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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS P R E S E N T A M. en C. MARGARITA LÓPEZ MARTÍNEZ . DIRECTOR: DR. HÉCTOR JAIME SALGADO ZAMORA . ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANSIOLÍTICA Y/O SEDANTE POTENCIAL DE DERIVADOS DE IMIDAZO[1,2-a]PIRIDINA MÉXICO, D. F. AGOSTO DE 2010
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
P R E S E N T A
M. en C. MARGARITA LÓPEZ MARTÍNEZ
.
DIRECTOR: DR. HÉCTOR JAIME SALGADO ZAMORA
.
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANSIOLÍTICA
Y/O SEDANTE POTENCIAL DE DERIVADOS
DE IMIDAZO[1,2-a]PIRIDINA
MÉXICO, D. F. AGOSTO DE 2010
El presente trabajo se realizó en los laboratorios 6 y 7 de investigación de Química
Orgánica y en el laboratorio de Neurociencia Conductual de la Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, en el laboratorio de Farmacología Conductual de la Sección de
Estudios de Posgrado e Investigación en la Escuela Superior de Medicina del
Instituto Politécnico Nacional y en el bioterio de la Facultad de Química de la
Universidad Nacional Autónoma de México, bajo la dirección del Dr. Héctor Jaime
Salgado Zamora.
El trabajo de investigación recibió financiamiento de C.G.P.I. a través del Programa
Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) con las claves 20070630
20080319 Y 20090741 y de CONACYT con registro 202056.
RESUMEN
Los problemas relacionados con el sueño y la ansiedad se encuentran entre los trastornos
mentales mas frecuentes, particularmente en nuestros días. Las benzodiazepinas son
compuestos químicos que se utilizan en el tratamiento de este tipo de trastornos aunque
recientemente derivados del núcleo imidazo[1,2-a]piridina como es el caso del zolpidem y
alpidem han surgido como una importante alternativa en la quimioterapia de dichos trastornos.
En la presente investigación se sintetizaron tres imidazo[1,2-a]piridina-3-nitrosadas (L-1, L-2, L-
3) y una tiosemicarbazona (L-4), derivada de 3-formil imidazo[1,2-a]piridina, las cuales fueron
sometidas a un estudio en el laberinto elevado en cruz (plus maze), pruebas de conducta
defensiva de enterramiento, rodillo giratorio (rotarod), cuerda tirante y actividad locomotora
espontánea.
Los derivados L-2 y L-3 aumentaron significativamente el porcentaje de tiempo de estancia en
los brazos abiertos en el plus maze a las dosis de 1 y 2 mg/kg sin modificar el número de
entradas totales. Adicionalmente, los compuestos L-2 y L-3 aumentaron el número de entradas
a los brazos abiertos a la dosis de 1 mg/kg, lo cual indicó que hubo inducción de actividad
ansiolítica a las concentraciones mencionadas.
En la prueba conducta defensiva de enterramiento, los derivados L-1 (2-4 mg/kg), L-2 (8
mg/kg)y L-3 (4 y 8 mg/kg), indujeron una clara disminución en la conducta de enterramiento
acumulativo, sin modificar la latencia de enterramiento. Como consecuencia de ello, se obtuvo
una disminución en la respuesta de ansiedad experimental de los animales.
Los resultados obtenidos en la prueba del rodillo giratorio determinaron que los derivados de
imidazo[1,2-a]piridina L-1 y L-2 deterioraron el desempeño en el rodillo pero únicamente a la
dosis más alta evaluada (64 mg/kg), dosis en la cual se observó disminución de la actividad
locomotora espontánea y por lo tanto no se determinó presencia de efectos miorrelajantes.
Todos los compuestos mostraron claramente un efecto sedante. Las correspondientes DE50
fueron calculadas. Los resultados experimentales obtenidos indicaron que los compuestos L-1,
L-2 y L-3 muestran tanto un perfil sedante como ansiolítico.
ABSTRACT
Sleep behavior and anxiety problems are amongst the most frequently mental disorders
particularly found in these days. Benzodiazepines are chemical compounds currently used for
the treatment of these disorders, however very recently derivatives of imidazo[1,2-a]pyridines,
such as Zolpidem have emerged as an important alternative for the chemotherapeutic
treatment of such disorders.
In the present investigation, three imidazo[1,2-a]pyridine-3-nitrosated (L-1, L-2, L-3) and a 3-
formyl imidazo[1,2-a]pyridine thiosemicarbazone (L-4) were synthesized and evaluated for their
actions on elevated plus maze, burying behavior test, rotarod performance, the horizontal wire
test and locomotor activity. Derivatives L-2 and L-3 significantly increased the percent of time
spent in the open arms of the plus maze at doses of 1 and 2 mg/kg without modifying the
number of total entries. In addition, L-2 and L-3 (1 mg/kg) increased the number of entries to
open arms, indicating that an anxiolytic-like activity is developed at such concentration.
In the burying behavioral test, derivatives L-1 (2-4 mg/kg), L-2 (8 mg/kg), L-3 (4 and 8 mg/kg),
induced a clear reduction in cumulative burying behavior, without modifying its burying
behavior latency. As a consequence an effect in the reduction in experimental anxiety was
obtained. The results obtained in rotarod test determined that imidazo[1,2-a]pyridine
derivatives L-1 and L-2 impaired rotarod performance only at the highest evaluated dose (64
mg/kg) at which reduction of motor activity was observed and thereby no conclusions about
myorelaxant effects can be proposed. All compounds showed a clear sedative effect and the
corresponding ED50 values were obtained. Results indicate that compounds L-1, L-2 and L-3
show a sedative and an anxiolytic profile.
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
II. FARMACOTERAPIA DE LOS TRASTORNOS DE SUEÑO Y ANSIEDAD ........................ 4
II.1 Función del GABA (ácido γ-aminobutírico) en los trastornos de ansiedad ......................... 4
II.2 Función de la serotonina (5-HT) en la ansiedad .................................................................... 6
II.3 Función de la noradrenalina en la ansiedad ........................................................................... 6
III. FÁRMACOS ANSIOLÍTICOS, SEDANTE-HIPNÓTICOS NO BENZODIAZEPÍNICOS
CON ACCIÓN SOBRE EL RECEPTOR GABAA ..................................................................... 7
IV. MODELOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS EN EL ANÁLISIS FARMACOLÓGICO
DE LAS IMIDAZO[1,2-a]PIRIDINAS ...................................................................................... 8
IV.1 Modelos para la evaluación del estado de ansiedad ............................................................. 8
IV.2 Modelos para la evaluación miorrelajante ......................................................................... 10
IV.3 Evaluación de la actividad locomotora espontánea .......................................................... 10
V. ANTECEDENTES .................................................................................................................... 11
VI. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................... 13
VII. HIPÓTESIS ............................................................................................................................ 14
VIII. OBJETIVO GENERAL: ....................................................................................................... 14
IX. OBJETIVOS PARTICULARES: ............................................................................................ 14
X. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES .................................................................................... 15
X.1 Metodologías de síntesis ..................................................................................................... 15
X.2 Evaluación farmacológica de los derivados de imidazo[1,2-a]piridina .............................. 20
X.2.1 Evaluación del efecto ansiolítico en el modelo del laberinto elevado en cruz (Plus-
Maze) ...................................................................................................................................... 21
X.2.2 Evaluación del efecto ansiolítico en el modelo de conducta defensiva de enterramiento
................................................................................................................................................ 22
X.2.3 Evaluación del efecto relajante muscular en el rodillo giratorio (Rota-rod) ................ 23
X.2.4 Evaluación del efecto de relajación muscular en el modelo de la cuerda tirante ......... 24
X.2.5 Evaluación del efecto sedante-hipnótico en ratón ........................................................ 25
X.2.6 Evaluación de la actividad locomotora espontánea en rata y ratón .............................. 26
XI. RESULTADOS FARMACOLÓGICOS .................................................................................. 28
XI.1 Análisis estadístico ............................................................................................................. 28
XI.2 Actividad locomotora espontánea ...................................................................................... 28
XI.4 Modelo de ansiedad en el laberinto elevado en cruz (Plus-Maze) ..................................... 32
XI.5 Modelo de ansiedad de la conducta defensiva de enterramiento ....................................... 36
XI.6 Modelos de evaluación de la coordinación motora (rotarod y cuerda tirante) ................... 38
XII. RESULTADOS Y DISCUSIONES ....................................................................................... 41
XIII. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 45
XIV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 46
ANEXOS ........................................................................................................................................ 54
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructuras químicas de las benzodiazepinas. .................................................................. 2
Figura 2. Receptor a benzodiacepinas GABAA................................................................................ 5
Figura 3. Ejemplos de fármacos que contienen el núcleo imidazopiridina. ..................................... 8
Figura 4. Receptores benzodiazepínicos tanto centrales (RBC) como periféricos (RBP) ............. 11
Figura 5. Distribución del potencial electrostático molecular del zolpidem. ................................. 12
Figura 6. Estructura general de los derivados de imidazopiridina evaluados. ............................... 13
Figura 7. Síntesis de derivados de 2-arilimidazo[1,2-a]piridinas .................................................. 16
Figura 8. Síntesis de 2-arilimidazo[1,2-a]piridinas-3-nitrosadas, 3- tiosemicarbazona ................. 17
Figura 9. Método general para la síntesis de 2-aril-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridinas ................... 18
Figura 10. Modelo ansiolítico del laberinto elevado en cruz (Plus-Maze) .................................... 22
Figura 11. Modelo de la conducta defensiva de enterramiento ...................................................... 23
Figura 12. Equipo Rodillo giratorio (Rota-rod) para ratas modelo acelerante 7750 (Ugo Basile) 24
Figura 13. Modelo de relajación muscular de la cuerda tirante ..................................................... 25
Figura 14. Ratón en estado de sedación ......................................................................................... 25
Figura 15. Ratón en estado de hipnosis .......................................................................................... 26
Figura 16. Equipo de análisis de movimiento (VIDEOMEX) para la evaluación de la actividad
locomotora ...................................................................................................................................... 26
Figura 17. Equipo de análisis de movimiento (OPTO-VARIMEX) para la evaluación de la
actividad locomotora ...................................................................................................................... 27
Figura 18. Curvas dosis-respuesta del DZP (0.25-12.5 mg/kg), ZLP (0.3-100 mg/kg) y los
derivados de imidazo[1,2-a]piridina (0.5-480 mg/kg) sobre la actividad sedante en ratón. ......... 31
Figura 19. Relación dosis-efecto de cuatro derivados de imidazopiridinas (A, B, C, D), diazepam
(E) y zolpidem (F) sobre el número de entradas totales, a brazos abiertos y cerrados del laberinto
elevado en cruz (Ns=5 y 7). *P 0˂.05 versus control vehículo .................................................... 34
Figura 20. Relación dosis-efecto de cuatro derivados de imidazopiridina (A, B, C, D), diazepam
(E) y zolpidem (F) sobre el porcentaje de tiempo en brazos abiertos del laberinto elevado en cruz
(Ns=5 y 7). *P< 0.05 versus control vehículo .............................................................................. 36
Figura 21. Relación dosis-efecto de cuatro derivados de imidazopiridina (A, B, C, D), diazepam
(E) y zolpidem (F) sobre el tiempo acumulativo de enterramiento y latencia de enterramiento de
ratones macho (Ns=6 y7). *P< 0.05 versus control vehículo ........................................................ 38
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Rendimiento y puntos de fusión de los derivados imidazopiridina ................................. 20
Tabla 2. Parámetros de actividad locomotora espontánea en ratas tratadas con derivados de
imidazopiridina. Se presenta la media ± E.E de 1 h de locomocióna ............................................. 29
Tabla 3. Parámetros de actividad locomotora espontánea en ratones tratados con derivados de
imidazopiridina. Se presenta la media ± E.E de 1 h de locomocióna ............................................. 30
Tabla 4. Parámetros obtenidos en el rotarod (en rata) y la cuerda tirante (en ratón) con el
tratamiento de las imidazopiridinas para evaluar efectos miorrelajantes. Se presenta la
media ± E.E del numero de caídas totales en el rotaroda ............................................................... 40
LISTA DE ABREVIATURAS
Subunidad gamma del receptor a GABAA
Subunidad delta del receptor a GABAA
Subunidad épsilon del receptor a GABAA
Subunidad theta del receptor a GABAA
5-HT 5-Hidroxitriptamina (serotonina)
5-HT1A Receptor de serotonina subtipo 1A
5-HT2 Receptor de serotonina subtipo 2
ANDEVA Análisis de varianza de una vía
APA Asociación Psiquiquiátrica Americana
BZ1 Receptor a benzodiacepinas tipo 1
BZ2 Receptor a benzodiacepinas tipo 2
BZDs Benzodiazepinas
Ccf Cromatografia en placa
d Señal doble
DA Dopamina
dd Señal doble de dobles
DE50 Dosis efectiva 50
DMF N,N-dimetil Dimetilformamida
DMS Manual Estadístico y de Diagnostico de los Desordenes Mentales
E.E Error estándar
FDA Food and Drugs Administration
Fig. Figura
GABA Ácido γ-aminobutírico, por sus siglas en inglés
GABAA Receptor al Ácido γ-aminobutírico tipo A
GABAB Receptor al Ácido γ-aminobutírico tipo B
GABAC Receptor al Ácido γ-aminobutírico tipo C
i.p Intraperitoneal
ISRS Inhibidor selectivo de la recaptura de serotonina
L-1 2-(3’-CF3fenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
L-2 2-(4’-clorofenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
L-3 2-(3’,4’-dimetoxifenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
L-4 2-(4’-Metoxifenil)-3-formilimidazo[1,2-a]piridina tiosemicarbazona
LC Locus coeruleus
m Señal múltiple
N.A Noradrenalina
n.s No significativo
Pf. lit Punto de fusión de la literatura
POCl3 Oxicloruro de fósforo
RMN Resonancia Magnético Nuclear
RMN 1H Resonancia Magnético Nuclear de protón
RMN13C Resonancia Magnético Nuclear de carbono
s Señal simple
t Señal triple
TAG Trastorno de ansiedad generalizada
TAS Trastorno de ansiedad social
TMS Tetrametilsilano
TOC Trastorno obsesivo compulsivo
TP Trastorno de pánico
TSPT Trastorno de estrés post-traumático
ZLP Zolpidem
α1 Receptor adrenérgico alfa tipo 1
α2 Receptor adrenérgico alfa tipo 2
β1 Receptor adrenérgico beta tipo 1
β2 Receptor adrenérgico beta tipo 2
1
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANSIOLÍTICA Y/O SEDANTE POTENCIAL DE
DERIVADOS DE IMIDAZO[1,2-a]PIRIDINA
I. INTRODUCCIÓN
Los trastornos de ansiedad y sueño son los padecimientos mentales más comunes y motivos de
consulta más frecuentes en la práctica médica general [Dell’Osso, 2010]. Varían ampliamente en
términos de su naturaleza, gravedad, frecuencia, persistencia y consecuencias. De acuerdo con
el Manual Diagnostico y Estadístico de los Trastornos Mentales (DSM-IV-TR) de la Asociación
Psiquiquiátrica Americana (APA, 2007) dentro de los trastornos de ansiedad se incluye:
trastorno de pánico (TP), trastorno de ansiedad generalizada (TAG), fobia especifica, trastorno
de ansiedad social (TAS) también conocida como fobia social, trastorno de estrés post-
traumático (TSPT) y trastorno obsesivo compulsivo (TOC). Excluyendo las fobias, los trastornos
de ansiedad afectan al 18 % de la población en general, lo cual la hace [Massana, 2000] y
representan condiciones extremadamente prevalentes y representan un substancial impacto
económico y social en las personas afectadas así como en sus familias [Lépine, 2002].
La ansiedad es un fenómeno emocional común en los seres humanos. Es un sistema de aviso-
alarma frente a una amenaza, esto es, constituye una respuesta usualmente adaptativa. Cuando
ésta se torna patológica se presenta con reacciones desproporcionadas y/o injustificadas, que
escapan del control voluntario de la persona, que perturba el diario vivir produciendo gran
sufrimiento en los pacientes [Massana, 2000].
Los trastornos de ansiedad son padecimientos mentales que se caracterizan por síntomas de
ansiedad y conducta de evitamiento. Los trastornos de sueño asociados con trastornos de
ansiedad se caracterizan por un largo inicio del sueño o mantenimiento del insomnio debido a la
ansiedad excesiva y expectación aprensiva acerca de una o más circunstancias de la vida [The
international classification of sleep disorders, 2001].
Los pacientes con trastornos de ansiedad tienen algunas similitudes en los estudios poligráficos
de sueño con aquellos que padecen perturbación del sueño de tipo psicofisiológico. Sin
2
embargo, para los primeros la manifestación de la ansiedad es generalizada mientras que los
pacientes que padecen insomnio psicofisiologico el foco de la ansiedad primariamente se centra
alrededor de la falta de sueño [The international classification of sleep disorders, 2001].
La farmacoterapia de los trastornos de ansiedad así como los trastornos del sueño ha incluido el
uso de benzodiazepinas (BZDs) las cuales se descubrieron desde hace más de 50 años por
Hoffman-La Roche, iniciando con el descubrimiento del clorodiacepóxido (librium). A partir de
este descubrimiento muchos congéneres se han desarrollado, tales como el diazepam, el
clonazepam, el nitrazepam y el alprazolam [Feldman et al., 1997; Meyer, 2002].
N
N
OCH3
Cl
Diazepam
N+
N
O-
NH
Cl
CH3
Clordiazepóxido
N
NH
O
O2N
Nitrazepam
N
NCl
N
N
CH3
Alprazolam
Figura 1. Estructuras químicas de las benzodiazepinas.
Las BZDs actúan como agonistas totales sobre el receptor GABAA (ácido γ-aminobutírico).
Presentan potente actividad ansiolítica, sedante-hipnótica, relajante muscular y anticonvulsión.
Son a menudo utilizadas en la práctica clínica para reducir los síntomas de la ansiedad aguda
pero no son recomendadas para tratamientos a largo plazo en pacientes que no sean aquellos
con los trastornos más graves y deshabilitantes [Argyropoulos and Nutt, 1999; Baldwing et al.,
2005]. Las BZDs resultan ser más efectivas en aliviar los síntomas somáticos de ansiedad, pero
son menos efectivas en reducir los síntomas psicológicos y son a menudo, asociadas con efectos
secundarios tales como ataxia, supresión del sueño MOR (movimientos oculares rápidos),
deterioro cognitivo [Shader y Greenblatt, 1993] y muestran un gran potencial para producir
tolerancia y dependencia, lo cual es más frecuente después del tratamiento a largo plazo y en
dosis altas [Shader and Greenblatt, 1993; Goodman,2004]. Por lo que el tratamiento para los
3
trastornos de ansiedad y sus sintomatologías, requieren de fármacos alternos con mayor
selectividad y menos efectos colaterales [Davidson, 2002; Kent, 2002].
Dentro de los ansiolíticos no relacionados con las BZDs, está la buspirona que actúa como
agonista parcial sobre los receptores 5-HT1A, aunque presenta acción ansiolítica significativa,
resulta ser mucho menos efectiva en reducir los síntomas somáticos de la ansiedad, además
requiere de varias semanas para el comienzo de su efecto [Davidson, 2002].
Algunos antidepresivos tienen efectos benéficos en los trastornos de ansiedad, además de sus
acciones antidepresivas, tal es el caso de la paroxetina un inhibidor selectivo de la recaptura de
serotonina (ISRS) estudiado en el tratamiento del TAG y aprobado por la Food and Drugs
Administration (FDA) para el tratamiento de este padecimiento [Davidson, 2002; Goodman,
2004]. Sin embargo, se ha reportado que algunos pacientes sometidos bajo estos tratamientos
desarrollaron efectos secundarios como disfunción sexual [Baldwin, 2004] y aumento de peso
[Papakostas, 2008].
Las imidazopiridinas tales como zolpidem (ZLP) (sedante-hipnotico) y alpidem (ansiolítico),
representan una clase química de compuestos no relacionados con las BZDs que han mostrado
propiedades farmacológicas más selectivas en comparación con las BZDs. Sin embargo, se ha
reportado la aparición de efectos amnésicos e insomnio de rebote con el uso del zolpidem (ZLP)
y el alpidem resultó hepatotóxico [Berson, 2001; Depoortere et al., 1986]. Lo anterior ha llevado
a que en los últimos años se haya aumentado el interés en encontrar otras opciones
farmacológicas para el tratamiento de los trastornos de ansiedad y sueño.
En el presente trabajo se sintetizaron y sometieron a evaluación farmacológica tres 2-aryl-3-
nitrosoimidazo[1,2-a]piridinas (L-1-3) y 3-formyl imidazo[1,2-a]piridina tiosemicarbazona (L-4).
4
II. FARMACOTERAPIA DE LOS TRASTORNOS DE SUEÑO Y ANSIEDAD
Diversos estudios han demostrado perturbaciones de diferentes sistemas de neurotransmisión
en la patogénesis de los trastornos de ansiedad, en particular en el sistema límbico, incluyendo
la amígdala y otras estructuras. Las investigaciones se han enfocado principalmente sobre la
función del complejo receptor a benzodiacepinas GABAA, los sistemas serotonérgico y
noradrenérgico.
II.1 Función del GABA (ácido γ-aminobutírico) en los trastornos de ansiedad
El GABA es el mediador primario de la neurotransmisión inhibidora en el sistema nervioso
central. Este actúa a través de diferentes tipos de receptores como el receptor metabotrópico
GABAB y los receptores ionotrópicos (GABAA y GABAc) los cuales son canales que activan
corrientes de Cl- que controlan la neurotransmisión inhibidora del GABA [Graham, 2005; Pleury,
2004].
Los receptores GABAA (fig.2) son heteropentámeros simétricos formando un poro central
selectivo a iones Cl-. Están formados por un gran número de subunidades 1-6, 1-3, 1-3, , y .
Se ha demostrado que los receptores GABAA que contienen la subunidad 1, median los efectos
de sedación y relajación muscular (BZ1), incrementando la actividad de las neuronas inhibidoras,
dicha acción permite reducir la espasticidad [Whiting, 2006; Dias, 2005; Griebel, 1999F; White
and Katzung, 2005].
Mientras que aquellos que contienen la subunidad 2 y/o 3 (BZ2) median los efectos
ansiolíticos/anticonvulsivante reduciendo la excitabilidad neuronal y aumentando el umbral
convulsivo. Un tercer tipo lo constituyen los receptores BZ3 o receptores periférico [Dias, 2005;
Papadopoulos, 2006].
Siendo el blanco de acción de varios ligandos naturales o drogas exógenas psicotrópicas, se cree
que el receptor GABAA interviene en la regulación de una serie de mecanismos normales y
5
patológicos del cerebro incluyendo el sueño, la epilepsia y emociones [Izquierdo and Medina,
1991; Majewska, 1992; Griebel, 1999].
Diversos trastornos de ansiedad pueden ser tratados por fármacos moduladores de receptores
GABAA, que aumentan la afinidad del GABA por su receptor específico (GABAA), el cual es el sitio
de acción de numerosos moduladores alostéricos que incluyen barbitúricos, anestésicos, etanol,
BDZs y esteroides de origen neural [Izquierdo and amedina, 1991; Majewska, 1992; Griebel,
1999].
Algunos estudios han mostrado que los receptores GABAA modulan las respuestas de ansiedad
a través de proyecciones hacia áreas límbicas con una disminución resultante en el recambio de
monoaminas, en el locus coeruleus (LC) y núcleos del rafé con supresión del disparo neuronal
por inhibición de la actividad neuronal [Kardos, 1999].
Figura 2. Receptor a benzodiacepinas GABAA (Feldman, 1997)
6
II.2 Función de la serotonina (5-HT) en la ansiedad
Neuronas serotonérgicas localizadas en el núcleo del rafé proyectan a grandes áreas del
cerebro, incluyendo sistema límbico e hipotálamo y están integralmente involucradas en la
mediación de la respuesta al miedo [Ressler and Nemeroff, 2000; Millan, 2003; Gorman et al.,
2002]. Los receptores presinápticos 5-HT1 y receptores postsinápticos 5-HT2 están
principalmente involucrados en la modulación de la ansiedad [Salzman et al., 1993]. Se ha
propuesto que los ISRS podrían actuar reduciendo la transmisión 5-HT central sugiriendo que
puede haber un estado de función serotonérgica incrementada en los trastornos de ansiedad.
Sin embargo, dos son los principales sistemas serotonérgicos que han sido implicados en
ansiedad. Uno originado del núcleo medial del rafé y el otro del núcleo dorsal del rafé. De lo
cual se ha sugerido que cada sistema media diferentes aspectos de la ansiedad y que la
disfunción de uno o ambos sistemas podrían resultar en diferentes formas de trastornos de
ansiedad [Bell and Nutt, 1998; Millan, 2003].
Los ISRS desensibilizan a los autorreceptores terminales de 5-HT (pero no a los 5-HT2) en la
corteza orbitofrontal sólo después de 8 semanas de tratamiento completo, en el tratamiento de
los síntomas del TOC. La desensibilización de autorreceptores produce una mayor liberación de
5-HT para actuar sobre receptores 5-HT2 postsinápticos.
II.3 Función de la noradrenalina en la ansiedad
La noradrenalina (N.A) es un neuromodulador liberado en el órgano blanco visceral durante la
activación del sistema nervioso simpático, que al igual que la adrenalina tienen una
participación significativa en la formación de la memoria emocional, que tal vez contribuye a los
trastornos de ansiedad [Berne and Levy, 2006].
Las neuronas noradrenérgicas del LC dan origen a proyecciones difusas en el prosencéfalo y tal
vez juegan una función crítica en mediar la respuesta al miedo, estrés y excitación [Dell’Oss,
2010]. Los efectos centrales de la N.A son mediados a través de receptores postsinápticos α1 y
β1 y receptores presinápticos α2 los cuales son importantes en mediar la inhibición presináptica
7
de liberación de la N.A (autorreceptores) y la liberación de otros neurotransmisores, cuando
éstos se ubican en las terminales de las neuronas noradrenérgicas. Los fármacos antagonistas
del receptor adrenérgico α2 (yohimbina) incrementan el disparo de cuerpos celulares
noradrenergicos en el LC lo cual induce ansiedad, mientras que los agentes que reducen la
frecuencia de disparo de esas neuronas, tales como los agonistas del receptor α2 (clonidina)
reducen los síntomas de la ansiedad [Dell’Oss, 2010].
III. FÁRMACOS ANSIOLÍTICOS, SEDANTE-HIPNÓTICOS NO BENZODIAZEPÍNICOS
CON ACCIÓN SOBRE EL RECEPTOR GABAA
El abordaje psicofarmacológico de los trastornos de sueño y de ansiedad, cuenta en la
actualidad con numerosos y variados fármacos. Particularmente el zolpidem (1) y el alpidem (2)
(fig. 3) son dos derivados de la imidazopiridina que muestran acción sedante-hipnótica selectiva
en los receptores tipo BZ1 para el primer caso y ansiolítica para el alpidem, el cual tiene también
afinidad por receptores BZ1 [Zivkovic et al; Sanger and Zivkovic, 1994; Depoortere et al., 1986;
Sancar et al., 2006].
El núcleo imidazo[1,2-a]piridina (I) (fig. 3) ha sido considerado como un grupo farmacóforo
importante responsable de una amplia variedad de respuestas farmacológicas, en particular las
3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridinas se han evaluado como antirretrovirales [Chaouni-Benabdallah
et al., 2001], agentes antiparasitarios [Srivastava et al., 1998] y han mostrado actividad
antifúngica [Yu et al., 2008]. Por otro lado, diversos derivados de dicho núcleo, han mostrado
resultados como antipiréticos, analgésicos [Almirante et al., 1965] como ligandos para detectar
placas β-amiloides en cerebro (en relación con la patología del Alzheimer) [Zhuan et al., 2003] y
en tratamientos de los trastornos de ansiedad [Sanger y Zivkovic, 1994]. De lo anterior se deriva
el gran interés por estudiar la influencia que pueden tener diferentes sustituyentes en el núcleo
de la imidazopiridina en relación a su acción sobre el sistema nervioso central.
8
N
N
I
N
N
N
O
CH3
CH3CH3
CH3
1
N
N
N
O
Cl
Cl
CH3CH3
2
N
N
F
F
FOH
N
3
Figura 3. Ejemplos de fármacos que contienen el núcleo imidazopiridina.
Una vez sintetizados los análogos imidazo[1,2-a]piridina, se requirió conocer sus efectos
farmacológicos, por lo que fueron sometidos a diversos modelos de prueba, entre ellos los de
relajación muscular, sedación-hipnosis y ansiedad, así como sus efectos locomotrices.
IV. MODELOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS EN EL ANÁLISIS FARMACOLÓGICO
DE LAS IMIDAZO[1,2-a]PIRIDINAS
Existen numerosos modelos experimentales de comportamiento para la evaluación del
potencial ansiolítico y propiedades ansiogénicas, así como para la evaluación de las propiedades
relajantes musculares y de los efectos sedante-hipnóticos de los fármacos.
IV.1 Modelos para la evaluación del estado de ansiedad
Los modelos que se utilizan para el estudio del estado de ansiedad básicamente se clasifican en
2 tipos, los condicionados y los no condicionados. En los modelos de tipo condicionado se
emplean conductas condicionadas, en las cuales se incluyen procedimientos de castigos, que
consisten en aplicar un estímulo aversivo, generalmente un choque eléctrico leve, aplicado a un
animal entrenado o condicionado para emitir una respuesta determinada. En este tipo de
modelos animales, se somete al animal en estudio al conflicto de dos impulsos antagónicos; por
9
un lado la realización de una conducta que satisfaga una necesidad dominante (beber o comer)
y otro recibir el estimulo aversivo durante la consumación de la conducta. El estímulo adverso
es reconocido así mediante el aprendizaje.
Los modelos de laberintos elevados, como el “plus maze” son ejemplos de modelos ansiolíticos
de tipo no condicionado que están basados en la tendencia natural que tienen los roedores a
evitar espacios abiertos y elevados [Pellow et al., 1985; Pellow and File, 1986]. Sin necesidad de
someter al animal a estímulos aversivos o situaciones de castigo que puedan provocar un
condicionamiento. Este modelo permite diferenciar entre el efecto ansiolítico o ansiogénico de
nuevos fármacos. La prueba consiste en cuantificar el tiempo en que las ratas permanecen en
las zonas abiertas y zonas cerradas del laberinto; así como el número de veces que éstas entran
en cada una de ellas. Por lo tanto, se considerará disminución del estado ansioso (ansiólisis)
cuando más tiempo y mayor número de entradas a zonas abiertas se presente. Por el contrario
aumento del estado ansioso (ansiogénesis) se tendrá si el tiempo de permanencia en zonas
cerradas es mayor [Pellow and File, 1986; Carobrez and Bertoglio, 2005]. Lo anterior se podría
explicar considerando que este modelo remeda un tipo específico de ansiedad, quizá la
agorafobia (miedo a los espacios abiertos) o la acrofobia (miedo a las alturas) [Treit, 1985;
Fernandes and File, 1996].
La prueba de enterramiento defensivo es un ejemplo de modelo ansiolítico condicionado que
permite evaluar efectos ansiolíticos de fármacos sujetos a estudio, basado en la tendencia
natural de los roedores a enterrar estímulos aversivos (Pinel and Treit, 1978). Así, el método es
útil para evaluar cambios farmacológicos y fisiológicos en ansiedad experimental [Treit et
al.,1980; Treit, 1985].
La prueba consiste en cuantificar el tiempo en el que el roedor inicia a enterrar el estímulo
aversivo (latencia de enterramiento), que en este caso se trata de un electrodo. Este parámetro
ha sido inversamente asociado con la reactividad del animal. Por otro lado, también se
cuantifica el tiempo total de enterramiento lo cual ha sido directamente relacionado con niveles
de ansiedad experimental [Treit et al., 1985]. Así la conducta de enterramiento es revertida por
10
fármacos ansiolíticos que aumentan la latencia de enterramiento en algunos casos y disminuyen
el tiempo total de éste.
IV.2 Modelos para la evaluación miorrelajante
El modelo del rodillo giratorio (rota-rod) permite cuantificar el efecto de un fármaco sobre la
relajación muscular en roedores, al evaluar la resistencia al cansancio y la coordinación motora
(sin ningún estímulo aversivo o condicionamiento) cuando éstos son sometidos a un rotor en
movimiento y de cierta altura. Esto es, a un mayor número de caídas del rotor se tendrá una
coordinación motora menor, por lo tanto, un efecto relajante muscular mayor del fármaco
administrado [Dunham y Miya, 1956; Jones and Robert, 1968; Farkas, 2005].
Un fármaco con actividad miorrelajante produce deterioro en la habilidad de los roedores para
agarrarse de una cuerda rígida (modelo de la cuerda tirante) con las extremidades. Por lo que
este tipo de modelos representan una forma fácil y efectiva de evaluar la acción de los fármacos
que pudieran presentar dicha acción [Bonetti, 1982; Trullier, 1997].
IV.3 Evaluación de la actividad locomotora espontánea
La valoración de la actividad locomotora espontánea nos permite verificar mediante actividad
ambulatoria, actividad vertical y tiempo de inmovilidad, si los efectos de los fármacos en estudio
no están influenciados por deficiencias motrices que también pudieran indicar efectos sedantes.
Lo anterior es de gran importancia al utilizar modelos experimentales de ansiedad como los
laberintos, ya que puede presentarse un aumento en el tiempo de permanencia en zonas
abiertas o cerradas por efectos sedantes, lo cual podría ocasionar falsos positivos en la
interpretación de resultados. Por lo que este tipo de evaluación experimental permite
identificar aquellos fármacos que producen sedación o bien fármacos que produzcan
sobreactividad (ansiogénesis).
11
V. ANTECEDENTES
Anzini et al., (1996) realizaron un estudio comparativo de los modelos de interacción de
ligandos a receptores benzodiazepínicos tanto centrales (RBC) como periféricos (RBP).
Determinaron que protección o evitación del nitrógeno como aceptor de puentes de hidrógeno
en alpidem decrece la afinidad por receptores centrales a BZDs. El dipolo carbonilico y las
cadenas laterales lipofilicas de la amida son importantes para la interacción a RBP. (fig.4).
Figura 4. Receptores benzodiazepínicos tanto centrales (RBC) como periféricos (RBP)
Lange et al., (2001) sintetizaron una serie de análogos de ZLP y alpidem para evaluar in vitro la
unión a receptores benzodiazepínicos, junto con cálculos de la distribución del potencial
molecular electroestático, evidenciaron que el grupo carbonilo de la amida y en el átomo de
nitrógeno del anillo de imidazol de ZLP y algunas BDZs, actúan como potenciales aceptores de
protón y por lo tanto, son dos sitios importantes de anclaje al receptor (fig. 5).
12
Figura 5. Distribución del potencial electrostático molecular del zolpidem.
Dias et al., (2005) sintetizaron derivados de imidazo[1,2-a]piridinas como el TP003 (3), el cual
presentó eficacia significativa sólo en receptores que contienen α3 (para los cuales es un
agonista total) (fig. 3).
Con base en estos antecedentes que resaltan la importancia de algunos elementos
farmacofóricos fundamentales de derivados de imidazopiridina en la interacción con los
receptores a BZDs se planteó lo siguiente:
13
VI. JUSTIFICACIÓN
La variabilidad en la selectividad de unión de los ligandos hacia diferentes isoformas de las
subunidades del receptor de BZDs. Así como, la afinidad de éstos a receptores centrales y/o
periféricos son causas de los diversos efectos neurofarmacológicos de las BZDs. Así, las BZDs
clásicas son eficaces en el tratamiento de los trastornos de sueño y ansiedad, sin embargo,
también muestran un gran potencial para producir tolerancia, dependencia, ataxia, supresión
del sueño MOR (movimiento ocular rápido) y amnesia. De aquí deriva la importancia de
investigar nuevas estructuras que pudieran presentar menos efectos adversos.
En el presente trabajo se propone una serie de derivados de imidazo[1,2-a]piridinas
conteniendo un grupo arilo en posición 2, así como diversos sustituyentes en las posiciones 3
y ‘3,’4 del arilo (fig. 6) que conferirán variaciones en los parámetros hidrofílicos, electrónicos y
estéricos, los cuales modificarán el perfil farmacológico.
N
N
R2
R1
1
2
345
6
7
8
9
1'
2' 3'
4'
5'6'
Figura 6. Estructura general de los derivados de imidazopiridina evaluados.
14
VII. HIPÓTESIS
Sí los derivados de la 2-arilimidazo[1,2-a]piridina conteniendo sustituyentes nitrogenados
particularmente en la posición 3 presentan afinidad de unión por el receptor GABAA y producen
efectos neurofarmacológicos similares a BZDs, entonces es muy probable que la introducción de
sustituyentes (grupos funcionales) con efectos electrónicos diversos (electroatractores o
electrodonadores) tanto en el grupo arilo como en otras posiciones del mismo núcleo podrían
presentar algún tipo de respuesta neurofarmacológica.
VIII. OBJETIVO GENERAL:
Sintetizar y evaluar farmacológicamente 4 derivados selectos de 2-arilimidazo[1,2-a]piridina.
IX. OBJETIVOS PARTICULARES:
a) Sintetizar en cantidad mínima de 3 g y pureza mayor de 95%, 3 derivados selectos 2-
arilimidazo[1,2-a]piridin-3-nitrosados, así como el derivado tiozemicarbazona de 2-
arilimidazo[1,2-a]piridin-3-carboxaldehído.
b) Evaluar la respuesta ansiolítica, sedante-hipnótica y miorrelajante.
c) Analizar el efecto de los mismos sobre la actividad motora.
15
X. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES
X.1 Metodologías de síntesis
Para la síntesis de los compuestos sujetos a evaluación se emplearon los siguientes reactivos:
2-Aminopiridina, oxicloruro de fósforo (POCl3), N,N-dimetil formamida (DMF), Tiosemicarbazida
así como los bromuros de fenacilo con diferentes sustituyentes y disolventes deuterados. Todos
ellos fueron adquiridos de la empresa Aldrich Chem. Co. Los disolventes empleados para
extracción o disolución fueron comprados a empresas nacionales y destilados previos a su uso.
El nitrito de sodio, ácido acético glacial, bicarbonato de sodio y el sulfato de sodio anhidro
tambien fueron de procedencia nacional.
Los puntos de fusión fueron determinados en un equipo Electrothermal Modelo 120 ID de
capilar y son reportados sin corrección. Los datos espectroscópicos de RMN de 1H y 13C, se
registraron a 300 y 75 MHz respectivamente empleando un espectrómetro de RMN, marca
Bruker Avance DPX 300. Los desplazamientos químicos () están dados en partes por millón a
campo bajo usando tetrametilsilano (TMS) como referencia interna ( = 0).
La síntesis de los compuestos bajo investigación fue realizada de acuerdo al diagrama mostrado
en la fig. 7. La ruta de síntesis inició con la preparación de los bromuros de fenacilo
correspondientes obtenidos a partir de reacciones de α-halogenación. Una reacción de
condensación de la 2-aminopiridina con el correspondiente bromuro de fenacilo permitió la
síntesis de los heterociclos fusionados (1) de acuerdo con protocolos establecidos en la
literatura [Lombardino, 1965]. El procedimiento de condensación involucró el uso de bicarbonato
de sodio y calentamiento en etanol.
16
O
CH3
Z
Y
BrCuAcOEt
O
Z
YBr+
N NH2
NaHCO3
EtOH
N
N
Ar
Y = 4'-MeO, 3'-CF3
Z = 4'-Cl, 3',4'-MeO
1 Ar = 3'-CF3Ph, 4'-ClPh, 4'-MeOPh, 3',4'-(MeO)
2Ph
Figura 7. Síntesis de derivados de 2-arilimidazo[1,2-a]piridinas
El grupo funcional carboxaldehído fue introducido a través de una reacción Vilsmeier Haack
(fig. 8), usando DMF y POCl3 y calentamiento a 80°C por 12 h, seguido de tratamiento con
hidróxido de sodio en medio acuoso generando la 2-(4’-metoxifenil) imidazo[1,2-a]piridin-3-
carboxaldehido (3) [Fuentes and Paudler, 1975].
La 2-(4’-Metoxifenil)-3-formilimidazo[1,2-a]piridina tiosemicarbazona (L-4) fue preparada a
partir de 3 y tiosemicarbazida en ácido [West et al., 1993].
17
Figura 8. Síntesis de 2-arilimidazo[1,2-a]piridinas-3-nitrosadas, 3- tiosemicarbazona
Posteriormente el tratamiento de la imidazo[1,2-a]piridina (1) con ácido nitroso, condujo a la
obtención de los 2-arilimidazo[1,2-a]piridina-3-nitrosados (2). Del método de síntesis general
derivaron los compuestos 2-(3’-trifluorofenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina (L-1), 2-(4’-
clorofenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina (L-2) y 2-(3’,4’-dimetoxifenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-
a]piridina (L-3), mediante el procedimiento que acontinuación se describe ( fig. 9).
N
N A r
N
N A r
N O
N
N A r
C H O
N
N
N O
C F 3
N
N
N O
C l
N
N
N O
O M e
O M e
N
N
N H N
N H 2 S
O M e
D M F / P O C l 3
a q . N a O H
L - 1
L - 2
L - 3
L - 4
1
H O N O
N H 2 C S N H N H 2
A c O H
2
3 5
6
7
8
2
3
18
N N
R
NaNO2 ac.
AcOH
N N
RON
R = -3CF3, 4-Cl, 3,4-diMeO
Figura 9. Método general para la síntesis de 2-aril-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridinas
En un matraz Erlenmeyer se disolvió la 2-arilimidazo[1,2-a]piridina en ácido acético glacial
(10 mL por cada 2.5 mmol de la 2-arilimidazo[1,2-a]piridina), y a continuación se agregó nitrito
de sodio (NaNO2, 2 equivalentes por cada uno de 2-arilimidazo[1,2-a]piridina) en solución
acuosa (concentración de 1 mmol/mL = 1M) para generar el ácido nitroso [Chaouni-Benabdallah
et al., 2001] . El matraz se colocó en un baño de hielo-agua y se empleó agitación. El progreso
de la reacción fue monitoreado por ccf hasta el consumo total de la materia prima. Pasado este
tiempo se observó la formación de un precipitado verde que fue separado por filtración al vacío;
a las aguas madres se le agregó agua logrando así la formación de más precipitado el cual
también fue recuperado. El precipitado fue lavado con agua hasta que el líquido residual de
lavado tuvo un pH de entre 5-7 unidades. Entonces el sólido fue finalmente secado al aire y
purificado.
Todos los productos fueron purificados e identificados adecuadamente por medio del análisis
de las señales obtenidas en el espectro de resonancia RMN de 1H y 13C a 300 y 75 MHz
respectivamente. Compuestos L-1, L-3 y L-4 no han sido previamente descritos en la literatura
por lo tanto datos de 1H and 13C RMN para estos compuestos se muestran a continuación.
2-(3’-Trifluorometilfenil)-3-nitroso imidazo[1,2-a]piridina (L-1). Fue aislado como un sólido verde
pistache y con punto de fusión 124-125 ºC. 1H RMN (CDCl3) δ H5 9.9 (dd, J5,6 = 8.8, J5,8 = 1.0, 1H),
H5’,6’ 8.9 (m, 2H), H8,2’,4’ 7.9-7.2 (m, 3H), H7 7.7 (t, J = 7.6, 1H), H6 7.0 (td, J5,6 = 8.8, J6,7 = 7.7, J6,8 =
2.4, 1H). 13C NMR δ 117.7, 120.0, 125.9, 126.4, 127.2, 127.3, 127.8, 127.9, 129.3, 132.4, 134.1,
19
136.3, 145.5, 153.3. Anal. Calcd. para C14H8N3F3O: C, 57.73; H, 2.75. Encontrado: C, 57.61; H,
2.90.
2-(4’-Clorofenil)-3-nitroso imidazo[1,2-a]piridina (L-2). Se obtuvo como polvo verde con
rendimiento del 75%, con punto de fusión 223 – 224 ºC, Pf lit. 222-224 [Salgado-Zamora et al.,
2008].
2-(3’,4’-Dimetoxifenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina (L-3). Se obtuvo como solido amarillo
oscuro, con punto fusión 196-198 ºC. 1H RMN (CDCl3) δ H5 9.9 (d, J5,6 = 6.0, 1H), H8 8.4 (d, J8,7 =
8.0, 1H), Ar-H 8.2 (s, 1H), Ar-H 7.8 (s, 2H), Ar-H + H7 7.2 (m, 2H), H6 7.0 (d, J6,7 = 8.0, 1 H), MeO-,
4.0 (s, 3 H), MeO- 3.98 (s, 3 H). 13C NMR 56.0, 56.04, 111.1, 112.8, 117.1, 119.0, 124.3, 125.0,
126.6, 136.2, 146.0, 149.2, 152.5, 153.3, 159.5. Anal. Calcd. para C15H13N3O3: C, 63.60; H, 4.59.
Encontrado: C, 63.74; H, 4.68.
2-(4’-Metoxifenil)-3-formilimidazo[1,2-a]piridina tiosemicarbazona (L-4). Fue preparada a partir
de 3 y tiosemicarbazida en acido [West et al., 1993]. El compuesto fue aislado en forma de
cristales de color café claro y punto de fusión 223-224 ºC. 1H NMR (DMSOd6) δ H5 9.5 (d, J5,6 =
6.7. 1H), NH 8.7 (s, 1H), Ar-H 8.2 (bs, 1H), Ar-H 7.8-7.6 (m, 4H), H7, 7.51 (t, J7,6 = 7.3 1H), Ar-H +
H6, 7.13-7.06 (m, 3 H), MeO- 3.8 (s, 3 H). 13C RMN 55.9, 114.7, 114.9, 117.0, 126.0, 128.2,
130.2, 131.1, 126.4, 146.6, 150.8, 160.3, 177.3. Anal. Calcd. para C16H15N5SO: C, 59.07; H, 4.61.
Encontrado: C, 59.23; H, 4.26.
La Tabla 1 resume los resultados obtenidos en el proceso de síntesis.
20
Tabla 1. Rendimiento y puntos de fusión de los derivados imidazopiridina
Compuesto Punto de fusión (°C) Rendimiento (%)
L-1
124-125 90
L-2
222-224 75
L-3
196-198 80
L-4
223-224 98.5
3 184-185 85
X.2 Evaluación farmacológica de los derivados de imidazo[1,2-a]piridina
Para el análisis farmacológico conductual se emplearon ratas macho [Wistar (180-230 g),
UNAM-Harlan] y ratones macho [ICR (18-23g), UAM-Xochimilco] con libre acceso al alimento y
al agua. Todos los animales fueron sometidos a un ciclo luz-oscuridad de 12x12 h y
seleccionados al azar con n=5-7. Los experimentos se llevaron a cabo entre las 10:00 y 14:30 h.
Se emplearon como testigos, diazepam (Valium Lab. Roche) y zolpidem como tartrato (Lab
Auylacem), los cuales fueron suspendidos en 0.3% de tween 80 (Sigma-Aldrich, USA)/solución
salina.
Una serie de derivados de imidazopiridinas como fármacos sujetos a estudio, que emplearon
como vehículos: Tween 80 al 10% (Merk) para los compuestos L-1, L-2 y L-4 y Polietilenglicol 400
(PEG) al 10% (Merck-Schuchardt) para el L-3. La administración se realizó vía intraperitoneal (i.p)
para cada animal en un volumen de 10 mL/kg en ratón y 1 mL/kg en rata, 30 min previos a cada
N
N
NO
CF3
N
N
NO
Cl
N
N
NO
OMe
OMe
N
N
OMe
N
NH
CH3
S
21
prueba en una sola dosis. Se utilizaron grupos independientes para cada tratamiento y para
cada prueba.
Para la valoración conductual del efecto ansiolítico se utilizó el laberinto elevado en cruz “Plus
Maze”. El rodillo giratorio (equipo rota-rod) para ratas modelo 7750 (Ugo Basile) fue empleado
en la determinación de la actividad relajante muscular. El dispositivo de la cuerda tirante
también fue utilizado para evaluar relajación muscular. Por otro lado, en la evaluación de la
actividad locomotora espontánea se utilizaron dos equipos de análisis de movimiento
(Videomex V. y Opto-varimex).
X.2.1 Evaluación del efecto ansiolítico en el modelo del laberinto elevado en cruz (Plus-Maze)
El dispositivo consiste en un laberinto elevado que consta de 2 zonas o brazos abiertos y dos
zonas cerradas que se contraponen en forma de cruz, con dimensiones de 50 X 10 X 40 cm. En la
zona de intersección de los cuatro brazos, se forma un cuadro central cuyas dimensiones son de
10 X 10 cm, este cuadro es abierto y se considera como zona abierta (fig. 10). El laberinto
elevado en cruz se encuentra sostenido por una plataforma que lo mantiene a 50 cm del piso
[Pellow et al., 1985].
El experimento se realiza en un cuarto aislado provisto con una cámara de filmación y luz roja.
Antes de iniciar los experimentos, se limpia cada una de las zonas del “Plus-Maze” con una
solución de jabón y agua, se seca perfectamente. Este procedimiento se repite entre cada
animal sujeto a experimentación con la finalidad de eliminar rastros que pudieran indicar
“peligro” a los siguientes animales.
30 min postadministración cada rata se coloca inmediatamente después en el centro del
laberinto, con la cabeza dirigida hacia uno de los brazos abiertos registrando el comportamiento
durante 5 min mediante la filmación. Los parámetros que se registran son: número de entradas
a zonas abiertas y cerradas, así como el tiempo de permanencia en cada zona. De igual forma el
número total de levantamientos.
22
Todos los experimentos se realizan siguiendo el mismo procedimiento y bajo las mismas
condiciones. El estudio estadístico fue realizado.
Figura 10. Modelo ansiolítico del laberinto elevado en cruz (Plus-Maze)
X.2.2 Evaluación del efecto ansiolítico en el modelo de conducta defensiva de enterramiento
El estudio se realizó en un cuarto aislado, acondicionado con luz roja y provista de una cámara
de filmación. El modelo consiste en una caja de acrílico que mide 27x16x23 cm3, cuyo piso está
cubierto con aserrín fino (fig. 11). La caja contiene en la parte media un electrodo por el que
circula una corriente constante de 0.3 mA.
En esta prueba, las ratas cubren con aserrín el electrodo que representa una fuente de
estimulación aversiva, ya que cuando lo tocan reciben una descarga eléctrica.
El comportamiento es registrado durante 10 min mediante filmación. Así, se cuantifica la
latencia de enterramiento una vez que el animal recibe el primer choque (ansiedad reactiva) y el
tiempo acumulativo que el animal pasa enterrando el electrodo durante los 10 min que dura la
prueba (tiempo de enterramiento (lo cual determina los niveles de ansiedad experimental)
[Treit et al., 1985].
23
Figura 11. Modelo de la conducta defensiva de enterramiento
X.2.3 Evaluación del efecto relajante muscular en el rodillo giratorio (Rota-rod)
El rodillo giratorio (equipo rota-rod) para ratas modelo acelerante 7750 (Ugo Basile) consiste
básicamente de cuatro tambores de 7 cm de diámetro. Cinco discos dividen los tambores, lo
cual permite evaluar por separado 4 ratas simultáneamente (fig. 12). El equipo está provisto de
cuatro tableros de cristal líquido que son puestos en marcha por un reloj interno. Cada tablero
está conectado a una placa (sensor de caída) que está debajo de cada uno de los tambores.
Cuando una rata cae de su sección cilíndrica a la lámina de abajo, la operación se interrumpe y
el tablero correspondiente es desconectado, grabando el tiempo de resistencia del animal en
segundos.
Para este modelo se seleccionó de forma aleatoria ratas macho, las cuales se pesaron y
marcaron. Se administró DZP a dosis de 3.5 mg/kg (control positivo). Dado que la evaluación de
la relajación muscular requiere de previo entrenamiento, una hora antes de la administración se
colocó a cada rata en el Rota-rod 5 min a 10 rpm. [Depoortere et al., 1986] Treinta minutos
post-administración las mismas ratas fueron evaluadas en el rotor a 15 rpm durante 10 min
registrando micción, piloerección, bolos fecales, número de caídas, así como el tiempo de
permanencia en el rotor.
24
Figura 12. Equipo Rodillo giratorio (Rota-rod) para ratas modelo acelerante 7750 (Ugo Basile)
X.2.4 Evaluación del efecto de relajación muscular en el modelo de la cuerda tirante
El modelo de la cuerda tirante emplea un dispositivo que consiste de una cuerda rígida
(alambre) de 15 cm de longitud, sostenida por dos columnas de madera a una altura de 22 cm,
las cuales están sujetas a una base de madera cuyas dimensiones son 23x10x10 cm (fig. 13).
Este modelo permite determinar el efecto potencial relajante de nuevos fármacos.
El experimento consiste en colocar a cada ratón por separado, sobre la cuerda tirante durante
1 min minuto como entrenamiento previo y permitir a este que en un inicio sólo se sostenga de
las extremidades anteriores. 30 min post-administración se repite el mismo procedimiento y se
registra con la ayuda de un cronómetro, el tiempo de latencia de la primera caída y el número
de caídas totales durante 1 min. Aquellos ratones que registren latencias de caída menores a 10
sec serán considerados como positivos para relajación muscular. Finalmente se calcula el
porcentaje de ratones por grupo que presentaron el efecto.
25
Figura 13. Modelo de relajación muscular de la cuerda tirante
X.2.5 Evaluación del efecto sedante-hipnótico en ratón
Cada animal fue colocado en una caja de acrílico de forma individual. Posteriormente
administrados por vía i.p. Para la evaluación de los efectos de sedación de los compuestos se
registró el tiempo en el cual el ratón comienza a presentar incoordinación motora, disminución
de la actividad ambulatoria, periodos de tiempo con largas pausas en la ambulación y en un
momento dado parcialmente cierran sus ojos [Crawley, 1981] (fig. 14).
Figura 14. Ratón en estado de sedación
Los efectos hipnóticos fueron evaluados registrando inicio (latencia de hipnosis) y duración de la
pérdida de reflejo de enderezamiento en el piso, lo cual se define como la inhabilidad para
enderezarse tres veces en un minuto después de colocarse en la posición supina (Kralic et al.,
2002) (fig. 15). Las curvas dosis respuesta cuantales para sedación fueron obtenidas.
26
Figura 15. Ratón en estado de hipnosis
X.2.6 Evaluación de la actividad locomotora espontánea en rata y ratón
EL modelo consiste de un campo abierto (60x60x30 cm) negro. En la parte superior de este
campo se encuentra una cámara de video que graba la trayectoria de la rata (fig. 16). La cámara
está conectada a un equipo de análisis de movimiento (Videomex V. Columbus Instruments,
Columbus U.S.A.) el cual se encarga de registrar distancia total recorrida, tiempo total de
ambulación, tiempo de estereotipias (movimientos no ambulatorios) y tiempo total de reposo.
Esta prueba se realizó introduciendo a cada rata en el campo abierto, 30 min. Post-
administración y 2 repeticiones de 3 min por cada animal fueron realizados. Esta prueba se llevó
a cabo inmediatamente después de la evaluación en el laberinto elevado en cruz.
Figura 16. Equipo de análisis de movimiento (VIDEOMEX) para la evaluación de la actividad locomotora
27
Para la evaluación de la actividad locomotora en ratones se utilizó un mostrador automático de
la actividad (Opto-Varimex, Columbus, Ohio, U.S.A). Este sensor consiste en una jaula de acrílico
que mide 51.1x9.5x69.2 cm con dos series de 15 rayos infrarrojos que están colocados en forma
perpendicular uno al otro. Los rayos están espaciados 2.5 cm de tal manera que la interrupción
de cada rayo produce un impulso eléctrico que se procesa y es presentado como un evento o
una cuenta (fig. 17). Esta prueba se llevó a cabo inmediatamente después de la evaluación en la
conducta defensiva de enterramiento y del efecto de sedante.
Figura 17. Equipo de análisis de movimiento (OPTO-VARIMEX) para la evaluación de la actividad locomotora
28
XI. RESULTADOS FARMACOLÓGICOS
XI.1 Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de las variables cuantitativas, se realizó análisis de varianza de una vía
(ANDEVA) y donde se encontró que existía diferencia significativa con p<0.05, se efectuaron
pruebas post-hoc (en este caso se utilizó la prueba de Student-Newman-Keuls) para
comparación entre medias. Para el análisis de las variables nominales se uso por la prueba
exacta de Fisher. Los análisis fueron realizados utilizando los programas estadísticos Sigma Stat
versión 3.5 y Sigma Plot 10 para windows.
XI.2 Actividad locomotora espontánea
Los efectos de cada uno de los cuatro derivados de la imidazopiridina sobre la actividad
locomotora espontánea en rata, fueron evaluados a diferentes dosis 30 min
postadministración. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2. Diferencia estadística
significativa se obtuvo sobre la actividad locomotora entre los grupos evaluados y el control
vehículo. Las dosis de 4 y 8 mg/kg disminuyeron la distancia total recorrida así como el tiempo
total de ambulación para los derivados L-1 [F(5,26)=28.46; P<0.001], [F(5,26)=11.80; P<0.001],
L-2 [F(4,26)=69.653; P<0.001], [F(4,22)=18.794; P<0.001], y L-3 [F(5,30)=15.644; P<0.001],
[F(5,30)=11.711; P<0.001 ] respectivamente. El derivado L-4 indujo la disminución de las
variables descritas a 8 mg/kg [F(4,22)=19.519; P<0.001] y [F(4,22)=4.868; P<0.006].
El DZP produjo la disminución de la distancia total [F(4,22)=14.151, P<0.001] como del tiempo
de ambulación [F(4,22)=3.711; P=0.019] a la dosis de 3.5 mg/kg.
29
El ANDEVA determinó que los cuatro derivados de imidazopiridina tuvieron efectos
significativos sobre la actividad locomotora espontánea en ratón, en la actividad ambulatoria
como en la vertical (Tabla 3). Para las variables mencionadas, se produjo la disminución
significativa a las dosis que a continuación se enlistan:
L-1 de 120-480 mg/kg [F(11,62)=7.841; P<0.001] y de 4-480 mg/kg [F(11,62)=10.912; P<0.001].
L-2 de 30-480 mg/kg [F(11,61)=9.577; P<0.001] y de 120-480 mg/kg [F(11,62)=9.391; P<0.001].
L-3 de 120-480 mg/kg [F(11,61)=13; P<0.001] y de 120-480 mg/kg [F(11,61)=6; P<0.001].
Tabla 2. Parámetros de actividad locomotora espontánea en ratas tratadas con derivados de imidazopiridina. Se presenta la media ± E.E de 1 h de locomocióna
Compuesto Dosis (mg/kg, ip)
Actividad Locomotora
Distancia total (cm) Tiempo de ambulación (sec)
Vehículo 0 662.5 ± 50.5 31.0 ± 2.3
Diazepam 0.5 609.8 ± 26.1 31.2 ± 2.3 1 591.9 ± 31.4 30.0 ± 4.0 2 581.2 ± 14.9 30.0 ± 3.1 3.5 354.4 ± 16.0* 18.8 ± 1.7***
L-1 0.5 544.8 ± 21.5 32.6 ± 1.5 1 630.0 ± 30.2 25.6 ± 3.7 2 573.7 ± 22.6 27.4 ± 4.5 4 350.3 ± 28.7* 14.3 ± 2.3* 8 226.2 ± 19.5* 9.5 ± 0.3*
L-2 1 651.7 ± 31.9 28.1 ± 2.2 2 609.3 ± 12.3 27.7 ± 2.9 4 232.2 ± 27.2* 10.8 ± 1.2* 8 68.7 ± 36.7* 9.6 ± 3.3*
L-3 0.5 683.5 ± 37.8 28.8 ± 2.6 1 628.6 ± 25.6 31.7 ± 2.0 2 608.0 ± 21.9 31.5 ± 2.8 4 391.6 ± 60.5* 16.0 ± 1.8* 8 331.0 ± 17.9* 15.2 ± 0.5*
L-4 1 595.2 ± 13.2 35.0 ± 2.7 2 580.2 ± 28.3 29.0 ± 3.8 4 567.6 ± 3.9 29.0 ± 2.8 8 328.8 ± 18.6* 18.8 ± 1.6**
aEfecto de los derivados de imidazopiridina sobre la actividad locomotora espontánea. Ns=5 y 7,
*p<0.001,**p<0.006,***p<0.01 versus control vehículo correspondiente.
N
N
NO
CF3
N
N
NO
Cl
N
N
NO
OMe
OMe
N
N
OMe
N
NH
CH3
S
30
Finalmente L-4 disminuyó la actividad ambulatoria sobre un intervalo de dosis de 60-480 mg/kg
[F(11,61)=14.161; P<0.001] y la actividad vertical en un intervalo de 30-480 mg/kg
[F(11,61)=11.885; P<0.001].
Tabla 3. Parámetros de actividad locomotora espontánea en ratones tratados con derivados de imidazopiridina. Se presenta la media ± E.E de 1 h de locomocióna
Dosis (mg/kg)
Grupos DE50
Actividad Locomotora
Grupos DE50
Actividad Locomotora
Actividad Ambulatoria (no. cuentas)
Actividad Vertical
(no. cuentas)
Actividad Ambulatoria (no. cuentas)
Actividad Vertical
(no. cuentas)
0 Vehículo 1,078.9 ± 38.1 105.1 ± 9.9
0.5 L-1 7.43 1,202.8 ± 64.8 105.1 ± 9.9 L-3 30.88 1,254.8 ± 215.9 87.0 ± 22.9
1 (5.7 -9.6) 1,195.5 ± 70.6 97.5 ± 5.8 (27.8 - 34.4) 1,449.7 ± 240.1 126.3 ± 28.8
2 1,050.3 ± 32.4 91.5 ± 9.3 1,080.3 ± 40.3 114.5 ± 7.6
4 797.3 ± 198.8 85.0 ± 15.2* 1,063.2 ± 94.2 105.6 ± 19.5
8 761.0 ± 211.4 41.8 ± 7.2* 1,024.4 ± 93.9 102.2 ± 26.4
15 684.1 ± 140.3 32.9 ± 6.9* 912.0 ± 146.8 64.4 ± 14.9
30 626.6 ± 113.6 32.3 ± 9.0* 818.5 ± 58.8 76.5 ± 23.7
60 595.3 ± 176.8 31.6 ± 6.1* 777.5 ± 114.0 70.0 ± 22.5
120 466.8 ± 204.4* 21.1 ± 7.9* 467.0 ± 32.9* 7.0 ± 3.5*
240 153.0 ± 59.5* 18.0 ± 4.6* 67.5 ± 4.3* 5.5 ± 0.3*
480 98.1 ± 33.9* 11.1 ± 5.4* 183.5 ± 19.3* 0.0 ± 0.0*
0.5 L-2 19.07 1,080.3 ± 40.3 114.5 ± 7.6 L-4 17.70 1,059.0 ± 171.2 87.8 ± 14.4
1 (15.9-22.8) 1,063.2 ± 94.2 105.6 ± 19.5 (11.4 - 27.6) 1,066.2 ± 34.2 119.0 ± 7.4
2 924.0 ± 57.2 87.5 ± 6.6 1,063.2 ± 94.2 105.6 ± 19.5
4 910.2 ± 104.9 63.0 ± 12.7 1,070.3 ± 135.9 85.1 ± 11.9
8 817.4 ± 58.7 52.4 ± 8.4 926.6 ± 77.7 85.2 ± 14.7
15 759.3 ± 145.7 85.2 ± 17.4 849.3 ± 78.6 78.0 ± 7.4
30 692.8 ± 119.2* 62.5 ± 9.2 829.3 ± 45.4 58.9 ± 8.0*
60 712.7 ± 186.6* 60.2 ± 12.4 542.0 ± 53.1* 27.0 ± 4.0*
120 666.0 ± 145.5* 37.5 ± 13.1* 409.5 ± 23.4* 24.0 ± 3.5*
240 203.2 ± 52.9* 16.9 ± 4.5* 465.8 ± 114.7* 29.3 ± 4.0*
480 140.0 ± 10.0* 7.7 ± 0.3* 122.0 ± 23.7* 12.0 ± 0.0*
0 Diazepam 0.95 Zolpidem 3.0
(0.8-1.1) (1.5-6.1)
a Efectos de los derivados de imidazopiridina sobre la actividad locomotora espontánea. Ns=6 y 7, *p<0.001 versus
control vehículo correspondiente.
31
XI.3 Resultados de actividad sedante
La fig. 17 muestra la gráfica de las curvas dosis-respuesta cuantales para los efectos de sedación
de las imidazo[1,2-a]piridinas, así como para los compuestos ZLP y DZP utilizados como testigos.
Figura 18. Curvas dosis-respuesta del DZP (0.25-12.5 mg/kg), ZLP (0.3-100 mg/kg) y los derivados de imidazo[1,2-a]piridina (0.5-480 mg/kg) sobre la actividad sedante en ratón.
En la fig. 18 se observa que tanto DZP como ZLP requieren de dosis más bajas para alcanzar la
respuesta media en comparación con los compuestos analizados. Las DE50 calculadas para DZP
fueron de 0.95 mg/kg y de 3 mg/kg para el ZLP (Tabla 3). Por otro lado de las cuatro
imidazo[1,2-a]piridina el compuesto L-1 resultó ser el más potente con DE50 de 7.43. Mientras
que los compuestos L-2 y L-4 presentaron potencias cercanas con valores de DE50 19.07 y 17.70
mg/kg respectivamente. Finalmente el derivado L-3 resultó ser el menos efectivo en términos
de sedación, ya que su DE50 fue de 30.88 mg/kg. Los resultados mostrados permiten concluir
que los compuestos evaluados poseen actividad sedante.
log10
[Dosis]
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
U P
rob
its
2
3
4
5
6
7
Zolpidem
Diazepam
L-1
L-2
L-3
L-4
32
XI.4 Modelo de ansiedad en el laberinto elevado en cruz (Plus-Maze)
Los resultados de la evaluación de cuatro derivados de imidazopiridina a diferentes dosis, en el
laberinto elevado en cruz “plus maze” se muestran en la fig. 19.
El tratamiento con L-1 mostró un claro incremento significativo en las entradas totales, entradas
a brazos abiertos y brazos cerrados [fig. 19A, ANDEVA F(5,26)=2.804, P<0.037; F(5,26)=3,
P<0.029, F(5,26)=2.833; P<0.036 respectivamente]. El análisis Pos-hoc reveló que tales efectos
fueron atribuidos a las dosis de 4 y 8 mg/kg.
En la fig. 19B se muestra que el tratamiento con L-2 disminuyó significativamente el número de
entradas totales y el número de entradas a brazos cerrados [ANDEVA F(4,22)=10.236; P<0.001;
F(4,22)=12.444, P<0.001 respectivamente] a las dosis de 4 y 8 mg/kg. Mientras que provocó un
incremento significativo en el número de entradas a brazos abiertos [F(4,22)=5.062; P<0.005]
solo a 1 mg/kg sin modificar las entradas totales.
Como se muestra en la fig. 19C, el derivado L-3 indujo efectos significativos sobre el número de
entradas totales, entradas a brazos abiertos y cerrados [ANDEVA F(5,30)=4.998, P<0.002;
F(5,30)=7.398, P<0.002; F(5,30)=6.66; P<0.001, respectivamente]. El análisis post- hoc indicó que
el compuesto L-3 disminuye las entradas totales a dosis de 4 y 8 mg/kg y las entradas a zonas
cerradas en un intervalo de dosis de 1-8 mg/kg; así como también indujo un incremento
significativo en el número total de entradas a zonas abiertas sólo a la dosis de 1 mg/kg.
En la fig. 19D se muestra que el tratamiento con L-4 predijo la disminución estadísticamente
significativa en las entradas totales así como en el número de entradas a los brazos cerrados
[ANDEVA [F(4,22)=5.584, P<0.003; F(4,22)=11.448, P<0.001] a 8 mg/kg. No se encontraron
efectos significativos con el tratamiento de L-4, en relación con el número de entradas a los
brazos abiertos [F(4,22)=2.429; n.s.].
El DZP indujo efectos significativos sobre las entradas totales, las entradas a los brazos abiertos
y a los brazos cerrados [ANDEVA F(4,22)=8.217, P<0.001; F(4,22)=20.516, P<0.001,
F(4,22)=14.668, P<0.001] como se indica en la fig. 19E. El análisis post- hoc por Newman-Keuls
33
reveló que el diazepam aumenta las entradas a brazos abiertos y disminuye las entradas a los
brazos cerrados del laberinto a las dosis de 1 y 2 mg/kg sin modificar el número de entradas
totales. Por otro lado una reducción en las entradas totales y entradas a brazos cerrados se
observó a 3.5 mg/kg.
EL ZLP disminuyó significativamente las entradas a brazos cerrados [fig.19F ANDEVA
F(3,18)=8.55, P<0.001] a las dosis de 0.75 mg/kg y 1 mg/kg. Más aun, el ZLP redujo el número de
las entradas totales [F(3,18)=5.806, P<0.006] y entradas a zonas abiertas [F(3,18)=4.467;
P<0.016] a una dosis de 1 mg/kg.
34
Figura 19. Relación dosis-efecto de cuatro derivados de imidazopiridinas (A, B, C, D), diazepam (E) y zolpidem (F) sobre el número de entradas totales, a brazos abiertos y cerrados del laberinto elevado en cruz (Ns=5 y 7). *P 0˂.05 versus control vehículo
La figura. 20 muestra los efectos de los cuatro derivados de imidazopiridina a diferentes dosis
sobre el porcentaje de tiempo en zonas abiertas en el laberinto elevado en cruz.
No se encontraron diferencias significativas con el tratamiento de L-1 [fig. 20A, ANDEVA
F(5,26)=1.867, n.s] entre los diferentes grupos y el control vehículo sobre un intervalo de dosis
de 1-8 mg/kg.
L-1 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8
Nú
mero
de
entr
adas
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
L-2 (mg/kg)
0 1 2 4 8
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Totales
Abiertas
Cerradas
L-3 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
L-4 (mg/kg)
0 1 2 4 8
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Nú
mero
de
en
trad
as
Diazepam (mg/kg)
0 0.5 1 2 3.5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Zolpidem (mg/kg)
0 0.5 0.75 1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
**
**
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
A B C
D E F
35
En la fig. 20B se muestran los resultados obtenidos con el compuesto L-2. El ANDEVA reveló un
aumento significativo [F(4,26)=19.042; P<0.001] en el porcentaje de tiempo que los animales en
estudio pasan en las zonas abiertas a las dosis de 1 y 2 mg/kg.
En la fig. 20C se muestra que el tratamiento con L-3 también incrementó significativamente el
porcentaje de tiempo en los brazos abiertos [ANDEVA F(5,28)=15.767, P<0.001] a las dosis de
1 y 2 mg/kg. El derivado L-4 no indujoresultados significativos [F(4,22)=2.052; P<0.122] a
ninguna de las dosis evaluadas (fig. 20D).
La fig. 20F muestra que el DZP indujo aumento selectivo y significativo en el porcentaje de
tiempo en los brazos abiertos [fig. 19E, ANDEVA F(4,23)=34.33; P<0.001] a las dosis de
1 y 2 mg/kg. Adicionalmente, no se encontraron diferencias estadísticas con ZLP [ANDEVA
F(3,18)=2.788; P=0.07] a las dosis evaluadas.
36
Figura 20. Relación dosis-efecto de cuatro derivados de imidazopiridina (A, B, C, D), diazepam (E) y zolpidem (F) sobre el porcentaje de tiempo en brazos abiertos del laberinto elevado en cruz (Ns=5 y 7). *P< 0.05 versus control vehículo
XI.5 Modelo de ansiedad de la conducta defensiva de enterramiento
La latencia de enterramiento y la conducta de enterramiento acumulativo de cuatro
imidazopiridinas a varias dosis (A, B, C, D), DZP (E) y ZLP (F) sobre ratones macho se muestra en
la fig. 21.
En la fig. 20A, se observa que la conducta defensiva de enterramiento fue significativamente
suprimida [F(6,36)=7.347, P<0.001] por el compuesto L-1 en unintervalo de dosis de 2-15 mg/kg.
L-1 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8
Porc
enta
je d
e tie
mpo e
n z
onas a
bie
rtas
0
10
20
30
40
50
60
70
L-2 (mg/kg)
0 1 2 4 8
0
10
20
30
40
50
60
70
L-3 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8
0
10
20
30
40
50
60
70
L-4 (mg/kg)
0 1 2 4 8
Po
rce
nta
je d
e t
iem
po
en
zo
na
s a
bie
rta
s
0
10
20
30
40
50
60
70
Diazepam (mg/kg)
0 0.5 1 2 3.5
0
10
20
30
40
50
60
70
Zolpidem (mg/kg)
0 0.5 0.75 1
0
10
20
30
40
50
60
70
* *
*
*
*
*
A B C
D E F
37
Por otro lado, se obtuvo un aumento significativo en la latencia de enterramiento
[F(6,36)=4.443, P<0.002] a la dosis más alta de 15 mg/kg, lo cual podría deberse a alteraciones
motoras. El tratamiento con L-2 también indujo la disminución significativa en la conducta de
enterramiento acumulativo [fig. 21B, ANDEVA F(6,37)=5.893; P<0.001] a las dosis de
8 y 15 mg/kg y aumentó la latencia de enterramiento [F(6,37)=3.771; P<0.005] soló a la dosis de
15 mg/kg.
De acuerdo con la fig. 21C, el derivado L-3 indujo una disminución significativa en la conducta de
enterramiento acumulativo [F(6,36)=6.307, P<0.001] a un intervalo de 4-15 mg/kg. Más aun, no
se observaron cambios significativos en la latencia de enterramiento [F(6,36)=2.237; n.s.]. Un
comportamiento similar se presentó con el compuesto L-4, ya que no modificó la latencia de
enterramiento a ninguna de las dosis evaluadas [fig. 21D, ANDEVA [F(6,37)=1.762, n.s.],
mientras que se registró la disminución significativa de la conducta de enterramiento
acumulativo [F(6,37)=3.648, P 0˂.006] a 15 mg/kg.
El análisis post-hoc (Student-Newman-Keuls) mostró que el DZP (fig. 21E) indujo una esperada
disminución estadísticamente significativa [F(6,38)=12.024; P<0.001] en la conducta de
enterramiento acumulativo a dosis de 0.75-1.5 mg/kg, al tiempo que aumentó la latencia de
enterramiento [F(6,38)=8.424; P<0.0.001] a 1.5 mg/kg.
En la fig. 21F. se muestra que, el testigo ZLP disminuyó significativamente la conducta de
enterramiento acumulativo de [F(4,26)=19.69; P<0.001] a las dosis de 3 y 10 mg/kg, mientras
que la latencia de enterramiento aumentó a las mismas dosis [F(4,26)=41.351; P<0.001].
38
Figura 21. Relación dosis-efecto de cuatro derivados de imidazopiridina (A, B, C, D), diazepam (E) y zolpidem (F) sobre el tiempo acumulativo de enterramiento y latencia de enterramiento de ratones macho (Ns=6 y7). *P< 0.05 versus control vehículo
XI.6 Modelos de evaluación de la coordinación motora (rotarod y cuerda tirante)
Se determinaron los efectos de cada una de los cuatro derivados de imidazopiridines evaluados
en ratas sobre el número total de caídas del rotarod (2-64 mg/kg) y el porcentaje de ratones con
deterioro en el reflejo de agarre, en el modelo de la cuerda tirante (4-60 mg/kg). De acuerdo
con los resultados obtenidos, efectos estadísticamente significativos fueron observados sobre el
L-3 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8 15
0
100
200
300
400
500
600
L-2 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8 15
0
100
200
300
400
500
600
L-4 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8 15
0
100
200
300
400
500
600
Diazepam (mg/kg)
0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5
0
100
200
300
400
500
600
Latencia de conducta de enterramiento
Conducta de enterramiento acumulativo
Tie
mp
o (
se
gu
nd
os)
Zolpidem (mg/kg)
0 0.3 1 3 10
0
100
200
300
400
500
600
L-1 (mg/kg)
0 0.5 1 2 4 8 15
Tie
mp
o (
se
gu
nd
os)
0
100
200
300
400
500
600
*
*
*
** * *
*
*
*
**
*
* * **
*
*
* *
A B C
D E F
39
número total de caídas con el tratamiento de L-1 [F(6,35)=2.929; P<0.02] and L-2
[F(6,35)=6.436; P<0.001] soló a las dosis más altas (mayores a 64 mg/kg), probablemente
debido a efectos motores. Las midazopiridinas evaluadas no presentaron efectos significativos
sobre el reflejo de agarre en el modelo de la cuerda tirante a ninguna de las dosis evaluadas.
Por otro lado, el DZP produjo deterioro en la ejecución sobre el rotarod a 2.75 mg/kg, mientras
que a 1.5 mg/kg produjo deterioro en el reflejo de agarre del 71 % de los ratones. Los resultados
se muestran en la tabla 4.
40
Tabla 4. Parámetros obtenidos en el rotarod (en rata) y la cuerda tirante (en ratón) con el tratamiento de las imidazopiridinas para evaluar efectos miorrelajantes. Se presenta la media ± E.E del numero de caídas totales en el rotaroda
Rotarod “Cuerda tirante”
Compuestos Dosis
(mg/Kg) Caídas totales
(5 min) Dosis
(mg/Kg) Caídas totales
(1min) Ratones con deterioro
en reflejo de agarre (%)
Tween 80 (10%) 0 1.8 ± 0.3 0 0.33 ± 0.21 0
Diazepam 2.75 5.43 ± 0.61* 1.5 6.0 ± 0.4* 71*
L-1 2 2.0 ± 0.6
4 1.3 ± 0.4 4 0.5 ± 0.3 0
8 1.3 ± 0.2 8 0.3 ± 0.3 0
16 2.3 ± 0.6 15 2.2 ± 1.4 33
32 2.6 ± 0.5 30 1.6 ± 0.5 33
64 4.0 ± 0.9** 60 2.6 ± 0.9 33
L-2 2 1.2 ± 0.4
4 2.0 ± 0.3 4 0.7 ± 0.4 0
8 2.0 ± 0.4 8 1.7 ± 0.4 17
16 1.7 ± 0.4 15 1.3 ± 0.7 17
32 2.0 ± 0.4 30 1.6 ± 0.6 17
64 2.2 ± 0.7 60 1.9 ± 0.6 50
L-3 2 2.7 ± 0.5
4 2.0 ± 0.6 4 0.8 ± 0.4 0
8 2.3 ± 0.6 8 1.0 ± 0.4 0
16 2.0 ± 0.6 15 2.1 ± 0.7 50
32 2.3 ± 0.5 30 2.3 ± 0.6 50
64 3.0 ± 0.6 60 2.2 ± 0.6 50
L-4 2 1.3 ± 0.3
4 1.5 ± 0.4 4 0.3 ± 0.2 0
8 1.5 ± 0.4 8 0.8 ± 0.4 0
16 2.6 ± 0.5 15 0.3 ± 0.2 0
32 3.2 ± 0.6 30 0.4 ± 0.4 0
64 4.2 ± 0.3* 60 1.8 ± 0.6 20 aEfectos de los derivados de imidazopiridina sobre la actividad miorelajante en rata (N=6 y 7) y ratón (Ns=6 y 7), *p<0.001, **p<0.02 versus control vehículo.
N
N
NO
CF3
N
N
NO
Cl
N
N
NO
OMe
OMe
N
N
OMe
N
NH
CH3
S
41
XII. RESULTADOS Y DISCUSIONES
En la Tabla 1 se muestran los rendimientos obtenidos en el proceso de nitrosación llevado a
cabo sobre el heterociclo imidazo[1,2-a]piridina 2 para obtener los productos, objeto de la
presente investigación. La nitrosación es una reacción de substitución electrofílica aromática y
llama la atención que a pesar de que el electrófilo es débil, la sustitución ocurre con relativa
facilidad sobre la posición 3, la mas reactiva del heterociclo. Es interesante observar también
que a pesar de que uno de los sustituyentes aeilo contiene dos grupos metoxilo, fuertemente
donadores, el reactivo electrofílico (ión nitrosonio) haya preferido al anillo de imidazol.
La identificación de los productos se realizó por medio de espectroscopía de RMN de 1H y de
13C. El hidrógeno 6 de la imidazopiridina se desplazó a campo relativamente alto ( 7.06-7.13)
por ser el protón mas electrónicamente protegido. El hidrógeno 7 se identificó debido a su
multiplicidad y al desplazamiento químico, el cual ocurrió en el intervalo 7.5-7.7 ppm. El
hidrógeno 8 se desplazó a campo bajo en la región 7.9-8.4 ppm y su mulriplicidad en forma de
una señal doble o doble de dobles confirmaron su asignación. Finalmente a campo bajo se
encontró la señal atribuida al protón 5. El desplazamiento del H-5 a campo tan bajo puede
explicarse por el efecto que sobre el mismo ejerce el sustituyente pi-electro-atractor colocado
en la posición 3 de la imidazopiridina y con el cual parece interaccionar a través de la formación
de un puente de hidrógeno intramolecular. Una situación similar se observa pàra el caso de la
tiosemicarbazona, en la cual el H 5 apareció a 9.5.
Una vez sintetizadas e identificads las imidazo[1,2-a]piridinas 3-nitrosadas L-1-L-3 así como la
tiosemicarbazona L-4 se procedió a evaluarlas en relación a una respuesta conductual similar a
zolpidem y benzodiazepinas (Diazepam) lo anterior basado en la analogía estructural con el
primero y el desempeño cualitativamente similar con el ultimo.
Los resultados obtenidos en la prueba del rotarod determinaron que los derivados de
imidazo[1,2-a]piridina L-1 y L-2 deterioraron el desempeño en el rotarod sólo a la dosis más alta
evaluada (64 mg/kg) a la cual, se observó reducción de la actividad locomotora (no se muestran
los resultados) y por lo tanto no se establecen conclusiones con respecto a efectos
42
miorrelajantes. Por otro lado, ninguno de los derivados exhibió efectos relajantes sobre el
modelo de la cuerda tirante aún a dosis altas (Tabla 3). Diazepam produjo efectos relajantes a
dosis mínimas de 2.75 mg/kg, similar a reportes previos [Soderpalm et al., 1988].
La actividad ansiolítica se determinó para los derivados L-2 y L-3 con base a los siguientes
hechos: el tratamiento con L-2 y L-3 incrementó significativamente el porcentaje de tiempo en
los brazos abiertos del plus maze a dosis de 1 and 2 mg/kg sin modificar el número de entradas
totales. Adicionalmente, L-2 y L-3 a 1 mg/kg incrementaron el número de entradas a brazos
abiertos y resultados previos muestran que dichos efectos no son mediados por efectos
motores (Tabla 1).
El número total de entradas está directamente relacionado con la actividad locomotora [Pellow
et al., 1985], aunque este parámetro no puede ser considerado independientemente del estado
de ansiedad. De acuerdo con lo mencionado anteriormente L-1, L-2 y L-3 a dosis altas de 4 y 8
mg/kg decrementaron el número de entradas totales, entradas a brazos abiertos y cerrados. L-4
mostro efecto similar a dosis de 8 mg/kg. Resultados de actividad locomotora espontánea en
campo abierto muestran que los efectos descritos son mediados por efectos motores.
Como se esperaba, el DZP incremento significativamente las entradas y porcentaje de tiempo en
las zonas abietas del plus maze a dosis de 1 and 2 mg/kg sin modificar el número de entradas
totales [Soderpalm et al., 1988; Frankowska et al., 2007].
Las pruebas conductuales más ampliamente usadas para evaluar las propiedades ansiolíticas de
los fármacos son los modelos de conflicto. Ya que el efecto de los fármacos en modelos de
conflicto (pruebas de conducta defensiva de enterramiento) son correlacionados positivamente
con la unión a receptor de benzodiacepinas [Lippa et al., 1978] los efectos producidos por las
imidazopiridinas durante la evaluación sobre el modelo del laberinto elevado en cruz, fueron
comparados con aquellos generados con el tratamiento de zolpidem y diazepam en el modelo
de “Conducta defensiva de enterramiento”. Los derivados L-1 (2-15 mg/kg), L-2 (8 y 15 mg/kg),
L-3 (4-15 mg/kg) y L-4 (15 mg/kg) produjeron una clara reducción en el tiempo acumulativo de
43
enterramiento. Como consecuencia un efecto de reducción en la ansiedad experimental fue
determinado [Treit et al.,1980; Treit, 1985].
L-1 y L-2 modificaron la latencia de enterramiento sólo a dosis de 15 mg/kg. Esto podría indicar
que la reactividad de los animales en estudio fue decrementada. Sin embargo, es importante
mencionar que a tales dosis, 2 de cada 6 animales alcanzaron el estado de sedación. Como se
esperaba, DZP redujo la conducta defensiva de enterramiento a dosis experimentales de
0.75-1.5 mg/kg e incremento significativamente la latencia de enterramiento a dosis sedativas
por arriba del 1.5 mg/kg. Por su parte ZLP (3 mg/kg) produjo reducción significativa en la
conducta de enterramiento. Dosis a la cual redujo la actividad locomotora espontanea y por lo
tanto no se establecen conclusiones de efectos ansiolíticos.
Para confirmar los efectos sedantes de los fármacos, se evaluó la actividad locomotora. La DE50
sedante en ratón fue calculada usando análisis probit (Tabla 2). Los efectos sedantes
consistieron de reducción significativa en la actividad ambulatoria y vertical. Las DE50
encontradas fueron: 7.43 mg/kg para L-1, 19.07 mg/kg para L-2, 30.88 mg/kg para L-3 y 17.70
mg/kg para L-4.
Todos los compuestos disminuyeron la actividad locomotora en rata y en ratón. A dosis altas,
los ratones mostraron movimientos lentos, periodos de tiempo con largas pausas en la
ambulación y parcialmente cerraban sus ojos. Estos signos se presentaron a dosis por arriba de
8 mg /kg para L-1 y 15 mg/kg para L-2, L-3, L-4 con errores estándar grandes y a menudo en el
límite de la significancia. Por lo tanto las imidazopiridinas evaluadas mostraron perfil sedante a
dosis más altas que diazepam (0.95 mg/kg) y zolpidem (3 mg/kg). Diazepam y zolpiden iniciaron
efecto sedativo a dosis mínimas de 1 mg/kg and 3 mg/kg respectivamente.
Se ha sugerido que las imidazopiridinas tales como el ZLP y alpidem tienen afinidad preferencial
por el complejo receptor a benzodiazepinas GABAA tipo (BZ1) (estructura que contiene la
subunidad α1) [Langer et al., 1985, Depoortere et al., 1986; Benavides et al., 1988]. Por lo tanto,
es posible sugerir que los derivados de imidazopiridinas evaluadas ejercen su efecto a través de
mecanismos gabaérgicos.
44
Diferentes reportes [Rudolph et al., 1999; McKernan et al., 2000] indican que los agentes activos
en el receptor de benzodiazepinas producen efecto sedante a través de interacciones con el
complejo receptor a benzodiazepinas GABAA conteniendo la subunidad α1 y que aquellos
compuestos que no poseen dicha actividad podrían actuar como agentes ansiolíticos
(posiblemente por unión con receptores que contienen otro tipo de subunidades alfa) con
mínimo efecto sedante y deterioro motor. A la luz de los presentes hallazgos, investigaciones
posteriores de la especificidad de unión de las imidazopiridinas al receptor a benzodiacepinas
GABAA es recomendado. Actualmente se realiza la investigación correspondiente para
establecer si las propiedades ansiolíticas y/o sedativas obtenidas en este estudio, podrían ser
atribuidas a acciones como agonistas parciales.
45
XIII. CONCLUSIONES
Se sintetizaron 4 compuestos derivados de imidazo[1,2-a]piridina, L1-L4 en buenos
rendimientos los cuales fueron identificados y caracterizados espectroscópicamente,
confirmando su estructura.
L-1 y L-2 indujeron relajación muscular a la dosis más alta evaluada (64 mg/kg) debido a
efectos motrices.
Ninguno de los derivados exhibió efectos relajantes en ratón aun a las dosis más altas
evaluadas.
L-1, L-2 y L-3 indujeron propiedades sedativas a las dosis de 4 y 8 mg/kg (en rata). L-4
indujo un efecto similar a la dosis de 8 mg/kg.
Se determinó actividad ansiolítica para los derivados L-2 y L-3 a las dosis de 1 y 2 mg/kg.
Los derivados L-1 a dosiss de 2 y 4 mg/kg, L-2 a dosis de 8 mg/kg y L-3 a dosis de 4 y
8mg/kg indujeron ansiólisis experimental.
Los compuestos L-1 y L-2 redujeron la reactividad de los animales unicamente a dosis de
15 mg/kg (por inicio de efecto sedante).
El compuesto L-1 resultó ser el más potente con una DE50 de 7.43. El derivado L-3
resultó ser el menos efectivo en términos de sedación, ya que su DE50 fue de 30.88
mg/kg. Los compuestos L-2 y L-4 presentaron potencias cercanas con valores de DE50
19.07 y 17.70 mg/kg respectivamente.
Se obtuvieron efectos sedantes a dosis mayores de de 8 mg /kg para L-1 y de 15 mg/kg
para L-2, L-3, L-4 en ratòn
Las imidazopiridinas evaluadas indujeron efecto sedante a dosis más altas que Diazepam
(1 mg/kg) y zolpiden (3 mg/kg).
46
XIV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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54
ANEXOS
No. Espectro Compuesto
1 1H RMN 2-(3’-CF3fenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
2 13C RMN 2-(3’-CF3fenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
3 1H RMN 2-(4’-clorofenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
4 13C RMN 2-(4’-clorofenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
5 1H RMN 2-(3’,4’-dimetoxifenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
6 13C RMN 2-(3’,4’-dimetoxifenil)-3-nitrosoimidazo[1,2-a]piridina
7 1H RMN 2-(4’-Metoxifenil)-3-formilimidazo[1,2-a]piridina tiosemicarbazona
8 13C RMN 2-(4’-Metoxifenil)-3-formilimidazo[1,2-a]piridina tiosemicarbazona
55
Espectro 1
7 6
58
N1
9 N 43
2
NO
CF
3
1'
2'
3'
4'
5'
6'
H5
H2
’, H
4’
H6
’, H
7, H
8
H-5
’
H-6
L-1
56
Espectro 2
57
Espectro 3
7 6
58
N1
9 N 43
2
NO
Cl
AB B
'A
'
H5
H-A
,A’
H7
, H8
H-6
H-B
,B’
L-2
58
Espectro 4
59
Espectro 5
7 6
58
N1
9 N 43
2
NO
OM
e
OM
e
1'
2'
3' 5
'6
'
4'
H5
H2
’, H
6’
OC
H3
H-8
H-7
H-6
H-5
’
L-3
60
Espectro 6
61
Espectro 7
7 6
58
N1
9 N 43
2 NNH
NH
2
S
OM
e
AB B
'A
'
H5
H-8
, H
-A,A
’
H-7
H-6
H-B
,B’
OC
H3
L-4
NH
62
Espectro 8
