Reporte 2. Metodos para la cuantificación de proteinas
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO || FACULTAD DE QUIMICA INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. Albo Josué Hernández Rojas Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected] Fernando Larriva Sánchez Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected] Fernando Olvera Martínez Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected] Francisco León Solorio Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected] Natalia García Orihuela Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected] RESUMEN: Se conocieron los diferentes métodos para la cuantificación de proteínas, así como sus ventajas y desventajas. Se construyeron curvas de calibración para la cuantificación de proteínas mediante un blanco y cuatro soluciones estándar con diferentes concentraciones de caseína, y se determinó la concentración de dos muestras problema, mediante dos métodos colorimétricos: Bradford y Biuret. Las curvas de calibración se construyeron con el programa estadístico Minitab 17. Se evaluó la presencia de tres interferentes: EDTA, Tween 80 y Lauril sulfato sódico (LSS) para determinar las diferencias que causan en la cuantificación de proteínas tanto positivas como negativas mediante la construcción de curvas de calibración normales y con interferentes. La confiabilidad de la curva de calibración se evaluó mediante la correlación lineal. Los resultados nos arrojan que la curva más confiable es la hecha con el método de Biuret, con un nivel de confianza del 95%. El método más sensible a los interferentes experimentalmente es Bradford además de que el EDTA es el que causa más modificación en la cuantificación. PALABRAS CLAVE: Cuantificación, proteínas, Bradford, Biuret, EDTA, Tween 80, Lauril Sulfato Sódico (LSS) ABSTRACT: Different methods for quantitation of protein as well as its advantages and disadvantages met. Calibration curves for quantification of proteins using a white and four standard solutions with different concentrations of casein were constructed, and the concentration of two test samples was determined by two colorimetric methods: Bradford and biuret. Calibration curves were constructed using Minitab statistical program 17. The presence of three interferents were evaluated: EDTA, Tween 80 and sodium lauryl sulfate (SLS) to determine differences caused in the quantification of both positive and negative proteins by constructing normal calibration curve and interferents. The reliability of the calibration curve was evaluated using linear correlation. The results show us that the most reliable curve is made with the Biuret method, with a confidence level of 95%. The most sensitive method is experimentally Bradford interferents plus EDTA is causing more modification quantification. KEYWORDS: Quantification, proteins, Bradford, Biuret, EDTA, Tween 80, Sodium Lauryl Sulfate (SLS).
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO || FACULTAD DE QUIMICA
INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS.
Albo Josué Hernández Rojas Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected]
Fernando Larriva Sánchez Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected]
Fernando Olvera Martínez
Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected]
Francisco León Solorio Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected]
Natalia García Orihuela Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected]
RESUMEN: Se conocieron los diferentes métodos para la cuantificación de proteínas, así como sus ventajas y
desventajas. Se construyeron curvas de calibración para la cuantificación de proteínas mediante un blanco y cuatro
soluciones estándar con diferentes concentraciones de caseína, y se determinó la concentración de dos muestras
problema, mediante dos métodos colorimétricos: Bradford y Biuret. Las curvas de calibración se construyeron con el
programa estadístico Minitab 17. Se evaluó la presencia de tres interferentes: EDTA, Tween 80 y Lauril sulfato sódico
(LSS) para determinar las diferencias que causan en la cuantificación de proteínas tanto positivas como negativas
mediante la construcción de curvas de calibración normales y con interferentes. La confiabilidad de la curva de
calibración se evaluó mediante la correlación lineal. Los resultados nos arrojan que la curva más confiable es la hecha
con el método de Biuret, con un nivel de confianza del 95%. El método más sensible a los interferentes
experimentalmente es Bradford además de que el EDTA es el que causa más modificación en la cuantificación.
PALABRAS CLAVE: Cuantificación, proteínas, Bradford, Biuret, EDTA, Tween 80, Lauril Sulfato Sódico (LSS)
ABSTRACT: Different methods for quantitation of protein as well as its advantages and disadvantages met.
Calibration curves for quantification of proteins using a white and four standard solutions with different concentrations
of casein were constructed, and the concentration of two test samples was determined by two colorimetric methods:
Bradford and biuret. Calibration curves were constructed using Minitab statistical program 17. The presence of three
interferents were evaluated: EDTA, Tween 80 and sodium lauryl sulfate (SLS) to determine differences caused in the
quantification of both positive and negative proteins by constructing normal calibration curve and interferents. The
reliability of the calibration curve was evaluated using linear correlation. The results show us that the most reliable
curve is made with the Biuret method, with a confidence level of 95%. The most sensitive method is experimentally
Bradford interferents plus EDTA is causing more modification quantification.
KEYWORDS: Quantification, proteins, Bradford, Biuret, EDTA, Tween 80, Sodium Lauryl Sulfate (SLS).
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INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
INTRODUCCIÓN
Cuando se trata de proteínas, además de que
presenta pocas interferencias y es económico. La
única desventaja es que tiene poca sensibilidad,
por lo que se recomienda usarse en la
cuantificación de preparaciones con altas
concentraciones. El método Lowry se llevan a
cabo dos reacciones coloridas: primero se produce
un color muy tenue con el cobre en medio alcalino
y después se forma un color azul verdoso con el
reactivo fenol-Folin-Cicalteu (presente en el
reactivo de Lowry). Y a pesar de ser bastante
preciso, tiene muchas interferencias. [3] El método
de Bradford se basa en la unión del reactivo
Comassie Blue G-250 a las proteínas presentes.
Sus ventajas son que tiene un límite bajo de
detección, que es compatible con agente
reductores y que se puede llevar a cabo de manera
rápida. Aunque también muestra interferencia con
detergentes. [1]
Como se mencionó muchos de los métodos de
cuantificación de proteínas pierden exactitud y
precisión por la presencia de interferentes. Un
interferente es un compuesto que altera los
resultados ya que tiene afinidad en el fundamento
de cada método sin ser proteína. [4] Para saber el
efecto de estos interferentes, se trabajó con EDTA,
Tween y Laurin. EDTA es un agente quemante, es
decir que forma complejos de metal. [5] Tween es
un compuesto que se utiliza como aditivo a ciertos
alimentos y actúa como detergente, disuelve y
emulsiona grasas. [6] El Laurin es también un
detergente que tiene un efecto en la tensión
superficial del líquido al que se le agrega. [7]
El objetivo de este trabajo es el conocer diferentes
técnicas de cuantificación de proteínas, así como
su fundamento y el procedimiento de cada una y
realizar curvas de calibración con y sin
interferentes.
METODOLOGÍA
Se prepararon 20 ml del reactivo estándar para
cada concentración. Se hizo en NaCl 0.15M y
caseína a dos concentraciones diferentes, 20mg/ml
para su análisis a través del reactivo de Biuret, y
0.5mg/ml para el método de Bradford. Los
cálculos realizados se encuentran anexados al
final.
Las muestras a evaluar se colocaron en dos placas
distintas: una en la que se agregó el reactivo de
Biuret y en otra el reactivo de Bradford. El
procedimiento para preparar dichos reactivos se
encuentra anexado.
En cada orificio se colocaron las cantidades
indicadas en la siguiente tabla.
Tabla 1. Preparación de muestras
Reactivos
Estándar
µl
NaCl
0.15M en
H2O
µl
Reactivo
indicado
µl
Blanco 0 100 100
1 25 75 100
2 50 50 100
3 75 25 100
4 100 0 100
M1 100 0 100
M2 100 0 100
Se llenó ocho veces todo lo presentado la tabla 1,
ya que todas las pruebas fueron realizadas por
duplicado y con los resultados obtenidos se calculó
un promedio. Dos para el análisis estándar
(agregando únicamente el reactivo) y seis más para
cada interferente y su duplicado (3 interferentes x
2 repeticiones). Para los interferentes se agregaron
10 µl de cada interferente. Una vez listas las placas
se colocaron una por una en “BIO-RAD iMark TM
Microplate Absorbance Reader” equipo que como
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su nombre lo dice fue utilizado para determinar las
absorbancias. Con los datos obtenidos de dicha
lectura, se realizaron curvas de calibración para el
estándar y cada interferente a través de los dos
métodos (ocho en total). Se obtuvo el coeficiente
de extinción y las concentraciones de M1 y M2.
RESULTADOS
En la tabla 2 se muestran los resultados de
absorbancias de la curva de calibración de Biuret y
en la figura 1 se muestra la gráfica de la curva de
calibración.
Tabla 2. Resultados a través del método de Biuret.
Tubos
Estándar
(20mg/ml) Agua R.
Biuret µ
ABS
595nm µl µl
Blanco 0 100 100 0
1 25 75 100 0.0085
2 50 50 100 0.038
3 75 25 100 0.0675
4 100 0 100 0.0775
M1 100 0 100 0.032
M2 100 0 100 0.013
En la tabla 3 se muestran los resultados de
absorbancias del método Biuret y en la figura 2 se
muestra la gráfica de la curva de calibración.
En la tabla 4 se muestran los resultados de
absorbancias de las curvas de calibración de Biuret
con los diferentes interferentes y en la figura 3a,
3b y 3c se muestra la gráfica de la curva de
calibración con interferentes.
20151050
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
S 0.0074095
R-Sq 96.5%
R-Sq(adj) 95.4%
[Proteina mg/ml]
AB
S
Curva de calibración de Biuret sin interferentesABS = - 0.004500 + 0.004280 [Proteina mg/ml]
Figura 1. Curva de calibración para el método de Biuret
0.50.40.30.20.10.0
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
S 0.112690
R-Sq 59.0%
R-Sq(adj) 45.4%
[Proteina mg/ml]
AB
S
Curva de calibración de Bradford sin interferentesABS = 0.1231 + 0.5928 [Proteina mg/ml]
Figura 2. Curva de calibración de Bradford
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En la tabla 5 están los resultados de las
absorbancias de Bradford con diferentes
interferentes (Tween 80, LSS y EDTA). En la
figura 4a, 4b y 4c se muestran las curvas de
calibración del método de Bradford con
interferentes
Tabla 4. Resultados de la curva de calibración con interferente a través del método de Biuret
20151050
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
S 0.147463
R-Sq 91.4%
R-Sq(adj) 88.5%
[Proteina mg/ml]
AB
S
Curva de calibración de Biuret con LSSABS = 0.0435 + 0.05260 [Proteina mg/ml]
Figura 3b. Curva de calibración con interferente LSS
20151050
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
S 0.0119569
R-Sq 88.1%
R-Sq(adj) 84.1%
[Proteina mg/ml]
AB
S
Curva de calibración de Biuret con Tween 80ABS= 0.008600 + 0.003560 [Proteina mg/ml]
Figura 3a. Curva de calibración con interferente Tween 80
20151050
0.01
0.00
-0.01
-0.02
-0.03
S 0.0209386
R-Sq 15.7%
R-Sq(adj) 0.0%
[Proteina mg/ml]
AB
S
Curva de caliración de Biuret con EDTAABS = - 0.01860 + 0.000990 [Proteina mg/ml]
Figura 3c. Curva de calibración con interferente EDTA
Tabla 5. Resultados de las soluciones + interferente a través del método de Bradford.
0.50.40.30.20.10.0
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
S 0.0396791
R-Sq 76.3%
R-Sq(adj) 68.4%
Proteina mg/ml
AB
S
Curva de calibración de Bradford con LSSABS = 0.04130 + 0.3120 [Proteina mg/ml]
0.50.40.30.20.10.0
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
S 0.187239
R-Sq 47.9%
R-Sq(adj) 30.6%
[Proteina mg/ml]
AB
S
Curva de calibración de Bradford con Tween 80ABS = 0.2050 + 0.7872 [Proteina mg/ml]
Figura 4a. Curva de calibración de Bradford con Tween 80
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En la tabla 6 se muestran las concentraciones
obtenidas a partir de las diferentes curvas de
calibración, así como también sus
correspondientes correlaciones lineales en
porcentaje.
DISCUSIÓN
El método de Biuret no es muy sensible por lo que
se utilizó una concentración de 20mg/ml. Este
método se basa en la reacción de una molécula
formada a partir de dos moléculas de urea (H2N-
CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da
positiva esta reacción. El reactivo de Biuret
contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina
(NaOH o KOH). La reacción se basa en la
formación de un compuesto de color violeta,
debido a la formación de un complejo de
coordinación entre los iones de Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma
parte de los enlaces peptídico presentando un
máximo de absorción a 540 nm. Da positiva esta
reacción en todos los compuestos que tengan dos o
más enlaces peptídicos consecutivos en sus
moléculas [8]. Esta es una de las razones por la
que la curva de calibración dio una regresión lineal
del 0.95 en el método de Biuret (Ver figura 1), ya
que se midió en 595 nm debido a que no se tenía el
filtro de 545 y es muy superior a la longitud de
onda en la que se tiene la máxima absorbancia
causando que la lectura de inferior, debido a que
un cambio de longitud de onda origina que la
muestra tengo una absorción menor.
Método de Bradford
Este método está basado en el cambio de color del
colorante Comassie brillant blue G-250 en
respuesta a diferentes concentraciones de
proteínas. Este compuesto interacciona con
aminoácidos básicos (especialmente arginina) y
aromáticos, esta unión del colorante con las
proteínas provoca un cambio en el máximo de
absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Las
interferentes que afectan demasiado la lectura son
altas concentraciones de detergentes como el SDS,
Tritón X-100, etc. [9]. En la práctica se observa
que la curva de calibración tiene un nivel de
confiabilidad realmente despreciable (R2: 59% y
ajustado el R2: 45.4%) por lo que es inútil tomar a
Figura 4c. Curva de calibración de Bradford con EDTA
0.50.40.30.20.10.0
1.75
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
S 0.399929
R-Sq 65.8%
R-Sq(adj) 54.4%
Proteina mg/ml
AB
S
Curva de calibración de Bradford con EDTAABS = - 0.1010 + 2.431 [Proteina mg/ml]
Tabla 6. Concentración de las muestras con ambos métodos (Biuret y Bradford) con y sin interferentes
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consideración los resultados que arrojan sobre la
concentración de proteína en la muestra.
Interferente descripción
Tween 80: El Mono oleato de Polioxietileno
Sorbitan, es un aditivo con acción detergente [10]
Lauril Sulfato sódico: Mono dodecil sulfato de
sodio; una mezcla de alquil sulfatos de sodio
consistentes sobre todo en lauril sulfato de sodio.
El contenido combinado de cloruro de sodio y
sulfato de sodio no es mayor del 8%. Es un agente
emulsionante, detergente y humectante. Reacciona
con agentes tenso activos catiónicos con pérdida
de su actividad, aun en concentraciones demasiado
bajas como para causar precipitación. [11]
EDTA: El ácido etilen-diamino-tetraacetico, es un
agente complejante especialmente efectivo que
puede formar cinco ciclos de quelante de cinco
miembros con un solo ion metálico por
coordinación mediante los pares de electrones de
los cuatro (o a veces tres) grupos carboxilato y de
los dos átomos de nitrógeno [12].
Efecto del interferente El LSS y el Tween-80
resultan ser en común detergentes, ambas
sustancias tienen una longitud de onda de
absorción de 650 nm e interfieren con la reacción
entre el colorante y la proteína en el método de
Bradford y Biuret debido a que las bases desplazan
el equilibro del colorante libre hacia su forma
aniónica [14] causando que los resultados den
falsos positivos, es decir puede que arrojen una
lectura alta de absorbancia donde hay poco analito.
Como se puede ver en las curvas de calibración
(Ver figura 4) para el ensayo de Bradford se
observa que dieron absorbancias muy altas los
estándares que tenían LSS y Tween 80, en cambio
la de EDTA dio una lectura baja de absorbancia
esto se debe a que el colorante Comassie G-250
tiene tres formas, catiónica (roja) neutra (verde) y
aniónica (azul) bajo condiciones acida el colorante
es predominante rojo con una máxima absorción a
470 nm y en su forma básica es azul. El EDTA es
un ácido y por tanto cambia el equilibrio del
colorante a su forma catiónica y eso modifica la
longitud de onda a la cual tendrá su máxima
absorción [15]. Para disolver la proteína usada
para los estándares (caseína) se usó NaCl y se ve
en la tabla 7 [13] que el NaCl también es causante
de interferencia.
Sin embargo, aún en la curva de calibración de
Bradford sin interferentes tiene un nivel de
confiabilidad bajo, por tanto, descartamos los
efectos de los interferentes y los dos razones que
quedan son las siguientes:
1) La preparación de los estándares se realizó
mal, ya puede ser por micropipetas
contaminadas, volúmenes mal medidos, el
analista agrego una sola concentración o no la
diluyo como debía ser y se corregiría
repitiendo el ensayo.
Tabla 7. Efectos de contaminantes comunes
en la absorbancia en el ensayo Bradford
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2) La concentración cuantificable y que arrojaría
una señal lineal se encuentra entre 0.00 y 0.10
mg/ml y esto concuerda con un protocolo
consultado con un protocolo consultado [13]
las concentraciones que se manejan son de
0.01 a 0.1 µg/ml, ya que este es un método
sensible requiere una concentración baja,
después de 0.10 mg/ml la señal perdería su
linealidad debido a que dejan de seguir la ley
de Lambert-Beer y esto se debe a muestras
muy concentrada [15]. Este problema se
corrige cambiando la concentración de los
estándares, ya sea preparando nuevos
estándares o bien diluyéndolos.
En el ensayo de Biuret el EDTA es un quelante y
tiene afinidad por metales [13] en este caso el
EDTA interactúa con el Cu2+ y puede interferir
con la reacción, que es la acomplejación entre el
Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrógeno que forma parte del enlace peptídico,
causando un falso negativo, diciendo que no hay
proteínas donde si hay presencia.
CONCLUSIONES
Antes de seleccionar una metodología para la
determinación de proteínas es necesario considerar
diversos factores, sin embargo, uno de ellos es
esencial: el conocimiento de la naturaleza de la
muestra, sus constituyentes y sus concentraciones
aproximadas de la manera más precisa posible.
Esto facilitara la identificación de posibles
interferencias y por lo tanto ayuda en la elección
del método más adecuado para cada situación.
Otros factores también importantes, son la
sensibilidad requerida, que es dependiente de la
concentración de proteína en la muestra y el
volumen de muestra disponible; la velocidad y el
costo de la metodología; y, no menos importante,
el grado de fiabilidad de los resultados, debido a
que interfiere en el método elegido.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la academia de Biotecnología de la
Universidad Autónoma de Querétaro por brindar
las instalaciones de laboratorio requeridas para
llevar a cabo esta práctica. Agradecemos también
al Dr. Aldo Amaro Reyes por proporcionar el
equipo BIO-RAD iMarkTM Microplate Absorbance
Reader para determinar las absorbancias, el
reactivo de Bradford para la cuantificación de
proteínas, y las micropipetas para realizar las
soluciones y el vaciado a las placas.
BIBLIOGRAFÍA
[1] Segal C, Ortega G. Manual de Prácticas
Biología Molecular de la Célula I. 1ª ed. Ciudad de
México: UNAM, 2005.
[2] Amaro A, Regalado C. Manual Prácticas
Tecnología Enzimática. Querétaro: UAQ, 2010.
[3] Cornejo J, Mancera R, Doria M. Experimentos
de química en micro escala para nivel medio
superior. 1ª ed. Ciudad de México: Universidad
Iberoamericana, 2009.
[4] Rivas S. Contribución a la determinación de la
fracción de metales traza ligados a las proteínas
similares a las metalotoneínas en muestras de
mejillón. Universidad de Santiago de Compostela,
2009.
[5] Obtenido el 24/01/2016 de:
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_etilen
diaminotetraac%C3%A9tico
[6] Obtenido el 27/01/2016 de:
https://es.wikipedia.org/wiki/Lauril_%C3%A9ter_
sulfato_s%C3%B3dico
[7] Obtenido el 27/01/2016 de:
https://es.wikipedia.org/wiki/Polisorbato_80
[8] Obtenido el 27/01/2016 de:
http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/B
iuret.pdf
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO || FACULTAD DE QUIMICA
INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
[9] Obtenido el 27/01/2016 de :
https://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&
esrc=s&source=web&cd=6&cad=rja&uact=8&ve
d=0ahUKEwjWm7fKscrKAhVmuYMKHfdkBG
MQFgg6MAU&url=http%3A%2F%2Fwww.biol.
unlp.edu.ar%2Fqcabiolfarmacia%2Fguia1.doc&us
g=AFQjCNEE8UliYu602KZz9eSHS_4u7SeF9Q
&sig2=7maL4xBZWXzwxzBDcUXrMw&bvm=b
v.112766941,d.amc
[10] Obtenido el 27/01/2016 de:
http://www.cimpaltda.com/modulo/quimicos/twee
n%2080.pdf (hacer referencia)
[11] Genaro A. Ramington Farmacia. 20ª ed.
Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana,
2003.
[12] Harris W, Laitinen H. Chemical Analysis. 2a
ed. Nueva York: McGraw-Hill, 1982.
[13] Kruger Nicholas J. Basic protein and peptide
protocols: The Bradford Method for Protein
Quantitation. Capítulo 3. (12): 9-15
[14] Dimas Zaia A.M., Cassia Thai B.V., Licgtig
J. Determinación de proteínas totales vía
espectrofotometría: ventajas y desventajas de los
métodos existentes. Química Nova. Universidad
de Sao Paulo, 1997
[15] Quintana Aguado M.A. Análisis cuantitativo
empleando métodos instrumentales. Cortázar:
C.B.T.i.s. 172: 62
ANEXO
Stock de caseína para Biuret
20ml de NaCl 0.15M
Caseína 20mg/ml)
Mezclar la caseína y el NaCl en 20 ml de agua
destilada.
Stock de caseína para Bradford
20ml de NaCl 0.15M
Casein 0.5mg/ml)
Mezclar la caseína y el NaCl en 20 ml de agua
destilada.
Reactivo de Biuret
Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver
3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g
NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita
añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g
de KI como estabilizante. Guardar en frasco de
plástico.
Reactivo de Bradford
Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar
10 mg de Comassie Blue G-250 con
10 ml de fosfórico al 88% y 4,7 ml de etanol
absoluto. Añadir H2O hasta 100 ml. Filtrar
a través de papel de filtro y guardar en la
oscuridad.
