REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE … · Fecundación in vitro In vitro In vivo Cultivo...
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Máster Interuniversitario en Zootecnia y Gestión Sostenible:
ganadería ecológica e integrada.
Instituto de Estudios de Postgrado
Universidad de Córdoba
J. De la Fuente INIA – Reproducción Animal y
Conservación Recursos Zoogenéticos
REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE FIV
Córdoba, Marzo 2012
Impacto de las Tecnologías de
Reproducción Asistida
Mejora Reproductiva Bovina
I.A.
FIV
Clonación
Transgénesis
MOET
Sexaje OPU
1
2
3
4 5
6
7
PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO (FIV):
ÍNDICE
1.- INTRODUCCIÓN
3.- VALORACIÓN DE OVOCITOS
4.- VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA FIV
2.- ASPIRACIÓN DE OVOCITOS :
- OVARIOS DE MATADERO
- DE ANIMALES VIVOS:
* PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA
* PUNCIÓN ECOGRÁFICA
• >200.000 ovocitos al nacer
• 1 ovulación por ciclo - 17 ciclos/año
• Media por vaca < 3 crías
• Descendencia limitada:
– Duración de la gestación
– 1-2 ovocitos ovulados
Cómo MEJORAMOS esto ?
FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA HEMBRA BOVINA
Fecundación in vitro
Cultivo In vitro In vivo
Aspiración Ovarios
Maduración Ovocitos
Transferencia
Capacitación Espermas
Fertilización
Embriones
ASPIRACIÓN DE OVOCITOS
1.- OVARIOS DEL MATADERO: En caso de accidente No repetible Aplicación en investigación
2.- ANIMALES VIVOS
2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA: Requiere cirugía Repetibilidad limitada (bienestar animal y adhesiones
2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Repetible y poco invasivo Fácil para vacas gestantes y con problemas Posible en terneras
1.- OVARIOS DE MATADERO:
Aspiración de ovocitos
Búsqueda de ovocitos
2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA:
Anestesia quirúrgica Puertos
Suturas
2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA:
Ovario SOV
Aspiración
Punción
Producción de embriones in vitro, aspiración laparoscópica en prepúberes
Edad,
meses
Folículos
puncionados
Ovocitos
recuperados
Embriones
desarrollados
6
50
32 (64%)
3 (10%)
7
43
14 (33%)
2 (14%)
8
19
5 (26%)
3 (60%)
9
18
9 (50%)
4 (44%)
2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Aplicaciones
Vacas cíclicas: semen caro
problema: oviductos bloqueados
quistes ováricos
fallo en la SOV
fallo en la fecundación
post parto: durante el anoestro
gestantes: durante el primer trimestre
Novillas impúberes: desde el primer mes
– Aspiración ultrasonográfica:
– Aguja de 14g.
– 20-22 ml/min de presión de aspiración.
– Medio: PBS + BSA, surfactante.
Aspiración en animales prepúberes
– Tratamiento de superovulación:
• 750 a 1.000 ui de eCG.
• Neutra eCG + GnRH.
• A intervalos de 2 a 4 semanas.
– Intervalo de SOV a la obtención de 48 a 72h.
Punción en hembras prepúberes:
Modificación de la sonda para terneras
A) Rotación axial B) Plano vertical C) Craneal-caudal D) Plano horizontal
Direcciones y planos
Terneras de 6 meses
Imagen ultrasonográfica: ovario estimulado
Punción en hembras prepúberes:
Folículo aspiración transvaginal hembras prepúberes
Aguja de aspiración
Tamaño de los folículos
Punción en hembras prepúberes:
1. Aspiración folicular
4. Recuperación de ovocitos
2. Sedimentación
3. Búsqueda
Metodología de FIV:
OBTENCION DE OVOCITOS:
Primera visión
Denudados Poco CODs
SELECCION DE OVOCITOS:
NO
¿ ?
SI
Expandido
SELECCION DE OVOCITOS:
Vacuolizados
Picnóticos
Placa de
maduración
Grado 1 y 2
Grado 3 y 4
Maduración in vitro
1er corpúsculo polar
MIV durante 24 h
39o C, 5% CO2
Fecundación (FIV)
• Descongelar el semen.
• Capacitación - heparina.
• Selección espermática:
– Swim-up.
– Gradiente de densidad de Percoll.
• 0,5-1 X 106 spz/mL.
• Co-cultivo durante 24 h en 5% CO2 en aire.
Separación espermática con Swim-up
0.25 mL semen + 1 mL medio
DESCONGELACIÓN SPZ
Separación espermática con Percoll
Antes de centrifugar Después de centrifugar
Zigoto
FIV durante 24h
39o C, 5% CO2
Diferencias entre toros al fecundar in vitro e in vivo (7 réplicas por semental, P<0.001)
Toro
Ovocitos
Cultivo
% División
% Desarrollo
TNR (IAs)
A
1.212
73 a
21 a
78% (5.300)
B
1.207
64 b
14 b
73% (1.500)
C
684
56 b
12 b
-
D
615
44 c
5 c
-
Diferencias entre eyaculados de un mismo semental (17 réplicas, P<0.01)
Ovocitos cultivados
(%) División
(%) Eclosión
Eyaculado 1
2.817
70
19
Eyaculado 2
2.604
72
11*
Estabilidad de la cromatina (EC, explica el 36%).
Porcentaje de spz normales determinados por eosina/nigrosina (%ENOR, explica el 25%).
Porcentaje de embriones divididos (%D, explica el 16,8%)
Porcentaje de ovocitos penetrados in vitro (%P, explica el 3,6%).
Ecuación de Predicción de la Tasa de No Retorno (PTNR)
PTNR= 173,11 – 0,02 (EC) + 1,38 (%ENOR) + 0,95 (%D) + 0,39 (%P)
R2 = 0,82
La ecuación para predecir la fertilidad de los toros incluyó cuatro parámetros que explican el 82% de la variación en la fertilidad de los toros estudiados.
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5
Día 6 Día 7 Día 8 - 9
Desarrollo de embriones cultivados in vitro
Cultivo in vitro de embriones a los 7-8 días
Pocillo completo
Blastocistos sin ZP, elongados
Blastocistos expandidos
Congelación y vitrificación de embriones producidos in vitro
10% ETG
10´
10% Gly 10% Gly
20% ETG
25% Gly
25% ETG
5´ 5´ 30´´
Viabilidad (%)
Eclosión (%)
Congelación
77/150 (51)
46/150 (31)
Vitrificación
82/147 (56)
52/147 (35)
Viabilidad post descongelación de embriones PIV vitrificados
Viabilidad
Eclosión
1 paso
55% (33/60)
35% (21/60)
2 pasos
56% (38/68)
41% (28/68)
3 pasos(4ºC)
72% (47/65)*
63% (41/65)*
0.5 M S 10 min 35ºC
Comparación entre ambos tipos de producción de embriones bovinos
In vivo
In vitro
Embriones/vaca/año +21 +80
Partos de embriones frescos 60 % 45 %
Partos de emb. congelados 50 % 20 %
Defectos congénitos 1 % 4 %
Distocias 6 % 11 %
Peso al nacimiento
>10 %
FECUNDACIÓN IN VITRO
• VENTAJAS
• Disminución del estrés de manejo.
• Sin interacción sobre la ovulación.
• Utiliza varios sementales sobre una misma vaca.
• Evita la transmisión de enfermedades.
• Realización durante largos períodos fisiológicos.
• Propicio para la investigación.
• Insustituible en la Conservación de Recursos Genéticos.
• INCONVENIENTES
• Bajos resultados en la congelación.
• Equipo y formación muy elevada.
• Síndrome del Ternero Gigante.