vías de infección, el tamaño del inóculo y el grado de excreción de virus por parte de los animales infectados necesario para que se diseminar una infección.
55
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SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: Clonación de toxinas con una DL50 100 ng/kg de peso corporal
SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: ADN proviene de RG-1 y hospedero patógenoADN –VECTORES HOSPEDERO-
GRUPO DE RIESGONIVEL DE CONTENCIÓN
Sin riesgo RG-2 BL2Sin riesgo RG-3 BL3Sin riesgo RG-4 ¿No definido?SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO:ADN proviene de un grupo de riesgo y hospedero
no-patógeno procariote o eucariote inferior y el DNA proviene de un grupo de riesgo
ADN –VECTORES HOSPEDERO-GRUPO DE RIESGO
NIVEL DE CONTENCIÓN
RG-2 o RG-3 No patógeno BL2RG-4 No patógeno BL4/ BL2SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: ADN o ARN A viral o ADN o ARN A viral alterado
en presencia de un virus “helper” en sistemas de cultivo de tejido ADN –VECTORES HOSPEDERO-
GRUPO DE RIESGONIVEL DE CONTENCIÓN
Virus -RG-2 Infeccioso/alterado/PHV
cultivo de tejido BL2.
Virus -RG-3/Priones/ PHV cultivo de tejido BL3
Virus –RG-4 Infeccioso/alterado/PHV
cultivo de tejido BL4
DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE CONTENCIÓN
56
DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE CONTENCIÓN
SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: Cultivos de más 10 L
ADN –VECTORES HOSPEDERO-GRUPO DE
RIESGO
NIVEL DE CONTENCIÓN
No tóxicos No patógeno GLSP/GMP
Requiere BL1 a escala de lab Requiere BL1 a escala de lab
BL1-LS
Requiere BL2 a escala de lab Requiere BL2 a escala de lab
BL2-LS
Requiere BL3 a escala de lab Requiere BL3 a escala de lab
BL3-LS
CULTIVOS DE MÁS DE 10 L DE OGMs
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DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE CONTENCIÓN
SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO: Usados a escala Laboratorio y de producción
SISTEMA VECTOR-HOSPEDERO:
HOSPEDERO-GRUPO DE
RIESGO
VECTOR NIVEL DE CONTENCIÓ
NSistema de
Escherichia coli K-12 (EK1)
Escherichia coli K-12 derivados
No conjugativos
pSC101, Co1E1Bacteriófago
BL1/ BL1-LS
Sistema deSaccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
BL1/ BL1-LS
SistemaKluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactis
BL1/ BL1-LS
Sistema Bacillus subtilis
Bacillus subtilis BL1/ BL1-LS
Sistema Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
No forma esporas
BL1/ BL1-LS
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CAPÍTULO II DE LOS AVISOS En el caso específico de la utilización confinada de OGMs con fines deenseñanza, de investigación científica y tecnológica, industriales ocomerciales, la LBOGM establece la figura del “Aviso” para quieneslleven a cabo estas actividades. Específicamente, el Art. 74 de laLBOGM dice a la letra: Quienes realicen actividades de utilizaciónconfinada sujetas al requisito de presentación de aviso en los términos de estaLey, deberán cumplir con lo siguiente:
I. Llevar un libro de registro de las actividades de utilización confinada querealicen, el cual se deberá proporcionar a las Secretarías correspondientes cuandoéstas lo soliciten;II. Aplicar las medidas de confinamiento cuya ejecución deberá adaptarse a losconocimientos científicos y técnicos más modernos y avanzados en materia de manejode riesgos y de tratamiento, disposición final y eliminación de residuos de OGMsgenerados en la realización de la actividad yIII. En el caso de la utilización confinada con fines de enseñanza o de investigacióncientífica y tecnológica, integrar una comisión interna de bioseguridad yaplicar los principios de las buenas prácticas de la investigación científica, así como lasreglas de bioseguridad que defina la comisión interna de bioseguridad. Dicha comisióninterna estará encargada de la seguridad en las instalaciones y de las buenas prácticasy la seguridad en el manejo de OGMs utilizados en la actividad señalada.
La Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGMS)
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La Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGMS)
Ante que secretaría se debe presentar el AVISO
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