SECUENCIACIÓN

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ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA

Secuenciación de genomas

•Detección de mutacionesMétodo de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

•Secuenciación de ADNs fósilesPosibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoríaestán dañadas o degradadas)

•Diagnóstico de enfermedades genéticasDiagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos defecundación in vitro

•Identificación de especies y control de cruces entre animalesPara descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

•Secuenciación de genomasConocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

5’3’

|||||||||||||||3’

• Técnica de Sanger para secuenciar el DNA:

• el DNA se denatura: hebras simples

• el partidor se hibrida a la hebra molde

• el DNA es sintetizado usando DNA polimerasa

Las Cadenas Polinucleotídicas crecen porAdición de nucleótidos al Extremo 3´ OH

FUNDAMENTO

Dideoxy Sequencing

Fred Sanger - 1977

5’3’

|||||||||||||||

ddATPDNAdNTPs

ddTTPDNAdNTPs

ddGTPDNAdNTPs

ddCTPDNAdNTPs

A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C

T A

T A G T A

T A G T A C A

T A G T A C A G T A

T A G T A C A G T A G T T C A

T A G T A C A G T A G T T C A G A

• Todos los posibles productos

de la reacciónconteniendo ddATP

•cada fragmentotermina en ddA

SECUENCIACION DEL DNA

METODO ENZIMATICO

graphics taken from Cold Spring

Harbor Laboratory web site:

darwin.cshl.org/shockan.html

migración

González,2007

Beneficios médicos tras el conocimiento de laestructura de cada gen humano

1. Diagnóstico en individuos con riesgo de serportadores del gen de alguna enfermedad

2. Marco de trabajo para el desarrollo denuevas terapias, además de nuevasestrategias para la terapia génica

16 de Febrero de 2001Celera Genomics

15 de Febrero de 2001Consorcio público internacional

Proyecto genoma humanoLa secuencia del genoma es un atajo valioso: ayuda a los científicos a encontrar los genes más fácil y rápidamentey sienta las bases para averiguar la función de los genes identificados

SORPRESA No. 1

Sólo 2% del genoma son genes.

Gen 1 Gen 298% del genoma

Somos casi idénticos (2% de diferencia) a los chimpancés.

SORPRESA No. 2

Hay sólo 0,1% de variación genética entre todos los seres humanos.

SORPRESA No. 3

Pero 0,1% de 3.000.000.000 bases = 3.000.000 bases

La propiedad mas importante del DNA es su secuencia de nucleótidos.

La secuenciación es la determinación del orden de los nucleótidos.

Secuenciación por el método de Maxam-Gilbert

• Esta basada en la modificación química del dna yposterior escisión de bases específicas.

Ventaja:

El dna que se usa directamente (no requieres ser clonado)

Desventajas:

• ha quedado en desuso por su complejidad.

• Los reactivos de este método no se pueden adaptar para usarse en un kit biológico

• El método requiere el marcaje radiactivo enel extremo 5 y la purificación del fragmentoque se requiere secuenciar.

• De esta manera las longitudes de los fragmentos corresponden a posiciones en la secuencia donde esta esa base

Métodos de terminación de la cadena (sanger)

• Es el método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como la técnica del didesoxi.

• Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos(figura 1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos un nucleótido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.

• Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar

• Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena

• desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.

• didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación.

• Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido porque la ausencia de un hidroxilo 3’ impide el agregado del próximo nucleotido.

• Deben prepararse cuatro reacciones de secueciación, cada una con un didesoxi distinto . Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN

•CYCLE SEQUENCING

•3 µl de ddH2O•2 µl buffer 5x•1 µl de cada cebador•1 µl Big Dye•3 µl de ADNmt (gelasa)

Automatización y preparación de las muestras

• Más de 384 muestras marcadas por fluoresciencia de una sola vez y 24 ciclos de secuenciación al día.

• Preparar por separado las reacciones de secuenciación mediante una termocicladora, lavado y resuspensión en una solución buffer antes de pasar las muestras al secuenciador.

• Limitaciones: alturas y formas de picos desiguales en los registros del cromatograma producto de los terminadores fluorescentes.

• Solución: introducción de nuevos sistemas enzimáticos de polimerasas de ADN y colorantes que minimizan la variabilidad de la incorporación..

TECNOLOGíA DE MICROARRAYS DE cDNAS

CHIPs de DNA

• Permite analizar cientos o miles de genes diferentesen un solo experimento.

Tipos de arrays

1. Microarrays de cDNAs:• DNAs (cDNA o productos de PCR 0,6-2,4 Kb) son inmovilizados en

una superficie solida (nylon o vidrio).• Contienen cientos-miles de sondas.• Baja densidad de las sondas inmovilizadas.• La muestra a hibridar es marcada con radioactividad.

2. 2. Microarrays de oligonucleotidos:• Oligonucleotidos (20-80 pb) son sintetizados sobre una matriz de

vidrio o plástico.• Contienen 40.000-60.000 sondas.• Alta densidad de sondas inmovilizadas (107 copias/punto de

siembra).

Confección del array

Confección de arrays

MICROARRAYS

Siembra 0,25-1 nL/spotgenerando spots de 100-150 m de diametro.

Confección de arrays

Figure 3: Atomic force microscopy of DNA on a microarray. This is a micrograph of a portion of a hybridization probe from ayeast microarray, taken after the array was subjected to hybridization. The DNA is clearly deposited at a sufficient density toallow many kinds of strand–to–strand interactions. The width of the picture represents a scanned distance of 2 m. Imagekindly provided by J. DeRisi (Stanford) and E. Carr (Hewlett–Packard).

Confección de arrays

Colección de genes blanco: DNA’s o

Productos de PCR

Membrana de nylon

Robot sembrador

Siembra 7 nL/spotgenerando spots de 400-800

m de diametro.

Confección de arrays

Macroarrays

Hibridación en microarrays

Cy5 Cy3

Cy5 = 633 nm Cy3 = 532 nm

Expresión de 1 > 2

21

Expresión de 1 = 2

Expresión de 1 < 2

Microarray de levadura

El nivel de expresión de cada gen es representado por la intensidad de la señal asociada a un color:Rojo (Cy5) = > expresión en la muestra experimentalVerde (Cy3) = < expresión en la muestra experimental Por convención el RNA de referencia es marcado con Cy3.