Seminario 3. Clonación animal Obtención de embriones capaces de desarrollar un organismo completo...
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Seminario 3
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Clonación animal
Obtención de embriones capaces de desarrollar un
organismo completo o producción de células
multipotenciales, a partir de tejidos diferenciados
mediante la técnica de transferencia nuclear
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Transferencia nuclear
Introducción de núcleos diferenciados de células de anfibios
ó mamíferos en huevos anucleados
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Los núcleos espermátic
os se replican con total
eficiencia. Pero los
núcleos de eritrocitos no pueden replicarse.
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¿¿¿Es necesario el pasaje por mitosis para reprogramar los núcleos para la rápida replicación del ADN???
Pregunta….
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Pregunta….
¿¿¿La remodelación de la cromatina en los núcleos de los eritrocitos durante la mitosis afecta el tamaño de los replicones???
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Núcleos de eritrocitos + extracto de huevo + BrdUTP + aphidicolin
en fase M o S
DNA combing *Ubicación de las fibras
anticuerpo a- guanosina + anticuerpo secundario con fluoróforo
*Incorporación de BrdUTP anticuerpo
a-BrdU + anticuerpo secundario con fluoróforo
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77% < 30kpb
97% > 30kpb
74% 10-30 kpb
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• La replicación lenta en los eritrocitos en fase S se debe a una baja frecuencia de orígenes de replicación.
• La exposición de los núcleos de eritrocitos a un extracto en fase M genera un espaciamiento de los orígenes de replicación similar al núcleo espermático
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¿¿¿Es suficiente la formación de cromosomas mitóticos para reprogramar la organización nuclear de eritrocitos para que se produzca la rápida replicación de DNA en el siguiente ciclo celular???
Pregunta…
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•Acetilación de histonas requerida para una rápida replicación
•Nivel de acetilación máximo en núcleos de eritrocitos en extracto interfásico
•Efecto dominante de la organización cromatínica por sobre la acetilación
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Se investigaron cambios globales en la organización de la cromatina de eritrocitos que puedan explicar la remodelación de los replicones
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¿¿¿Puede ocurrir lo contrario cuando los núcleos de eritrocitos son expuestos a extractos de huevo??? Es decir, ¿¿¿Puede haber una transición desde sitios de unión definidos a una asociación al azar con la matriz nuclear???
Pregunta…
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El pasaje previo por la fase M induce dos tipos de rearreglos en nucleos de eritrocitos:
•Reduce el tamano de los loops, consistentemente con una mayor densidad de sitios de anclaje a la matriz nuclear
•Disminuye el espacio promedio entre origenes de replicacion
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Pregunta…
¿¿¿La reprogramación de los replicones en núcleos de eritrocitos incubados en extracto de huevos en fase M de Xenopus se debe a la condensación de los cromosomas dirigida por la Topoisomerasa II o únicamente al pasaje de la fase M a la S???
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La reorganización de los replicones no se debe a la transición de la fase M a la S
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+ICRF 193
ICRF 193 inhibidor de la Topoisomerasa II previene la condensación cromosómica
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No es el pasaje de la Fase M a la S la que aumenta la tasa de replicación sino la condensación cromosómica
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La organización cromosómica dependiente
de topoisomerasa II, ¿¿¿controla la eficiencia de reclutamiento de ORC???
Pregunta…
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•Tasa replicativa depende de un eficiente reclutamiento de factores de iniciación de la replicación
•Reclutamiento en eritrocitos incubados en extracto en fase M es afectado por la remodelación cromatínica dependiente de topoisomerasaII
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Se investigó si la misma reorganización cromatínica ocurre durante el desarrollo temprano “in vivo”
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Los datos sugieren que la rápida replicación del DNA durante el desarrollo temprano, involucra el uso de muchos puntos de unión situados al azar entre la cromatina y la matriz nuclear. La entrada en mitosis restaura el tamaño de los loops tanto de embriones tempranos en fase post-replicativa como de núcleos diferenciados
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Modelus
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De este trabajo puede deducirse que….
• La mayor especificidad en los orígenes de replicación observado en células diferenciadas debe ocurrir entre el medio y el final de la fase G1
• Para obtener una exitosa clonación deben realizarse sucesivas transeferencias nucleares
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Resumiendo…
• El aumento de la organización de los cromosomas en la metafa- tasa replicativa se dirigida por la
depende de Topoisomerasa II y el anclaje en la Matriz Nuclear
loops más pequeños reclutamiento de ORC =
Mayor orígenes de replicación
la acetilación de las histonas • Es independiente de la concentración de
factores de replicación presencia del complejo
pre- replicativo
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Gracias!!!!!