Cuestionario de Enzimas 1) ¿Qué es una enzima? ¿Cuál es su función? 2) ¿Qué significa que una enzima es un catalizador biológico? 3) ¿Cuál es la estructura química de las enzimas? ¿Qué es el sitio activo de una

enzima? ¿Por qué tres aminoácidos que forman parte del sitio activo pueden estar alejados en la estructura primaria?

4) Explique a qué se denomina apoenzima, holoenzima, coenzima, cofactor y grupo prostético.

5) Explique y ejemplifique qué son las isoenzimas. 6) ¿De qué depende la especificidad de las enzimas? 7) Para la reacción de A → B se aplica el siguiente diagrama. Calcule:

a) El ∆G para la reacción de A → B, indicando si se producirá espontáneamente esta reacción en el sentido en el que está escrita. b) La energía de activación (Ea) en presencia y ausencia de enzima indicando qué curva corresponde a cada caso. Cinética Enzimática. 8) ¿Cómo se hace para determinar la concentración de una determinada enzima en una muestra de extracto tisular o de algún líquido biológico’ 9) Defina actividad de una enzima. ¿Cómo se determina?¿Qué son las Unidades Internacionales (UI)? 10) ¿Qué información brinda la actividad total y la actividad específica? 11) ¿Cuáles son los factores que modifican la actividad enzimática? 12) Explique cuál es la influencia de las variaciones de temperatura sobre las velocidades de reacción enzimática. a) Dibuje un gráfico de la velocidad de reacción en función de la temperatura explicando qué pasa a baja temperatura y alta temperatura.

G (

cal/m

ol)

Sustrato

Producto

sin enzima

con enzima

Estado activado

Grado de avance de la reacción

100

400

300

200

G (

cal/m

ol)

Sustrato

Producto

sin enzima

con enzima

Estado activado

Grado de avance de la reacción

100

400

300

200

b) ¿Qué es la temperatura óptima? 13) Discuta cómo afectan los cambios de pH a la actividad enzimática a) ¿Cuál es el mecanismo por el cual los cambios de pH afectan a la actividad enzimática? 14) En el siguiente gráfico, se muestran los pH óptimos de tres enzimas importantes ¿Qué puede decir al respecto?

15) En el estudio de una enzima se midió la concentración del compuesto producido a los largo del tiempo. Se obtuvo el siguiente gráfico:

Proponga un diseño experimental para la obtención de este gráfico Indique: a) ¿Qué parámetros se miden y cómo? b) ¿Qué parámetros se mantienen constantes durante la determinación? c) ¿Cómo se obtiene la velocidad de la reacción a un tiempo dado? d) Compare la velocidad de la reacción a t1 y t2. e) ¿Qué significado tiene la meseta que se observa en el gráfico?

f) Grafique los resultados obtenidos cuando se realiza la misma experiencia i) con diferente [Enzima] ii) con diferente [S] inicial g) Realice un gráfico que muestre cómo varía la velocidad de reacción en función del tiempo. h) ¿Qué otras determinaciones necesita realizar para poder determinar los parámetros cinéticos de la enzima? 16) a) Explique qué información proporciona el siguiente gráfico. b) ¿Cómo procedería experimentalmente para construir dicho gráfico. c) ¿A qué se denomina una enzima Michaeliana. d) ¿Cuáles son los parámetros cinéticos de una enzima Michaeliana? e) Señale en el grafico Km y Vmáx. f) Dibujar en el mismo gráfico la curva que se obtiene con una concentración mayor de enzima. En este caso ¿cómo se modifica el Km y la Vmáx?. Actividad enzimatica: Recuerde. Actividad enzimática:

Unidad Internacional UI = µmoles/ min Katal Katal = mol/ seg

Actividad Específica AE = UI/ mg proteínas 17) 20 ul de una homogenato de tejido hepático (250 µg de proteínas) catalizan la formación de 56,7 µmoles de glu-6P en 15 minutos de incubación en las condiciones óptimas para la determinación de la actividad de glucoquinasa. a)¿Cuántas UI de enzimas habrá en dicha preparación? b)¿Cuántas por ml de homogenato?. c)¿Cuál será la actividad específica de dicha preparación? d)¿Cómo esperaría que fuera esta último valor con respecto al de la enzima pura? e)¿Cuál es el valor de actividad enzimática expresado en Katales?

concentracion de sustrato

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

velo

cida

des

inic

iale

s (V

o)

0

25

50

75

100

18) La hidrólisis de pirofosfato a fosfato constituye una fuerza impulsora importante en muchas reacciones químicas (por ejemplo: síntesis de ADN). La Vmáx de una pirofosfatasa purificada de E.coli es de 2800 UI/mg de proteina. ¿Cuántos moles de sustrato son hidrolizados por segundo por mg de proteina cuándo la concentración del sustrato es mucho mayor que el Km? 19 Un extracto formado por 94 g de proteínas totales contiene una enzima (no purificada) que cataliza la transformación de 480 µmoles de sustrato en producto en 30 segundos. Luego de varios pasos de purificación se obtuvieron 27 mg de proteínas totales, capaces de transformar 220 µmoles de sustrato en 30 segundos. a) calcule la actividad (en unidades internacionales) y la actividad específica de las preparaciones antes y después de la purificaron. b) ¿Cómo varían la actividad y la actividad específica en el proceso de purificación? Justifique. 20) En un experimento en el estudio de una enzima se obtuvieron los siguientes resultados. Calcule la velocidad inicial Vo.

21) La hidrólisis de la sacarosa, catalizada por la sacarasa.

Sacarosa + H2O → Glucosa + Fructosa

Tiene el siguiente curso.

a) Calcule las velocidades de la reacción.

b) Utilizando el grafico de aparición de producto en función del tiempo que se muestra a continuación, i) Calcule la velocidad inicial (Vo). ii) Realice el gráfico velocidad vs tiempo. 22) Midiendo la velocidad inicial de una reacción en presencia de diferentes concentraciones de sustrato, se obtuvieron los siguientes datos: Indique en qué condiciones se realizó la determinación. ¿Qué significado tiene la meseta que se observa en el gráfico? 23) La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa y la fructosa utilizando ATP. Siendo el Km para la glucosa 0,13 mM, mientras que para la fructosa es 1,3 mM. Indicar por cuál de ambos sustratos la enzima tiene mayor afinidad. Considere que ambas Vmáx son muy similares para ambos sustratos. 24) Se tienen dos enzimas que catalizan la misma reacción A → B La enzima 1 tiene un Km para el compuesto A de 10 mM. El Km de la enzima 2 para el compuesto A es de 0,1 mM. Compare la velocidad de ambas enzimas cuando la [A] = 1 mM, con respecto a la Vmáx de cada una de las enzimas.

Tiempo (segundos)

[producto] (mM)

Velocidades (mM/segundos)

0 0,050 20 0,195 40 0,342 60 0,488 90 0,659 130 0,770 180 0,871 360 0,991

[Sustrato] (M)

Vo (µM/min)

2,5 10-6 28 4 10-6 40 1 10-5 70 2 10-5 95 4 10-5 112 1 10-4 128 2 10-3 139 1 10-2 140

t (segundos)

0 100 200 300 400

(Pro

duct

o) m

M

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

25) Una cantidad constante de una solución de una enzima fue adicionada a una serie de tubos conteniendo diferentes concentraciones de sustrato [S]. La velocidad inicial (Vo) de la reacción fue obtenida por la medida de la pendiente inicial de la curva de formación de producto. Los datos se representan en la siguiente tabla. Considere que la enzima tiene un comportamiento michaeliano. a) Sin graficar, estime un valor aproximado para ambos parámetros cinéticos, Km y Vmáx. b) Usando los parámetros cinéticos del inciso a), calcular la velocidad inicial cuando la concentración de sustrato es 15 µM. c) Utilizando los datos de la tabla, realice el grafico de Michaelis-Menten. Calcule según el gráfico los valores de Km y Vmáx. d) Realice la representación gráfica de las dobles reciprocas o Lineweaver-Burk. Calcule según este grafico los valores de Km y Vmáx. 26) Aunque existen métodos gráficos para la determinación precisa de los parámetros cinéticos, Km y Vmáx, ambos valores se pueden estimar en algunos casos particulares mediante la observación de datos como los registrados en la siguiente tabla. a) Estime el valor de Km y Vmáx b) Calcule la velocidad inicial de la reacción cuando [S] = 3. 10-5 mM. c) Utilizando los datos de la tabla, realice el grafico de Michaelis-Menten. Calcule según el gráfico los valores de Km y Vmáx. d) Realice la representación grafica de las dobles reciprocas o Lineweaver-Burk. Calcule según este grafico los valores de Km y Vmáx. Inhibición enzimática 1) La biosíntesis de purinas y pirimidinas utilizadas en la síntesis de ADN necesita acido fólico. El Metotrexate es un análogo estructural del acido fólico utilizado en el tratamiento de algunos canceres. Se fija con 1000 veces más afinidad que el sustrato a la enzima dihidrofolato reductasa. Esta enzima es importante para el mantenimiento de los niveles del acido fólico.

a) Grafique Vo en función de [S] en presencia y ausencia del inhibidor. b) ¿Por qué este fármaco se utiliza para el tratamiento del cáncer? c) ¿Por qué el fármaco tiene efectos secundarios que afectan al tubo digestivo y al

sistema hematopoyético?

[Sustrato] (µM)

Vo (µM/min)

0,1 0,27 2 5 10 22 20 40 40 67 60 80 100 100 200 120 1000 150 2000 155 3000 163

[Sustrato] (mM)

Vo (mM/min)

2,5 10-6 28 4 10-6 40 1 10-5 70 2 10-5 95 4 10-5 112 1 10-4 128 2 10-3 139 1 10-2 141

2) El metabolismo del etanol se produce fundamentalmente en el hígado en dos pasos: en principio el etanol se oxida a acetaldehído por la enzima etanol deshidrogenasa (EDH) que consume NAD+. El acetaldehído es medianamente toxico, dado que normalmente es oxidado por la aldehído deshidrogenasa (ADH) a acetato. El Metanol también es sustrato de la etanol deshidrogenasa, pero el producto formado que se acumula es muy toxico. EDH

Etanol + NAD+ → Acetaldehido + NADH + H+

ADH

Acetaldehido + NAD+ → Acetato + NADH + H+ Caso A. A un hombre de 43 años se le prescribió disulfiran pero se le advirtió que no consumiera alcohol durante el tratamiento. El disulfiran inhibe en forma irreversible a la enzima aldehído deshidrogenasa y no presenta toxicidad en ausencia de alcohol. El paciente bebió una gran cantidad de etanol en una fiesta y tuvo que ser trasladado al hospital, donde murió esa misma noche. ¿Por qué el fármaco resulto tóxico para este paciente? Caso B. Una persona ingirió vino adulterado con metanol. Posteriormente debió ser hospitalizada. Como parte del tratamiento, el medico le suministró un exceso de etanol. ¿Cuál es el fundamento de este tratamiento? Caso C. Los orientales son muy sensibles a las bebidas alcohólicas. Esto se debe a que la forma mitocondrial de la enzima aldehído deshidrogenasa de bajo Km esta ausente. Estas personas solo poseen la enzima citosólica de alto Km.

a) En base a esta información explique la mayor susceptibilidad al alcohol en estos individuos.

b) ¿Qué son entre sí las formas mitocondrial y citosólica de la enzima aldehído deshidrogenasa?

3) La siguiente tabla indica la velocidad con que se transforma un sustrato en una reacción catalizada por una enzima, en ausencia (c) y en presencia de dos inhibidores (I1 y I2). Calcule el Km y la Vmáx en cada caso e indique de qué tipo de inhibidores se trata.

Vo (mM/min) [Sustrato] (mM) C I1 I2

1 2,5 1,17 0,77 2 4,0 2,10 1,25 5 6,3 4,00 2,00 10 7,6 5,70 2,51 20 9,0 7,20 2,86

4) Se quiere determinaron los parámetros cinéticos de una enzima que se comporta según el modelo de Michaelis-Menten, en ausencia y en presencia de un inhibidor no competitivo. Se obtuvo el gráfico que se muestra más abajo. a) Indique como se denomina dicho gráfico. b) Indique que recta corresponde a la reacción en ausencia (control) o presencia de dos concentraciones diferentes de un inhibidor I ( I1, I2). Considere [I2] > [I1]. c) Cómo calcularía los parámetros cinéticos a partir del gráfico. ¿Qué valor calcula para los Km y las Vmáx?. d) Represente el grafico de Michaelis-Menten (Vo en función de [S]) para los tres casos. Identifique cada uno de los gráficos. 5) Se quiere determinaron los parámetros cinéticos de otra enzima michaeliana , en ausencia y en presencia de un inhibidor. Se obtuvo el gráfico que se muestra más abajo. a) Indique de qué tipo de inhibidor se trata. b) Indique cuál recta corresponde a la reacción en ausencia (control) o presencia de dos concentraciones diferentes de un inhibidor I (I1, I2). Considere [I2] > [I1]. c) Cómo calcularía los parámetros cinéticos a partir del gráfico. ¿Qué valor calcula para los Km y las Vmáx?. d) Represente el grafico de Michaelis-Menten (Vo en función de [S]) para los tres casos. Identifique cada uno de los gráficos.

1/(S)

1/Vo0,03

0,02

0,01

-1 1 32 4

1/(S)

-1 0 1 2 3 4 5

1/Vo

0,01

0,02

0,03

6) A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar:

[S] en mM Vo (g Prod /h) Sin inhibidor

Vo (g Prod /h) Con inhibidor

2,0 139 88 3,0 179 121 4,0 213 149 10,0 313 257 15,0 370 313

a) el tipo de inhibición presente b) el valor de Km en ausencia y en presencia del inhibidor 7) A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar: a) el tipo de inhibición presente b) el valor de Km en ausencia y en presencia del inhibidor. 8) La penicilina es hidrolizada y así inactivada por la enzima penicilinasa, también conocida por β-lactamasa, presente en algunas bacterias resistentes. Se midió la cantidad de penicilina hidrolizada en un minuto en función a la concentración de penicilina y se obtuvieron los resultados resumidos en la siguiente tabla. a) ¿Sigue la penicilinasa una cinética de Michaelis-Menten?. En caso afirmativo, b) ¿Cuál es el valor del Km? c) ¿Cuál es el valor de la Vmáx? (Sugerencia, realice el grafico de Lineweaver-Burk) 9) Considere los siguientes datos para una reacción de hidrólisis catalizada por una enzima y en presencia del inhibidor I. a) Utilizando una representación de Michaelis-Menten, determine el Km de la reacción en ausencia o presencia del inhibidor. b) Genere una representación de Lineweaver-Burk de los datos. Explique el significado de: i) la ordenada al origen ii) la intersección con el eje de las abscisas iii) la pendiente c) Determine de que tipo de inhibición se trata.

[S] mM

Vo (g Prod /h) Sin inhibidor

Vo (g Prod /h) Con inhibidor

1,5 0,21 0,08 2,0 0,25 0,10 3,0 0,28 0,12 4,0 0,33 013 8,0 0,40 0,16 16,0 0,44 0,18

[Penicilina] en µM

cantidad hidrolizada

en nmoles/min 1,0 11 3,0 25 5,0 34 10 45 30 58 50 61

[sustrato] (M)

Vo (µM/min)

Voi (µM/min)

6 10-6 20,8 4,2 1 10-5 29 5,8 2 10-5 45 9 6 10-5 67,7 13,6

1,8 10-4 87 16,2

10) Se ha realizado dos experimentos con la enzima ribonucleasa. En el experimento 1 se midió el efecto del incremento dela concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción. En el experimento 2, las mezclas de reacción fueron idénticas a las del experimento 1 excepto la adición de 0,1 mg de un compuesto desconocido por tubo. Represente los datos de acuerdo don el método de Lineweaver-Burk. Determine el efecto del compuesto desconocido sobre la actividad de la enzima.

Experimento 1 Experimento 2 [sustrato]

mM Vo

(mM/hora) [sustrato]

mM Vo

(mM/hora) 0,5 0,81 0,5 0,42 0,67 0,95 0,67 0,67

1 1,25 1 0,71 2 1,61 2 1,08

11) La enzima aspartato transcarbamilasa cataliza la primera reacción propia de la síntesis de pirimidinas. En un estudio de ésta enzima, utilizando aspartato como sustrato, en presencia de CTP 0,5 M y en ausencia del mismo, se obtuvieron los siguientes datos: a) Sin utilizar ninguna representación gráfica, estime el valor de Km y Vmáx b) Utilizando la ecuación de Michaelis-Menten, calcular Vo para una [S]= 3 mM. ¿Existe alguna discrepancia entre éstos datos y los experimentales?. Justificarlo (la realización del grafico Vo vs [S] es una buena ayuda). c) ¿Qué efecto tiene el CTP sobre la actividad enzimática? 12) Completar las siguientes frases: a) La región de una molécula de enzima con la cual debe interaccionar el sustrato se llama ------------------------------- b) La especie química de vida corta que se forma después de que la enzima y el sustrato interaccionen se llama ----------------------------------- c) Debido a su estructura, un inhibidor -------------------------------- se une al centro activo de una enzima. d) Un inhibidor que no altera la KM de una enzima es un inhibidor de tipo ----------------- e) A mayor valor de KM, --------------------- es la afinidad de una enzima por su sustrato.

Aspartato (mM)

V0 sin CTP

V0 con CTP 0,5 M

1 0,45 0,2 2 0,8 0,4 3 1,7 0,7 4 2,9 1,0 5 3,4 1,4 7 4,3 2,4 9 5,1 3,7 10 5,3 4,2 12 5,6 4,8 15 5,8 5,5 16 5,8 5,6 17 5,8 5,6

Ejercicio integrador.

1 E 2 N 3 Z 4 O I 5 M 6 D A 7 T 8 O I 9 C 10 H O 1) Capacidad de un enzima para discriminar entre sustratos o ligandos competitivos. 2) Modelo matemático que describe el comportamiento de muchas enzimas, como una dependencia hiperbólica de Vo versus [sustrato] (2 palabras). 3) Enzimas que tienen diferente estructura proteica y catalizan la misma reacción. 4) Zona de la enzima donde se une el sustrato para transformarse en producto (2 palabras). 5) Parámetro cinético relacionado con la afinidad de la enzima por el sustrato. 6) Parámetro cinético que depende de la cantidad de enzima presente (2 palabras). 7) Inhibición enzimática que se puede revertir aumentando la concentración de sustrato. 8) Inhibición enzimática que no se puede revertir aumentando la concentración de sustrato (2 palabras). 9) Ión inorgánico o coenzima necesaria para la actividad enzimática. 10) Molécula que modula a una enzima, por la unión no covalente, en un sitio distinto del sitio activo (2 palabras).

Problema adicional En el cerebro humano está presente una isoenzima de la fosfodiesterasa que degrada al AMPc y al GMPc con un Km de 20 µM y 6 µM respectivamente, pero con igual velocidad máxima. Ante un estímulo generado por neurotransmisores y péptidos natriuréticos, la concentración de estos compuestos se eleva a 10 µM. Indique cuál de los 2 compuestos será degradado más rápidamente por la enzima en esas condiciones. Justifique.