I. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 Formación de biofilms bajo condiciones in vitro.

En la figura 3, se muestra la formación de biofilms bajo condiciones in vitro, donde

se observa una tendencia creciente a medida que pasan las horas de incubación,

induciendo la mayor formación de biofilms bajo condiciones in vitro M1E1

(Salmonela spp. y el envase de polietileno tereftalato) y M2E1 (Escherichia coli

ATCC 35218 y el envase de polietileno tereftalato)?? mientras las demás bacterias

con los otros tipo de envase inducen menos formación de biofilms.MODIFICAR

contrastar con referencias bibliográficas

ARREGLAR

FIG 3? XXXXXXX MOSTRAR LEYENDA EN FIG

Densidad óptica (620 nm)

Tiempo (horas)

En la mayoría de los estudios, la formación de biofilms por diferentes especies de

microorganismos es estimada por las densidades ópticas (DOs) obtenidas

después de la tinción de las bacterias adheridas con cristal violeta (CV) u otros

colorantes que indican la biomasa total. El CV es un colorante básico que se une a

moléculas superficiales cargadas negativamente y a polisacáridos en la matriz

celular (Peeters y otros 2008)

Al-Shuneigat y otros (2005), determinaron la formación de biofilms mediante un

ensayo en microplacas de poliestireno (90 pozos), utilizando coliformes totales y

coliformes termotolerantes incubadas a 35ºC y 44,5ºC respectivamente por 18 hr.

Para cuantificar la densidad óptica como una estimación de la capacidad de

formación de biofilms, la medición se realizó a 490nm. Un porcentaje significativo

en ambos grupos, demostró la capacidad de formación de biofilms, los coliformes

totales el 50,0 %, y los coliformes termotolerantes un 65,5 % formaron biofilms.

Danese y otros (2000), evaluaron la formación de biofilms por cuatro cepas (Ec1,

Ec2, Ec3 y Ec ATCC), el estudio se realizó en cuatro caldos de cultivo distintos

M63 (US Biological, Swampscott, EEUU), M9 (Sigma), LB (Luria Bertani) y MH-II

(Mueller-Hinton II) respectivamente, se incubaron a 30ºC durante 24 hr. Se

utilizaron pocillos con los distintos caldos no inoculados como controles negativos.

Los biofilms adheridas en los pocillos de poliestireno fueron teñidas con 130 µL de

cristal violeta al 1% durante 5 minutos, luego los pocillos lavados 4 veces con 150

µL de agua destilada, se obtuvieron las DO630 nm del crecimiento de la formación

de biofilms en lector de placas. RESULTADOS DE LA TESIS O DEL

AUTOR???? MODIFICAR REDACCION

Hernández y otros (2009), investigaron la formación de biofilms, para lo cual

utilizaron en este estudio 15 cepas de Salmonella. Se emplearon dos placas de

poliestireno con 24 pozos cada una, las placas inoculadas se incubaron a 37ºC

por 24, 48 y 72 horas. Los valores de densidad óptica (D.O) registrados en cada

ensayo se promediaron y se clasificaron en las categorías de: productora de

biofilms moderada o biofilms fuerte.RESULTADOS DE LA TESIS O DEL AUTOR

¿????? MODIFICAR REDACCION

4.2 Efecto del tipo envase y tiempo de incubación sobre la formación de

biofilms bajo condiciones in vitro

En el cuadro 4. Se tiene la prueba de Levene modificada donde no se observó

homogeneidad de varianza (p<0.05), por lo que se procedió a realizar una

transformación de datos (raíz cuadrada), se volvió a realizar la prueba de Levene

modificada (cuadro 5) con los datos transformados la cual presento homogeneidad

de varianza (p>0.05), por lo que se procedió a realizar un análisis de varianza y

posteriormente la prueba de Duncan para observar la tendencia al mejor

tratamiento.

Cuadro 4. Prueba de Levene modificada DE QUE?? INDICAR VARIABLES DE

ESTUDIO

Cuadro 5. Prueba de Levenne modificada con los datos transformados (raíz

cuadrada) DE QUE?? INDICAR VARIABLES DE ESTUDIO

El cuadro 6, presenta el análisis de varianza, donde se observó efecto significativo

para cada bacteria, tipo de envase, tiempo de incubación y su interacción sobre la

formación de biofilms bajo condiciones in vitroa un nivel de confianza del 95%.

MODIFICAR REDACCION

Estadístico de Levene gl1 gl2 p

1.690 23 96 0.042

Estadístico de Levenne gl1 gl2 p

1.000 23 96 0.476

Cuadro 6. Análisis de varianza para formación de biofilms bajo condiciones

in vitro.

VariableFuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Cuadrados medios

F p

Formación de

biofilms

Bacteria: A 1.033 2.000 0.517 202.651 0.000Envase: B 1.285 1.000 1.285 503.925 0.000Tiempo: C 0.681 3.000 0.227 89.051 0.000A*B 0.496 2.000 0.248 97.218 0.000A*C 0.593 6.000 0.099 38.728 0.000B*C 0.246 3.000 0.082 32.138 0.000A*B*C 0.811 6.000 0.135 52.987 0.000Error 0.245 96.000 0.003    Total 5.389 119.000      

Resultado similar fue reportado por Montgomery (2006), donde estudio la

formación de biofilms en placas de polietileno, se evaluó el tiempo de incubación,

la proporción de inóculo, con el fin de validar las diferencias entre estos

parámetros y determinar la combinación de variables que favorecen la formación

de biofilm. Se realizó un análisis de varianza que justifica que los tratamientos

tienen una influencia significativa en la formación de biofilm, con un error p < 0.05

y un nivel de significancia del 95%.SE MODIFICO LA COMA POR PUNTO

En el cuadro 7, se presenta la prueba de Duncan para la formación de biofilms

bajo condiciones in vitro, donde se aprecia: el subconjunto 9 se tiene al

tratamiento M1E1 y el subconjunto 7 al tratamiento M2E1, el cual presentan mayor

formación de biofilms bajo condiciones in vitro a las 48 y 24 horas

respectivamente.

Cuadro 7. Prueba de Duncan para la formación de biofilms bajo condiciones

in vitro.

Variables Subconjunto

Bacteria Envase Tiempo (horas)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

M3 E2 12 0.134                

M3 E1 6 0.150 0.150              

M3 E2 6   0.193 0.193            

M2 E2 6   0.195 0.195 0.195          

M3 E2 24   0.198 0.198 0.198          

M1 E2 12     0.229 0.229 0.229        

M1 E2 6     0.231 0.231 0.231        

M3 E1 12     0.239 0.239 0.239 0.239      

M3 E2 48     0.242 0.242 0.242 0.242      

M1 E2 24     0.248 0.248 0.248 0.248      

M3 E1 24     0.248 0.248 0.248 0.248      

M2 E2 12     0.250 0.250 0.250 0.250      

M3 E1 48     0.253 0.253 0.253 0.253      

M2 E2 24     0.261 0.261 0.261 0.261      

M1 E2 48       0.267 0.267 0.267      

M1 E1 6       0.279 0.279 0.279      

M1 E1 12       0.282 0.282 0.282      

M2 E2 48           0.518      

M2 E1 48             0.518    

M2 E1 6             0.543    

M2 E1 12             0.549    

M2 E1 24             0.574    

M1 E1 24               0.979  

M1 E1 48                 1.723

M2E1 (Escherichia coli ATCC 35218 y el envase de polietileno tereftalato)

Para cuantificar mejor los tratamientos con respecto a la formación de biofilms, se

podría explicar teniendo en cuenta la mayor concentración de bacterias; pero si

bien hay una mayor concentración de bacterias, no necesariamente se dará una

mayor formación de biofilm, esto se debe a todos los factores que pueden influir

en su mecanismo de formación, desde la adhesión hasta la maduración del mismo

(Donlan, 2002; Wimpenny y otros, 2000).

Sin embargo, los resultados muestras que, quienes registraron una mayor

formación de biofilms sobre el tipo de envase de polietileno tereftalato fue dada

por la Salmonella spp. a las 48 horas con una D.O.= 1.723 y la Escherichia coli

ATCC 35218 a las 24 horas con una D: O.= 0.574.????

II. CONCLUSIONES

1. El efecto del tipo de envase y tiempo de incubación fue significativo sobre la

formación de biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de interés

alimentario. ¿a que nivel de significación??

2. Se determinó que el tipo de envase de polietileno tereftalato y tiempo de

incubación de 48 y 24 horas permiten cuantificar mejor la formación de

biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de interés alimentario.

3. La formación de biofilms se logró por espectrofotometría (λ=620 nm) al

termino de las 6, 12, 24 y 48 horas de crecimiento previa coloración de los

biofilms, lo cual permitieron cuantificar mejor la mayor formación de biofilms

sobre el envase de polietileno tereftalato la Salmonella spp. a las 48 horas.

con una D.O. = 1.723 y la Escherichia coli ATCC 35218 a las 24 horas con

una D: O.= 0.574.?????

4. El período de incubación también es un factor que afecta la formación de

biofilms, tal y como lo demuestran los resultados obtenidos en este trabajo,

donde se pone de manifiesto que mayores tiempos permiten una expresión

diferenciada de la capacidad de formación de biofilms.

5. Se pudo comprobar que cada una de las cepas aún bajo las mismas

condiciones que se tuvo, como era de esperarse dadas las diferencias

biologías o biológicas??’ naturales de cada una, un nivel de formación de

biofilm particular.