Sem16_Técnicas_radiocompetición_proteica

7/28/2019 Sem16_Tcnicas_radiocompeticin_proteica

1/19

TECNICAS DE RADIOCOMPETICION PROTEICA

Nociones de Radioactividad

Recordemos que los tomos estn formados por un ncleo, que contiene protones,

neutrones y la energa de interaccin nuclear y por una zona extranuclear donde se

mueven los electrones por caminos energticos definidos llamados rbitas. La

radioactividad es un fenmeno nuclear, es el proceso por el cual un ncleo inestable

se desintegra, perdiendo partculas o energa de excitacin para formar una especie

nuclear ms estable.

Los tomos poseen en su ncleo protones y neutrones, y su identidad la define el

nmero de protones Z (un elemento de Z = 6 siempre va a ser C, no importa el

nmero de neutrones). En la naturaleza podemos encontrar C con 6, 7 u 8

neutrones, pero siguen siendo C porque su Z = 6. A estos se los denomina istopos.

Muchos de los istopos de los elementos representados en la tabla peridica de

Mendeleiev poseen una inestabilidad en su ncleo, ya sea por exceso de masa,

neutrones, protones o energa; en otras palabras son radioactivos. Para ganar

estabilidad deben perder ese exceso emitiendo partculas o fotones (desintegracin).

En el RIA, los elementos radioactivos frecuentemente utilizados para marcar los Ag

son: 125I y 3H (tritio).

El 125I posee un exceso de energa y para ganar estabilidad desintegra emitiendo

fotones . Como los fotones no poseen masa, su interaccin con la materia es pobre,

por lo que pueden recorrer grandes distancias antes de colisionar con molculas del

medio circundante (tienen alta penetrancia). El nmero de desintegraciones que el125I emite en la unidad de tiempo puede medirse en un contador de centelleo slido.

Este instrumento de medicin lo que determina es el nmero de coaliciones que se

producen entre los fotones emitidos y un cristal de NaI, en otras palabras

determina cmo interacciona con la materia.

NaI

Muestra con 125I

Fotn

Contador de centelleo slido

NaI

Muestra con 125I

Fotn

Contador de centelleo slido


2/19

El 125I se utiliza para marcar molculas proteicas. La mayora de las protenas posee

en su estructura residuos de tirosina, y son precisamente los anillos aromticos los

que se iodinan (as como ocurre con la tiroglobulina en la glndula tiroidea). Las

hormonas esteroideas no pueden ser marcadas con 125I, por lo que se debe recurrir

a otro elemento radioactivo mucho ms pequeo, el tritio: 3H.

El 3H posee un exceso de neutrones en su ncleo y para ganar estabilidad emite una

partcula cargada llamada -. Esta partcula posee cierta masa y rpidamente

interacciona con la materia, por lo que su penetrancia es baja. El nmero de

desintegraciones que el 3H emite en la unidad de tiempo no podra jams medirse en

un contador de centelleo slido debido a su baja penetrancia. La partcula -

coalicionara primero con el tubo o con el aire antes de interaccionar con el cristal.

Para ello, la materia que va a interaccionar con el 3H debe mezclarse con la muestra

que posee 3H. Dicha materia se denomina lquido centellante. El nmero de

coaliciones entre la partcula - y las molculas del lquido centellante se miden en el

contador de centelleo lquido.

Tanto para el contador de centelleo slido como lquido, la eficiencia de medicin no

es del 100%, siempre pierde alguna que otra coalicin, por lo que la medida arrojada

la da en cuentas por minuto (cpm) y no en desintegraciones por minuto (dpm).

Para marcar las hormonas esteroideas lo que se hace es recurrir a una marcacin

isotpica, reemplazando algunos de los tomos de H de la molcula por 3H.

En la figura se observa como ejemplo la marcacin de la testosterona con 8 tomos

de 3H.

Introduccin a la radiocompeticin proteica

La sangre y otros fluidos biolgicos son mezclas qumicas complejas. La

determinacin en sangre de sustancias tales como glucosa, urea, lpidos, etc, que

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

3H3H

3H3H

H 3H 3H

3H

3H

HH

H H

H

H

HH H

H

H

H

1,2,6,7-3H-testosterona

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

3H3H

3H3H

H 3H 3H

3H

3H

HH

H H

H

H

HH H

H

H

H

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

3H3H

3H3H

H 3H 3H

3H

3H

HH

H H

H

H

HH H

H

H

H

1,2,6,7-3H-testosterona


3/19

estn presentes en concentraciones del orden de los mg% se puede llevar a cabo

mediante ensayos de laboratorio convencionales, de baja sensibilidad.

En cambio, existe un gran nmero de sustancias como hormonas proteicas y

esteroides, vitaminas, etc, que tambin son de gran importancia clnica y que se

hallan en muy bajas concentraciones, del orden de los nanogramos/ml (ng/ml) o

picogramos/ml (pg/ml).

1 ng = 1 x 10-9 g 1 pg = 1 x 10-12 g

Para poder cuantificar estas sustancias se requiere un mtodo de alta sensibilidad

y especificidad, como las tcnicas de radiocompeticin proteica. La sensibilidad

es la capacidad de detectar un compuesto que se encuentra en muy bajas

concentraciones. La especificidad es la capacidad de reconocer nicamente a una

sustancia dada en una mezcla compleja.

En el mtodo de radiocompeticin proteica, la sustancia que se quiere valorar en el

suero del paciente es enfrentada en un tubo de ensayo con una protena ligadora

que la une especficamente, que tiene alta afinidad por ella y que es saturable por

ella (afinidad es la tendencia que presenta la sustancia ligadora de unirse al ligando,

mientras que saturabilidad es la propiedad de la sustancia ligadora de unir una

cantidad mxima fija de ligando). Las protenas ligadoras empleadas en este tipo de

ensayo pueden ser:

- Protenas plasmticas: por ejemplo transcortina srica, empleada para determinar

glucocorticoides en fludos biolgicos; o la protena ligadora de esteroides sexuales,

empleada para la determinacin de estradiol y testosterona en suero.

- Receptores celulares: en este caso el mtodo recibe el nombre de radiorreceptor.

Se emplea por ejemplo en la determinacin de estradiol en suero usando receptor

estrognico uterino.

- Anticuerpos (Ac): en este caso el mtodo recibe el nombre de radioinmunoanlisis

(RIA). Los Ac, inmunoglobulinas o -globulinas aparecen en la sangre y en ciertos

tejidos de vertebrados en respuesta a la inyeccin de un Antgeno (Ag), protena o

macromolcula que le es extraa al individuo. Cada protena fornea (Ag)

desencadena la formacin de un conjunto de diferentes anticuerpos que reconocen

distintas porciones (epitopes) de su estructura. Los Ac se combinan con los epitopesdel Ag para formar un complejo Ag-Ac.


4/19

En cuanto a la estructura de los Ac, estos son protenas que presentan forma de Y y

estn constituidas por cuatro cadenas polipeptdicas. Tienen dos sitios de unin que

son complementarios a los epitopes del Ag, llamados paratopes.

Paratope

Los Ac necesarios se obtienen en animales de laboratorio por inyeccin del Ag, que

en nuestro caso es la sustancia a determinar. Las hormonas proteicas suelen tener

buena capacidad antignica, en cambio las hormonas esteroides, por ser pequeas

no dan buena respuesta y se las suele administrar conjugadas a protenas de gran

tamao. Otra posibilidad es aumentar la antigenicidad empleando adyuvantes

como el de Freund completo o incompleto, que consiste en una suspensin compleja

de aceites minerales con o sin micobacterias. La preparacin antignica suele

administrarse en repetidas ocasiones para obtener una mayor produccin de

anticuerpos.

Hasta aqu la reaccin que tendramos en el tubo de ensayo sera:

Ac + Ag Ag-Ac

Pero qu pasara si al tubo de ensayo le agregramos una cantidad conocida de la

sustancia a dosar, o sea el Ag, pero marcada radioactivamente (Ag*, tambin

llamada trazador).

Las caractersticas inmunoqumicas del Ag* deben permanecer idnticas a las del

Ag sin marcar, en otras palabras, la presencia del tomo radiactivo en la molcula no

debe distorsionar ningn epitope. De esta forma, el Ag y el trazador competirn por

su unin al Ac que no podr distinguir entre ellos. Existirn entonces dos equilibriossimultneos:

Ag

epitope

Ac

Ag

epitope

Ac


5/19

Ag + Ac Ag-Ac

+

Ag*

Ag*-Ac

Resumiendo: dentro del tubo de ensayo, en un medio de pH y temperatura

adecuados, se establece una competencia entre las molculas marcadas y las no

marcadas del Ag para unirse al Ac. Dado que la cantidad de Ac es limitante, luego

de un tiempo de incubacin adecuado se llegar a un estado de equilibrio en el que

parte del Ag se uni al Ac para formar el complejo Ag-Ac y otra parte del Ag qued

libre en el medio de reaccin. Lo mismo sucede con Ag*.

Por lo tanto, cuando se llegue al equilibrio en el tubo de ensayo habr:

- complejos Ag-Ac

- molculas de Ag libres

- complejos Ag*-Ac

- molculas de Ag* libres

La interaccin de estas molculas est regida por la Ley de Accin de Masas: la

unin del Ag o Ag* con el Ac se realiza mediante sitios reactivos especficos y las

reacciones se desplazarn de acuerdo con la concentracin de estas especies. As,cuanto mayor sea la concentracin de Ag, mayor ser la cantidad del complejo Ag-

Ac formado y, por lo tanto, mayor ser la cantidad de Ag* desplazada.


6/19

Control Muestra desconocida

Cantidad fija de Ag*

Se aade lamuestra que

tiene unacantidaddesconocidade Ag

Se aade unacantidad fijade Ac anti-Ag

Se aade agenteprecipitante (Acanti-inmunoglobulina)

Se determinaradioactividad enlos precipitados

cpmcontrolcpmdesconocido


x 100 =%.Ag* unido











Se aade agenteprecipitante (Acanti-inmunoglobulina)

Se determinaradioactividad enlos precipitados



x 100 =%.Ag* unido

Ag*

Ag

Ac

Ag*

Ag

Ac


7/19

Principio del radioinmunoanlisis - RIA

En el ejemplo que se muestra las cantidades de Ag* son inferiores a las de Ag, lo

que produce una reduccin del antgeno radioactivo unido (3 partculas en el tubo

control versus 1 particula en el tubo muestra).

Es de importancia mencionar que el Ac ant i-Ag de inters se agrega en

concentraciones limitantes con el fin de que se establezca la competencia entre

Ag y Ag*.

Podemos entonces hablar de una fraccin unida (complejos Ag-Ac y Ag*-Ac) y de

una fraccin libre (molculas de Ag y Ag*). Si con un mtodo adecuado separamos

la fraccin libre de la unida, podremos medir la radioactividad presente en cada una

de estas fracciones. Cuanto mayor haya sido la cantidad de Ag presente en la

muestra original, mayor ser la cantidad de complejos Ag-Ac y menor la de

complejos Ag*-Ac formados, y mayor ser la cantidad de Ag* libre.

La separacin de ambas fracciones puede efectuarse por alguno de los siguientes

mtodos:

- precipitacin con segundo anticuerpo: los complejos formados se precipitan con

un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo utilizado en el ensayo. Este

mtodo se usa principalmente cuando el Ag es una hormona proteica, ya que se

forman complejos proteicos de alto peso molecular que precipitan fcilmente.

- adsorcin de la fraccin libre: se emplean materiales de alto poder adsorbente

como el carbn activado con o sin agregado de dextrano, talco, florisil, etc, que

retienen, por el fenmeno fsico de adsorcin, las molculas de bajo peso molecular.

Al centrifugar el carbn activado con las partculas adsorbidas se encuentran en el

precipitado. Se emplea para hormonas esteroides.

Separadas ambas fracciones se mide la radioactividad en general en la fraccin

donde se encuentran los complejos Ag-Ac, llamada fraccin unida. Si se us el

mtodo del 2do Ac, la fraccin unida se encuentra en el precipitado; pero si se us el

mtodo del carbn activado, la fraccin unida se encuentra en el sobrenadante. Pero

cmo relacionamos la radioactividad con la concentracin de la sustancia a dosar

presente en la muestra?

Preparando simultneamente una curva patrn (o de desplazamiento) con

cantidades conocidas y crecientes del Ag (patrn, es decir Ag de concentracinconocida). Evidentemente, todos los tubos, incluyendo los que contienen la muestra,


8/19

debern llevar la misma cantidad de Ac y de Ag* dado que la nica variable del

ensayo debe ser el Ag de la muestra, y debern ser sometidos a las mismas

condiciones de incubacin y separacin. Entonces, a mayor concentracin de Ag

ms se desplaza el Ag* y menos complejos Ac-Ag*. Se construye entonces la curva

de desplazamiento:

cpmunido/cpmtotal

[Ag]

Los valores de radioactividad correspondientes a las muestras pueden entonces

interpolarse en la curva para obtener las concentraciones del Ag. Dado que las

interpolaciones sobre curvas no son precisas se recurre a un tratamiento matemtico

de los datos que transforma la curva en recta para trabajar con menor error. Este

procedimiento se conoce como mtodo LOGIT LOG.

Log [Ag]

LogitT

LogitT =ln T1-T

=cpmunido

cpmunin mximaT

Por otro lado, cada vez que se realice un ensayo deben considerarse las uniones

inespecficas. Las uniones inespecficas son las uniones del Ag* a otras sustancias

que no sean el Ac. Para ello utilizamos tubos procesados de la misma manera quelos restantes pero que carecen del Ac. Toda unin que se observe en estos tubos se


9/19

deber a la fijacin del Ag y Ag* a molculas distintas al Ac. El valor de esta unin

inespecfica se sustrae a los tubos restantes, ya que se asume que en todos los

tubos ocurre en la misma proporcin.

EJ EMPLO UN ENSAYO RIA

Se realiza un RIA para determinar la concentracin de LH en 2 muestras de suero (A

y B). Los datos obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

LH1

LH2

LH3

LH4

LH5

LH6

LH*

LH*

LH*

LH*

LH*

LH*

LH*

LH*

LH*

LH*

LH*

Todos los tubos deben tener igual volumen final, lo que se consigue completandocon solucin buffer. Calcule las concentraciones de LH en A y B (en mUI/ml)utilizando una representacin grfica.

Resolucin:

Primero hay que promediar los valores de radioactividad (cpm) para cada par de

duplicados. La unin especfica de cada tubo se obtiene restando el promedio de la

unin inespecfica [(396+418)/2=407]. Se hacen los cocientes entre el promedio de

cada punto y el de la unin mxima, tanto para la curva como para las muestras a


10/19

determinar. A este cociente se lo denomina T = cpm unido / cpm unin mxima. Se

calcula el valor de Logit T:

LogitT =ln T

1-T

y se grafica la curva de desplazamiento: Logit T en funcin de los logaritmos de la

concentracin de LH (eje x: log [LH]; eje y: Logit T). Entrando a la curva con el valor

de Logit de las muestras a determinar, se obtiene el valor del logaritmo de la

concentracin de LH, a partir del que se calcula la concentracin de LH

(antilogaritmo).

T

2.17

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,52

2,5

3

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

A

B

LogitT

Log [LH]

Resultados exactos:

[LH] A = 13.72 mUI/ml

[LH] B = 41.58 mUI/ml

ENSAYOSINMUNOMTRICOS

1) IRMA (ensayo inmunoradiomtrico)


11/19

A diferencia del RIA, que como se vi, es un mtodo competitivo, el IRMA es un

ensayo de tipo NO competitivo utilizado en la cuantificacin de antgenos de alto

peso molecular que presentan varios determinantes antignicos epitopes. El IRMA

no puede emplearse en la determinacin de molculas pequeas (ej. esteroides) que

poseen baja capacidad antignica, ya que en general se requiere que posean varios

epitopes.

Este ensayo requiere de dos anticuerpos especficos (mono policlonales) dirigidos

contra epitopes diferentes del antgeno. Ambos anticuerpos deben encontrarse en

altas concentraciones (en exceso). Uno de estos anticuerpos se adsorbe a una fase

slida y el otro anticuerpo se marca radiactivamente, en general con 125I.

Luego de incubar, se formarn complejos de anticuerpo adsorbido a la fase slida-

antgeno presente en la muestra-anticuerpo marcado radiactivamente. Se lava, y se

determina la radiactividad en un contador de centelleo lquido. La radiactividad

obtenida ser directamente proporcional a la concentracin de antgeno presente en

la muestra a dosar.

con 2 epitopes (pueden ser igualeso diferente)

*

Ac especficoadsorbido a la placa

Ag

Ac especfico marcadoradioactivamente**

Ac especficoadsorbido a la placa

Ag

Ac especfico marcadoradioactivamente*

*

*

*

*

*

**

*

*


12/19

Ventajas del IRMA:

posee mayor sensibilidad que el RIA. Al utilizar anticuerpos en exceso, el

IRMA es capaz de detectar antgeno en muy bajas concentraciones.

es ms fcil marcar radiactivamente anticuerpos (como utiliza el IRMA) que

marcar radiactivamente antgeno (como requiere el RIA).

es un ensayo rpido y estable.

Desventajas del IRMA:

requiere de mayor nmero de pasos, por ejemplo necesita lavados

adicionales que el RIA no utiliza.

utiliza generalmente anticuerpos monoclonales (Mab), que son ms

laboriosos de obtener que los anticuerpos policlonales (Ac). Los Mab son

anticuerpos que proceden de un nico clon de linfocitos B activados

(plasmocitos), o sea que poseen la capacidad de reconocer un nico epitope

en toda la molcula antignica y siempre es el mismo. Se obtienen por la

tcnica desarrollada por Milstein y Khler.

al utilizar sustancias radiactivas est sujeto a legislacin restrictiva (a

diferencia del ELISA y el DELFIA que no emplean compuestos radiactivos).

Cuadro comparativo entre RIA e IRMA:

RIA IRMA

Ensayo competitivo (se establece una

competencia entre las molculas marcadas y

las no marcadas por el ligando).

Ensayo NO competitivo.

Se alcanza un estado de equilibrio ( en el cual

parte del antgeno marcado y no marcado se

uni al anticuerpo para formar el complejo

antgeno-anticuerpo, y parte del antgeno

No se alcanza un estado de

equilibrio.


13/19

marcado y no marcado qued libre en el

medio de reaccin)

El anticuerpo es utilizado en concentracin

limitada (para que el antgeno no marcado yel antgeno marcado compitan por el Ac)

Los anticuerpos son utilizados en

altas concentraciones (en exceso).

Se determina antgeno marcado

radiactivamente (libre formando parte del

complejo antgeno-anticuerpo).

Se determina anticuerpo marcado

radiactivamente (formando parte

del complejo Ag-Ac).

El antgeno debe tener un determinante

antignico.

El antgeno debe tener por lo

menos dos determinantes

antignicos diferentes.

En general utiliza anticuerpos policlonales En general utiliza anticuerpos

mono y policlonales

Para aumentar la sensibilidad del RIA debo

colocar el anticuerpo y el antgeno marcado

en bajas concentraciones.

Para aumentar la sensibilidad del

IRMA debo colocar los anticuerpos

muy concentrados, de modo de

atrapar todo el antgeno presente

en la muestra.

La radiactividad obtenida (en los complejosanticuerpo-antgeno marcado) disminuye amedida que aumenta la concentracin de

antgeno presente en la muestra.cpm unidocpm total

[antgeno]

La radiactividad obtenida aumentaa medida que aumenta la

concentracin de antgeno en lamuestra.

cpm unidocpm total

[antgeno]

2)ELISA

El enzimoinmunoanlisis es una de las tcnicas inmunoqumicas ms

importante desarrollada en los ltimos aos. Los inmunoensayos sirven para

detectar y cuantificar antgenos o anticuerpos y para estudiar la estructura de


14/19

los antgenos. Si el ensayo es el adecuado, son muy rpidos y fciles,

rindiendo informacin que sera difcil obtener utilizando otras tcnicas.

El enzimoinmunoanlisis es un mtodo objetivo y automatizable; a diferencia

del RIA est exento de legislacin restrictiva y los reactivos usados se

conservan durante un tiempo relativamente prolongado. Estas consideraciones

unidas al hecho de que slo se necesita un equipo sencillo y econmico, han

llevado al desarrollo reciente de numerosos enzimoinmunoanlisis, muchos de

los cuales son especialmente adecuados para su utilizacin en laboratorios

pequeos y en pases en desarrollo.

Nos ocuparemos ahora de un tipo de enzimoinmunoanlisis conocido como

anlisis por enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (ELISA). Esta tcnica

presenta como requisito que los anticuerpos o los antgenos se puedan ligar a

una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunolgica como

la enzimtica.

En estos ensayos, el antgeno o el anticuerpo se une usualmente a un soporte

de fase slida para facilitar la separacin de los reactivos libres y combinados.

Se ha hallado que antgenos y anticuerpos se pueden unir covalentemente al

material particulado, como celulosa, poliacrilamida, y que tambin se puede

obtener una adsorcin pasiva satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas

de nylon, poliestireno, polivinilo o polipropileno. Como ya se ha mencionado

una parte esencial del ELISA es la conjugacin del anticuerpo (o antgeno) con

una enzima. Es necesario que la enzima tenga actividad elevada, sea

econmica, fcil de obtener en forma pura, y que posea una reaccin con el

sustrato fcilmente medible. Las enzimas consideradas hasta ahora ms

satisfactorias son la peroxidasa del rbano picante, la glucosa oxidasa, la -

galactosidasa y la fosfatasa alcalina. Estas son fijadas generalmente a

anticuerpos o antgenos por medio de glutaraldehdo o periodato. Los

conjugados as obtenidos han demostrado ser estables durante muchos

meses, incluso aos.


15/19

La eleccin del sustrato es crtica en el ELISA. Los sustratos deben ser

estables y solubles antes y despus de la reaccin enzimtica. Los sustratos

cromognicos deben ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados

despus de la degradacin. Los sustratos fluorognicos, que producen un

compuesto fluorescente, pueden ser ventajosos para anlisis de alta

sensibilidad.

ELISA INDIRECTO

Si bien existen muchas formas de llevar a cabo un ELISA y se los puede

clasificar segn varios criterios diferentes, describiremos el mtodo ms

comnmente utilizado, denominado Elisa Indirecto. Este mtodo es

ampliamente utilizado para la determinacin de anticuerpos, ya que se

necesitan slo unos pocos conjugados (ej. anticuerpos anti-inmunoglobulinas

humanas marcadas con enzimas) para analizar anticuerpos de una gran

variedad de enfermedades. La tcnica es la siguiente:

1) El antgeno correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego

se lavan.

2) Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se

lavan nuevamente; el anticuerpo presente reacciona con el antgeno

inmovilizado en la superficie de las concavidades.

3) El conjugado de antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima se

incuba en las concavidades; ste reacciona con cualquier anticuerpo

"capturado en el paso anterior. El exceso de reactivo se lava.

4) Se agrega el sustrato enzimtico y las placas se incuban; la velocidad de la

degradacin se indica por el cambio de color, que es proporcional a la

concentracin de anticuerpo de las muestras del paso (2).

5) Se detiene la reaccin y el color se determina en un espectrofotmetro.


16/19

E E

E E

s

s

s

s

s

2) Se aade suero del paciente. Si hayAnticuerpos especficos anti-Ag estos se unirn.

3) Se aade anti -globulina humana marcada conuna enzima. Esta se unir al Ac del paciente.

4) Se aade el sustrato de la enzima.

LAVAR

LAVAR

La cantidad de producto que se

obtiene es propo rcional a la

cantidad de anticuerpo presente.

E E

E E

s

s

s

s

s

EE EE

EE EE

s

s

s

s

s

2) Se aade suero del paciente. Si hayAnticuerpos especficos anti-Ag estos se unirn.

3) Se aade anti -globulina humana marcada conuna enzima. Esta se unir al Ac del paciente.

4) Se aade el sustrato de la enzima.

LAVAR

LAVAR

La cantidad de producto que se

obtiene es propo rcional a la

cantidad de anticuerpo presente.


17/19

Determinacion biolgica de hormonas: Bioensayo

Las hormonas se pueden determinar en el suero o plasma de acuerdo adiferentes criterios: se puede medir la cantidad de hormona que se encuentracirculante o se puede evaluar la capacidad que tiene sta de generar una accin, es

decir que se puede medir su capacidad funcional. Para medir la concentracin dehormona circulante se utilizan por ejemplo, las tcnicas de radiocompeticin proteica ode enzimo-inmunoensayo. Para medir la actividad biolgica de una hormona seutilizan distinos tipos de bioensayos.

El bioensayo tiene la caracterstica de estudiar la capacidad de la hormona deproducir una respuesta, de manera tal que esta accin se pueda determinar ocuantificar midiendo el metabolito final producido por esta hormona. De esta manerase evala a la hormona de acuerdo a su actividad biolgica. Se recurre a estametodologa en casos muy particulares donde los resultados de los niveleshormonales obtenidos en el laboratorio no son consistentes con los sntomas clnicosobservados en el paciente. Para establecer una analoga, se puede pensar que essimilar a cuando se determina la actividad de una enzima de acuerdo a la cantidad de

producto que se forma en la unidad de tiempo y no a la masa de la enzima endeterminado volumen.La metodologa del bioensayo, al igual que las otras tcnicas descriptas en esta

unidad temtica, tiene tambin una alta sensibilidad y reproducibilidad.

Actividad biolgica de la hormona luteinizante

Daremos como ejemplo la medicin en el suero de un paciente de la actividadbiolgica de la hormona luteinizante. Para estudiar esta actividad, se evala lacapacidad que tiene el suero de producir una respuesta biolgica sobre una poblacincelular, por ejemplo, en este caso: clulas de Leydig de testculo de rata o ratn. Larespuesta que se mide es la capacidad que tiene esa muestra de suero de estimular la

produccin de testosterona en las clulas de Leydig.La metodologa consiste en la extraccin de los testculos del animal luego del

sacrificio del mismo. El testculo est formado por dos compartimientos encerradosdentro de la cpsula o albugnea: el tubo seminfero y el tejido intersticial. Las clulasde Leydig se encuentran en el tejido intersticial.

El tejido se decapsula y se trata con una enzima llamada colagenasa. Estetratamiento permite la liberacin de las clulas intersticiales que generalmente seencuentran en la conjuncin de varios tubos seminferos. Esta preparacin se filtra atravs de una gasa de nylon y de esta manera se aislan las clulas intersticiales.

Una vez obtenidas las clulas, se procede a su conteo para conocer el nmerode clulas de Leydig obtenidas y as poder determinar el nmero de clulas que sedistribuir en cada uno de los tubos.

En cada tubo se coloca:# Una cantidad determinada de medio de cultivo.# La misma cantidad de clulas en cada uno de los tubos.# Una alcuota de la muestra incgnita o diferentes cantidades de hormona standard

(curva de calibracin).Luego se incuban los tubos en un bao de agua a una temperatura y tiempo

adecuados para que las clulas sean capaces de responder al estmulo hormonalsintetizando testosterona y segregndola al medio de incubacin.

Para cuantificar la respuesta hormonal se debe cuantificar la testosteronasintetizada y secretada al medio de incubacin. Esto se puede realizar, por ejemplo,por la tcnica de radioinmunoanlisis (RIA).

Si se realiza un grfico con las muestras de concentraciones crecientes de LHstandard (curva patrn), se obtiene un grfico semejante al de la figura, en donde se


18/19

alcanza un mximo en la produccin de testosterona debido a la saturacin de larespuesta.

Para determinar la concentracin de hormona que produjo la estimulacin de lasclulas se realiza una extrapolacin del valor de la concentracin de testosterona

producida por la muestra incgnita y se averigua la concentracin de hormonaluteinizante biolgicamente activa que contena esa muestra. Como en la tcnica deRIA, tambin se pueden realizar ajustes matemticos para obtener rectas en lugar decurvas en los grficos.

Pueden existir discrepancias en el valor obtenido para una misma hormona por unensayo biolgico y otro ensayo inmunolgico, ya que la misma masa de hormonapuede tener distinta bioactividad en procesos patolgicos o en determinadascondiciones fisiolgicas.

A continuacin daremos algunos ejemplos de bioensayos basados enmetodologas muy similares a la descripta para el bioensayo de LH.

a) Bioensayo para ACTH: se utilizan clulas de glndula adrenal de la zonafasciculata. Se determinan los niveles de glucocorticoides sintetizados por

accin de ACTH.b) Bioensayo de angiotensina: en este caso se usan clulas de glndula

adrenal de la zona glomerulosa, determinndose los niveles demineralocorticoides sintetizados por accin de la angiotensina.

c) Bioensayo de la hormona foliculoestimulante: Se utilizan clulas de Sertoliy se miden los niveles de estradiol sintetizados por accin de dichahormona. Tambin se pueden usar clulas de la granulosa de ovario ymedir la produccin de esteroides.

d) Bioensayo de prolactina: se utilizan lneas celulares en cultivo queresponden a prolactina, determinndose el incremento en el ndice mitticopor accin de la hormona.

Ejercicio: Comparacin de tcnicas


19/19

Sem16_Técnicas_radiocompetición_proteica

Documents

Transcript of Sem16_Técnicas_radiocompetición_proteica